CN1850146A - 猴耳环提取物的新用途 - Google Patents

Abstract

猴耳环提取物的新用途，涉及天然植物提取物在药品或食品中的应用。具体是取植物猴耳环用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物，在制备抗病毒药物和在制备抗氧化食品中的应用。可采用含植物猴耳环水或50～95％的乙醇提取物为活性成分，添加常规的药用辅料或食品添加剂，按常规的药物或食品制剂技术制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、丸剂、口服液等口服剂型。猴耳环水提取物或醇提取物对流感病毒甲3型(A₃)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1和2型(HSV－1，HSV－2)、肠道病毒CoxB3、鼻病毒(RV)、腮腺炎病毒均有的抑制作用和很强的抗氧化活性。

Description

猴耳环提取物的新用途

                         技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及天然植物提取物在药品或食品中的应用。

                         背景技术

中药材猴耳环[Pithecellobium clypearia enth./Archidendronclypearia(Jack).Nielsen]为豆科含羞草涎树属植物。猴耳环为乔木，分布于热带亚洲。猴耳环又名围涎树、鸡三树等，其叶、种子和果实均可入药，民间用于烧伤、烫伤的治疗。“卫生部药品标准”中成药方剂第六册公开了一种猴耳环消炎片和胶囊，它是由猴耳环的水提取物制备的片剂和胶囊剂，在临床上用于治疗上呼吸道感染、急性咽喉炎、急性扁桃体炎、急性肠炎、细菌性痢疾等由炎症引起的疾病。国内外有关植物猴耳环的药理活性和化学成分的研究并不多，在文献“HPLC法测定猴耳环消炎片中没食子酸的含量”中药材2000，23(11)：708-708报道认为没食子酸是猴耳环抗菌消炎的活性成分。但对于猴耳环提取物的其它作用尚未见有报道。

                         发明内容

本发明的目的是开发植物猴耳环的新用途。

本发明所采用的技术方案之一是取植物猴耳环用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物，在制备抗病毒药物应用。

另一方案是取植物猴耳环用水或95％的乙醇溶液提取的提取物，在制备抗氧化食品中的应用。

在制备抗病毒药物、抗氧化食品时，可采用一种含植物猴耳环用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物为活性成分，添加常规的药用辅料或食品添加剂制成的组合物。组合物中含猴耳环提取物活性成分的量视不同的剂型，不同的使用场合而不同，以添加填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂糖浆剂、防腐剂等制成单位剂量含10～1000mg的猴耳环提取物干品，按常规的药物或食品制剂技术制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、丸剂、口服液等口服剂型较合适。

本发明的有益效果是开拓了猴耳环植物的新用途。

下面通过具体实施例阐述本发明的技术方案，但不以具体实施例限制本发明。

                       具体实施方式

实施例1、植物猴耳环水提取物的制备

方法：采用“卫生部药品标准”中成药方剂第六册公开的制备猴耳环胶囊剂中的猴耳环提取方法：

取猴耳环幼枝、叶200公斤，加入水2000升，煎煮2小时，共煎煮二次，合并煎叶，滤过，滤液减压浓缩，干燥制得约30公斤的猴耳环水提取物干浸膏。

实施例2、植物猴耳环50％的乙醇溶液提取物的制备

取猴耳环干燥叶200公斤，加入50％的乙醇2000升，回流提取3小时。提取液静置，过滤，滤液减压浓缩，干燥制得32公斤的猴耳环50％乙醇溶液提取物干浸膏。

实施例3、植物猴耳环75％的乙醇溶液提取物的制备

取猴耳环干燥叶200公斤，加入75％的乙醇2000升，回流提取3小时。提取液静置，过滤，滤液减压浓缩，干燥制得34公斤的猴耳环得到75％的乙醇溶液提取物干浸膏。

实施例4、植物猴耳环95％的乙醇溶液提取物的制备

取猴耳环干燥叶200公斤，加入95％的乙醇2000升，回流提取3小时。提取液静置，过滤，滤液减压浓缩，干燥制得36公斤的猴耳环得到95％的乙醇溶液提取物干浸膏。

下面通过试验证明本发明的用途

试验例1、猴耳环提取物体外抗病毒生物活性试验

【实验材料】

受试药物：上述实施例1.2.3.4.的样品

以三蒸水配制成70mg干膏/ml，隔水煮沸20分钟灭菌。

阳性对照药  病毒唑(三氮唑核苷Ribavirin)，湖北省医药工业研究所产品。双黄连口服液，哈药集团三精制药有限公司生产。

病毒  流感病毒甲₃型(A₃)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(ADV₃)、腺病毒7型(ADV₇)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、肠道病毒科萨奇B₃(CoxB₃)，鼻病毒(RV)、腮腺炎病毒用于体外实验；流感病毒鼠肺适应株FM1，用于体内实验。均购自中国预防医学科学院病毒学研究所，本实验室传代后保存于-70℃冰箱备用。

