CN1857315A - 促骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物，该龟板提取物为乙酸乙酯分析纯提取物，将其用乙酸乙酯按10mg/ml的比例溶解，并经0.45μm的滤膜过滤后，在以甲醇∶乙腈∶水＝47.5∶47.5∶5为流动相，波长为254nm，色谱柱为Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，进样量为10uL，流速为1.000ml/min的条件下进行高效液相HPLC检测，在保留时间依次为1.59±0.05min、2.72±0.05min、3.00±0.06min和4.86±0.05min处有吸收峰，吸收峰的相对峰面积依次为1.45％、6.14％、56.31％和31.45％。本发明所述的龟板提取物是由龟板经粉碎，石油醚分析纯回流提取除杂，残渣再用乙酸乙酯分析纯回流提取得到的。本发明所述龟板提取物可制成各种常用的剂型，对促进骨髓间充质干细胞生长具有显著的技术效果。

Description

促骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种中药提取物及其制备方法，具体涉及龟板提取物(Plastrum Testudinis Extract，PTE)及其制备方法。

背景技术

传统医学认为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)的主要功能是参与构成造血干细胞生存和分化的微环境，而近代医学研究发现，它具有向多种细胞系分化的潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞和脂肪细胞等，进而得出MSC扩增数量少而慢是导致人类很多重大疾病(如神经损伤，神经退行性疾病，心脏损伤、骨质疏松、再障等)的主要原因。但是，人的骨髓中的MSC不仅含量极少，而且扩增速度慢，而进行在体或体外移植，存活率又较低。因此，提高骨髓中的MSC含量是困扰广大医务人员的技术难题。

现代中医学研究表明，龟板咸、甘、平，入肾经，滋阴补肾之力强，所以在许多治疗与骨髓中MSC含量水平有关的疾病的传统组方中普遍使用龟板与其它原料药进行配伍。但这些传统药方普遍存在治疗周期长，效果不明显的缺陷，

随着科学技术的发展，中医药领域引入了现代提取制备方法。目前，龟板的提取方法主要有氯仿-甲醇超声提取，乙醇提取和水提取。采用脂溶性化学成分分析方法对氯仿-甲醇超声提取物进行成分分析，结果表明氯仿-甲醇超声提取物含有胆甾醇、十二烯酸胆甾醇脂、甾醇-4-烯-3-酮和脂肪酸，且10-十八碳烯酸含量最高(参见孙苏亚，李发美，黄喉拟水龟板中三种甾类化合物的分离和鉴定，中国中药杂志，2000，25(3)：165-166和孙苏亚，李发美，龟板中脂肪酸的GC-MS分析，药物分析杂志，1999，19(6)：406-409)。将乙醇提取物和水提取物进行游离氨基酸和水解后进行化学成分分析，发现这两种提取物均含17种氨基酸及Zn、Fe等人体必需微量元素(方达任，张克兰，刘焱文，龟板、鳖甲炮制前后化学成分的变化，中国药学杂志，1989，24(1)：26-28)。上述提取方法所得到的龟板提取物对去势造成的大鼠骨质疏松有一定的治疗，但是，氯仿和甲醇都是有毒性溶剂，易造成提取物残留有毒溶剂，对环境造成污染，龟板乙醇提取和水提取物对骨髓间充质干细胞生长无促进作用。因此，寻求一种绿色环保的提取方法，得到促骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物则成为本领域内渴望解决的技术难题。

发明内容

本发明目的是提供一种促骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物。

本发明的另一目的是提供一种绿色环保的龟板提取物的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种含有龟板提取物的药物组合物。

本发明所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物为一种乙酸乙酯分析纯提取物，将其用乙酸乙酯按10mg/ml的比例溶解，并经0.45μm的滤膜过滤后，在以甲醇∶乙腈∶水＝47.5∶47.5∶5为流动相，波长为254nm，色谱柱为Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，进样量为10uL，流速为1.000ml/min的条件下进行高效液相HPLC检测，在保留时间依次为1.59±0.05min、2.72±0.05min、3.00±0.06min和4.86±0.05min处有吸收峰，吸收峰的相对峰面积依次为1.45％、6.14％、56.31％和31.45％(参见说明书附图1)。

上述高效液相HPLC检测所用仪器为：DIONEX summit P680(四泵，带自动进样)，所用检测器为：PDA-100 Photodiode Arry Delector。

本发明所述的龟板提取物，在常温(25℃)下为深咖啡色膏体，难溶解于水，易溶于有机溶剂，在乙醇中溶解量为20mg/ml，氯仿溶解量为50mg/ml，二甲亚砜中溶解量为33.3mg/ml。

本发明所述的龟板提取物是从龟板中提取得到。其中所述龟板是指乌龟的腹甲和背甲，较好是腹甲。

本发明技术方案中所述的常温为25℃。

本发明所述的龟板提取物含有脂肪酸类27～35％、脂肪酸酯类52～60％、甾体2～10％。其中，所述的脂肪酸类含有十四碳羧酸、十六碳羧酸和十八碳羧酸；所述的脂肪酸酯含有十六碳羧酸甲酯、十六碳羧酸乙酯、十八碳羧酸甲酯、十八碳-9-烯羧酸甲酯和十八碳-9-烯羧酸乙酯；所述的甾体含有3-胆甾醇和3，5-二胆甾烯。

