CN1815198A - 一种用氢化物发生－原子光谱法测量血铅含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用氢化物发生－原子光谱法测定血样中铅含量的方法，包括第一步血样的前处理，在离心管里加载流，然后加血样并进行振荡使其混合均匀，静置2～10分钟后离心处理，得到样品待测液；第二步标准曲线的建立，用1000毫克/升铅标准溶液逐级稀释到10微克/升，用氢化物发生－原子光谱法测定得到铅的标准曲线；第三步样品测定，使用氢化物发生法－原子光谱法测定仪测定样品待测液，与标准系列比较定量。该方法使用的前处理手段，大大简化了操作，改进了试剂配比，扩大了测量的可用酸度范围。整个测量方法操作简单，便捷迅速，具有很好的稳定性和可靠性，测定数据的重复性和准确性高，而且实验成本低廉，是一种非常适合推广到基层医疗机构测定血铅的方法。
Description
技术领域
本发明提供了一种酸蛋白沉淀法处理血样，然后用氢化物发生-原子光谱法测定血样中铅含量的方法。
背景技术
铅是一种著名的有毒元素，可以造成消化道，造血系统与神经系统受损，对人体(特别是儿童)危害很大。但同时铅又被广泛使用于蓄电池、汽油抗震剂、合金、放射性防护等领域，短期内无法彻底消除。这就造成了较为严重的铅中毒，特别是处于生长发育阶段的儿童，铅中毒的比例很高，很有可能危害我国的整体人口素质。铅中毒的防治包括初级预防(停止使用含铅汽油、用具和油漆等)和次级预防(在妇幼卫生保健项目和其他公共卫生项目进行儿童铅中毒筛查)以及采取非药物方法治疗铅中毒等手段预防儿童铅中毒。进行次级预防，就需要检测人体内的铅含量，为政府制定有关法律法规，防治铅中毒提供科学依据。另一方面，对病人进行临床铅含量检测，将有助于判定病因，为制定正确的治疗方案提供有力依据。
当前检测人体铅含量主要依靠对血铅的检测，主要方法有锌原卟啉法、微分电位溶出法、石墨炉原子吸收法、氢化物发生-原子光谱法等。其中前两种方法检出限较高，测定准确度较差，现在已经很少使用；石墨炉原子吸收法是当前血铅测定的标准方法，但其仪器成本较高，操作较为复杂，在我国这样的发展中国家难于推广到基层单位。近年来氢化物发生-原子光谱法用于血铅测定已经有了较好的实践，这一方法能够真正做到微量、准确、廉价、便利的测量血铅，所以非常易于推广。
当前，采用氢化物发生-原子光谱法测血铅仍存在一些缺陷，主要集中在两个方面：首先是氢化物发生-原子光谱法测血铅时要求对样品进行消解，消解过程耗时长且易污染，酸也无法赶干净；另一方面，氢化物发生测血铅时对反应的酸度要求非常苛刻，可用酸度范围小于0.5％(体积百分比)，稍有偏差就会造成测量结果显著偏低。
发明内容
本发明的目的是提供一种氢化物发生-原子光谱法测量血铅含量的方法。本发明所述方法的目的是通过以下技术方案实现：
一种用氢化物发生-原子光谱法测量血铅含量的方法，步骤分为第一步血样的前处理、第二步标准曲线的建立和第三步样品测定。所述第一步血样的前处理是在清洗后的离心管里每支加2.9毫升～2.95毫升的载流，然后加50～100微升血样并进行振荡混合均匀，再静置2～10分钟，然后在3000～12000转/分转速下离心2～15分钟，得到澄清透明的样品待测液；第二步标准曲线的建立，用1000毫克/升的铅标准溶液逐级稀释为0～10微克/升的不同浓度的标准溶液，用氢化物发生-原子光谱法测定得到铅的标准曲线，该过程包括载流携带标准溶液到反应块处跟还原剂反应，生成气态的铅的氢化物，然后气态的铅氢化物被载气送到原子化器中原子化，用原子光谱法测得相应的光谱信号，用标准溶液浓度和光谱信号作图就可得到铅的标准曲线；第三步样品测定，使用氢化物发生法-原子光谱法测定样品待测液，该过程包括载流携带样品待测液到反应块处跟还原剂反应，生成气态的铅的氢化物，然后气态的铅氢化物被载气送到原子化器中原子化，用原子光谱法测得相应的光谱信号，与标准曲线比较定量。
其中，所述还原剂的组分为10克/升-30克/升的氢氧化钠或氢氧化钾、5克/升-30克/升的硼氢化钾或硼氢化钠、10克/升-30克/升的铁氰化钾和5克/升-20克/升的弱酸；
所述弱酸是酒石酸、草酸或硼酸。
所述载流是体积百分比为1.0％～4.5％的无机强酸溶液。
所述无机强酸是盐酸、硝酸、高氯酸或硫酸。
本发明使用了一种新的简单便捷的血样处理方法，而且通过反复实验，得到一种新型的试剂配比，扩大了测量的可用酸度范围，使得测定的数据更加稳定可靠，实验的耗材也非常廉价，方法准确、快速、便利，非常适合于在基层医疗单位推广。
本发明与标准的石墨炉原子吸收方法比较，操作简单，快速而且准确性高，测定数据的重复性和平行性好；主要的是仪器的价格便宜，操作方法简单便于掌握，实验的耗材是普通的化学试剂，成本低廉，非常适合于在基层的医疗机构推广。
本方法与传统的氢化物发生-原子光谱方法相比，具有以下优点：
1.本发明的血样前处理方法避免了传统氢化物发生-原子光谱测铅方法要对血样进行长时间复杂的消解过程，降低了污染的可能性，而且避免了赶酸不完全的问题。
2.改进了氢化物发生反应的试剂，使氢化物发生反应的可用酸度范围扩展到1.5％(体积百分比)，保证了测量过程的稳定性和可靠性。
3.本发明的方法可以将载流加入离心管中加盖保存，便于携带和保存，采取血样时可以很方便的将血样采到加载流的离心管中，加盖避免被污染。使用容量大的离心机，一次可以离心处理100多个样品，可极大提高测量的速度。
4.本发明的方法使用的实验耗材都是非常普通，价格低廉，大大降低了经济成本。
具体实施方式
本发明所述的用氢化物发生-原子光谱法测量血铅含量的方法，包括：第一步血样的前处理，第二步标准曲线的建立，第三步样品测定。
第一步血样的前处理，是在清洗后的离心管里每支加2.9毫升～2.95毫升的载流，然后加50～100微升血样并进行振荡混合均匀，再静置2～10分钟，然后在3000～12000转/分转速下离心2～15分钟，得到澄清透明的样品待测液；第二步标准曲线的建立，用1000毫克/升的铅标准溶液逐级稀释为0～10微克/升的不同浓度的多个标准溶液，一般可取3-6个点，用氢化物发生-原子光谱法测定得到铅的标准曲线，该过程包括载流携带标准溶液到反应块处跟还原剂反应，生成气态的铅的氢化物，然后气态的铅氢化物被载气送到原子化器中原子化，用原子光谱法测得相应的光谱信号，用标准溶液浓度和光谱信号作图就可得到铅的标准曲线；第三步样品测定，使用氢化物发生法-原子光谱法测定样品待测液，该过程包括载流携带样品待测液到反应块处跟还原剂反应，生成气态的铅的氢化物，然后气态的铅氢化物被载气送到原子化器中原子化，用原子光谱法测得相应的光谱信号，与标准曲线比较定量。
所述振荡可采用旋涡混合器或超声混合器等设备，振荡时间大约10-60秒即可。
本发明所述的测定血铅含量的方法是在已有技术方案基础上，研究了酸度、载气流量、屏蔽气流量、还原剂配比、空心阴极灯电流等因素的影响，从而得到氢化物发生法测定血铅的条件；并且考察了干扰离子的影响，全血中常见的二价阳离子：镁(Mg2+)、铁(Fe3+)、锌(Zn2+)、钴(Co2+)、镉(Cd2+)、镍(Ni2+)、钙(Ca2+)、铜(Cu2+)等8种离子，它们的生理浓度对原子荧光测定铅无明显的干扰，因此本方法具有较好的选择性。本方法改进了原有的氢化物发生试剂，其中第二、三步使用的还原剂的主要组分有：10克/升-30克/升的氢氧化钠或氢氧化钾，5克/升-30克/升的硼氢化钾或硼氢化钠，10克/升-30克/升的铁氰化钾和加入5克/升-20克/升弱酸。
所述弱酸可以是酒石酸、草酸或硼酸等。
所述载流是体积百分比为1.0％～4.5％的无机强酸溶液，如盐酸、硝酸、高氯酸或硫酸等。
本发明中使用的实际血样为抽取的静脉血或末梢血、或采用肝素或乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的静脉血，其中抗凝的静脉血可直接测量或放在冰箱中保存一段时间(不得超过3个月)后测量。
为检验方法的准确性，采用的标准物质来自中国疾病预防控制中心的冻干牛血GBW09139和GBW09140，它们的标定值分别为96±20ppb和248±35ppb。
实施例1
第一步血样的前处理，在清洗后的离心管里每支加2.9毫升的体积百分比为3.5％的硝酸为载流，然后加100微升血样，相当于稀释30倍，另外取4支清洗后的离心管，每支加3毫升的体积百分比为3.5％的硝酸，作为试剂空白，将上述所有离心管都在旋涡混合器上振荡混合30秒，再静置10分钟，然后在3000转/分下离心10分钟，离心完毕，得到澄清透明的样品待测液，将离心管取出放在样品架上待测；
第二步标准曲线的建立，用体积百分比为3.5％的硝酸逐级稀释1000毫克/升的铅标准溶液(GBW08611)到10微克/升，然后取0、2、4、8、10微克/升五个点，以30克/升氢氧化钠+10克/升硼氢化钾+20克/升铁氰化钾+10克/升硼酸为还原剂，体积百分比为3.5％的硝酸(HNO3)为载流，用顺序注射氢化物发生-原子荧光光谱仪(见专利号CN01274858.7，发明名称“用于原子荧光光谱仪的顺序注射进样装置”)测定即可得到铅的标准曲线，仪器的条件设定见表1，顺序注射的条件设定见表2。
第三步样品测定，采用顺序注射氢化物发生-原子荧光光谱仪，使用与第二步相同的条件测量样品待测液，得到血样中的铅含量。
下面介绍一组样品的实验数据，在实验中，采用氢化物发生-原子荧光光谱法测定2份标准冻干牛血样品和14份肝素抗凝的静脉血样，每份血样作2个平行。同时用石墨炉原子吸收法测量了14份肝素抗凝的静脉血样，得到的测定结果示于表3。
由表3可知，本方法测得的GBW09139、GBW09140两组血铅值均落在标物的不确定度范围内，说明该方法准确可靠。另外，由表4可知，石墨炉原子吸收和氢化物发生-原子荧光两种方法的血铅测定结果经过配对t检验，得到t＝-1.84，P＝0.088＞0.05，在95％的置信区间范围内，因此这两种方法测定血铅含量没有显著性差异，这也证明了本发明提供的方法的可靠性。
表1.氢化物发生-原子荧光测铅仪器条件
| 总电流(mA) | 40～80 | 载气(mL/min) | 300～800 |
| 辅阴极电流(mA) | 15～40 | 屏蔽气(mL/min) | 600～1000 |
| 负高压(V) | 250～300 | 积分时间(s) | 5～12 |
| 炉体高度(mm) | 8～12 | 采样延迟(s) | 1～3 |
| 进样量(mL) | 0.8 | 读数方式 | 峰面积 |
表2.氢化物发生-原子荧光测铅的顺序注射条件
| 时间(s) | 样品注射泵 | 多位阀位 | 还原剂注射泵 | 蠕动泵速 | 读数 | 自动配制 | |||||
| 阀位 | 动作 | 体积 | 阀位 | 动作 | 体积 | 样品 | 空白 | ||||
| 1 | A | 吸 | 1.5 | G | B | 吸 | 0 | 130 | |||
| 1 | B | 吸 | 0.8 | G | B | 吸 | 0 | 0 | |||
| 1 | B | 推 | 2.3 | E | B | 推 | 0 | 0 | |||
| 0.5 | A | 吸 | 1.6 | G | B | 吸 | 1.85 | 130 | √ | ||
| 0.5 | B | 吸 | 0.8 | G | B | 吸 | 1 | 0 | √ | ||
| 0.5 | B | 吸 | 1.2 | G | B | 推 | 0.5 | 0 | |||
| 6 | B | 推 | 3.6 | B | A | 推 | 2.35 | 140 | √ | ||
