CN1844371A - 冻存胚胎干细胞的复苏方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对冻存胚胎干细胞进行复苏的方法，该方法包括在复苏过程中，添加含一定浓度的糖类物质的复苏液。该方法可显著提高复苏干细胞的存活率(可使复苏成活率提高到42％左右)，且重复性好。

Description

冻存胚胎干细胞的复苏方法

技术领域

本发明涉及生物学领域，更具体地，涉及一种对冻存胚胎干细胞进行复苏的方法，该方法可显著提高复苏干细胞的存活率。

背景技术

1998年，美国威斯康星大学的科学家成功地在体外培养和扩增了人体胚胎干(hES)细胞，并证实其具有向人体三个胚层细胞分化的潜能(ThomsonJ.Itskovitg-Eldor J，Shapiro S.et.al，Embryonic stem cell lines derivedfrom human blastocysts Science 1998；282：1145-1147.)，使人们注意到hES细胞在临床应用的潜在价值。

通过对胚胎干细胞定向分化结合细胞治疗技术，有望治疗临床的某些疾病，包括神经性疾病、糖尿病、慢性心脏疾病、肾脏病、肝脏疾病、癌症和艾滋病等。同时利用干细胞及其产物细胞，还可以基因研究以及药物开发等领域。

虽然要将人胚胎干细胞用于临床治疗还比较遥远，但其潜在的巨大应用价值，吸引了各国政府和科学界的关注。关于hES细胞的研究目前仍处于起步阶段，许多技术性问题未得到解决，其中一个就是能有效保存细胞的冻存复苏技术。因为hES细胞一旦建系，便急剧扩增，需要定时传代培养。但在体外维持hES细胞未分化状态的培养条件非常苛刻，传代方法繁琐，而且hES细胞经长期培养后会出现变异，如核型改变、瘤化等问题，所以，hES细胞建系后的冷冻保存，并在复苏后保持其干细胞特性成为必须解决的急迫问题。

目前，人胚胎干细胞的体外培养和扩增技术已较成熟，但其冷冻与复苏的效果还不够理想。体外培养的hES细胞以巢状方式生长，具有界限清楚、细胞质结构简单、细胞核质比例高等特点。同时hES细胞比较是脆弱的，受到外来压力时，细胞常常会破碎，而不能生存(Brumfiel G，Just add water.Nature2004；4 Mar，428：14-15)，因而对它的保存有一定的难度。威斯康星大学的研究结果显示，在常规方法冷冻ES细胞的情况下，复苏细胞往往不能存活，成活率仅能达到10％(Brumfiel G，Just add water.Nature 2004；4 Mar，428：14-15)。

目前对ES细胞低温保存的研究不是很多，一般采用简单的两步降温法。具体方法是将DMSO和血清加入细胞悬液后放入冻存管中，置于-80℃冰箱过夜后转入液氮中保存。这种慢速冻存与快速复苏的方法对鼠胚胎干细胞的保存是有效的，但对于人ES细胞来说，存活率相对较差，未分化率在10％以下。威斯康星大学的研究结果显示，在常规方法冷冻ES细胞的情况下，复苏细胞往往不能存活，成活率仅能达到10％(Brumfiel G，Just add water.Nature 2004；4 Mar，428：14-15)。而Freshney(1994)采用如下方法：将约10-20个ES团块放入已加预冷保护剂的冻存管中，小管以-1℃/min慢速降温，降至-80℃投入液氮，37℃水浴复苏后种于新鲜培养层。这种方法成功的复苏了ES细胞并保持其基本特性，但最终仅有16％的未分化ES细胞(Freshney RI(ed)Culture of Animal cells；A manual of basic technique Wiley-Liss Inc.1994；P255-265.)。

另外，Reubinoff(2001)采用了拉伸麦管的玻璃化冻存法，未分化的ES细胞达到32％(Reubinof B.E，Pera，M.F，Vatija G and Trounson，A.O.Effectivecryopreservation of human embryonic stem cells by the open pulled strawvitrification method.Hum.Reprod 2001；2187-2194；Reubinof B.E，Pera，M.F，Fong.C.Y.et al.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation in vitro.Nature Biotechnol.，2000，18，399-405.)，但玻璃化冻存法操作复杂，比较费时费力。