本发明所述的龟板提取物制备方法是：

(1)将龟板粉碎成10～40目的细粉；

(2)用龟板粉质量的6～12倍的石油醚在50～70℃下回流提取8～12小时，除去石油迷提取物；

(3)将残渣用龟板粉质量的6～12倍的乙酸乙酯在60～80℃下回流提取8～12小时，减压并加热浓缩去除乙酸乙酯得到龟板提取物。

上技术方案步骤(1)的一个较佳具体制备方法是将龟板粉碎成20目的细粉。

上技术方案步骤(2)的的一个较佳具体制备方法是用龟板粉质量的6～12倍的石油醚在60℃下回流提取12小时，除去石油迷提取物。

上技术方案步骤(3)的的一个较佳具体制备方法是用龟板粉质量的6～12倍的乙酸乙酯在70℃下回流提取12小时，减压并加热浓缩除去乙酸乙酯得到龟板提取物。

本发明技术方案中所使用的乙酸乙酯为常用的分析纯，所使用的石油迷为常用的石油迷分析纯；所述的龟板粉与提取介质之间的比例为重量/体积比(本领域的习惯做法)，即龟板粉为重量单位，石油迷分析纯和乙酸乙酯分析纯为体积单位。

本发明所述的含有上述龟板提取物的药物组合物，含有治疗有效量的龟板提取物和常用的辅剂或赋型剂。

本发明所述的含有上述龟板提取物的药物组合物，其中龟板提取物的药用注射剂，是将上述龟板提取物先经硅胶柱层析，再用石油醚-乙酸乙酯混合液，按1％递减梯度洗脱2次，接着蒸发浓缩成无色蜡状固体，最后加20～40倍的1，2-丙二醇溶解得到。所述无色蜡状固体与1，2-丙二醇的为重量/体积比。

本发明所述的含有龟板提取物的药物组合物除注射剂以外的其它剂型，本领域技术人员可以依据本领域已知的方法得到所用的辅剂、赋型剂的使用形式和用量。

本发明所述的含有龟板提取物的药物组合物除注射剂以外的其它剂型，采用本领域常用的制备方法。例如将上述龟板提取物和药物辅剂混合均匀即得。

本发明所述的含有龟板提取物的药物组合物，其剂型还可以是片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液、混悬液中的任何一种。本领域技术人员可以依据本领域已知的方法得到所用的剂型。

本发明所述的含有龟板提取物的药物组合物，其剂型最好是胶囊和针剂。

本发明药物具有促进MSC生长的积极作用，应用于干细胞移植治疗重大疾病，如治疗神经损伤，神经退行性疾病，心脏损伤、骨质疏松、再障等。

以下通过药理试验及其结果来说明本发明所述的龟板提取物在治上述疾病中的有益效果。

为了描述方便而不会产生歧义，以下所述的龟板提取物未特别定义的均为本发明所述的龟板提取物(龟板的乙酸乙酯提取物)。

(一)活性比较

近代医学研究结果表明碱性成纤维生长因子(fibroblast growth factor，bFGF)是促细胞增殖作用强的细胞生长因子，因此本发明选用bFGF为阳性对照，与龟板提取物作用比较，结果表明龟板提取物比bFGF作用强。以上结果提示龟板提取物具有进一步研发新型促干细胞生长药物的潜力，并且可能获得比传统细胞因子更好的效果。

1材料与方法

1.1试剂和实验动物

1.2MSC分离、扩增与鉴定

1.3.1不同龟板提取物和bFGF作为比较标准对MSC的增殖活性影响

传3代MSC分为对照组、bFGF组和不同龟板提取物组。对照组分别为L-DMEM培养液和含二甲亚砜的L-DMEM培养液；bFGF组为对照组(L-DMEM培养液)加bFGF；龟板组为对照组(L-DMEM培养液)分别加不同龟板提取物，即石油醚提取物A、龟板乙酸乙酯提取物B、乙醇提取物C和水提取物D，4种提取物分别称取33.33mg，A、B、C三种均溶于1ml二甲亚矾中，D溶于1ml蒸馏水中，得到33.33mg/ml的4种不同龟板提取物供试液，将4种不同龟板提取物再配成作用终浓度分别为1、3、6、9、15、20、30、40(ul/200ul)，培养基200ul/孔。各组分别在96孔培养3d后作MTT法检测。

1.3.2龟板提取物和bFGF作为比较标准对MSC的增殖活性影响

传3代MSC分为对照组、bFGF组和龟板提取物组。对照组为L-DMEM培养液和含二甲亚砜的L-DMEM培养液，bFGF组为对照组(L-DMEM培养液)+20ng/mlbFGF，龟板提取物组为对照组(L-DMEM培养液)+龟板提取物。龟板提取物称取33.33mg，溶于1ml二甲亚砜DMSO中，即为龟板提取物33.33mg/ml供试液，配成作用终浓度分别为0.5、0.8、1.5、2.5、5、6.7mg/ml，培养基200ul/孔。各组分别在分别在96孔培养3d后作MTT法检测。