表3.石墨炉原子吸收与氢化物发生-原子荧光血铅实验结果对照
| 样本编号 | 石墨炉原子吸收(微克/升) | 原子荧光(微克/升) |
| GBW09139(96±20微克/升) | 93±6(S.D.) | |
| GBW09140(248±35微克/升) | 255±4(S.D.) | |
| 血样1 | 52.8 | 51.4 |
| 血样2 | 56.5 | 59.1 |
| 血样3 | 41.6 | 41.1 |
| 血样4 | 37.2 | 42.2 |
| 血样5 | 38.6 | 56.7 |
| 血样6 | 66.5 | 54.5 |
| 血样7 | 36.3 | 40.1 |
| 血样8 | 54.7 | 67.7 |
| 血样9 | 95.5 | 95.4 |
| 血样10 | 46.0 | 53.4 |
| 血样11 | 61.5 | 59.1 |
| 血样12 | 49.8 | 55.4 |
| 血样13 | 28.6 | 36.4 |
| 血样14 | 139.4 | 142.1 |
表4.配对t检验结果
| 配对 | 平均值 | 标准偏差 | 标准误差平均值 | 95％的置信区间 | t值 | P |
| 石墨炉原子吸收-氢化物发生-原子荧光 | -3.54 | 7.20 | 1.92 | -7.70＜t＜0.61 | -1.84 | 0.088 |
实施例2：
第一步血样的前处理，在清洗后的离心管里每支加2.95毫升的体积百分比为4.5％的盐酸为载流，然后加50微升血样，相当于稀释60倍，另外取4支清洗后的离心管，每支加3毫升的体积百分比为4.5％的盐酸，作为试剂空白，将上述所有离心管都在超声振荡器上振荡混合60秒，再静置2分钟，然后在10000转/分下离心5分钟，离心完毕，得到澄清透明的样品待测液，将离心管取出放在样品架上待测；
第二步标准曲线的建立，用体积百分比为4.5％的盐酸逐级稀释1000毫克/升的铅标准溶液(GBW08611)到10微克/升，然后取0、2、4、8、10微克/升五个点，以30克/升氢氧化钾+30克/升硼氢化钠+30克/升铁氰化钾+5克/升草酸为还原剂，体积百分比为4.5％的盐酸为载流，用氢化物发生-原子吸收光谱仪测定即可得到铅的标准曲线，仪器的条件设定见表5。
第三步样品测定，采用氢化物发生-原子吸收光谱仪，使用与第二步相同的条件测量样品待测液，得到血样中的铅含量。
本实施例方法测得的GBW09139、GBW09140两组血铅值分别是91和243，均落在标物的不确定度范围内，说明该方法准确可靠。
表5.氢化物发生-原子吸收仪器条件
| 波长 | 283.3nm | 光谱能带 | 0.4nm |
| 灯电流 | 3.0mA | 载气流速 | 160ml/min |
| 石英管加热电压 | 150V |
实施例3
第一步血样的前处理，在清洗后的离心管里每支加2.95毫升的体积百分比为2％的高氯酸为载流，然后加50微升血样，相当于稀释60倍，另外取4支清洗后的离心管，每支加3毫升的体积百分比为2％的高氯酸，作为试剂空白，将上述所有离心管都在超声振荡器上振荡混合50秒，再静置4分钟，然后在8000转/分下离心7分钟，离心完毕，得到澄清透明的样品待测液，将离心管取出放在样品架上待测；
第二步标准曲线的建立，用体积百分比为2％的高氯酸逐级稀释1000毫克/升的铅标准溶液(GBW08611)到10微克/升，然后取0、2、4、8、10微克/升五个点，以15克/升氢氧化钾+5克/升硼氢化钠+10克/升铁氰化钾+20克/升酒石酸为还原剂，体积百分比为2％的高氯酸为载流，用氢化物发生-原子荧光光谱仪测定即可得到铅的标准曲线，仪器的条件设定见表6。
第三步样品测定，采用氢化物发生-原子荧光光谱仪，使用与第二步相同的条件测量样品待测液，得到血样中的铅含量。
本实施例方法测得的GBW09139、GBW09140两组血铅值分别是99和263，均落在标物的不确定度范围内，说明该方法准确可靠。
表6.氢化物发生-原子荧光测铅仪器条件
| 总电流(mA) | 40～80 | 载气(mL/min) | 300～800 |
| 辅阴极电流(mA) | 15～40 | 屏蔽气(mL/min) | 600～1000 |
| 负高压(V) | 250～300 | 积分时间(s) | 5～12 |
| 炉体高度(mm) | 8～12 | 采样延迟(s) | 1～3 |
| 进样量(mL) | 1.2 | 读数方式 | 峰面积 |
实施例4
第一步血样的前处理，在清洗后的离心管里每支加2.95毫升的体积百分比为1％的硫酸为载流，然后加50微升血样，相当于稀释60倍，另外取4支清洗后的离心管，每支加3毫升的体积百分比为1％的硫酸，作为试剂空白，将上述所有离心管都在旋涡混合器上振荡混合50秒，再静置4分钟，然后在12000转/分下离心2分钟，离心完毕，得到澄清透明的样品待测液，将离心管取出放在样品架上待测；
第二步标准曲线的建立，用体积百分比为1％的硫酸逐级稀释1000毫克/升的铅
标准溶液(GBW08611)到10微克/升，然后取0、2、4、8、10微克/升五个点，以10克/升氢氧化钾+20克/升硼氢化钠+15克/升铁氰化钾+5克/升柠檬酸为还原剂，体积百分比为1％的硫酸为载流，用氢化物发生-电感耦合等离子体发射光谱仪测定即可得到铅的标准曲线，仪器的条件设定见表7。
第三步样品测定，采用氢化物发生-电感耦合等离子体发射光谱仪，使用与第二步相同的条件测量样品待测液，得到血样中的铅含量。
本实施例测得的GBW09139、GBW09140两组血铅值分别是89和261，均落在标物的不确定度范围内，说明该方法准确可靠。
表7.氢化物发生-电感耦合等离子体发射光谱仪条件
| 功率 | 1.2kW | 波长 | 220.353nm |
| 观察高度 | 11mm | 载气压力 | 360kPa |
| 冷却气流速 | 14L/min |
Claims (5)
1.一种用氢化物发生-原子光谱法测量血铅含量的方法，步骤分为第一步血样的前处理、第二步标准曲线的建立和第三步样品测定，其特征在于：所述第一步血样的前处理是在清洗后的离心管里每支加2.9毫升～2.95毫升的载流，然后加50～100微升血样并进行振荡混合均匀，再静置2～10分钟，然后在3000～12000转/分转速下离心2～15分钟，得到澄清透明的样品待测液；第二步标准曲线的建立，用1000毫克/升的铅标准溶液逐级稀释为0～10微克/升的不同浓度的标准溶液，用氢化物发生-原子光谱法测定得到铅的标准曲线，该过程包括载流携带标准溶液到反应块处跟还原剂反应，生成气态的铅的氢化物，然后气态的铅氢化物被载气送到原子化器中原子化，用原子光谱法测得相应的光谱信号，用标准溶液浓度和光谱信号作图就可得到铅的标准曲线；第三步样品测定，使用氢化物发生法-原子光谱法测定样品待测液，该过程包括载流携带样品待测液到反应块处跟还原剂反应，生成气态的铅的氢化物，然后气态的铅氢化物被载气送到原子化器中原子化，用原子光谱法测得相应的光谱信号，与标准曲线比较定量。
2.根据权利要求1所述的测定血铅含量的方法，其特征在于：所述还原剂的组分为10克/升-30克/升的氢氧化钠或氢氧化钾、5克/升-30克/升的硼氢化钾或硼氢化钠、10克/升-30克/升的铁氰化钾和5克/升-20克/升的弱酸。
3.根据权利要求2所述的测定血铅含量的方法，其特征在于：所述弱酸是酒石酸、草酸或硼酸。
4.根据权利要求1或2或3所述的测定血铅含量的方法，其特征在于：所述载流是体积百分比为1.0％～4.5％的无机强酸溶液。
5.根据权利要求4所述的测定血铅含量的方法，其特征在于：所述无机强酸是盐酸、硝酸、高氯酸或硫酸。
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