CN1858238A - 快速结核分支杆菌培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速结核分支杆菌培养基。所述培养基的主要成分是胰蛋白胨、葡萄酸钠、盐酸吡咯醇、孔雀绿水溶液、甘油、琼脂、小牛血清等。本发明的培养基的细菌培养、菌种鉴定时间短，可快速进行结核与非结核分支杆菌培养、鉴定；可进行多种药物敏感实验，并可长期保存结核与非结核分支杆菌。该培养基不含新鲜鸡卵液，制备方便，培养结果容易观察，应用范围广泛。

Description

快速结核分支杆菌培养基

技术领域：

本发明涉及微生物领域，具体涉及对结核与非结核分支杆菌进行快速培养、鉴定、药敏试验及长期保存的一类培养基。

背景技术：

当前，结核病疫情在全球范围内回升，耐多药结核病(MDR-TB)和非结核分支杆菌病(NTM)急剧增多和广泛传播扩散。MDR-TB病治疗依靠结核杆菌的耐药性检测，尽早诊断和获得结核杆菌耐药性资料，制定有针对性的综合性治疗方案(包括新药)，是控制结核病亟待解决的任务之一。因此，结核菌培养基的使用非常重要。

现有技术的结核菌培养基存在以下主要不足：

1、细菌培养、鉴定时间长

长期以来采用的结核菌涂片抗酸染色阳性率低。而传统的结核菌培养、菌种鉴定和药敏试验繁琐费时(一般需3～4个月)，已远远不能满足临床的需要。如传统的L-J氏培养基，初生长期是20天，菌落形成期需22～30天。

2、菌种不能长期保存

结核分支杆菌的生存主要依靠培养基的各种营养物质，培养基质量的优劣直接关系到细菌寿命的长短、生长的状况和是否产生变异。一般培养基常温下保存细菌的时间仅为1年，到期后必须重新转种，带来大量工作的同时，多次转种不同质量的培养基，也可使细菌产生变异。因此，寻找结核分支杆菌长期保存方法是十分重要的课题。现有技术的培养基不能使结核菌长期存活，给研究工作带来了很多困难。

3、药敏培养时间长，测试的药物种类少

在结核病的治疗中，需要及时对抗药物的耐药情况做出正确的判断，正确指导临床医师治疗用药。结核菌药敏培养常用的苏通氏培养基不仅培养时间长，30天才能报告结果，且只能做四种药物试验。配制培养基时使用三角烧瓶分装，繁琐且占用空间较大。1997年，WHO已将二线药物纳入治疗结核病的范围，尤其是近两年，有更多的新药应用于临床，仅仅做4项药敏实验，远远不能满足临床的需要。而且，苏通氏培养基是一种液体培养基，生长出的菌落悬浮在液体中，不容易观察。

4、需要用新鲜鸡卵液为主要营养来源

传统L-J氏培养基依赖新鲜鸡卵液为主要营养来源。不仅培养时间长，而且鲜鸡蛋不能高温消毒，只能用巴氏消毒法。而且培养基呈混浊状，难以观察结核菌的初生长情况。

要取得结核病的有效控制，关键是争取时间，快速进行结核杆菌(结核菌)培养，菌型鉴定，才能及时对耐药情况做出正确的判断，采用有效的、针对性强的用药方案，以及筛选新的抗结核菌药物。因此，需要有能够快速培养、并能够长期保存结核杆菌的培养基，以便快速进行结核菌培养和药敏研究，从而达到快速分型、诊断，快速准确治疗，缩短治疗时间，提高治愈率的目的，而且可为科研工作长期保存结核杆菌。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术上述不足，提供一种可快速进行结核与非结核分支杆菌培养、鉴定，并可进行多种药物敏感实验的培养基；本发明的另一目的是提供可长期保存结核与非结核分支杆菌的保养液。