1.4MTT法测MSC增殖

2结果

不同龟板提取物对MSC增殖活性的量效关系

由表1可见，在1至30(ul/200ul)范围内，随龟板乙酸乙酯部分B浓度的增大，细胞吸光值逐渐增高，与对照组和bFGF组E比较，差别有显著性(P＜0.01)。实验结果显示，不同龟板提取物对MSC增殖作用各异，龟板乙酸乙酯提取物B促进细胞增殖；石油醚提取物A、乙醇提取物C和水提取物D对细胞增殖无影响。实验还发现，龟板提取物B不同剂量对MSC增殖影响也不同，如较大剂量促进细胞增殖，小剂量对细胞增殖无影响，以浓度依赖方式促进MSC增殖。研究结果表明龟板提取物对MSC增殖起促进药理作用。

用bFGF作为比较标准和龟板提取物对MSC的增殖活性比较

由图2可见，在0.8mg/ml至2.5mg/ml范围内，随龟板提取物浓度的增大，细胞吸光值逐渐增高，与对照组比较，差别有显著性(P＜0.05)，以浓度依赖方式促进MSC增殖，龟板提取物在2.5mg/ml与5mg/ml、6.7mg/ml浓度作用比较，差别无显著性，表明龟板提取物最大作用浓度为2.5mg/ml；由于bFGF为促细胞增殖作用强的细胞生长因子，因此选bFGF为阳性对照，bFGF组亦促进MSC增殖，但龟板提取物与bFGF组比较，差别有非常显著性(P＜0.01)，表明龟板提取物促进MSC增殖作用强于bFGF。

表1不同龟板提取物对MSC增殖活性的量效关系(X±S)

分组	1ul	3ul	6ul	9ul	15ul	20ul	30ul	40ul
									ABCDE	0.30±0.020.37±0.020.36±0.020.29±0.020.45±0.02	0.31±0.010.38±0.030.34±0.010.31±0.030.47±0.01	0.35±0.020.49±0.020.35±0.020.32±0.020.68±0.02	0.38±0.020.60±0.020.31±0.020.42±0.010.66±0.01	0.34±0.030.69±0.030.35±0.020.38±0.020.64±0.02	0.27±0.031.16±0.020.45±0.030.31±0.030.78±0.03	0.49±0.021.70±0.020.28±0.020.47±0.010.64±0.02	0.50±0.021.94±0.04*0.25±0.020.26±0.020.71±0.03*
对照	0.41±0.02							0.42±0.01

*与对照组比较，P＜0.01

龟板提取物促MSC增殖作用的特异性。为了探讨龟板补肾促MSC增殖作用的特异性，选取清热解毒中药如青天葵提取物作对照，结果表明青天葵提取物抑制MSC增殖，而龟板提取物促MSC增殖，结果表明龟板促MSC增殖可能与其补肾作用有关。依据“肾主发育”这条思路来解决MSC增殖问题，既有中医理论特色，更是有临床实用价值。

(二)促进MSC生长

1龟板提取物促进体外培养的MSC生长实验

将低、中、高剂量龟板提取物加入体外培养的MSC，以形态学观察，5-溴脱氧尿嘧啶(Bromodeoxyuridine，Brdu)，增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen，PCNA)，细胞周期为促MSC生长的药理学指标，实验表明龟板提取物以浓度依赖方式促进体外培养MSC生长效果，药理剂量为0.8mg/ml-6.7mg/ml。

1.1材料与方法

1.1.1MSC的分组培养  传3代MSC种植24孔板玻片细胞，分为对照组，龟板提取物低剂量组，龟板提取物中剂量组，龟板提取物高剂量组。对照组为含L-DMEM培养液，龟板提取物组为对照组+龟板提取物。龟板提取物称取33.33mg，溶于1ml二甲苯亚砜DMSO中，即为龟板提取物33.33mg/ml供试液，培养基1ml/孔，低、中、高剂量分别为33.33ug/ml，333.3ug/ml，3333ug/ml(下述相同)。各组分别在6孔培养1d后作流式细胞仪分析MSC的细胞周期的影响，各组分别在24孔培养3d后作Brdu，PCNA免疫细胞组化检测，倒置相差显微镜下观察。

1.1.2HE染色

1.1.3单标和双标免疫组化检测  在24孔MSC细胞培养液中加入Brdu(5mg/L)培养5h，去掉培养液，用DMEM冲洗2遍后再用新鲜培养液培养16h，固定的细胞涂片以0.01MPBS(PH7.4)洗后入3％过氧化氢-甲醇溶液中室温15分钟，以0.01MPBS洗10×3分钟后入0.1％TritonX-100的10％牛血清白蛋白溶液室温1小时，血清封闭后分别加入CD34、CD45、CD44、CD54、PCNA等多克隆兔抗或BrdU单克隆小鼠抗体，4℃冰箱过夜。次日以0.01MPBS洗，相应的二抗37℃孵育20min，0.01M PBS洗，SABC 37℃孵育20min，充分洗涤，DAB显色，根据需要复染，梯度酒精脱水干燥，透明封片。双标染色先按以上步骤一抗用BrdU单克隆小鼠抗体，二抗用羊抗小鼠，三抗用SABC-AP，BCIP/NBT显色，0.1M TBS洗，双标阻断剂30min，血清封闭后一抗用CD44等多克隆兔抗，二抗用羊抗兔，三抗用SABC，最后用AEC显色。阴性对照：用正常血清代替一抗，其余过程同上。