动物  ICR小鼠，体重13～15g，雌雄各半。

细胞  人喉癌传代细胞Hep-2株，购自卫生部药品生物制品检定所。

细胞培养液  含10％小牛血清、0.29mg谷氨酰胺/ml、100u/ml青、链霉素。

细胞维持液  除所含小牛血清为2％外，其他含量均同培养液。

抗病毒试验方法

1、对Hep-2培养细胞的毒性试验

方法  按常规实验操作，将瓶中Hep-2细胞消化下来，接种于96孔细胞培养板中，置37℃5％CO₂培养箱中培养2天，长成单层细胞后，进行试验：将培养板中的培养液倾去，加入以维持液连续2倍稀释的药液200μl/孔，每稀释度加4孔，第8行留4孔不加药作正常细胞对照。将培养板置37℃5％CO₂培养箱中培养3天，每日用倒置显微镜观察药液对细胞的影响。判断标准如下：

毒性实验结果判断：

以下结果表中的数字表示药物对细胞的毒性程度分级：

“-”：表示细胞生长基本正常，未出现中毒现象；

“1”：表示中毒细胞发生率在25％以下；

“2”：表示中毒细胞发生率在25％～50％之间；

“3”：表示中毒细胞发生率在50％～75％之间；

“4”：表示中毒细胞已在75％以上。

若毒性为“1”及其以下“-”，则视为阴性，可认为此浓度药样对细胞无中毒现象，其余的“2”及其以上各级，均视为阳性，即所试药样在此浓度对细胞有中毒作用。

利用Reed-Muench法计算50％毒性浓度(TC₅₀)。

试验结果：

猴耳环水提取物50％毒性浓度TC₅₀＝0.208mg干浸膏/ml，TC₀＝0.145mg干浸膏/ml，猴耳环50％乙醇提取物50％毒性浓度TC₅₀＝0.198mg干浸膏/ml，TC₀＝0.140mg干浸膏/ml，猴耳环75％乙醇提取物50％毒性浓度TC₅₀＝0.190mg干浸膏/ml，TC₀＝0.135mg干浸膏/ml，猴耳环95％乙醇提取物50％毒性浓度TC₅₀＝0.185mg干浸膏/ml，TC₀＝0.130mg干浸膏/ml。同样方法求得双黄连口服液的TC₅₀＝2.12mg生药/ml，病毒唑Ribavirin的TC₅₀＝0.714mg/ml。

选择稀释度对细胞生长无影响的药液TC₀及其以下浓度作抗病毒实验。

2、各病毒滴度(TCID₅₀)的测定

按常规实验操作，将瓶中Hep-2细胞消化下来，接种于96孔细胞培养板中，置37℃5％CO₂培养箱中培养2天，长成单层细胞后，进行病毒毒力滴定试验，测定出各病毒的滴度(TCID₅₀)。具体操作为：将各病毒以细胞维持液作10倍连续稀释7个浓度，倒去细胞板中培养液，将每稀释度病毒液加入板中4孔，每孔100μl，留1行不加病毒液改加维持液作为正常细胞对照，补足维持液到200μl/孔。置37℃5％CO₂培养箱中培养，次日开始观察细胞病变(CPE)3天，以最后1日的CPE为准(判断标准同下)，以Reed-Muench法计算各病毒的TCID₅₀。

结果  按上述方法滴定结果如下：

病毒	A3	RSV	HVJ	HSV-1	HSV-2	CoxB3	RV	腮腺炎病毒
									TCID50	-4	-6	-5	-4	-4	-6	-4	-3

3、对病毒致细胞病变作用的影响

方法  取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种100 TCID₅₀的不同病毒液100μl于细胞孔，每一种病毒接种一块细胞板，留一行不接种病毒作正常细胞对照。置37℃5％CO₂培养箱中吸附2小时，倒掉病毒液，用不含小牛血清的Eagle’s维持液洗细胞面1次后，加入从最大无毒浓度TC₀起倍比稀释6个浓度的各个药液(包括对照药)200μl/孔，各浓度加3孔。同时设病毒对照、正常细胞对照。置37℃5％CO₂培养箱中培养3天，  每日在倒置显微镜下镜检CPE进展。细胞病变程度的判断：

