CN105506183A - 一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括步骤S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取几组实验浓度中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。其优点是：通过荧光素酶检测原理，采用病毒IBV-3ab-luc、感染细胞H1299作为原材料，简单、有效地筛选出抗病毒能力强的植物乙醇提取物。

Description

一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法。
背景技术
现有筛选方法主要是通过将乙醇提取物加入感染细胞，使病毒感染细胞。一定时间后观察细胞的形态，如细胞病变的情况，只能定性地了解抗病毒效果，而不能定量。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明提供筛选方便且抗病毒能力强的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法。
本发明提供了一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括步骤S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取各组中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。
本发明一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其优点是：通过荧光素酶检测原理，采用病毒IBV-3ab-luc、感染细胞H1299作为原材料，简单、有效地筛选出抗病毒能力强的植物乙醇提取物。
具体实施方式
本发明提供了一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括步骤S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取几组实验浓度中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。
下面结合实例对本发明进行详细描述，当然所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
优选地，一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括以下步骤：
步骤S1，确定细胞无毒浓度：将至少一种植物乙醇提取物分别用75％～85％的乙醇做溶剂，再等倍稀释成至少一个浓度，放入3°～5°冰箱中备用；培养至少一组细胞，将稀释好的植物乙醇提取物加入细胞中，作为对照组，放入细胞培养箱，48～52小时后，在倒置显微镜下观察经不同浓度的植物乙醇提取物处理后的细胞的形态变化；若细胞轮廓变形，粗糙，或聚合脱落视为该浓度的植物乙醇提取物对细胞有毒害，从而选取几组实验浓度中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物。
进一步地，培养细胞具体操作为：在12孔板中均用RPMI-1640培养液培养细胞H1299，且每孔的培养液体积为0.8～1.2mL；加入每孔细胞中的植物乙醇提取物的量为4.8～7.2ul。
进一步地，待细胞铺满培养板底部80％时，再将稀释后的植物乙醇提取物加入细胞；
进一步地，选取的每种植物的每个浓度至少对应一组细胞。
优选地，一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括以下步骤：
包括步骤S2，病毒感染：待多组孔板中细胞的覆盖达到80％至90％时，分别加入步骤S1中获得的植物乙醇提取物，且此植物乙醇提取物的浓度对细胞无毒影响；放入培养箱，24h后，用病毒感染细胞；
进一步地，每孔细胞中加入的植物乙醇提取物为4.8～7.2ul；
优选地，所述病毒为携带有荧光素酶基因的重组病毒IBV-3ab-luc；且每孔病毒的加入量为80～120ul；所述细胞为人肺癌细胞H1299。
优选地，一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括以下步骤：
包括步骤S3，荧光素酶检测：病毒感染细胞24h后，去上清液、洗涤，然后每孔加入细胞裂解液RLB100～120ul；刮下细胞后冻融，将细胞液转移至一无菌EP管中，涡旋、离心，取上清液至另一无菌EP管中，加入底物荧光素15～25ul，充分混合后，放入化学发光检测器中检测，至少读数3次，取平均值，最后将溶剂对照与各处理的数值相比，数量级大，表明植物乙醇提取物的抗病毒能力强，反之，则弱。
进一步地，所述洗涤采用1mL的PBS对每孔清洗2～5次；
进一步地，用枪头刮下细胞，再冻融一次；
进一步地，所述涡旋时间为15～18s，离心条件为10000rpm，2min；所取上清液15～25ul至另一新EP管中。
下面结合具体实施例为本发明作进一步说明：
实施例一：
一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括如下步骤：