1.1.4检测细胞周期分布  使MSC同步于G0期，按以上实验分组更换培养液，收集约1×10⁶用于检测。收集细胞于Eppendorf管中，依次经过1×PBS冲洗一次，70％乙醇4℃固定过夜，以CD44、CD71、CD90标记MSC；RNA酶于37℃消化30min及室温碘化丙啶(PI)染色20min，PI标记DNA，计数CD44/PI双标细胞比例，最后采用流式细胞术检测细胞周期分布。每个样品计数10000个细胞，用MODIFIT软件进行数据分析。

1.2结果

1.2.1形态学观察  倒置相差显微镜下观察到龟板提取物组MSC胞体梭形，周围有光晕，立体感强，突起平滑细长，细胞不断增殖，细胞数量不断增加；对照组MSC胞体立体感下降，突起收缩，细胞缩成宽大扁平，细胞内颗粒状物质逐渐增多，增殖速度较慢，细胞数量减少。

1.2.2HE染色显示，对照组MSC细胞核大，形态多样，以椭圆形或圆形为主，以常染色质为主可见1-2个核仁，核仁明显，核浆比例大，表明所培养的细胞处于未分化的干细胞状态；龟板提取物组MSC可见强分裂相细胞，细胞核呈双核，说明龟板提取物促进MSC分裂增殖功能。

1.2.3龟板提取物以量效依赖性促进Brdu、PCNA的表达随机取5张Brdu、PCNA免疫阳性细胞染色盖片，在显微镜下(20×)随机选10个视野对每张盖片阳性细胞行计数，取其平均值。Brdu是一种胸腺嘧啶类似物，在DNA合成时可被细胞摄取利用而参与DNA组成，利用Brdu标记技术可以识别外源性MSC细胞和观察其分裂增殖情况，它可以作为评价细胞增殖的一个指标；增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen，PCNA)是一种核内蛋白质，与细胞增殖有关。在G0期细胞含量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期下降。因此，它可以作为评价细胞增殖的另一个指标[24](Bravo R，Frank R，Blundell PA，etal.Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNApolymcerase-delta.[J].Nature，1987，326(6112)：515)。Brdu、PCNA阳性染色主要位于细胞核，核圆、大小不等，颜色浅深不均。对照组Brdu、PCNA阳性细胞数量少散在分布；龟板提取物组Brdu阳性细胞数量多密集分布，低、中、高剂量组MSC的Brdu、PCNA阳性表达均明显增高，且呈浓度依赖性；而高剂量组的Brdu、PCNA阳性表达水平，与中剂量组表达水平相当，差别无显著性，提示中剂量组333.3ug/ml浓度达到最大激活细胞增殖内信号通路或受体。表明龟板提取物以量效依赖性促进Brdu、PCNA的表达

表2：不同浓度龟板乙酸乙酯部分对Brdu和PCNA阳性细胞数影响

分组	Brdu	PCNA
			对照组	10.3±2.3	11.6±2.5
龟板低剂量	17.5±2.7*	16.3±2.8*
			龟板中剂量	25.3±2.5**	26.7±2.3**
龟板高剂量	26.7±2.9**	27.3±2.6**

^**与对照组比较，P＜0.05；^**与对照组比较P＜0.01

1.2.4龟板提取物以浓度依赖方式促进S期细胞增高

龟板提取物组S期细胞百分比比对照组高，且随着浓度的增高而加大，在200ug/ml达到最高，S期为13.2％；与对照组和bFGF组比较，，S期的变化具有显著性差异(P＜0.05)，龟板提取物组细胞由G0/G1期向S期的转化受到激活。

表3：龟板提取物对体外培养的MSC细胞周期的影响(X±S)

分组	药物浓度(ug/ml)	G0/G1(％)	G2-M(％)	S(％)
					对照组	0	86.3±1.2	3.3±1.4	6.1±1.1
bFGF	40	87.8±1.3	3.0±1.2	9.2±0.9
						80	87.2±1.3	3.5±1.1	9.3±1.2*
龟板	80	81.9±1.2	6.2±1.1*△	10.3±0.9*
						200	85.4±1.4	7.3±0.9*△	13.2±1.2*

△与bFGF组比较P＜0.05；△△与bFGF组比较P＜0.01

^**与对照组比较，P＜0.05；^**与对照组比较P＜0.01

2、体内实验观察龟板提取物对在体骨髓MSC增殖的影响

将龟板提取物溶于二甲亚砜DMSO中，制备为龟板提取物注射剂，分别给予低、中、高剂量龟板提取物腹腔注射大鼠，以细胞周期S期为促MSC增殖的药理学指标，实验表明龟板提取物以时效和量效依赖方式促进在体骨髓MSC增殖效果。

2.1材料与方法

2.1.1、实验动物：健康清洁级Sprague-Dawley大鼠100只，200g，雌雄不限，雌鼠无孕，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXIC(粤)2003-001，粤监证字2005A031。

2.1.2量效实验分组：分为空白对照组，DMSO对照组，龟板提取物低剂量组，龟板提取物中剂量组，龟板提取物高剂量组。龟板提取物称取33.33mg，溶于1ml二甲亚砜DMSO中，即为龟板提取物33.33mg/ml供试液，低、中、高剂量分别为0.5ml，1ml和1.5ml，空白对照组则给予1.5ml蒸馏水腹腔注射，DMSO对照组则给予1.5mlDMSO，分组腹腔注射3天。腹腔注射后0时、1天、3天、5天4个时间点取骨髓，每个时间点5只SD大鼠，每组SD大鼠20只。