“-”：细胞生长正常，无病变出现；

“1”：细胞病变约占整个单层细胞的＜25％；

“2”：细胞病变约占整个单层细胞的25％～50％；

“3”：细胞病变约占整个单层细胞的50％～75％；

“4”：细胞病变约占整个单层细胞的75％～100％。

根据以上细胞病变五级标准判断，利用Reed-Muench法计算50％有效浓度(EC₅₀)，并求出治疗指数(TI＝TC₅₀/EC₅₀)，TI值越高，表明药效作用越强。

【结果】实验证明，猴耳环水提取物或醇提取物对流感病毒甲3型(A₃)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1和2型(HSV-1，HSV-2)、肠道病毒CoxB3、鼻病毒(RV)、腮腺炎病毒均显示出有一定的抑制作用，其中对副流感病毒抑制作用最强，而对腺病毒3型(ADV₃)和7型(ADV₇)未显示出明显的抗病毒活性，见下表。

                     表1  猴耳环提取物对常见呼吸道病毒的作用

病毒	水提取物		50％乙醇提取物		75％乙醇提取物		95％乙醇提取物		双黄连口服液		病毒唑Ribavirin
												EC50	TI	EC50	TI	EC50	TI	EC50	TI	EC50	TI
	A3	0.062	6.7	0.060	6.8	0.058	7.2	0.053	7.9	0.32												6.6	+
HVJ											0.053	7.9	0.051	8.0	0.050	8.9	0.044	9.4	0.53	4.0	+
	RSV	0.088	5.3	0.086	5.4	0.085	5.3	0.088	5.7													+
HSV-1												0.088	4.7	0.085	4.8	0.080	5.2	0.062	6.7	0.45	4.7		+
	HSV-2	0.105	4.0	0.10	4.3	0.080	5.6	0.062	6.7	0.53	4.0											+
CoxB3												0.095	4.5	0.092	4.6	0.085	4.8	0.082	5.2	-			+
	RV	0.090	4.2	0.089	4.2	0.090	4.7	0.085	5.0	-												+
腮腺炎病毒												0.092	4.0	0.090	4.0	0.090	4.5	0.087	4.9	-			+

注：(1)表中猴耳环提取物EC₅₀单位为mg提取物干膏/ml，双黄连为mg生药/ml。

(2).表中“+”为有抑制作用，“-”为无抑制作用，EC₅₀为50％有效浓，TI为治疗指数TI＝TC₅₀/EC₅₀。

结论……

试验例2、猴耳环提取物的体内抗病毒生物活性试验

受试药物：上述实施例1.2.3.4.的样品

以三蒸水配制成0.7g干膏/ml、0.35g干膏/ml和0.18g干膏/ml，隔水煮沸20分钟灭菌。

阳性对照药  病毒唑(三氮唑核苷Ribavirin)和双黄连口服液。

试验方法

1、将小鼠按体重随机分组，每组10只。于感染前1天开始灌胃给药，正常对照组和病毒感染对照组给同体积蒸馏水，每日2次，连续5天。

2、感染当日，将除正常对照组外的各组小鼠，以乙醚轻度麻醉，用15LD₅₀的流感病毒鼠肺适应株FM1，滴鼻感染小鼠。

3、于感染后第4天先称小鼠体重，再解剖取肺称肺重。

4、计算肺指数值＝100×肺重/体重，进行t检验，计算药物对肺炎的抑制率。

          表2  猴耳环水提取物对小鼠流感病毒性肺炎的作用

组别	鼠数	剂量g/kg/d	肺指数(x+sd)	P*	抑制率(％)
						病毒对照	10	-	1.3681±0.159
正常对照	10	-	0.9552±0.206	＜0.01	-
						猴耳环水提取物	10	1.45	1.0108±0.110	＜0.01	26.12
猴耳环水提取物	10	0.70	1.0715±0.103	＜0.01	21.68
						猴耳环水提取物	10	0.35	1.1196±0.188	＜0.01	18.16
双黄连口服液	10	33	1.1911±0.141	＜0.05	12.94

注：*表中P值为各组与病毒对照组比较结果。

              表3  猴耳环50％乙醇提取物对小鼠流感病毒性肺炎的作用

组别	鼠数	剂量(g/kg/d)	肺指数(x±sd)	P*	抑制率(％)
						病毒对照	10	-	1.3681±0.159
正常对照	10	-	0.9552±0.206	＜0.01	-
						猴耳环提取物(大)	10	1.45	1.0065±0.101	＜0.01	27.02
猴耳环提取物(中)	10	0.70	1.0665±0.100	＜0.01	23.08
						猴耳环提取物(小)	10	0.35	1.1096±0.178	＜0.01	19.06
双黄连口服液	10	33	1.1911±0.141	＜0.05	12.94