本发明提供的快速结核分支杆菌培养基的配方如下(以配制1000ml培养基为例)：

胰蛋白胨                5.5g～8.0g

葡萄酸钠                4.0g～5.0g

盐酸吡咯醇              0.1g～0.2g

2％孔雀绿水溶液         15～20ml

甘油                    120～140ml

琼脂                    15～20g

小牛血清                100～150ml

蒸馏水                  加至1000ml

上述培养基配方中还可包括有以下一种或多种成分：

柠檬酸三钠                    4～5g

柠檬酸铁铵                    0.3g～0.5g

尿嘧啶                        1～2g

硫酸镁                        0.5g～1.5g

马铃薯粉                      15～20g

上述马铃薯粉，也可改用新鲜马铃薯代替，可降低成本。

本发明提供的快速结核分支杆菌培养基还可以含有抗生素类成份，如可选自多粘菌素B、两性霉素B、萘啶酸、甲氧卡啶、阿莫西林等。

本发明以上所述的各种培养所需营养物质，均可通过市售等方式购到。

制作方法是：先将蒸馏水与甘油混合后，再分别加入上述配方中除小牛血清外的其它成分，待溶解后调ph值至6.6～6.8，高压灭菌待凉至50-56℃后，加入小牛血清混均，分装后贮存4℃冰箱备用。

本发明的培养基的使用范围及效果如下：

1、结核菌快速培养

所述快速结核分支杆菌培养基可用于快速培养结核与非结核分支杆菌。

实验证明，结核菌在该培养基的初生长期是9天，菌落形成期是12～15天。而L-J氏传统培养初生长期是20天，菌落形成期是22～30天。本发明的快速结核分支杆菌培养基缩短了一半以上的培养时间。

2、结核菌快速鉴别培养

将前述快速结核分支杆菌培养基中加入其它成分，用于快速鉴别。如加入PNB(对硝基苯甲酸)或TCH(噻吩-2-羧酸肼)，可主要用于结核菌与非结核分支杆菌；结核菌与牛分支杆菌的鉴别。

3、多种抗结核菌药物快速药敏试验

将前述快速结核分支杆菌培养基中分别加入各种抗结核菌的药物，可成为快速结核菌药敏培养基，进行快速抗结核药物敏感试验，用于结核菌药物的筛选和临床用药指导。

所述抗结核菌的药物既包括所有已知抗结核药物的单药，如异烟阱(INH)；利福平(RFP)；链霉素(SM)；吡嗪酰胺(PZA)；乙胺丁醇(EBM)；对氨水杨酸钠(PAS)；卡那霉素(KM)；力克肺疾(D)；利福喷丁(RFT)；氧氟沙星(OLX)；利复星(V)；费安(FI)；利福布丁(RBU)；利福霉素(RS)；阿米卡星(AMK)；氟罗沙星(FL)；硫酸卷曲霉素(CPM)；环丝(CS)；硫酸依替米星(PAE)；氟罗沙星(FL)等单药。

所述抗结核菌的药物也包括两种或两种以上药物，即也可对复方药物进行药敏试验。复方药物如RFP和INH；SM、RFP和INH；EBM、RFP和INH的组合等多种。

用本发明的培养基同时可进行20～30种受试单药或复方药物的药敏试验。每种药物可进行两种浓度试验。使用方法：取前处理后标本接种于快速结核分支杆菌培养基斜面上，每份标本接种2支培养基，转种完毕，置37℃孵箱内横放24小时后，再竖直培养。实验方法是：将待试验的各种药物分别溶解后，加上述基础液混均，低压灭菌，分装在试管中。

实验证实，不同浓度快速药敏试验培养基，使药敏试验比传统苏通式培养基药敏试验提前10天，能及时对耐药情况做出正确的判断，正确指导临床医师治疗用药。此类培养基的特点是快速、准确，与传统的常规药敏试验结果吻合一致，操作方便，不需要任何特殊仪器。