2.1.3时效实验分组：分为空白对照组，DMSO对照组，龟板提取物低剂量组，龟板提取物中剂量组，龟板提取物高剂量组。各组剂量同量效实验分组，再分腹腔注射3天、5天组，腹腔注射后1天取骨髓，每组SD大鼠10只。

2.1.4、流式细胞仪分析MSC细胞周期：将分组大鼠骨髓用L-DMEM冲出，充分混匀，转入离心管，300g离心10min，去上清，D-Hanks重悬，离心去上清后，加4ml D-Hanks混匀。Percoll贮存液按0.56∶0.44混合，取4ml放入10ml离心管内，吸骨髓液在离液面2cm处贴管壁缓缓加入。水平离心机900g离心5min，收集单核细胞层，用DMEM洗涤两次。70％乙醇4℃固定过夜，以CD44、CD71、CD90标记MSC；RNA酶于37℃消化30min及室温碘化丙啶(PI)染色20min，PI标记DNA，计数CD44/PI双标细胞比例，最后采用流式细胞术检测细胞周期分布。每个样品计数10000个细胞，用MODIFIT软件进行数据分析。

2.2结果

2.2.1龟板提取物以量效依赖性促进在体骨髓MSCS期细胞增高

龟板提取物强烈促进MSC的细胞周期进程。给予3天龟板提取物高剂量组的MSC立即进入S期，给药后1天，S期达高峰，与同时间点的空白对照组、溶剂组相比，差别有显著性，给药后5天S期降至低点；中剂量组给药后1天，MSC开始进入S期，给药后3天，S期达高峰；低剂量组和空白对照组无明显S期变化。结果表明龟板提取物以量效依赖关系促进在体骨髓MSCG1向S期转换。

表4：龟板提取物对在体髓MSC的细胞周期的影响

给药后时间	时相	空白组	溶剂组	低剂量	中剂量	高剂量
							01d3d5d	G1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MG1SG2/M	83.216.60.279.920.1078.119.12.265.526.28.3	77.522.607722.2070.127.2068.431.00.6	80.519.5075.123.11.874.624.11.283.6160.4	82.917.1072.124.9376.632.1265.921.42	68.731.3057.937.54.669.430.6080.917.50.3

2.2.2龟板提取物以时效依赖性促进在体骨髓MSCS期细胞增高

为了观察龟板提取物对在体骨髓MSC增殖过程中细胞周期分布的时效，用低、中、高剂量龟板提取物分别作用3天和5天。作用3天后，低、中剂量龟板提取物MSC的S期细胞开始增多，与对照组和DMSO对照组比较，S期的变化无显著性差异，高剂量龟板提取物MSC的S期细胞达到最高，与对照组和DMSO对照组比较，S期的变化具有显著性差异；作用5天后，低、中剂量龟板乙酸乙酯部分随着作用时间增加，S期细胞百分比比对照组和DMSO对照组高，具有显著性差异(P＜0.05)，而高剂量组的S期细胞百分比水平，与作用3天组水平相当，差别无显著性，提示高剂量作用3天组浓度达到最大激活细胞增殖内信号通路或受体。(参见图3)

(三)龟板提取物联合MSCs移植治疗脊髓损伤

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)所造成的外伤性截瘫是最严重的外伤之一。在美国每年约有11000例SCI患者[1]，(Lu J，Waite P.Spine update：advances in spinal cord regeneration.Spine，1999；24：926-930.)日本每年发生率约为百万分之四十[2]，(Shingu H，ohama M，Ikata T，et al.A nationwide epidemiological survey of spinal cord injures in Japan on January 1990 toDecember 1992.Paraplegia，1995；33：183-188.)近几年来看，随着我国交通工具使用的增加，临床上脊柱外伤合并的脊髓损伤的病例也有逐步增多的趋势。因此，脊髓损伤的修复成为临床医学亟待解决的问题。胚胎干细胞、神经干细胞移植对脊髓损伤具有理想的治疗作用[3]，(McDonald JW，Liu XZ，Qu Y，et al.Transplanted embryonic stem cells survive，differentiateand promote recovery in injured rat spinal cord.Nature Med，1999；5：1410-1412.)但由于伦理和道德问题，其临床应用受到限制。最近研究表明骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以转分化为神经细胞[4]，(Darwin J，Procko P.Marrow stromal cells as stem cells fornonhematopoietic tissues.Science，1997；276：71-74.)从而为脊髓损伤修复提供了新途径。我们在体外应用益肾中药龟板成功诱导MSCs向神经细胞分化的基础上[5]，(陈东风，杜少辉，李伊为，等.龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元。广州中医药大学学报，2003；3：224-226.)进一步探讨龟板对MSCs在脊髓损伤的存活和分化的影响，为益肾中药联合MSCs移植治疗脊髓损伤提供形态学依据。