              表4  猴耳环75％乙醇提取物对小鼠流感病毒性肺炎的作用

组别	鼠数	剂量(g/kg/d)	肺指数(x±sd)	P*	抑制率(％)
						病毒对照	10	-	1.3681±0.159
正常对照	10	-	0.9552±0.206	＜0.01	-
						猴耳环提取物(大)	10	1.45	1.0050±0.108	＜0.01	27.50
猴耳环提取物(中)	10	0.70	1.0615±0.105	＜0.01	24.00
						猴耳环提取物(小)	10	0.35	1.0996±0.184	＜0.01	19.56
双黄连口服液	10	33	1.1911±0.141	＜0.05	12.94

             表5  猴耳环95％乙醇提取物对小鼠流感病毒性肺炎的作用

组别	鼠数	剂量(g/kg/d)	肺指数(x+sd)	P*	抑制率(％)
						病毒对照	10	-	1.3681±0.159
正常对照	10	-	0.9552±0.206	＜0.01	-
						猴耳环提取物(大)	10	1.45	1.0038±0.101	＜0.01	28.42
猴耳环提取物(中)	10	0.70	1.0565±0.102	＜0.01	24.08
						猴耳环提取物(小)	10	0.35	1.0916±0.185	＜0.01	19.86
双黄连口服液	10	33	1.1911±0.141	＜0.05	12.94

注：*表中P值为各组与病毒对照组比较结果。

结论：体内实验显示，猴耳环水提取物和50％、75％、95％的乙醇溶液提取物对流感病毒性小鼠肺炎，所试大、中、小三个剂量，均有明显抑制作用(P＜0.01)。

试验例3、猴耳环提取物抗氧化生物活性的测定

1、体外抗氧化能力实验——氧自由基清除能力(ORAC)法

ORAC法是一种测定物质总抗氧能力的方法，以一种α-生育酚的水溶性类似物-Trolox(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)作为标准对照。

(1)反应试剂和供试品溶液的配制

荧光物质用75mM的磷酸钾缓冲液(75mM KH₂PO₄、75mM K₂HPO₄)配成63μM的储备液，置于4℃避光保存，测试前用该缓冲液稀释100倍。AAPH即2，2′-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，2，2′-偶氮(二眯基丙烷)二氯化氢，于实验前用75mM的磷酸钾缓冲液配成18.3mM的溶液。Trolox用75mM的磷酸钾缓冲液配成10μM的原液，测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。各种猴耳环提取物和阳性药V_C均用75mM的磷酸钾缓冲液配成100mM的原液，测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。

(2)活性的测定

本实验采用的ORAC测定参照文献[Assays for hydrophilic and lipophilicantioxidant capacity(oxygen radical absorbance capacity(ORAC_FL))of plasmaand other biological and food samples[J].J.Agric.Food Chem.2003，51(11)：3273-3279]方法进行。

实验方法：96孔板每个孔中加入不同浓度的待测样品溶液20μL，再加入75mM磷酸钾缓冲液20μL和AAPH 140μL(终浓度12.8mM)，最后加入荧光物质(disodium fluorescein)20μL(终浓度63nM)启动反应，迅速将96孔板置于荧光酶标仪(预置温度37℃)中开始测定，每组平行设3个复孔。采用动力学方式，每2min测定一个点，至荧光强度衰减为零为止。

测定结果表达为ORAC值，ORAC值越大，抗氧化能力越强。ORAC值的计算式为：

(3)实验结果

组别	ORAC
		猴耳环水提取物(62.5ug/ml)	0.60
猴耳环50％乙醇提取物(62.5ug/ml)	0.70
		猴耳环75％乙醇提取物(62.5ug/ml)	0.82
猴耳环95％乙醇提取物(62.5ug/ml)	0.80
		维生素C(0.78uM)	0.69

猴耳环水提取物和各浓度醇提取物都有一定的抗氧化能力。猴耳环50％、75％、95％乙醇提取物的抗氧化能力强于维生素C。

2、评价抗氧化活性——1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)自由基清除法

(1)DPPH·溶液和供试品溶液的配制

DPPH·用无水乙醇配成2×10^-4M的溶液，置于4℃避光保存。各猴耳环提取物和阳性药均用无水乙醇配成1mg/mL的原液，测试前用无水乙醇稀释成所需浓度。

(2)活性的测定

将不同浓度的供试品溶液100μL和2×10^-4MDPPH·溶液100μL加入96孔板各孔中，同时以不加DPPH·(以100μL无水乙醇代替DPPH·)的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设DPPH·阴性对照(以100μL无水乙醇代替供试品)，每组平行设4个复孔。将96孔板放入酶标仪中，震荡1min，并于此条件下保存(室温、避光)，30min后测试其在517nm处的吸光度OD值，按如下公式计算供试品的自由基清除率。

