CN1810828A - 一种脂肪酸－肌肽复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种脂肪酸—肌肽复合物及其制备方法。该复合物具有下列的分子结构通式：His－Ala－C(O)－(CH2)nCH3，其中n＝4，6，8，10，12，14，该复合物的分子量为324～465D。该复合物的制备方法是将含游离氨基的肌肽与含酰氯基团的脂肪酰氯CH3(CH2)nCClO进行SN2亲核取代的修饰反应，制得脂肪酸－肌肽复合物粗品溶液，经反向高效液相色谱分离、收集复合物部分、冷冻干燥，得脂肪酸－肌肽复合物纯品，脂肪酰氯分子式中的n＝4，6，8，10，12，或14。该复合物有抗氧化活性、体内生物稳定性高、半衰期长和生物利用率高的优点，有望成为治疗老年痴呆症、动脉粥样硬化、白内障、胃溃疡等疾病的新型抗氧化药物的活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂肪酸-肌肽复合物及其制备方法，属肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。
背景技术
肌肽(carnosine)是由β-丙氨酸和L-组氨酸构成的二肽(β-Ala-L-His)，分子式C9H14N4O3，分子量226.24D，在生物体内由肌肽合成酶利用β-丙氨酸和L-组氨酸合成。它广泛存在于机体的各器官组织，特别存在于肌肉，脑和眼晶状体，其浓度可高达20mmol/L。肌肽是一种新的高效低毒的生物类抗氧化剂，可有效的清除超氧阴离子，羟自由基和其他活性氧分子及过氧化自由基等，并且清除能力随浓度的增大而增大。肌肽既能够防止糖类的氧化，即清除糖基自由基，也可以中和攻击细胞膜蛋白的羰基，防止损伤性交联的形成，从而保护蛋白免受损伤。此外肌肽还具有胞内缓冲能力、组织修复功能、提高免疫应答能力，抗凋亡能力以及神经保护功能。体内肌肽含量不足会引起老年痴呆症、动脉粥样硬化、白内障、胃溃疡等疾病。但肌肽是一种小分子二肽，在体内很容易被特异性的肌肽酶降解，并且肌肽是一种水溶性物质，通过天然生物膜屏障的能力较弱，导致物理化学性质不稳定和生物利用度降低。因此需要研制新型的肌肽产品。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提出一种脂肪酸-肌肽复合物，其特征在于，该复合物具有下列的分子结构通式和简式：His-Ala-C(O)-(CH2)nCH3和Cn+2-Car，其中n＝4，6，8，10，12，14，该复合物的分子量为324～465D。该复合物不但具有天然肌肽的抗氧化活性，而且具有体内生物稳定性高、体内半衰期长的优点。利用上述的分子结构简式，可对该复合物命名。如n＝6的脂肪酸-肌肽复合物称为C8-Car复合物。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种脂肪酸-肌肽复合物的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是将含游离氨基的肌肽与含酰氯基团的脂肪酰氯CH3(CH2)nCClO进行SN2亲核取代的修饰反应，制得脂肪酸-肌肽复合物粗品溶液，经反向高效液相色谱分离、收集复合物部分、冷冻干燥，得脂肪酸-肌肽复合物纯品，脂肪酰氯分子式中的n＝4，6，8，10，12，或14。
现详细说明本发明的技术方案。
一种脂肪酸-肌肽复合物的制备方法，其特征在于，操作步骤：
第一步 将100mg肌肽干粉与8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液混和，得反应溶液；
第二步向第一步制得的反应溶液中滴入6.13μL～6.7mL脂肪酰氯CH3(CH2)nCClO，搅拌反应，脂肪酰氯分子式中的n＝4，6，8，10，12，或14；
第三步 将经第二步处理的反应溶液置于0～40℃下，反应0.5～24h，期间用NaOH调节反应溶液的pH值至10；
第四步 用HCl调节经第三步处理的反应溶液的pH值至5.0，终止反应，用pH10的100mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液补足反应溶液的体积至10mL，得脂肪酸-肌肽复合物粗品溶液，取250L粗品溶液进行茚三酮比色法测定修饰程度；