材料与方法

1.试剂和实验动物

细胞培养及免疫组化试剂：低糖DMEM(L-DMEM)、Percoll和胎牛血清(FBS)为GIBCOL公司产品，5-溴脱氧尿嘧啶(Bromodeoxyuridine，Brdu)及其单克隆小鼠抗体为SIGMA公司产品，CD44单克隆小鼠抗体由深圳晶美公司提供。神经丝蛋白(Neurofilamentprotein-160KD，NF)单克隆小鼠抗体为Neomarkers公司产品，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)单克隆小鼠抗体为Maxim公司产品。链霉亲和素复合物(SABC)、二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒均购于武汉博士德公司。

龟板提取物，根据成人日服药量折算成大鼠灌胃剂量。将大鼠随机分为龟板提取物组和脊髓损伤对照组。龟板提取物组每天给予龟板提取物50mg灌胃一周；脊髓损伤对照组则给予等体积蒸馏水灌胃。连灌一周。

实验动物：纯种SD大鼠，清洁级，雌雄各半，月龄1～4个月，体重250～300g，由广州中医药大学实验动物中心提供。实验大鼠分为脊髓损伤对照组及龟板提取物组，每组动物数50只，每个时间点分别为10只。MSC均经Brdu处理。

2.MSC分离、扩增与鉴定

将大鼠股骨、胫骨骨髓冲出，D-Hanks洗，1.073g/ml Percoll液900g离心30min，收集单个核细胞层，计数细胞按1×10⁶/cm²密度接种，37℃、5％饱和湿度的CO₂孵箱培养，培养液为含10％FBS的L-DMEM。移植前1d，加入Brdu(5mg/L)培养5h，用D-Hank’s冲洗2遍后再培养16h。移植前0.25％胰蛋白酶消化计数。将部分MSC接种至含盖片的24孔培养板内，培养2h后取出做Brdu、CD44免疫组化及免疫组化双重染色来鉴定MSCs。

3.改良Allen脊髓损伤模型及MSC的定位移植

改良Allen脊髓损伤模型  大鼠自由饮食、饮水，腹腔注射10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉；作背部后正中切口，咬除T11-13棘突及T12全部椎板和T11、T13上、下各半个椎板，暴露10mm长脊髓，保留硬脊膜；用10g质量的物体从7.5cm高处自由落下，造成大鼠不完全性截瘫，撞击成功的标志为：大鼠尾巴痉挛摆动，双下肢身体回缩性扑动。术后缝合伤口。于第1天进行移植，移植的大鼠于第1、2、3、4、6周后处死。

MSCs的立体定位移植  将大鼠麻醉固定，用5ul微量注射器吸取MSC细胞悬液4.5ul(约4万个细胞)注入大鼠脊髓损伤区内，注射速度1ul/min。留针10min。等量D-Hanks液注入对照的脊髓损伤区内。

4.组织切片制备与MSC增殖与分化检测

组织切片制备  手术后第1、2、3、4、6周处死动物，取脊髓损伤区及其上、下端各1cm的脊髓组织，冰冻切片，连续切片，片厚5μm，然后贴片。分别用于免疫组化与HE染色。

MSCs移植后增殖与分化的单标和双标免疫组化检测  固定的细胞涂片或脊髓组织切片以0.01M PBS(PH7.4)洗后入3％过氧化氢-甲醇溶液中室温15min，以0.01M PBS洗10×3min后入0.1％Triton×-100的10％牛血清白蛋白溶液室温1h，血清封闭后分别加入Brdu单克隆小鼠抗体或NF、GFAP、CD44等单克隆小鼠抗体，4℃冰箱过夜。次日以0.01MPBS洗，加入相应的二抗生物素化羊抗兔(博士德公司)37℃孵育20min，0.01M PBS洗，SABC 37℃孵育20min，充分洗涤，DAB显色，根据需要复染，梯度酒精脱水干燥，透明封片，显微镜观察，图像分析仪分析阳性结果。双标染色先按以上步骤一抗用Brdu单克隆小鼠抗体，二抗用羊抗小鼠IgG，三抗用链霉亲和素碱性磷酸酶复合物(SABC-AP)，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮蓝四唑盐(BCIP/NBT)显色，0.1M TBS洗，双标阻断剂30min，血清封闭后一抗用CD44等多克隆兔抗，二抗用羊抗兔IgG，三抗用SABC，最后用3-氨-9-乙基咔唑(AEC)显色。阴性对照：用正常血清代替一抗，其余过程同上。

5.病理组织观察

取免疫组化反应阳性切片的相邻切片HE染色进行病理观察。

6.统计分析

每只动物随机取5张阳性细胞染色切片，在显微镜下(×200)对每张切片阳性细胞进行计数，取其平均值，所得数据用均数±标准差(X±S)表示，组间比较采用单因素方差分析，差别如有显著性，再用t检验进行组间两两比较。

7.结果

7.1.形态学观察

原代贴壁的MSC呈成纤维细胞外观。MSC贴壁伸展开始为多角形、三角形，逐渐变成短梭形、长梭形。细胞不断分裂、增殖，接种后1周，贴壁细胞逐渐呈现集落生长，14天达到融合生长；刚经过传代的MSC呈圆形，很快贴壁、伸展成多角形、三角形，最后呈短梭形和长梭形。许多新生的圆形、折光性强的幼稚细胞散布于其间。