步骤S1，确定细胞无毒浓度：分别选用75％乙醇浸泡麦冬根、枸杞果、车前叶、三七叶7d以上，获取麦冬根、枸杞果、车前叶、三七叶的乙醇提取物(提取方法为常规方法，在广口瓶中，压紧植物材料，根据植物的体积，以80％乙醇刚好完全淹没植物材料为标准，根据植物质量和乙醇体积，确定初始浓度分别为2.7240g/mL、3.0272g/mL、1.6080g/mL和1.8632g/mL)，将获得的4种乙醇提取物分别再用80％乙醇做溶剂等倍(2X)稀释成5个浓度(具体如下表1所示)，放入4°冰箱中备用；在12孔板中均用RPMI-1640培养液培养细胞H1299，且每孔的培养液体积为1.2mL；待细胞H1299铺满培养板底部80％时，每孔加入7.2ul稀释好的植物乙醇提取物至细胞H1299中(保证细胞液中乙醇浓度为0.48％，前期试验得出此浓度对细胞没有影响)，放入细胞培养箱，48小时后，在倒置显微镜下观察各浓度提取物处理后细胞H1299的形态变化；若细胞轮廓变形，粗糙，或聚合脱落视为该浓度的植物乙醇提取物对细胞H1299有毒害，依此确定植物乙醇提取物的最大无毒浓度，结果如下表：
表1四种植物乙醇提取物不同浓度处理细胞H129924h后细胞的形态变化
由表1数据看出：麦冬根、枸杞果、车前叶和三七叶的最大无毒浓度分别为0.3405g/mL、0.3784g/mL、0.4020g/mL和0.9316g/mL，后续用该浓度进行试验。
S2：病毒感染：待孔板中细胞的覆盖达到80％至90％时，向各孔细胞H1299中加入7.2ul步骤S1获得的最大无毒浓度的植物乙醇提取物，进行对照；放入培养箱，24h后，用120ul携带有荧光素酶基因的重组病毒IBV-3ab-luc(MOI＝0.1)感染每孔中的人肺癌细胞H1299；
S3，荧光素酶检测：病毒感染细胞24h后，去上清液,用1mL的PBS每孔清洗4次，然后每孔加入细胞裂解液RLB120ul；用枪头充分刮下细胞H1299后冻融一次，将细胞液转移至一无菌EP管中，涡旋15s，用10000rpm离心2min，取25ul上清液至另一无菌EP管中，加入底物荧光素25ul，充分混合后，迅速放入化学发光检测器中检测，读取数据3次，取平均值。抗病毒能力评价的标准：将溶剂对照与各处理的数值相比，比值的数量级数作为抑制效力参考指标，数量级大，表明植物乙醇提取物的抗病毒能力强，反之，则弱。具体结果见下表2所示：
表2不同乙醇提取物检测荧光值及抑制效力
根据实验，结论为：三七叶乙醇抑制效力达到4个数量级，提取物抗病毒效果最佳，其次为车前叶、麦冬。而枸杞果乙醇提取物几乎没有抗该病毒的效果。
实施例二：
一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括如下步骤：
步骤S1，确定细胞无毒浓度：分别选用85％乙醇浸泡鱼腥草叶、决明子、薄荷叶7d以上，获取鱼腥草叶、决明子、薄荷叶的乙醇提取物(提取方法为常规方法，在广口瓶中，压紧植物材料，根据植物的体积，以85％乙醇刚好完全淹没植物材料为标准，根据植物质量和乙醇体积，确定初始浓度分别为2.4960g/mL、1.2492g/mL和1.7488g/mL)，将获得的3种乙醇提取物分别再用80％乙醇做溶剂等倍(2X)稀释成5个浓度(具体如下表3所示)，放入3°冰箱中备用；在12孔板中均用RPMI-1640培养液培养细胞H1299，且每孔的培养液体积为1mL；待细胞H1299铺满培养板底部80％时，向每孔加入6ul稀释好的植物乙醇提取物至细胞H1299中(保证细胞液中乙醇浓度为0.48％，前期试验得出此浓度对细胞没有影响)，放入细胞培养箱，50小时后，在倒置显微镜下观察各浓度提取物处理后细胞H1299的形态变化；若细胞轮廓变形，粗糙，或聚合脱落视为该浓度的植物乙醇提取物对细胞有毒害，依此确定植物乙醇提取物的最大无毒浓度，结果如下表3：
表3三种植物乙醇提取物不同浓度处理细胞H129924h后细胞的形态变化
由表1数据看出：鱼腥草、决明子和薄荷叶的最大无毒浓度分别为0.6240g/mL、0.3123g/mL和0.2186g/mL。后续用该浓度进行试验。
S2：病毒感染：待孔板中细胞的覆盖达到80％至90％时，向各孔细胞中加入6ul步骤S1获得的最大无毒浓度的植物乙醇提取物，进行对照；放入培养箱，24h后，用100ul携带有荧光素酶基因的重组病毒IBV-3ab-luc(MOI＝0.1)感染每孔中的人肺癌细胞H1299；
S3，荧光素酶检测：病毒感染细胞24h后，去上清液,用1mL的PBS每孔清洗5次，然后每孔加入细胞裂解液RLB110ul；用枪头充分刮下细胞H1299后冻融一次，将细胞液转移至一无菌EP管中，涡旋15s，用10000rpm离心2min，取20ul上清液至另一无菌EP管中，加入底物荧光素20ul，充分混合后，迅速放入化学发光检测器中检测，读取数据5次，取平均值。抗病毒能力评价的标准：将溶剂对照与各处理的数值相比，比值的数量级数作为抑制效力参考指标，数量级大，表明植物乙醇提取物的抗病毒能力强，反之，则弱。具体结果见下表4所示：
表4不同乙醇提取物检测荧光值及抑制效力
根据实验，结论为：鱼腥草叶乙醇抑制效力达到4个数量级，提取物抗病毒效果最佳，其次为薄荷，而决明子乙醇提取物抗病毒的效果很弱。
实施例三：
一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括如下步骤：