4、结核菌长期保存

将前述快速结核分支杆菌培养基中加入硫酸铵0.3～0.6g，麸氨酸钠0.3～0.6g，葡萄糖0.6～1.4g，可用于结核菌长期保存。

把在生长旺盛期的结核分支杆菌接种在此培养基中，-20℃冰冻保存。每5年取出复苏，转种于培养基中，观察其生长情况，经生化反应表明无明显变化即可继续保存。

实验证明在本发明上述提供的结核合成长期保存液的组方的培养基，与美国7H10培养液和传统L-J固体培养液进行5年的比较，优胜于后两者。

本发明提供的快速结核分支杆菌培养基的主要优点如下：

1、结核菌培养、菌种鉴定时间短

2、能长期保存细菌

可对临床培养出来的成千上万种耐药结核菌和非结核分支杆菌进行长期保存。

3、药敏培养时间短，药物种类多

不同浓度快速药敏试验培养基，使药敏试验比改良罗氏药敏培养基提前20天，比传统苏通式培养基多做16种药敏。结核病快速药敏培养基能及时对耐药情况做出正确的判断，正确指导临床医师治疗用药。此类培养基的特点是快速、准确，与传统的常规药敏试验结果吻合一致，操作方便，不需要任何特殊仪器。

4、不依赖新鲜鸡卵液为主要营养来源

可用多种更方便的原料作为替代营养来源。在本发明中，葡萄糖酸钠、丙酮酸钠、盐酸吡咯醇、胰蛋白胨、甘油、小牛血清等营养物质均可成为结核菌和非结核分支杆菌的培养中营养来源的配置原料。

5、培养结果容易观察，使用方便

本发明的培养基为呈半透明状的固体，种植的菌落易于观察，使用非常方便。

6、应用范围广泛

本发明涉及到微生物领域中细菌范围内抗酸染色阳性的一类细菌，包括结核菌和非结核分支杆菌(百余种菌)的增菌、分离计数、菌型鉴定、药敏试验的培养基。

本发明的培养基可用于研究结核与非结核分支杆菌营养生理、代谢途径、生化特征、鉴定分离、遗传变异、空气采样、耐药机制等，为传染病学的发展与临床应用及结核病的防治创造了条件。

具体实施方式：

实施例1快速结核分支杆菌培养基的配制(一)

配方：

胰蛋白胨           6g                   柠檬酸三钠        4g

葡萄酸钠           4.5g                 柠檬酸铁铵        0.4g

盐酸吡咯醇         0.1g                 尿嘧啶            1.5g

2％孔雀绿水溶液    18ml                 硫酸镁            1.0g

甘油               130ml                马铃薯粉          17g

琼脂               18g                  多粘菌素B         1.5ml

小牛血清           120ml                蒸馏水            880ml

培养基制作方法：先将蒸馏水与甘油混合后，再依次加入各成分，待溶解后以10％HCl调ph值至6.6～6.8，高压0.7×105pa，20min灭菌。待冷却至56℃。，加入已除菌小牛血清，混均，分装在分装18mm～150mm试管，每管7ml，放置斜面高度占试管2/3，37℃无菌测定24h后，贮存4℃冰箱备用，可用半年。

实施例2快速结核分支杆菌培养基的配制(二)

胰蛋白胨           7g                   甘油              140ml

葡萄酸钠           5g                   琼脂              17g

盐酸吡咯醇         0.1g                 小牛血清          130ml

2％孔雀绿水溶液    18ml                 蒸馏水            880ml

配制方法如实施例1。

实施例3快速结核分支杆菌培养基的配制(三)

胰蛋白胨           7g                   小牛血清          130ml

葡萄酸钠           4.5g                 柠檬酸三钠        4g

盐酸吡咯醇         0.1g                 柠檬酸铁铵        0.4g

2％孔雀绿水溶液    18ml                 硫酸镁            0.5g

甘油               140ml                萘啶酸            1.0ml

琼脂               17g                  蒸馏水            880ml

配制方法如实施例1。

实施例4快速结核分支杆菌培养基培养结果试验

一、实验材料：

受试培养基为实施例1的培养基，对照培养基为传统L-J鸡蛋培养基。

结核菌样品来自309医院临床。

二、实验方法：

取前处理后标本0.1ml，徐徐均匀地自下而上接种于快速结核分支杆菌培养基斜面上，每份标本接种2支培养基，转种完毕，置37℃孵箱内横放24小时后，再竖直培养。接种后于第3日和第7日观察结核菌的生长情况，此后，每周观察1次菌落生长情况，阳性生长斜面经涂片染色验证后随时报告。

同时用L-J鸡蛋培养基按上述使用方法进行培养，作为对照。

三、实验结果判定标准：

L-J鸡蛋培养基若至第8周仍无菌落生长方可报告阴性结果；快速结核菌至第5周仍无菌落生长方可报告阴性结果。

四、实验结果：

结核菌在受试培养基的初生长期是9天，菌落形成期是12～15天。而在对照物L-J氏培养基的初生长期是20天，菌落形成期是22～30天。

五、结论：

结核菌在受试培养基的生长显著快于对照培养基。

实施例5快速结核菌鉴别培养基(一)

将对硝基苯甲酸溶解在二甲基甲酰胺中，终浓度为0.5mg/ml加入实施例2所示的快速结核分支杆菌培养基中，混均，低压灭菌，分装在试管中。

该培养基主要用于结核菌与非结核分支杆菌；结核菌与牛分支杆菌的鉴别。

实施例6快速结核菌鉴别培养基(二)

将噻吩-2-羧酸肼溶解在二甲基甲酰胺中，终浓度为5μg/ml，加入实施例1所示的快速结核分支杆菌培养基中，混均，低压灭菌，分装在试管中。

实施例7快速结核菌鉴别培养基结核菌鉴别实验

一、实验材料：

受试培养基：为实施例5、实施例6的两种培养基(即加入对硝基苯甲酸PNB和噻吩-2-羧酸肼的培养基TCH，分别用PNB、TCH表示)；

对照培养基：为传统L-J鸡蛋培养基。

结核菌样品：含结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核性分枝杆菌，来自309医院临床。

二、实验方法：

将临床分离菌株制成菌悬液，取0.1ml，自下而上地徐徐均匀接种于快速结核菌鉴别培养基斜面上，置37℃孵箱内横放24小时后，再竖直培养，观察细菌在培养基上的生长情况。

三、实验结果

在两种受试鉴别培养基的初生长期和菌落形成期与实施例4的结果相同，比传统鉴别培养基提前15天报告结果。对三种菌的鉴别结果见表1。

      表1两种受试鉴别培养基对三种菌的鉴别结果

	PNB	TCH	L-J氏培养基
				结核分枝杆菌	-	+	+
牛分枝杆菌	-	-	+
				非结核性分枝杆菌	+	+	+

四、结论

实施例5、实施例6的两种培养基可用于结核菌与非结核分支杆菌；结核菌与牛分支杆菌的鉴别。

实施例8快速结核菌药敏试验(一)单药试验

一、试验材料

试验药物见表2，培养基为实施例1所示。

                   表2药敏试验的药物及浓度

序号	药名	英文缩写	药物浓度(mg/L)
					高浓度	低浓度
			1	异烟阱			INH	100	10
2	利福平	RFP			250	50
			3	链霉素			SM	100	10
4	吡嗪酰胺	PZA			250	50
			5	乙胺丁醇			EMB	50	5
6	对氨水杨酸钠	PAS			10	1

7	卡那霉素	KM	100	10
					8	力克肺疾	D	10	1
9	利福喷丁	RFT	250	50
					10	氧氟沙星	OLX	50	5
11	利复星	V	5	0.5
					12	司帕沙星	SPX	1.0	0.1
13	利福布丁	RBU	250	50
					14	利福霉素	RS	250	50
15	环丝	CS	40	10
					16	丙硫异烟胺	1321Th	100	25
17	阿米卡星	AMK	10	1
					18	氟罗沙星	FL	10	1
19	硫酸依替米星	PAE	10	1
					20	硫酸卷曲霉素	CPM	100	10

二、试验方法：

进行了300例结核病人20种药物高、低浓度耐药情况分析，对药敏培养基和改良L-J氏药敏培养基进行比较。

取20只三角烧瓶，标明编号，将下表中各种药物按表中所示浓度用蒸馏水配制后，分别加入实施例1所示的快速结核分支杆菌培养基中混均，低压灭菌，分装在试管中。将临床分离菌株制成菌悬液，配成接种量10^-3mg，取0.1ml，徐徐均匀地自下而上的接种于快速结核菌鉴别培养基斜面上，置37℃孵箱内横放24小时后，再竖直培养，观察细菌在培养基上的生长情况，2～3周报告结果。

三、试验结果判定标准：

(-)培养基斜面无菌落生长；

(+)菌落数约占培养基斜面面积1/4；

(++)菌落数约占培养基斜面面积1/2；

(+++)菌落数约占培养基斜面面积3/4；

(++++)菌落呈菌苔样生长。

报告菌落数：当含药培养基菌落数在20个以下时，报告菌落的个数。

四、试验结果

以高浓度耐药为例，见二种试验方法比较表3。从表中可以看出二种方法比较耐药情况相似P＞0.05。在药敏试验中，300例结核病人对各类药敏耐药情况皆不相同。以利福平(RFP)，链霉素(SM)，异烟阱(INH)耐药为多见，以组合类药物如KM、RFT、RS等耐药率为低。药敏培养基14天报告结果，改良L-J氏药敏培养基28天报告结果，前者比后者提前14天。

                            表3二种试验方法比较表

序号	药物	快速药敏培养基耐药率(％)	改良L-J氏药敏培养基耐药率(％)
				1	INH	48.6％(146/300)	48％(144/300)
2	SM	62.6％(188/300)	57.3％(172/300)
				3	PAS	52.6％(158/300)	50.6％(152/300)
4	EBM	52％(156/300)	50.3％(151/300)
				5	RFP	59.3％(178/300)	58％(174/300)
6	RFT	20％(6/30)	20％(60/30)
				7	PZA	51.3％(154/300)	52％(156/300)
8	KM	24％(72/300)	23％(70/300)
				9	OLX	45.6％(137/300)	44.6％(134/300)
10	D	37.0％(111/300)	36.6％(110/300)
				11	RS	30％(9/30)	29.3％(8/30)
12	FI2	23％(7/30)	23.3％(7/30)
				13	RBV	44.4％(28/63)	44.4％(28/63)
14	RS	32％(8/25)	32％(8/25)
				15	V	45.3％(136/300)	43％(129/300)
16	FI	27.7％(5/18)	22.2％(4/18)
				17	CPM	25％(2/8)	25％(2/8)
18	J	50％(6/12)	50％(6/12)
				19	CS	23.3％(7/30)	20％(6/30)
20	PAE	25％(2/10)	25％(2/10)

实施例9快速结核菌药敏试验(二)复方药试验

试验药物为RFP、INH、SM、EBM单药，以及二种或三种药的复方，见下表：

    表4药敏试验药物配比

	药物及浓度的配比
		复方一	RFP∶INH＝5∶2
复方二	SM∶RF∶INH＝2∶4∶1
		复方三	EBM∶RFP∶INH＝1∶3∶2

注：表中药物名称为：RFP-利福平，INH-异烟阱，SM-链霉素，EMB-乙胺丁醇

试验方法，同实施例8。

试验结果：二种或三种药的复方比单药耐药率明显降低。

实施例10菌种长期保养

将实施例1所示的快速结核分支杆菌培养基各成分(除小牛血清外)中加入硫酸铵0.5g，麸氨酸钠盐0.5g，葡萄糖1.0g。待溶解后以10％HCl调ph值至6.6，高压0.7×105pa，20min灭菌，待冷却至50℃，加入已除菌小牛血清100ml，混合后分装小瓶备用。

接种：把在生长旺盛期的结核分支杆菌或其他临床培养出来的各种结核耐药菌、分支杆菌和各种分支杆菌耐药菌，分别接种在小瓶中，-20℃冰冻保存。5年后取出一瓶，复苏后再转种于此培养基中，观察其菌落生长情况，并进行抗酸染色、菌落计数和各种生化反应，如硝酸盐还原实验、尿素酶实验等。