7.2.MSC的表型特征

培养细胞盖片可见Brdu阳性细胞，CD44阳性细胞、Brdu和CD44双重标记阳性细胞。Brdu阳性细胞呈圆形，胞核染色呈棕黄色。CD44阳性细胞亦呈圆形，胞膜呈棕色，阴性对照均未着色。Brdu和CD44双重标记阳性细胞胞核呈红色，胞膜为蓝色，Brdu阳性反应为胞核染红色，CD44阳性反应为胞膜染蓝。CD44和CD54是MSC的重要标志物，不是表达造血干细胞所特有的表面抗原CD34和白细胞标志抗原CD45的细胞。

7.3.移植后脊髓损伤组织Brdu染色结果

脊髓损伤组织内移植MSC后1周，Brdu阳性细胞核主要位于移植区内，核圆、大小不等，颜色浅不均。脊髓损伤对照组Brdu阳性细胞数量少散在排列，随时间推移数量逐渐减少，第6周Brdu阴性；龟板提取物组Brdu阳性细胞数量多，有许多圆形核染色。第6周仍有少量Brdu阳性细胞。因BrdU标记DNA，表明龟板提取物组MSC增殖较对照组多(表5)。

7.4.移植后脊髓损伤组织Brdu/NF双标染色结果

移植后2-4周，脊髓损伤对照组移植区内可见Brdu和NF双重标记阳性细胞，胞核呈红色，胞膜为蓝色，Brdu阳性反应为胞核染红色，NF阳性反应为胞膜染蓝色，细胞数量少；龟板提取物组Brdu和NF双重标记阳性细胞数多，胞体呈三角形，有短的突起。二组GFAP免疫组化反应均为阴性。NF是神经元的标记，此结果表明龟板提取物组MSC分化为神经元较对照组多(表6)。

Table 5 The number of Brdu immunopositive cells after MSCs transplanted

表5：MSCs移植后Brdu阳性细胞数(个，x±s)

时间(周)	损伤组	龟板提取物组
			12346	3.4±0.34.8±0.44.5±0.33.9±0.3-	6.7±0.4*8.9±0.5*7.8±0.4*7.2±0.3*6.7±0.3*

*与损伤组比较，P＜0.05，-为阴性

Table 6 The number of Brdu/NF double labeled immuno-positive cells after MSCs transplanted

表6：MSCs移植后Brdu/NF双标染色阳性细胞数(个，x±s)

时间(周)	损伤组	龟板提取物组
			12346	1.2±0.11.8±0.21.6±0.11.5±0.1-	4.3±0.3*6.9±0.4*4.9±0.2*4.5±0.3*3.8±0.2*

*与损伤组比较，P＜0.05，-为阴性

综上所述，本发明所述的龟板提取物，含有促MSC生长的有效组份，具有促MSC生长作用强的显著效果，解决了骨髓中MSC含量极少，扩增速度慢，无法满足临床上的大量需求以及长期增殖活性弱等问题。其次，本发明使用石油醚和乙酸乙酯为提取介质，所得到的龟板提取物无残留有毒溶剂，整个生产过程也不会对环境造成污染。

附图说明

图1为本发明所述的龟板提取物的高效液相HPLC指纹图谱

图2为本发明所述的龟板提取物对骨髓MSC增殖活性比较实验直方图；

图3为本发明所述的龟板提取物对在体骨髓MSC的S期影响的时间效应直方图。

具体实施方式

实施例1

一、龟板提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将龟板进行粉碎，过20目筛为所需龟板细粉。

2、除杂

取40g龟板细粉，装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加250ml石油醚(分析纯)溶剂，加热至50℃，回流提取12小时，去除石油醚提取部位。

3、有效部位的提取

将经石油醚提取除杂后的残渣用250ml乙酸乙酯(分析纯)加热至60℃继续回流提取12小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状龟板提取物0.4g。

二、化学成份分析

将所得到的咖啡色膏状龟板提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱2次，得无色蜡状固体，然后使用常规的方法标定：其中含有十四碳羧酸2.3％、十六碳羧酸14.16％、十八碳羧酸17.33％、十六碳羧酸甲酯18.00％、十六碳羧酸乙酯10.80％、十八碳羧酸乙酯7.50％、十八碳-9-烯羧酸甲酯15.00％、十八碳-9-烯羧酸乙酯8.69％、3-胆甾醇1.84％、3，5二胆甾烯1.01％。

三、龟板提取物注射液(Injectio PTE)的制备

本品为中药龟板经提取有效成分制成的无菌水溶液。2ml相当于龟板有效成分10mg。

1、精制

将所得到的咖啡色膏状龟板提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱2次，得无色蜡状固体，即为龟板提取物精制品。

2、处方

龟板提取物精制品500mg，1，2丙二醇20ml，吐温-80 2ml。制成注射液100ml。

3、制法

取龟板提取物精制品500mg，加1，2丙二醇20ml溶解，振摇使龟板精制有效成分完全溶解，再加注射用水至100ml。然后，加活性碳0.5％(V/V)，充分搅拌，过滤，最后以G3重熔玻璃漏斗过滤，灌封，100℃流通蒸气灭菌30min，即得。

四、龟板提取物注射液的使用方法

作用与用途  本品有促进MSC生长和促进MSC转分化为神经元作用，主要用于治疗骨病、再障和神经疾病。

用法与用量  常用量：肌肉注射和穴位注射，首次4ml，以后每次2ml，一日1-2次。

实施例2

一、龟板提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将龟板进行粉碎，过40目筛为所需龟板细粉。

2、除杂

取60g龟板细粉，装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加500ml石油醚(分析纯)溶剂，加热至50℃，回流提取10小时，去除石油醚提取部位。