因此，本领域迫切需要开发有效的对冻存胚胎干细胞进行复苏的方法，以便提高复苏干细胞的存活率。

发明内容

本发明的目的就是提供一种对冻存胚胎干细胞进行复苏的方法，该方法可显著提高复苏干细胞的存活率。

在本发明的第一方面，提供了一种冻存的干细胞进行复苏的方法，包括步骤：

(a)将冻存于液氮的干细胞，置于37±5℃的水浴中，以60-120℃/分钟(更佳地70-110℃/分钟)的速度升温至4-20℃(较佳地5-15℃)，从而使冻存的干细胞溶解；

(b)将溶解后的干细胞加至37±2℃复苏液，所述的复苏液是含0.05-0.5mol/L糖类物质的hES培养液；

(c)离心去除上清，将干细胞转移到小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上，在含0.05-0.25mol/L糖类物质的hES培养液中，于37±2℃下培养0.25-5小时；

(d)将培养液换成hES培养液继续培养。

在另一优选例中，所述的hES培养液含有20±4％敲除血清的替代品(knock-out Serum Replacement)，1±0.2％非必需氨基酸，1±0.2mM L-谷氨酰胺，0.1±0.02mM β-巯基乙醇，4±0.8ng/ml bFGF。

在另一优选例中，所述的糖类物质包括：海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、或其混合物。

在另一优选例中，所述的糖类物质包括：海藻糖、或海藻糖与选自下组的糖类的混合物：半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖。

在另一优选例中，所述的干细胞是胚胎干细胞。

在另一优选例中，所述的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。

在另一优选例中，所述的干细胞是用以下方法冻存的：将hES细胞用IV型胶原酶消化，轻轻吹打成小的细胞团块后，离心去除上清液，加入冻存液，所述冻存液含9∶1的knock-out Serum Replacement和二甲基亚砜，然后按1±0.5℃/分钟进行降温，直至-80℃，-80℃放置6-24小时后，转入液氮罐，冷冻保存。

在本发明的第二方面，提供了一种复苏液，它是含有0.05-0.5mol/L糖类物质的hES培养液，所述的糖类物质包括：海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、或其混合物，并且所述的hES培养液含有20±4％knock-out SerumReplacement，1±0.2％非必需氨基酸，1±0.2mM L-谷氨酰胺，0.1±0.02mMβ-巯基乙醇，4±0.8ng/ml bFGF。

在本发明的第三方面，提供了一种糖类物质的用途，所述的糖类物质包括：海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、或其混合物，所述的糖类物质被用于制备用于干细胞复苏的复苏液。

在另一优选例中，所述的糖类物质包括：海藻糖、或海藻糖与选自下组的糖类的混合物：半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖。

附图说明

图1A-1C显示了复苏后人ES细胞的形态学观察结果。其中图1A为常规冻存方法复苏后ES细胞状态；图1B为90％SR+10％DMSO冻存复苏后ES细胞状态；

图1C显示了90％SR+10％DMSO冻存复苏后ES细胞呈巢状生长。

图2显示了复苏后人ES细胞AKP染色示阳性反应。

图3显示了复苏后人ES细胞免疫荧光染色示阳性反应。

图4显示了复苏后人ES细胞的核型分析(46，XY)结果。

图5显示了复苏后人ES细胞形成的畸胎瘤切片包含三个胚层来源的细胞(HE染色)其中A：腺管B：软骨C：神经管。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现在复苏过程中，通过添加一定浓度的糖类物质，可以显著提高冻存胚胎干细胞的复苏存活率(可使复苏成活率提高到42％左右)，且重复性好。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“糖类物质”指醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸，或它们的混合物。糖也可以是单糖或多糖，例如二糖或多糖。合适的糖例如甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、海藻糖，或它们的衍生物。合适的多糖例如阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如土木香粉)、左聚糖、岩藻依聚糖、交叉菜聚糖、半乳糖卡诺糖(galactocarolose)、果胶、葡聚糖、石脐素、几丁质、琼脂糖。

