CN1810835A - 兔抗人smn全长多克隆抗体的优选与提取法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兔抗人SMN全长多克隆抗体的优选与提取法，属对脊髓性肌萎缩症的早期基因诊断疾病、SMN蛋白功能研究及疾病预后判断的方法。兔抗人SMN全长多克隆抗体选用涵盖1至294位氨基酸的全长SMN蛋白来制备抗体，针对SMN蛋白的所有功能区。采用制备正常人全长编码区cDNA片段，引物设计及His基因融合载体的选择，制备目的基因片段，并纯化His基因融合蛋白及收集目的蛋白，最终制备并纯化兔抗人SMN全长多克隆抗体，并使兔抗人SMN多克隆抗体得以应用。本发明抗体的特异性和敏感性，有助于SMN蛋白功能及发病机制研究，早期快速诊断及预后判断，对于脊髓性肌萎缩症今后的治疗方面的研究有着极积的作用。

Description

兔抗人SMN全长多克隆抗体的优选与提取法

技术领域

本发明涉及早期基因诊断疾病、SMN蛋白功能研究及疾病预后判断的方法，具体的说是对脊髓性肌萎缩症的兔抗人SMN全长多克隆抗体的优选与提取法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一类以脊髓前角α-运动神经元退行性变、肢体近端无力、萎缩为主要特征的遗传性疾病，临床表现为进行性对称性肌无力及肌萎缩，近端重于远端，下肢重于上肢。儿童期起病的SMA呈常染色体隐性遗传，群体发病率为1/6000-1/10000，携带者频率为1/40-1/60。根据发病年龄和病情的轻重，临床上将儿童期起病的SMA分为3型：I型患儿多在2岁内死于呼吸肌麻痹；II、III型虽然病情相对较轻，但晚期严重致残，生活自理能力差，给社会和家庭带来极大负担。

运动神经元生存蛋白基因(survival of motor neuron，SMN)为儿童型SMA的致病基因，该基因定位于5q11.2-13.3区域，编码含294个氨基酸的SMN蛋白，SMN蛋白在哺乳动物组织中广泛表达，与其它多种蛋白相结合形成蛋白复合体，参与机体mRNA的剪接过程，是维持机体正常生命活动的必须成份，完全缺失SMN的个体将在胚胎期即死亡。在病人中进行SMN蛋白表达研究发现，SMN蛋白下降水平与疾病严重程度相关，即患者病情越重，其外周血及肌肉组织中SMN蛋白含量越低，病情较轻者其SMN蛋白含量较高。多年来本病在治疗上一直未取得突破，其主要原因在于SMN蛋白功能及SMN表达调控机制未阐明。因此只有进行SMN蛋白功能的研究，从而揭示SMA发病机制，才能从根本上解决SMA的早期诊断、预后判断和治疗等问题。

研究SMN蛋白的功能及其致病机制，高质量的SMN抗体是必备条件。由于SMN蛋白不同区域其功能不同，如氨基端主要与蛋白在细胞内正确定位有关，中间的核心区域是剪接体蛋白装配与合成的关键，而羧基端则与SMN蛋白自身聚积和稳定性有关。

从包括中国专利在内的有关资料检索表明，目前国内尚无现成的SMN抗体，而国外学者制备的SMN抗体均为羧基端或氨基端多肽抗体，此类抗体制备时仅需合成数十个氨基酸的多态去免疫家兔，制备工艺较为简单、快速，但由于无法同时涵盖SMN蛋白的三个不同的关键区域，因此这类抗体的敏感性及特异性均较低，限制了抗体使用的深度和广度，如仅能用于细胞免疫荧光染色或仅能用于免疫组化，并且容易导致假阳性或假阴性结果，因此不是最佳的SMN抗体。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是在SMN基因中扩增出其全长编码序列，并进行兔抗人SMN全长多克隆抗体的优选与提取法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：制备抗体，首先必须合成制备抗体所需的蛋白。选用哪一段蛋白来制备抗体及如何合成正确序列的蛋白是本发明的关键。如果仅合成羧基端或氨基端数十个氨基酸的蛋白来制备抗体，将导致抗体的特异性和敏感性均不够高。由于SMN基因全长编码区仅882bp，编码的蛋白序列为294个氨基酸，因此完全可制备全长编码区的SMN蛋白。兔抗人SMN全长多克隆抗体的优选，其特征是：选用涵盖1至294位氨基酸的全长SMN蛋白来制备抗体，针对SMN蛋白的所有功能区。

直接通过合成多肽来制备这么大片段且编码正确的蛋白十分昂贵，也是不现实的，因此本发明选择诱导大肠杆菌表达His基因融合蛋白的方法来制备该H的蛋白片段。所述的His基因融合蛋白，必须自行设计引物扩增SMN基因全长编码区，与表达载体连接后构建His基因融合载体。

本发明的兔抗人SMN全长多克隆抗体的具体提取方法：

1、制备正常人全长编码区cDNA片段：新鲜脑组织来源于急性颅脑外伤手术患者，组织一经离体，迅速放置液氮中；称取50mg脑组织，加入1ml TRIZOL液体，匀浆器捣烂组织，混匀后转移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入200μl氯仿，用力上下甩动，使TRIZOL与氯仿充分混匀，冰浴5～10分钟，4～10℃10000～13000rpm离心10～30分钟；小心吸取上清移至一个新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl异丙醇，轻轻翻转Ep管5～15次，置冰浴5～15分钟，4～10℃10000～13000rpm离心10～15分钟，见管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入0.2～1ml 70～75％乙醇，振荡，4～10℃7000～10000rpm离心3～8分钟；去上清，翻转Ep管，室温干燥沉淀15～30分钟。溶解沉淀后即得总核糖核酸(RNA)，-80℃保存备用。将此RNA用逆转录试剂盒(Invitrogen公司)逆转录成cDNA，即为正常人脑组织全长编码区cDNA片段。

2、引物设计及His基因融合载体的选择：要保证长达882bp的PCR扩增产物片段(目的基因片段)正确无误，引物的设计至关重要。为了保证目的基因片段(SMN基因1-294氨基酸片段)与His基因融合载体连接后，氨基酸编码不发生移码改变，我们选择了pET-28a-c(+)载体，并选用限制性内切酶EcoRI和XhoI做为连接点。之所以选择这2种内切酶，是因为SMN基因片段上没有这2个切点，而且它们也是比较常见的限制性内切酶。根据引物设计原则自行设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5’端与3’端的4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共设计了4条引物，序列如下：

1F 5’-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3’(含EcoRI切点)

1R 5’-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3’(含XhoI切点)

442F 5’-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3’

486R 5’-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC 3’

1F和1R用于PCR扩增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用来测序证实所扩增的目的基因片段序列。

3、制备目的基因片段并连接到pET-28a-c(+)表达载体上：以正常人全长编码区cDNA片段为模板，采用引物1F、1R和高保真PCR扩增试剂盒扩增SMN基因1～882cDNA序列。应用TA克隆试剂盒将PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化DH5α大肠杆菌并挑取阳性TA克隆，摇菌并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒。EcoRI和XhoI双酶切证实阳性TA克隆并采用引物442F、486R及ABI PRISMR3730 DNA序列分析仪测序鉴定连接在pMD18-T载体上的目的基因片段序列的正确性。共挑取了30个阳性TA克隆才挑到了一个序列完全正确的克隆。应用EcoRI和XhoI双酶切正确的TA克隆，用胶回收试剂盒回收目的基因片段并连接到经过EcoRI和XhoI双酶切回收的pET-28a-c(+)载体上并转化大肠杆菌E.coli BL21。

4、含目的基因片段的His基因融合载体的表达鉴定：挑取1粒转化好的His基因融合载体克隆，用5ml LB培养基摇菌，离心收集细菌并制备小量的His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯兰染色，结果显示His基因融合蛋白片段大小正确，表达产量高。

5、制备并纯化His基因融合蛋白及收集目的蛋白：大量制备His基因融合蛋白，PAGE-SDS胶电泳分离并回收目的蛋白片段。

6、制备并纯化兔抗人SMN全长多克隆抗体(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)：SMN目的蛋白与完全弗氏佐剂匀浆后皮下多点注射免疫新西兰大白兔，此后每7～14天加强免疫1次，每次均从耳缘静脉取血1ml，凝固后离心取血清，Western Blot方法检测SMN多克隆抗体的滴度及特异性。加强免疫4次后，Western Blot方法检测抗体的效价达1∶2000，且具有高度特异性，无非特异性条带。上述结果提示该抗体的敏感性和特异性均很高。此时，从新西兰大白兔颈总动脉放血，离心收集抗体血清分装，采用ImmobilizedProteinA Column(Pierce公司)纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80℃。我们将该抗体命名为兔抗人SMN全长多克隆抗体(Rabbit anti-human SMN full-lengthpolyclonal antibody)。

7、兔抗人SMN多克隆抗体的应用：

(1)免疫印迹：2.5～10％脱脂奶做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜30～60分种；兔抗人SMN全长多克隆抗体(浓度为5μg/μl)做为一抗，1∶500～1∶1000稀释，室温摇育2～6小时或4～8℃摇育过夜，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1∶5000～1∶10000稀释，室温摇育45～90分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片(请参阅图1的结果)。

(2)免疫荧光染色：pcDNA3.1mycHisBSMN表达质粒转染CHO细胞，4～8％多聚甲醛固定细胞，5～10％山羊血清室温封闭细胞30～60分钟；兔抗人SMN抗体(浓度为5μg/μl)1∶50～1∶150稀释，室温反应1～3小时，1XPBS摇洗3次，每次5～10分种；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1∶100～1∶300稀释，室温反应30～60分钟，1XPBS摇洗3次，每次5～10分钟；封片镜下观察，结果见图2。

本发明的有益效果是：由于本发明设计并制备了兔抗人SMN全长多克隆抗体，保证了抗体的高度特异性，有助于进行SMN蛋白功能及发病机制研究，有助于儿童型脊髓性肌萎缩症的早期快速诊断及预后判断。同时本发明在优选的基础上提出了其制备及提取的方法，对于脊髓性肌萎缩症今后的治疗方面的研究有着极积的作用。

附图说明：

图1是本发明抗体用于免疫印迹的结果照片。标记1为不表达SMN蛋白的空CHO细胞；2为转染pcDNA3.1mycHisBSMN表达质粒的CHO细胞；3为正常人外伤手术后的肌肉组织。3所示片段大小为38KD，而2由于所表达的是SMN-His融合蛋白，故约39KD。

图2是本发明抗体检测转染质粒的CHO细胞的结果。1为转染pcDNA3.1mycHisBSMN的CHO细胞(带绿色荧光)，2为未转染质粒的空CHO细胞。

具体实施方式

实施例1：

针对SMN全长蛋白来制备抗体。

选择His基因融合蛋白的方法来制备该目的蛋白片段，His基因融合蛋白，必须构建含SMN基因1至294位氨基酸(882bp)目的片段的His基因融合载体；根据引物设计原则自行设计引物。

具体提取方法：

1、制备正常人全长编码区cDNA片段：新鲜脑组织来源于急性颅脑外伤手术患者，组织一经离体，迅速放置液氮中；称取50mg脑组织，加入1ml TRIZOL液体，匀浆器捣烂组织，混匀后转移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入200μl氯仿，用力上下甩动，使TRIZOL与氯仿充分混匀，冰浴10分钟，4℃12000rpm离心15分钟；小心吸取上清移至一个新的1.5ml Ep管中，加入500μl异内醇，轻轻翻转Ep管15次，置冰浴10分钟，4℃12000rpm离心15分钟，见管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入1ml 75％乙醇，振荡，4℃7500rpm离心5分钟；去上清，翻转Ep管，室温干燥沉淀20分钟。溶解沉淀后即得总核糖核酸(RNA)，-80℃保存备用。将此RNA用逆转录试剂盒(Invitrogen公司)逆转录成cDNA，即为正常人脑组织全长编码区cDNA片段。

2、引物设计及His基因融合载体的选择：为了保证目的基因片段(SMN基因1-294氨基酸片段)与His基因融合载体连接后，氨基酸编码不发生移码改变，我们选择pET-28a-c(+)载体，并选用限制性内切酶EcoRI和XhoI做为连接点。之所以选择这2种内切酶，是因为SMN基因片段上没有这2个切点。根据引物设计原则自行设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5’端与3’端的4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共设计了4条引物，序列如下：

1F 5’-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3’(含EcoRI切点)

1R 5’-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3’(含XhoI切点)

442F 5’-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3’

486R 5’-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC-3’

1F和1R用于PCR扩增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用来测序证实所扩增的目的基因片段序列。对于1F和1R引物设计是有一定技巧的，在1F的5’端添加了EcoRI切点序列gAATTC，其后的碱基序列与SMN基因氨基酸片段一致，1R为反向序列，在其5’端添加了XhoI切点序列CTCgAg，其后的碱基序列与SMN基因氨基酸片段一致，使目的基因片段可通过EcoRI和XhoI双酶切连到pET-28a-c(+)载体上。442F和486R引物设计遵从常规引物设计原则即可。

3、制备目的基因片段并连接到pET-28a-c(+)表达载体上：以正常人全长编码区cDNA片段为模板，采用引物1F、1R和高保真PCR扩增试剂盒扩增SMN基因1～882cDNA序列。应用TA克隆试剂盒将PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化DH5α大肠杆菌并挑取阳性TA克隆，摇菌并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒。EcoRI和XhoI双酶切证实阳性TA克隆并采用引物442F、486R及ABI PRISMR3730DNA序列分析仪测序鉴定连接在pMD18-T载体上的目的基因片段序列的正确性。共挑取了30个阳性TA克隆才挑到了一个序列完全正确的克隆。应用EcoRI和XhoI双酶切正确的TA克隆，用胶回收试剂盒回收目的基因片段并连接到经过EcoRI和XhoI双酶切回收的pET-28a-c(+)载体上并转化大肠杆菌E.coli BL21。

4、含目的基因片段的His基因融合载体的表达鉴定：挑取1粒转化好的His基因融合载体克隆，用5ml LB培养基摇菌，离心收集细菌并制备小量的His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯兰染色，结果显示His基因融合蛋白片段大小正确，表达产量高。

5、制备并纯化His基因融合蛋白及收集目的蛋白：大量制备His基因融合蛋白，PAGE-SDS胶电泳分离并回收目的蛋白片段。

6、制备并纯化兔抗人SMN全长多克隆抗体(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)：SMN目的蛋白与完全弗氏佐剂匀浆后皮下多点注射免疫新西兰大白兔，此后每14天加强免疫1次，每次均从耳缘静脉取血1ml，凝固后离心取血清，Western Blot方法检测SMN多克隆抗体的滴度及特异性。加强免疫4次后，Western Blot方法检测抗体的效价达1∶2000，且具有高度特异性，无非特异性条带。上述结果提示该抗体的敏感性和特异性均很高。此时，从新西兰大白兔颈总动脉放血，离心收集抗体血清分装，采用ImmobilizedProteinA Column(Pierce公司)纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80℃。

7、兔抗人SMN多克隆抗体的应用：

(1)免疫印迹(请参阅图1)：5％脱脂奶做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜60分种；兔抗人SMN全长多克隆抗体(浓度为5μg/μl)做为一抗，1∶1000稀释，室温摇育3小时，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1∶5000稀释，室温摇育60分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次10分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片。

(2)免疫荧光染色(请参阅图2)：pcDNA3.1mycHisBSMN表达质粒转染CHO细胞，4％多聚甲醛固定细胞，10％山羊血清室温封闭细胞60分钟；兔抗人SMN抗体(浓度为5μg/μl)1∶100稀释，室温反应3小时，1XPBS摇洗3次，每次5分种；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1∶200稀释，室温反应60分钟，1XPBS摇洗3次，每次5分钟；封片镜下观察。

Claims (6)

1.兔抗人SMN全长多克隆抗体的优选，其特征是：选用涵盖1至294位氨基酸的全长SMN蛋白来制备抗体，针对SMN蛋白的所有功能区。

2.本发明根据引物设计原则设计的引物，其特征是：共设计了4条引物，序列如下：

1F 5’-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3’(含EcoRI切点)

1R 5’-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3’(含XhoI切点)

442F 5’-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3’

486R 5’-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC-3’。

3.根据权利要求2所述的引物，其特征是：1F和1R用于PCR扩增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用来测序证实所扩增的目的基因片段序列。

4.根据权利要求2所述的引物，其特征是：同一条引物没有回文发夹结构，5’端与3’端的4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。

5.本发明的兔抗人SMN全长多克隆抗体的具体提取方法，其特征是：

(1)制备正常人全长编码区cDNA片段：新鲜脑组织来源于急性颅脑外伤手术患者，组织一经离体，迅速放置液氮中；称取50mg脑组织，加入1ml TRIZOL液体，匀浆器捣烂组织，混匀后转移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中；加入200μl氯仿，上下甩动，使TRIZOL与氯仿充分混匀，冰浴5～10分钟，4～10℃10000～13000rpm离心10～30分钟；吸取上清移至一个新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl异丙醇，轻轻翻转Ep管5～15次，置冰浴5～15分钟，4～10℃10000～13000rpm离心10～15分钟，见管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入0.2～1ml 70～75％乙醇，振荡，4～10℃7000～10000rpm离心3～8分钟；去上清，翻转Ep管，室温干燥沉淀15～30分钟。溶解沉淀后即得总核糖核酸(RNA)，-80℃保存备用；将此RNA用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，即为正常人脑组织全长编码区cDNA片段；

(2)His基因融合载体的选择：保证长达882bp的PCR扩增产物片段的目的基因片段SMN基因1-294氨基酸片段与His基因融合载体连接后，氨基酸编码不发生移码改变，选择了pET-28a-c(+)载体，并选用限制性内切酶EcoRI和XhoI做为连接点；

(3)制备目的基因片段并连接到pET-28a-c(+)表达载体上：以正常人全长编码区cDNA片段为模板，采用引物1F、1R和高保真PCR扩增试剂盒扩增SMN基因1～882cDNA序列；应用TA克隆试剂盒将PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化DH5α大肠杆菌并挑取阳性TA克隆，摇菌并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒；EcoRI和XhoI双酶切证实阳性TA克隆并采用引物442F、486R及ABI PRISMR3730 DNA序列分析仪测序鉴定连接在pMD18-T载体上的目的基因片段序列的正确性；应用EcoRI和XhoI双酶切正确的TA克隆，用胶回收试剂盒回收目的基因片段并连接到经过EcoRI和XhoI双酶切回收的pET-28a-c(+)载体上并转化大肠杆菌E.coli BL21；

(4)含目的基因片段的His基因融合载体的表达鉴定：挑取1粒转化好的His基因融合载体克隆，用5ml LB培养基摇菌，离心收集细菌并制备小量的His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯兰染色，结果显示His基因融合蛋白片段大小正确，表达产量高；

(5)制备并纯化His基因融合蛋白及收集目的蛋白：制备His基因融合蛋白，PAGE-SDS胶电泳分离并回收目的蛋白片段；

(6)制备并纯化兔抗人SMN全长多克隆抗体(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)：SMN目的蛋白与完全弗氏佐剂匀浆后皮下多点注射免疫新西兰大白兔，此后每7～14天加强免疫1次，每次均从耳缘静脉取血1ml，凝固后离心取血清，Western Blot方法检测SMN多克隆抗体的滴度及特异性；加强免疫4次后，Western Blot方法检测抗体的效价达1∶2000，且具有高度特异性，无非特异性条带；从新西兰大白兔颈总动脉放血，离心收集抗体血清分装，采用Immobilized ProteinAColumn纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80℃。

6、兔抗人SMN多克隆抗体的应用，其特征是：

(1)免疫印迹：2.5～10％脱脂奶做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜30～60分种；兔抗人SMN全长多克隆抗体(浓度为5μg/μl)做为一抗，1∶500～1∶1000稀释，室温摇育2～6小时或4～8℃摇育过夜，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1∶5000～1∶10000稀释，室温摇育45～90分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片；

(2)免疫荧光染色：pcDNA3.1mycHisBSMN表达质粒转染CHO细胞，4～8％多聚甲醛固定细胞，5～10％山羊血清室温封闭细胞30～60分钟；兔抗人SMN抗体(浓度为5μg/μl)1∶50～1∶150稀释，室温反应1～3小时，1XPBS摇洗3次，每次5～10分种；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1∶100～1∶300稀释，室温反应30～60分钟，1XPBS摇洗3次，每次5～10分钟。