3、有效部位的提取

将经石油醚提取除杂后的残渣用500ml乙酸乙酯(分析纯)加热至70℃继续回流提取10小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状龟板提取物0.6g。

二、化学成份分析

将所得到的咖啡色膏状龟板提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱2次，得无色蜡状固体，然后使用常规的方法标定：其中含有含有十四碳羧酸5.5％、十六碳羧酸10.36％、十八碳羧酸14.33％，十六碳羧酸甲酯16.80％、十六碳羧酸乙酯10.8％、十八碳羧酸甲酯7.00％、十八碳-9-烯羧酸甲酯14.00％、十八碳-9-烯羧酸乙酯8.11％，3-胆甾醇6.64％，3，5二胆甾烯3.01％。

三、龟板提取物胶囊(Capsulae PTE)的制备

处方  咖啡色膏状龟板提取物250mg，碳酸钙45mg，淀粉5mg。每个胶囊重300mg。

制法  将碳酸钙与淀粉混匀，过筛，再与适量乙醇稀释的浸膏混合，过120目筛，于60-70℃烘干2h，装胶囊。

四、龟板提取物胶囊的使用方法

作用与用途  本品有促进MSC生长和促进MSC转分化为神经元作用，主要用于治疗骨病、再障和神经疾病。

用法与用量  常用量每日1次，每次1-2粒，4周为一疗程，可再服两个疗程，药量可酌减。

实施例3

一、龟板提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将龟板进行粉碎，过10目筛为所需龟板细粉。

2、除杂

取60g龟板细粉，装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加600ml石油醚(分析纯)溶剂，加热至70℃，回流提取8小时，去除石油醚提取部位。

3、有效部位的提取

将经石油醚提取除杂后的残渣用600ml乙酸乙酯(分析纯)加热至80℃继续回流提取8小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状龟板提取物0.6g。

二、化学成份分析

将所得到的咖啡色膏状龟板提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱1次，得无色蜡状固体，然后使用常规的方法标定：其中含有十四碳羧酸2.5％、十六碳羧酸13.36％、十八碳羧酸7.33％，十六碳羧酸甲酯15.60％、十六碳羧酸乙酯9.36％、十八碳羧酸甲酯6.50％、十八碳-9-烯羧酸甲酯13.00％、十八碳-9-烯羧酸乙酯7.53％，3-胆甾醇3.64％，3，5二胆甾烯2.4％。

三、龟板提取物片剂(Tablet PTE)的制备

处方  咖啡色膏状龟板提取物400mg，碳酸钙90mg，淀粉10mg。每片重500mg。

制法  将碳酸钙与淀粉混匀，过筛，再与适量乙醇稀释的浸膏混合，过90目筛，于60-70℃烘干，压片。

四、龟板提取物片剂的使用方法

作用与用途  本品有促进MSC生长和促进MSC转分化为神经元作用，主要用于治疗骨病、再障和神经疾病。

用法与用量  常用量每日1次，每次1-2片，4周为一疗程，可再服两个疗程，药量可酌减。

Claims (8)

1、一种可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物，该龟板提取物为乙酸乙酯分析纯提取物，将其用乙酸乙酯按10mg/ml的比例溶解，并经0.45μm的滤膜过滤后，在以甲醇∶乙腈∶水＝47.5∶47.5∶5为流动相，波长为254nm，色谱柱为Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，进样量为10uL，流速为1.000ml/min的条件下进行高效液相HPLC检测，在保留时间依次为1.59±0.05min、2.72±0.05min、3.00±0.06min和4.86±0.05min处有吸收峰，吸收峰的相对峰面积依次为1.45％、6.14％、56.31％和31.45％。

2、权利要求1所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物含有脂肪酸类27～35％、脂肪酸酯类52～60％、甾体2～10％。

3、权利要求1或2所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物的制备方法由下列步骤组成：

(1)将龟板粉碎成10～40目的细粉；

(2)用龟板粉质量的6～12倍的石油醚在50～70℃下回流提取8～12小时，除去石油迷提取物；

(3)将残渣用龟板粉质量的6～12倍的乙酸乙酯在60～80℃下回流提取8～12小时，减压并加热浓缩除去乙酸乙酯得到龟板提取物。

4、权利要求3所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物的制备方法，其特征是将龟板粉碎成20目的细粉。

5、权利要求3所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物的制备方法，其特征是用龟板粉质量的6～12倍的石油醚在60℃下回流提取12小时，除去石油迷提取物。

6、权利要求3所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物的制备方法，其特征是用龟板粉质量的6～12倍的乙酸乙酯在70℃下回流提取12小时，减压并加热浓缩去除乙酸乙酯得到龟板提取物。

7、一种药物组合物，含有权利要求1或2所述的龟板提取物和药学上可以接受的辅料。

8、如权利要求7所述的一种药物组合物，其中药用注射剂，由所述的龟板提取物先经硅胶柱层析，再用石油醚-乙酸乙酯混合液，按1％递减梯度洗脱2次，接着蒸发浓缩成无色蜡状固体，最后加20～40倍1，2-丙二醇溶解得到。

Images