优选的糖类物质是甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖，或其衍生物、及其组合。

更优选的糖类物质是海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、或其混合物。

在复苏液中，糖类物质的浓度通常为0.05-0.5mol/L，较佳地为0.1-0.4mol/L，更佳地为0.15-0.3mol/L。

在本发明中，使用的复苏液没有特别限制，可以是目前本领域中用于复苏细胞的任何一种复苏液，只要其中添加了本发明所述浓度的糖类物质。优选的复苏液是添加了糖类物质的hES培养液。一种常用的hES培养液的配方如下：hES培养液为knock-out DMEM，含20％knock-out Serum Replacement(购自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)，商品编号：10828-028)，1％非必需氨基酸(Non-essential Amino Acids)，1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇，4ng/mlbFGF。

在复苏步骤中，可以将解冻溶解后的胚胎干细胞置于本发明所述的复苏液中10分钟-5小时，较佳地0.5-2小时。然后转移至常规的胚胎干细胞培养液中培养。在另一优选例中，可以在复苏之后和常规培养之间，增加一个或多个过渡步骤，即将复苏后的胚胎细胞置于糖类物质浓度依次降低的胚胎干细胞培养液中，并在每种糖类物质浓度下培养10分钟-5小时，较佳地0.5-2小时。

在本发明中，适用的细胞的冻存方法没有特别限制，可以是常规的两步降温法，也可以是其他的冻存方法。在一个优选例中，使用缓慢降温冻存法，即将人ES细胞放入SR和DMSO按9∶1比例配制的冷冻保护剂中，以1℃/min慢速降温，至-80℃投入液氮。

至于冷冻-复苏的其他步骤、材料和参数(如细胞离心去除上清的步骤等)，可以参照本领域目前的常规方法。

本发明的主要优点在于：

(1)冻存胚胎干细胞的复苏存活率，可使复苏成活率提高到42％左右

(2)操作简便。

(3)重复性好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

通用材料和方法

人胚胎干细胞(hES)：H1，购自美国威斯康星WiCell研究中心(美国NIH胚胎干细胞注册名WA01)，该胚胎干细胞衍生自人桑葚胚的内细胞团。

hES培养液为knock-out DMEM，含20％knock-out Serum Replacement(购自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)，商品编号：10828-028)，1％非必需氨基酸(Non-essential Amino Acids)，1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇，4ng/mlbFGF。

饲养层为丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞。37℃、5％CO₂培养，5-7天常规传代。

实施例1

细胞冻存

冻存液：将敲除血清的替代品(knock-out Serum Replacement，简称为SR)、二甲基亚砜(DMSO)按照9∶1比例混合，置于冰上，预冷。

取不同传代数的hES细胞(各20-25个ES细胞克隆)进行冻存，实验重复3次(见表1)。方法如下：

取生长良好的hES细胞，1mg/ml IV型胶原酶消化，将克隆移至eppendorf管中，滴加培养液，轻轻吹打成小的细胞团块，1000rpm/分钟离心3分钟，弃上清液，将冻存液逐滴缓慢加入管中，并不断摇匀。迅速将细胞悬液转至冻存管，放入程序降温盒内，按1℃/分钟进行降温，直至-80℃。-80℃过夜，第二天将其转入液氮罐，冷冻保存。

实施例2

细胞复苏

自液氮中取出实施例1制备的冻存管，迅速置于37℃水浴，不断摇动至溶解，75％酒精棉擦洗管壁(升温速度约为100℃/分钟)。然后将细胞缓慢加入复苏液(复苏液是含0.2mol/L海藻糖的hES培养液)，1000rpm/分钟离心3分钟，弃上清。将ES细胞转移至预先准备好的饲养层上，以含0.1mol/L海藻糖的hES培养液培养，培养1小时后换常规hES培养液。

实施例3

复苏后人ES细胞的形态学观察和特性测定

一、方法

(a)复苏后人ES细胞的形态学观察

应用相差显微镜来观察复苏后细胞的存活及分化情况。培养8天后计算克隆形成率。

克隆形成率＝复苏后未分化ES克隆数目/冻存前ES克隆总数×100％

(b)复苏后人ES细胞的特性测定

(1)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)染色

按Xu等人的方法(Xu X，Tsung HC，Yan Yc.Establishment anddifferentiatin of murine EG cell lines derived from primordial germcells.Acta Biologiae Exper Sinica 1999；32：251-63)，用NBT和BCIP(Sigma公司)作为底物和染色剂，进行AKP活性鉴定。

(2)免疫细胞化学

SSEA-4、Oct-4单抗(DSHB)购自Iowa大学生物科学院。用含1％BSA(Invitrogen)的PBS，按15ng/ml比例储存备用。二抗为兔抗鼠IgG-FITC。

按Solter等人的方法(Solter D，Knowles BB.Monoclonal antibodydefining a stage-specific mouse embryonic antigen(SSEA-1).Proc NatlAcad Sci USA.1987，75：5565-9.)，进行免疫荧光染色。

(3)核型检测

0.5ug/ml秋水仙素作用6小时，1mg/ml IV型胶原酶消化10分钟，解剖镜下收集ES细胞。低渗、固定、制片、G-带分析按常规方法进行。

二、结果

1.人ES细胞克隆形成率

人ES细胞复苏后细胞集落较常规方法保存所得集落完整(图1A、1B)，细胞透亮。细胞集落贴壁后呈巢状生长。(图1C)

细胞复苏率见表1。平均为42％。而分化克隆的比例较低，仅20％。这表明绝大多数复苏并存活的克隆是未分化的hES克隆。

表1hES细胞复苏后的克隆形成率

试验	冻存克隆数	复苏后7天的培养克隆数目	复苏后
					hES克隆	分化克隆
			1(22代)2(28代)3(38代)	202525			121517	8(40％)11(44％)11(44％)	4(20％)4(16％)6(24％)
平均	23.3	14.7			10(42％)	4.6(20％)

2.复苏后人ES细胞仍维持干细胞特性

ES细胞复苏后，AKP染色结果呈紫蓝色，为阳性(图2)；SSEA-4，0ct-4免疫荧光染色呈亮绿色，也为阳性(图3)。

核型分析结果显示，冻存复苏后人ES细胞核型正常，为46，XY(图4)。裸鼠体内分化实验结果证明ES细胞仍具有分化成3个胚层细胞的能力(图5)。

实施例4-7

不同海藻糖浓度下的复苏

重复实施例1-3，不同点在于改变复苏液中海藻糖的浓度，结果如表2所示。

表2

实施例	复苏液中海藻糖浓度	冻存克隆数(皆为28代)	复苏后7天的培养克隆数目	复苏后hES克隆比例
					4	0.25mol/L	20	13	9/20(45％)
5	0.30mol/L	20	12	8/20(40％)
					6	0.15mol/L	20	11	8/20(40％)
7	0.10mol/L	20	12	7/20(35％)

这表明，当海藻糖浓度为0.1-0.3mol/L时，都可显著提高复苏率。核型分析结果显示，冻存复苏后人ES细胞核型正常，为46，XY。

实施例8-10

不同的糖类物质下的复苏

重复实施例1-3，不同点在于改变用不同的糖类物质替换复苏液中的海藻糖，结果如表3所示。

表3

实施例	复苏液中的糖类物质和浓度	冻存克隆数(皆为28代)	复苏后7天的培养克隆数目	复苏后hES克隆比例
					8	0.2mol/L蔗糖	20	11	4/20(20％)
9	0.2mol/L海藻糖	20	12	9/20(45％)
					10	0.2mol/L海藻糖+0.05mol/葡萄糖	20	12	8/20(40％)

核型分析结果显示，冻存复苏后人ES细胞核型正常，为46，XY。

实施例11-13

不同的糖类物质下的复苏

重复实施例1-3，不同点在于，将ES细胞转移至预先准备好的饲养层上之后，用含0.15mol/L(实施例11)、0.05mol/L(实施例12)、0mol/L海藻糖的hES培养液培养替换以含0.1mol/L海藻糖的hES培养液。