半数有效浓度(EC₅₀)通过不同浓度下供试品清除率计算得出，表示供试品的活性。

(3)实验结果

组别	EC50(μM)
		猴耳环水提取物	2.2
猴耳环50％乙醇提取物	1.6
		猴耳环75％乙醇提取物	1.3
猴耳环95％乙醇提取物	1.4
		维生素C	1.8

猴耳环水提取物以及各浓度醇提取物都有很强的抗氧化活性，而且猴耳环50、75、95％乙醇提取物的抗氧化活性高于维生素C。

试验结果说明：猴耳环水提取物和猴耳环50、75、95％乙醇提取物都有抗病毒和抗氧化作用，而且，95％乙醇提取物的作用最强。但95％乙醇提取物的成本最高，所以通常采用猴耳环水提取物在实际中应用。

下面的实施例说明含本发明提供的猴耳环提取物为活性成分的组合物。

制剂实施例1、片剂

取上述实施例1的猴耳环水提物的干浸膏粉为原料，

处方            干浸膏     200克

                糊精       20克

                           制成1000片

制备方法：称取处方量的辅料-糊精，以及处方量的猴耳环干浸膏混匀，加入75％乙醇50g，搅拌，过筛制粒，干燥2小时，过筛整粒。取制备好的颗粒，用14mm平充压片，每片含猴耳环干浸膏0.2g。

制剂实施例2、胶囊剂

取上述实施例2的干浸膏粉为原料

处方  猴耳环50％乙醇提取物干浸膏    400克

      糊精                          40克

                                    制成1000粒

制备方法：称取处方量的辅料-糊精，以及处方量的猴耳环干浸膏混匀，加入75％乙醇20-100g，搅拌，过筛制粒，干燥2小时，过筛整粒。取制备好的颗粒，装0号胶囊，每粒胶囊含猴耳环干浸膏0.4g。

制剂实施例3、颗粒剂

取上述实施例1的猴耳环水提取物的干浸膏粉为原料

处方  干浸膏                80g

      甘露醇                200g

      糊精                  119g

      柠檬酸                0.5g

      甜橙油                3ml

                            制成400g

制备方法：取蔗糖、甘露醇分别粉碎成细粉，过100目筛，备用。取处方量甘露醇粉、糊精、柠檬酸混匀，另取提取猴耳环干浸膏，加入上述辅料当中，搅拌，再加入85％乙醇适量，搅拌，混合均匀，过12目筛制粒，湿颗粒65～70℃干燥2小时，过10目筛整粒；取处方量甜橙油，加入适量无水乙醇(5ml左右)，混匀，喷加入步烘好的颗粒中，混匀。用颗粒分装机分装入铝箔袋中，每袋装2.0g。

制剂实施例4、糖浆剂

取上述实施例1的猴耳环水提取物的干浸膏粉为原料

处方：干浸膏                 40g

      蔗糖                   650g

      对羟基苯甲酸乙脂       0.5g

      柠檬酸                 0.5g

      甜橙油                 3ml

      蒸馏水                 适量

                             制成1000ml

制备方法：将蔗糖加入蒸馏水中，加热溶解后过滤，加干浸膏、对羟基苯甲酸乙脂、柠檬酸、甜橙油和水至定量。

制剂实施例5、口服液

取上述实施例3的猴耳环水提取物的干浸膏粉为原料

处方：干浸膏                  40g

      对羟基苯甲酸乙脂        0.5g

      柠檬酸                  1.0g

      甜菊甙                  2g

      甜橙香精                2ml

      蒸馏水                  适量

                              制成1000ml

制备方法：将干浸膏、柠檬酸、甜菊甙溶于水中，过滤，取对羟基苯甲酸乙脂溶于少量的乙醇中，加入滤液中，补加水定容，再加少许香精，混合均匀后分装。

Claims (4)

1、一种植物猴耳环用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物，在制备抗病毒药物中的应用。

2、一种植物猴耳环用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物，在制备抗氧化食品中的应用。

3、根据权利要求1或2的猴耳环提取物的应用，其特征在于其中所说的药物、食品，是一种含植物猴耳环用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物为活性成分添加常规的药用辅料或食品添加剂的组合物。

4、根据权利要求3的猴耳环提取物的应用，其特征在于，其中所说的组合物是片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂。