CN102827802B - 培养基添加剂、包含所述添加剂的培养基、及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种添加剂、包括所述添加剂的培养基,所述添加剂包括少一种磷脂酰胆碱和/或其衍生物、或至少一种多肽、或至少一种脂肪酸、或能够提供二价钙离子的物质,或上述物质的任意组合。本方面所述添加剂和培养基可缩短培养时间,达到相同细菌浓度所需时间更少,灵敏度更高,用更少的接种量即可获得培养出细菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基添加剂、以及包含所述添加剂的培养基,尤其涉及一种促进放线菌快速增殖、提高培养阳性率的培养基、用于所述培养基的添加剂、及其应用。
背景技术
随着微生物在医药、环保、农业、生物能源等方面得到广泛的研究和应用,以及人们对微生物资源重要性的认识,细菌等微生物的培养技术受到了广泛的重视。细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术,即将细菌接种于培养基上,使其生长繁殖,然后用于研究、鉴定和应用。细菌培养在感染性疾病诊断方面有着重要作用。
结核分枝杆菌(M.tuberculosis),俗称结核菌,是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官,但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道,每年约有800万新病例发生,至少有300万人死于该病。中国每年死于结核病的人约25万之多,是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此,结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题,并成为某些发展中国家和地区,特别是艾滋病高发区人群的首要死因。
目前结核病诊断的金标准仍然是结核菌涂片和培养。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高,影响营养物质的吸收,故生长缓慢。在一般培养基中每分裂1代需时18~24小时,营养丰富时仍需5小时。所以要在固体培养基上形成菌落至少需要2-4周。初次分离需要营养丰富的培养基,常用的培养基包括罗氏培养基(Lowenstein-Jensen)、米氏培养基(Middlebrook7H9,7H10,7H11,7H12)、苏通培养基(Sauton’s)等。菌落呈颗粒、结节或花菜状,乳白色或米黄色,不透明。在液体培养基中可能由于接触营养面大,细菌生长较为迅速。一般也需要10-20天才可生长。
慢速生长分枝杆菌的培养及鉴定需要如此长的时间,严重影响病人的诊断和医治,所以增加细菌繁殖速度,缩短细菌培养时间以及提高培养所需接种量是一直是微生物学家研究的目标。常用的分枝杆菌培养基一般需要加入促细菌生长物质。促细菌生长物质是一类通过直接或间接作用于细菌生长代谢过程而加速细菌生长繁殖速度、或为细菌生长繁殖所必需的物质的总称,例如,BD公司的OADC生长增加剂(Bovine Albumin Fraction V2.50g,Dextrose1.00g,Catalase0.002g,Oleic acid0.025g,Sodium chloride0.425g,Distilled water50mL)能够增快分枝杆菌培养的速度。
在微生物检验方面,它可以加快传统培养对细菌的分离鉴定,并使样品中菌数快速达到基因探针、ELISA、单抗等现代技术的需要,缩短检测时间;在生物工程方面,可提高载体菌的生长繁殖速度,增加表达产物的产量;在工业方面,可用于双歧杆菌、光合细菌等经济菌类的大量生产以满足各种需要。例如专利CN1285723C公开了使用电气石或电气石处理水作为强化培养物,可明显促进细菌生长,缩短了培养时间。
鉴于促进细菌生长物质在细菌检验、生物工程、工业应用等方面的重要价值,在此方面进行研究仍然是人们重点关注的内容。
发明内容
本发明提供了一种用于细菌培养基的添加剂、包括所述添加剂的培养基、及其应用。
本发明第一个方面是提供一种用于细菌培养基的添加剂,包括至少一种磷脂酰胆碱和/或其衍生物、或至少一种多肽、或至少一种脂肪酸、或能够提供二价钙离子的物质,或上述物质的任意组合。
其中,所述的磷脂酰胆碱和/或其衍生物如卵磷脂、多烯磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰胆碱、卤代磷脂酰胆碱、上述物质的盐和/或酯中的任意一种或几种的混合物;具体实例包括:D(-)3-磷酸甘油酸、溴化磷脂酰胆碱、氯化磷脂酰胆碱、L-α-磷脂酰胆碱-β-双花生(L-α-Phosphatidylcholine,diarachidoyl,1,2-二花生酰基卵磷脂)、L-α-磷脂酰胆碱-β-花生四烯酰-γ-硬脂酰、L-α-磷脂酰-L-丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二乙酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二棕榈酰-3-磷脂酰胆碱甘油酯、1-豆蔻酰基-2-羟基磷脂酰胆碱、L-α-癸酰磷脂酰胆碱、L-α-溶血磷脂、1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、L-α-磷脂酰胆碱乙醇胺、L-α-二硬脂磷脂酰胆碱乙醇胺、1,2-十四酰基磷脂酰乙醇胺、L-α-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇,所述盐可以是钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、镁盐等,如磷脂酰胆碱钠盐、磷脂酰胆碱钾盐、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油钠盐、二棕榈酰磷脂酰甘油钠盐、二油酰磷脂酰甘油钠盐;可以是其中的任意一种或几种的混合物。更优选为L-α-磷脂酰胆碱-β-双花生、L-α-磷脂酰胆碱-β-花生四烯酰-γ-硬脂酰、卤代磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰胆碱中的任意一种或几种的混合物。
其中,所述多肽优选为≥8个氨基酸长度,更优选为10~50个氨基酸长度,如来自Rv1174c的肽段,具体举例如SEQ ID No.1~4。
其中,所述脂肪酸优选为C3~C30的脂肪酸,更优选为C5~C20的脂肪酸,如C6、C8、C9、C17、C18、C19脂肪酸(如正己酸、正辛酸、正壬酸、正十七酸、正18酸、正十九酸)中的任意一种或几种;可以是一元羧酸或多元羧酸,如二元羧酸、三元羧酸、四元羧酸、五元羧酸等。
其中,所述能够提供二价钙离子的物质如无机酸钙、有机酸钙、有机钙络合物、氢氧化钙,或者通过反应生成钙离子的物质,如碳酸钙与盐酸混合物,可以是其中的任意一种或几种的混合物;具体举例包括:氯化钙、硝酸钙、乳酸钙、乙酸钙、柠檬酸钙、抗坏血酸钙、磷酸钙、磷酸二氢钙、碳酸钙、碳酸氢钙等,可以是其中的任意一种或几种的混合物。
根据本发明所述添加剂的一种优选实施方式,所述添加剂包括所述磷脂酰胆碱和/或其衍生物、多肽、脂肪酸和二价钙离子,根据需要还可以加入溶剂、和可用的其它促细菌生长物质。
根据本发明所述添加剂的更优选实施方式,所述添加剂由所述磷脂酰胆碱和/或其衍生物、多肽、脂肪酸和提供二价钙离子的物质组成。
本发明所述添加剂各组分用量可根据所用培养基和细菌的重量、用量等进行调整,在本发明一种优选实施例中,每0.1~1mol二价钙离子,用磷脂酰胆碱和/或其衍生物1~100mg、和/或多肽0.1~5mg、和/或脂肪酸1~500mg,更优选为每0.1~1mol二价钙离子,用磷脂酰胆碱和/或其衍生物1~100mg、和/或多肽0.3~5mg、和/或脂肪酸3~500mg。
在本发明所述添加剂的另一种优选实施例中,所述添加剂包括磷脂酰胆碱和/或其衍生物、多肽;磷脂酰胆碱和/或其衍生物、多肽之间的重量比优选为1~100mg:0.1~5mg,更优选为1~100mg:0.3~5mg。
在本发明所述添加剂的另一种优选实施例中,所述添加剂包括磷脂酰胆碱和/或其衍生物、脂肪酸;磷脂酰胆碱和/或其衍生物、脂肪酸之间的重量比优选为1~100mg:1~500mg,更优选为1~100mg:1~500mg。
在本发明所述添加剂的另一种优选实施例中,所述添加剂包括多肽、脂肪酸;多肽、脂肪酸之间的重量比优选为0.1~5mg:1~500mg,更优选为0.3~5mg:1~500mg。
在本发明所述添加剂的另一种优选实施例中,所述添加剂包括磷脂酰胆碱和/或其衍生物、多肽、脂肪酸;磷脂酰胆碱和/或其衍生物、多肽、脂肪酸之间的重量比优选为1~100mg:0.1~5mg:1~500mg,更优选为1~100mg:0.3~5mg:1~500mg。
本发明的第二个方面是提供一种包括上述添加剂的培养基,还包括常规培养基,所述添加剂包括至少一种磷脂酰胆碱和/或其衍生物、或至少一种多肽、或至少一种脂肪酸、或能够提供二价钙离子的物质,或上述物质的任意组合。
其中,所述磷脂酰胆碱和/或其衍生物、多肽、脂肪酸、能够提供二价钙离子的物质如均为上述内容中所定义的物质。
在本发明上述培养基的一种优选实施例中,所述磷脂酰胆碱和/或其衍生物在培养基中的浓度优选为1~100μg/ml,如1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml。
在本发明上述培养基的一种优选实施例中,所述多肽在培养基中的浓度优选为0.1~5μg/ml,如0.3μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml。
在本发明上述培养基的一种优选实施例中,所述脂肪酸在培养基中的浓度优选为1~5μg/ml,如2μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、3.9μg/ml、4.2μg/ml、4.5μg/ml、4.8μg/ml。
在本发明上述培养基的一种优选实施例中,所述二价钙离子在培养基中的浓度优选为0.1~5mM,如0.2、0.3、0.5、0.6、1、2、3、3.5、4.2、4.6mM。
本发明上述的常规培养基可以是固体培养基、液体培养基、固液双相培养基、半流体培养基等,如米氏培养基、苏通(Sauton’s)培养基、罗氏培养基、哮喘培养基、血清酸性培养基、或上述培养基基础上的改良培养基。具体实例如米氏培养基7H9、米氏培养基7H10、米氏培养基7H11等。可以是上述培养基中的任意一种或几种的混合物。
本发明所述培养基的一种优选实施例中,所述培养基还包括至少一种溶剂,如水。
本发明上述的培养基中,还可以包括至少一种碳源和/或氮源。
本发明第三个方面是提供一种上述培养基的制备方法,将上述任意添加剂加入到常规培养基中。所述常规培养基和添加剂如上述内容中所定义。
本发明第四个方面是提供一种培养细菌的方法,培养细菌所用的培养基如上述内容中所定义。
本发明上述内容中,所述细菌优选为分枝杆菌属(Mycobacterium),如结核分枝杆菌(包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌)、麻风分枝杆菌、以及非结核分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌)等。
本发明提供的添加剂、包括所述添加剂的培养基,可明显促进包括耐药菌、和抗菌药物处理过菌株在内的分枝杆菌的生长,可有效改良现有培养基,缩短培养时间,达到相同细菌浓度所需时间更少,灵敏度更高,用更少的接种量即可获得培养出细菌,在微生物检测(如药敏检测、疾病诊断、药物筛选)、生物工程和微生物的工业应用方面均具有重要的意义。
附图说明
图1为BACTEC系统检测本发明添加剂各种用量对结核分枝杆菌促生长效果
图2为MGTI系统检测本发明添加剂各种用量对不同结核分枝杆菌促生长效果;
图3为本发明添加剂各种用量促进老的H37Rv生长效果;
图4为本发明添加剂各种用量促进异烟肼(INH)处理过的H37Rv生长效果;
图5为本发明添加剂各种用量促进耐药菌株生长效果。
具体实施方式
实施例1
促进细菌生长物质:
PHO-H:I-α-磷脂酰胆碱-β-双花生(c20:0)
PHO-1:氯化磷脂酰胆碱phosphorylcholine chloride
PHO-C:L-α-磷脂酰胆碱-β-花生四烯酰-γ-硬脂酰,I-α-phosphatidylcholine-β-arachidonoyl-γ-stearoyl(C20:4,[cis]-5,8,11,14/C18:0)
PHO-Q:L-α-二酰基磷脂酰胆碱,L-α-phosphatidylcholine,dicaproyl(C6:0)
PHO-P:L-α-磷脂酰-L-丝氨酸,L-α-phosphatidyl-L-serine
用7H9液体培养基将生长2-3周龄的结核分枝杆菌H37Rv菌株进行梯度稀释,分别为1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000、1:10000000、1:100000000倍稀释。在培养基中加入5~100μg/ml的上述磷脂酰胆碱类促进细菌生长物质,结果显示,PHO-H、PHO-1、PHO-C、PHO-Q对年轻的H37Ra结核菌具有显著的促生长效果,并且效果好于PHO-P;上述磷脂酰胆碱类促进细菌生长物质的促进H37Rv菌株生长的效果明显好于L-α-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(c16:0)、L-α-溶血磷脂、D(-)3-磷酸甘油酸等。
利用BACTEC系统,评估了一些潜在的促生长物质对结核分枝杆菌的生长的促进作用。BACTEC系统得到的检测结果与使用7H9液体培养基得到的结果有良好的相关性,其结果如下:
表1,各组GI值
第3天 | 第6天 | 第9天 | 第11天 | 第13天 | |
对照 | 2 | 23 | 41 | 72 | 170 |
PHO-1 | 3 | 56 | 92 | 162 | 313 |
PHO-Q | 1 | 29 | 103 | 174 | 377 |
PHO-H | 3 | 40 | 76 | 131 | 276 |
PHO-C | 0 | 12 | 77 | 192 | 452 |
使用BACTEC系统评估上述物质对结核分枝杆菌H37Rv生长的促进作用。BACTEC小瓶中接种104细菌/ml,随后加入1~2.5μg/ml不同的生长增强物质。在不同的时间点检测结核分枝杆菌的生长情况,按照下表所述,以Growth Index(GI)值的形式表示,PHO-1、PHO-Q、PHO-H和PHO-C(均为2.5μg/ml)对结核分枝杆菌H37Rv的生长有不同程度的促进作用,加入增强物质的GI值明显高于不加生长增强物质的对照组,结果见表1。
实施例2
促进细菌生长物质:
44-P2(SEQ ID No.1):NH2-LNATDPGAAAQFNASPVAQSYLRN-OH
44-P3(SEQ ID No.2):NH2-LRNFLAAPPPQRAAMAAQLQAV-OH
P4-1(SEQ ID No.3):NH2-AQLQAVPGAAQYI-OH
P4-2(SEQ ID No.4):NH2-GLVESVAGSCNNY-OH
以7H9液体培养基将H37Ra菌液进行10倍梯度稀释(稀释度10-1~10-8)。将上述肽段加入到稀释好的菌液中,至终浓度5μg/ml;37℃孵育4周。P4-1、P4-2、44-P2和44-P3肽段对结核分枝杆菌的生长具有促进作用。
将上述肽段加入7H11琼脂平板,并配制成含有不同浓度肽段的培养基,结果发现0.3~2.5μg/ml浓度的肽段能促进结核杆菌的生长。
使用BACTEC系统评估上述物质对结核分枝杆菌H37Rv生长的促进作用。BACTEC小瓶中接种104细菌/ml,随后加入1~2.5μg/ml不同的生长增强物质。在不同的时间点检测结核分枝杆菌的生长情况,按照下表所述,以Growth Index(GI)值的形式表示,多肽P4-1和44-P3(1μg/ml)对结核分枝杆菌H37Rv的生长有不同程度的促进作用,加入增强物质的GI值高于不加生长增强物质的对照组。结果见表2。
表2,各组GI值
第3天 | 第6天 | 第9天 | 第11天 | 第13天 | |
对照 | 2 | 23 | 41 | 72 | 170 |
P4-1 | 2 | 29 | 61 | 122 | 279 |
44-P3 | 1 | 29 | 72 | 136 | 314 |
实施例3
促进细菌生长物质:
C17:正十七酸
C18:正十八酸
C19:正十九酸
C20:正二十酸
利用MTT比色法,我们评估了各种脂肪酸对Sauton’s培养基中H37Ra生长情况的影响。浓度为3.9~125μg/ml的C18硬脂酸对Ra生长的刺激作用最佳,但是,高浓度的C19(如250-500μg/ml)比C18硬脂酸的刺激作用更好。与其它脂肪酸相比,C19脂肪酸的活性最佳。在一定浓度时,C17具有与C18或C19脂肪酸相似的刺激生长的活性(见下表3)。
表3,各脂肪酸存在下的OD值
此外,结核分枝杆菌H37Ra(2周和2个月)稀释至10-8后,仍可以在含有50μg/ml C19的7H11琼脂糖培养基上生长,而未加C19的对照组,H37Ra生长的最小稀释度为10-7。
实施例4
促进细菌生长物质:
C6:正己酸
C8:正辛酸
C9:正壬酸
利用MTT比色法,我们评估了各种脂肪酸对Sauton’s培养基中H37Ra生长情况的影响。表4中的结果显示,相比于C17~C19脂肪酸,C6、C8和C9脂肪酸具有较弱的刺激活性。
表4,各脂肪酸存在下的OD值
实施例5
0.6mM~5mM的Ca2+对结核分枝杆菌H37Ra在7H9培养基上的生长有明显的促进作用,10-7和10-8稀释度的菌量可以生长,而不加Ca2+的对照组则不能生长。
利用BACTEC系统评估钙离子促进细菌结核分枝杆菌生长作用,结果显示,Ca2+对于7H9培养基中结核分枝杆菌和BACTEC系统中H37Rv的生长均有促进作用。表5和6给出了不同Ca2+浓度下GI值(Growth Index)对比。
表5,10-2菌株稀释度度条件下不同时间GI值
第2天 | 第4天 | 第6天 | 第8天 | 第10天 | |
对照 | 5 | 21 | 105 | 238 | 337 |
0.5mM | 5 | 22 | 142 | 348 | 420 |
2.5mM | 10 | 41 | 230 | 484 | 538 |
表6,10-4菌株稀释度度条件下不同时间GI值
第7天 | 第9天 | 第11天 | 第12天 | 第14天 | 第16天 | 第18天 |
对照 | 1 | 3 | 9 | 11 | 34 | 32 | 60 |
0.5mM | 4 | 10 | 21 | 47 | 130 | 162 | 291 |
2.5mM | 5 | 14 | 32 | 53 | 124 | 121 | 167 |
实施例6
培养基中促进细菌生长物质组分和浓度:
如图1所示,与对照组相比,本发明所述培养基能够使结核分枝杆菌的生长提前至少一天检测到。尤其值得注意的是,最快7天GI值就能超过200,而对照组需要10天;9天后GI>400,对照组需要17天。这些数据说明上述促进细菌生长物质能够明显地促进生长,可以改进现有的分枝杆菌培养基。
MGIT系统检测,如图2所示,与不加入本发明所述添加剂的对照组相比,本发明培养基能够使实验室菌株H37Rv、结核分枝杆菌临床分离株、和老的H37Rv菌株至少提前一天生长。促生长作用最明显的是INH处理的菌株,与对照相比,加入所述促进细菌生长物质能够使H37Rv提前3-4天生长。
实施例7
培养基中促进细菌生长物质组分和浓度:
如图3所示,本发明所述培养基能够促进老化的结核分枝杆菌生长,第一天GI>10,第二天GI>50和GI>100,第3天GI>200。最重要的是,将培养3个月的H37Rv在普通的7H12B培养基中培养时,GI值无法超过400,而加入本发明所述促进细菌生长物质后的培养基在10或11天时可以达到GI>400。
实施例8
培养基中促进细菌生长物质组分和浓度:
如图4所示,本发明所述培养基能够促进药物处理过的结核分枝杆菌生长,异烟肼处理过的H37Rv在普通的7H12B培养基中GI值无法达到100以上,当加入本发明所述添加剂后,细菌可以生长达到GI>200,甚至可以超过400。
本发明所述添加剂和培养基对不仅对药敏菌株有作用,对耐药株也有作用,如图5所示,能够促进耐药株如INH耐药株的生长,对于结核分枝杆菌H37Rv和临床分离株的促进生长作用基本相同。
米氏培养基7H9或7H11等常规培养基中,加入本发明添加剂进行传统药敏检测,发现本发明添加剂的存在对于药敏试验结果没有明显的影响。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 培养基添加剂、包含所述添加剂的培养基、及其应用
<120> 复旦大学附属华山医院
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 1
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1 5 10 15
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<400> 4
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1 5 10
Claims (10)
1.一种用于分枝杆菌培养基的添加剂,其特征在于,包括至少一种多肽,所述的多肽为SEQ ID No.3所示的多肽或SEQ ID No.4所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的添加剂,其特征在于,还包括至少一种磷脂酰胆碱和/或其衍生物、或至少一种脂肪酸、或能够提供二价钙离子的物质,或上述物质的任意组合。
3.根据权利要求2所述的添加剂,其特征在于,所述的磷脂酰胆碱和/或其衍生物选自卵磷脂、多烯磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰胆碱、卤代磷脂酰胆碱、上述物质的盐和/或酯中的任意一种或几种的混合物。
4.根据权利要求2所述的添加剂,其特征在于,每0.1~1mol二价钙离子,用磷脂酰胆碱和/或其衍生物1~100mg、和/或多肽0.1~5mg、和/或脂肪酸1~500mg。
5.一种包括如权利要求1-4中任意一项所述添加剂的培养基。
6.根据权利要求5所述的培养基,其特征在于,所述磷脂酰胆碱和/或其衍生物在培养基中的浓度为1~100μg/ml。
7.根据权利要求5所述的培养基,其特征在于,所述多肽在培养基中的浓度为0.1~5μg/ml。
8.根据权利要求5所述的培养基,其特征在于,所述脂肪酸在培养基中的浓度为1~5μg/ml。
9.根据权利要求5所述的培养基,其特征在于,所述二价钙离子在培养基中的浓度为0.1~5mM。
10.一种使用权利要求6所述培养基培养分枝杆菌的方法。
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- 2012-08-16 CN CN201210297891.2A patent/CN102827802B/zh active Active
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