结果表明，复苏率为35-45％，平均40％。核型分析结果显示，冻存复苏后人ES细胞核型正常。

实施例14

不同的冷冻条件下的复苏

重复实施例1-3，不同点在于，用两步降温法替换实施例1中的细胞冻存法：两步降温法的具体步骤如下：将DMSO和血清加入细胞悬液后放入冻存管中，置于-80℃冰箱过夜后转入液氮中保存。

结果表明，复苏率为25-30％。核型分析结果显示，冻存复苏后人ES细胞核型正常。

讨论

对于冻存的人胚胎干细胞，快速复苏后置于含海藻糖的hES培养液中，可以显著提高复苏率。尤其是配合特定的缓慢降温冻存法(即将人ES细胞放入SR和DMSO按9∶1比例配制的冷冻保护剂中，以1℃/min慢速降温，至-80℃投入液氮)，可得到高达40％的复苏率。

在复苏中使用的海藻糖，具有保护细胞在脱水、冷冻等情况下不受破坏的功能。在优选例中，本发明人在复苏液中添加含0.2mol/L海藻糖，并使用含有0.1mol/L海藻糖的hES培养液继续培养1小时，以稳定ES细胞膜，减少渗透压改变对细胞的损伤，提高了细胞的存活率。

由于hES细胞的复杂性，在对其保存的过程中还有许多因素需要考虑。首先冻存时细胞集落不易过大，且细胞状态要好。集落过大时，保护剂不能渗入团块内部细胞而起不到保护作用，而外部细胞已受到损伤。

另外，在优选例中，冻存方法首次应用90％SR、10％DMSO的冷冻保护剂以促进复苏后的克隆形成。本发明人的试验提示，SR替代血清培养人ES细胞，能抑制ES细胞的分化，促进ES克隆的形成。SR结合bFGF后可促进ES细胞增殖，并提高其克隆形成率。因此，用90％SR、10％DMSO作为冷冻保护剂来保存ES细胞是有效的，优于常规的两步降温法。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种冻存的干细胞进行复苏的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将冻存于液氮的干细胞，置于37±5℃的水浴中，以60-120℃/分钟的速度升温至4-20℃，从而使冻存的干细胞溶解；

(b)将溶解后的干细胞加至37±2℃复苏液，所述的复苏液是含0.05-0.5mol/L糖类物质的hES培养液；

(c)离心去除上清，将干细胞转移到小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上，在含0.05-0.25mol/L糖类物质的hES培养液中，于37±2℃下培养0.25-5小时；

(d)将培养液换成hES培养液继续培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的hES培养液含有20±4％knock-out Serum Replacement，1±0.2％非必需氨基酸，1±0.2mM L-谷氨酰胺，0.1±0.02mMβ-巯基乙醇，4±0.8ng/ml bFGF。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的糖类物质包括：海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、或其混合物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的糖类物质包括：海藻糖、或海藻糖与选自下组的糖类的混合物：半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞是胚胎干细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞是用以下方法冻存的：将hES细胞用IV型胶原酶消化，轻轻吹打成小的细胞团块后，离心去除上清液，加入冻存液，所述冻存液含9∶1的knock-out Serum Replacement和二甲基亚砜，然后按1±0.5℃/分钟进行降温，直至-80℃，-80℃放置6-24小时后，转入液氮罐，冷冻保存。

8.一种复苏液，其特征在于，它是含有0.05-0.5mol/L糖类物质的hES培养液，所述的糖类物质包括：海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、或其混合物，并且所述的hES培养液含有20±4％knock-out Serum Replacement，1±0.2％非必需氨基酸，1±0.2mM L-谷氨酰胺，0.1±0.02mMβ-巯基乙醇，4±0.8ng/mlbFGF。

9.一种糖类物质的用途，所述的糖类物质包括：海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、或其混合物，其特征在于，用于制备用于干细胞复苏的复苏液。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的糖类物质包括：海藻糖、或海藻糖与选自下组的糖类的混合物：半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖。

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