保养液对比实验：确诊为结核病的临床分离株300例，以10^-2g/L结核杆菌悬液0.5ml接种于(a)结核杆菌长期菌种保养液(b)7H10培养液(美国)(c)L-J固体培养液中，每种培养液接种3瓶，-20℃冰柜中保存。每年取出1瓶复苏后进行实验分析，连续观察3年。实验分析项目包括：结核杆菌活动率、菌落计数、抗酸染色、培养液外观变化、生化指标(I.硝酸盐还原实验II.尿素酶实验)。

在结核分支杆菌长期5年保存中，3种培养液外观变化差异显著(见表5)。a长期菌种合成保养液外观变化不大。b.培养液冻后，部分水分脱出，培养基变软呈蜂窝状℃。培养液出现32％干裂现象。在结核分支杆菌长期5年保存后c.培养液只有40％的完好率。

在结核分支杆菌长期5年保存中的菌活动率中，3种培养液结核杆菌活动率均有下降，其中，b.培养液下降速度最快，5年后仅占30％。抗酸染色、菌落计数在第4、5年变化明显，生化指标变化是受保养液外观变化的影响。

                     表5结核菌接种于不同保养液中的对比实验

年份	培养基种类	外观完好率	TB菌活动率	抗酸染色	菌落计数	生化指标
								I	II
						1999	a			100％	95％	++++	++++	100％	100％
b	60％	92％	++++	++++	50％			70％
							c		78％	90％	++++	++++	88％	90％
2000	a	100％	88％	++++	++++			90％							88％
						b	48％		82％	++++	+++	40％	60％
	c	65％	75％	+++	+++			75％						80％
						2001	a		100％	80％	++++	+++	80％		85％
b	24％	72％	+++	+++	34％			42％
							c		58％	60％	+++	+++	68％	60％
2002	a	100％	70％	++++	++++			75％							75％
						b	15％		65％	++	++	15％	25％
	c	45％	60％	+++	+++			55％						50％
						2003	a		90％	65％	+++	+++	60％		65％
b	5％	30％	++	++	5％			13％
							c		40％	50％	++	++	50％	45％

Claims (11)

1.一种结核分支杆菌培养基，配制1000ml培养基的配方如下：

胰蛋白胨               5.5g～8.0g

葡萄糖酸钠             4.0g～5.0g

盐酸吡咯醇             0.1g～0.2g

2％孔雀绿水溶液        15～20ml

甘油                   120～140ml

琼脂                   15～20g

小牛血清               100～150ml

蒸馏水                 加至1000ml。

2.权利要求1所述的结核分支杆菌培养基，还包括以下一种或多种成分：

柠檬酸三钠                  4～5g

柠檬酸铁铵                  0.3g～0.5g

尿嘧啶                      1～2g

硫酸镁                      0.5g～1.5g

马铃薯粉                    15～20g

抗生素                      适量。

3.权利要求1或2所述的结核分支杆菌培养基用于快速培养结核与非结核分支杆菌的用途。

4.权利要求1或2所述的结核分支杆菌培养基进行多种药物结核与非结核分支杆菌快速药敏试验的用途。

5.权利要求4所述的结核分支杆菌培养基进行多种药物快速药敏试验的用途，所述药物是异烟阱、利福平、链霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、对氨水杨酸钠、卡那霉素、力克肺疾、利福喷丁、氧氟沙星、利复星、费安、利福布丁、利福霉素、阿米卡星、氟罗沙星、硫酸卷曲霉素、环丝、硫酸依替米星、氟罗沙星单药，也可以是上述药物的中2～3种药物的组合。

6.权利要求4所述的结核分支杆菌培养基进行多种药物快速药敏试验的用途，所述药敏试验同时可进行20～30种单药或复方药物。

7.权利要求1或2所述的结核分支杆菌培养基，含有对硝基苯甲酸或噻吩-2-羧酸肼。

8.权利要求7所述的结核分支杆菌培养基用于鉴别结核菌与非结核分支杆菌，或鉴别结核菌与牛分支杆菌的用途。

9.权利要求1或2所述的结核分支杆菌培养基，含有硫酸铵0.3～0.6g，麸氨酸钠0.3～0.6g，葡萄糖0.6～1.4g。

10.权利要求9所述的结核分支杆菌培养基用于结核菌长期保存的用途。