步骤S1，确定细胞无毒浓度：分别选用一定体积80％乙醇浸泡枇杷叶、牡丹叶、红豆杉叶7d以上，获取枇杷叶、牡丹叶、红豆杉叶的乙醇提取物(提取方法为常规方法，在广口瓶中，压紧植物材料，根据植物的体积，以80％乙醇刚好完全淹没植物材料为标准，根据植物质量和乙醇体积，确定初始浓度分别为1.8456g/mL、2.1456g/mL和1.4312g/mL)，将获得的4种乙醇提取物分别再用80％乙醇做溶剂等倍(2X)，将获得的3种乙醇提取物分别再用80％乙醇做溶剂等倍稀释成5个浓度(具体如下表5所示)，放入5°冰箱中备用；在12孔板中均用RPMI-1640培养液培养细胞H1299，且每孔的培养液体积为0.8mL；待细胞H1299铺满培养板底部80％时，向每孔加入4.8ul稀释好的植物乙醇提取物至细胞H1299中(保证细胞液中乙醇浓度为0.48％，前期试验得出此浓度对细胞没有影响)，放入细胞培养箱，52小时后，在倒置显微镜下观察各浓度提取物处理后细胞H1299的形态变化；若细胞轮廓变形，粗糙，或聚合脱落视为该浓度的植物乙醇提取物对细胞H1299有毒害，依此确定植物乙醇提取物的最大无毒浓度，结果如下表5：
表5三种植物乙醇提取物不同浓度处理细胞H129924h后细胞的形态变化
由表1数据看出：枇杷叶、牡丹叶和红豆杉的最大无毒浓度分别为0.9228g/mL、0.5364g/mL和0.3578g/mL，后续用该浓度进行试验。
S2：病毒感染：待孔板中细胞的覆盖达到80％至90％时，向各孔细胞中加入4.8ul步骤S1获得的最大无毒浓度的植物乙醇提取物，进行对照；放入培养箱，24h后，用80ul携带有荧光素酶基因的重组病毒IBV-3ab-luc(MOI＝0.1)感染每孔中的人肺癌细胞H1299；
S3，荧光素酶检测：病毒感染细胞24h后，去上清液,用1mL的PBS每孔清洗3次，然后每孔加入细胞裂解液RLB100ul；用枪头充分刮下细胞H1299后冻融一次，将细胞液转移至一无菌EP管中，涡旋15s，用10000rpm离心2min，取15ul上清液至另一无菌EP管中，加入底物荧光素15ul，充分混合后，迅速放入化学发光检测器中检测，读取数据4次，取平均值。抗病毒能力评价的标准：将溶剂对照与各处理的数值相比，比值的数量级数作为抑制效力参考指标，数量级大，表明植物乙醇提取物的抗病毒能力强，反之，则弱。具体结果见下表6所示：
表6不同乙醇提取物检测荧光值及抑制效力
根据实验，结论为：红豆杉乙醇抑制效力达到3个数量级，提取物抗病毒效果最佳，其次为枇杷，达到1个数量级，而牡丹叶乙醇提取物数量级同对照相同，基本无抗病毒效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取各组中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。
2.根据权利要求1所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：包括
步骤S1，确定细胞无毒浓度：将至少一种植物乙醇提取物分别用75％～85％的乙醇做溶剂，再等倍稀释成至少一个浓度，放入3°～5°冰箱中备用；培养至少一组细胞，将稀释好的植物乙醇提取物加入细胞中，作为对照组，放入细胞培养箱，48～52小时后，在倒置显微镜下观察经不同浓度的植物乙醇提取物处理后的细胞的形态变化；若细胞轮廓变形，粗糙，或聚合脱落视为该浓度的植物乙醇提取物对细胞有毒害，从而选取几组实验浓度中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物。
3.根据权利要求2所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：所述培养感染细胞具体操作为：在12孔板中均用RPMI-1640培养液培养细胞H1299，且每孔的培养液体积为0.8～1.2mL；加入每孔细胞中的植物乙醇提取物的量为4.8～7.2ul。
4.根据权利要求2所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：选取的每种植物的每个浓度至少对应一组细胞。
5.根据权利要求1所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：包括病毒感染：待多组孔板中细胞的覆盖达到80％至90％时，分别加入步骤S1中获得的植物乙醇提取物，且此植物乙醇提取物的浓度对细胞无毒影响；放入培养箱，24h后，用病毒感染细胞。
6.根据权利要求5所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：所述病毒为携带有荧光素酶基因的重组病毒IBV-3ab-luc；且每孔病毒的加入量为80～120ul；所述感染细胞为人肺癌细胞H1299。
7.根据权利要求1所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：包括步骤S3，病毒感染细胞24h后，去上清液、洗涤，然后每孔加入细胞裂解液RLB100～120ulul；刮下细胞后冻融，将细胞液转移至一无菌EP管中，涡旋、离心，取上清液至另一无菌EP管中，加入底物荧光素15～25ul，混合后，放入化学发光检测器中检测，至少读数3次，取平均值，最后将溶剂对照与各处理的数值相比。
8.根据权利要求7所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：所述洗涤采用1mL的PBS对每孔清洗2～5次。
9.根据权利要求7所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：用枪头刮下细胞，再冻融一次。
10.根据权利要求7所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：所述涡旋时间为15～18s，离心条件为10000rpm，2min；所取上清液15～25ul至另一新EP管中。
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