第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC层析柱，用20％乙腈洗脱，流速为1ml/min，210nm紫外检测吸收峰值；
第六步 对第五步收集到的各吸收峰洗脱液进行LC/MS检测，检查脂肪酸-肌肽复合物的分子量；
第七步 将第六步检测合格的吸收峰洗脱液，冷冻干燥，得到脂肪酸-肌肽纯品，分子量为324～465D。
所述的肌肽干粉、脂肪酰氯在Sigma公司有售。
上述方法制得的脂肪酸-肌肽复合物由肌肽和脂肪酸组成，两者通过前者的β-丙氨酸上的游离氨基取代脂肪酰氯上的氯原子发生SN2亲核取代反应形成，具有上文所述的分子结构通式：His-Ala-C(O)-(CH2)nCH3，其中n＝4，6，8，10，12，14，分子量为324～465D。
本发明的优点是：脂肪酸-肌肽复合物中的酰胺键极为稳定，使脂肪酸-肌肽复合物性质稳定，不易被肌肽酶降解分离，提高了其生物稳定性；脂肪酸为亲脂性的无毒化合物，与肌肽稳定结合后，能增强脂肪酸-肌肽复合物的亲脂性，提高其透过天然生物膜屏障的透过性，提高了其生物利用度。
附图说明
图1为本发明的脂肪酸-肌肽复合物的RT-HPLC分离纯化图，其中，峰1是未参与修饰反应的肌肽，峰2是脂肪酸-肌肽的修饰产物。
图2为本发明的脂肪酸-肌肽复合物抗脂质过氧化作用结果图。结果显示：所述的脂肪酸-肌肽复合物在体内具有明显的抗脂质过氧化作用。
具体实施方式
现结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1～实施例4均按照上述的制备方法进行操作。
实施例1 脂肪酸-肌肽复合物的制备方法。本实施例的特征在于，脂肪酰氯是己酰氯CH3(CH2)nCClO(n＝4)，分子量为134.61D，操作步骤：
第一步 将100mg肌肽干粉与8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液混和，得反应溶液；
第二步 向第一步制得的反应溶液中滴入6.13～306.5μL己酰氯，搅拌反应；
第三步 将经第二步处理的反应溶液置于0～40℃下，反应0.5～24h，期间用NaOH调节反应溶液的pH值至10；
第四步 用HCl调节经第三步处理的反应溶液的pH值至5.0，终止反应，用pH值为10的100mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液补足反应溶液的体积至10mL，制得脂肪酸-肌肽复合物粗品溶液，取250μL粗品溶液进行茚三酮比色法测定修饰程度；
第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC层析柱，用20％乙腈洗脱，流速为1ml/min，210nm紫外检测吸收峰值；
第六步 对第五步收集到的各吸收峰洗脱液进行LC/MS检测，检查脂肪酸-肌肽复合物的分子量；
第七步 将第六步检测合格的吸收峰洗脱液，冷冻干燥，得脂肪酸-肌肽复合物的纯品，分子量为324D。
实施例2 脂肪酸-肌肽复合物的制备方法。本实施例的特征在于，脂肪酰氯是十二酰氯CH3(CH2)nCClO(n＝10)，分子量为218.78D，操作步骤：
第一步 将100mg肌肽干粉与8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液混和，得反应溶液；
第二步 向第一步制得的反应溶液中滴入102.2μL～5.1mL十二酰氯，搅拌反应；
第三步 将经第二步处理的反应溶液置于0～40℃下，反应0.5～24h，期间用NaOH调节反应溶液的pH值至10；
第四步 用HCl调节经第三步处理的反应溶液的pH值至5.0，终止反应，用pH值为10的100mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液补足反应溶液的体积至10mL，制得脂肪酸-肌肽复合物粗品溶液，取250μL粗品溶液进行茚三酮比色法测定修饰程度；
第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC层析柱，用20％乙腈洗脱，流速为1ml/min，210nm紫外检测吸收峰值；
第六步 对第五步收集到的各吸收峰洗脱液进行LC/MS检测，检查脂肪酸-肌肽复合物的分子量；
第七步 将第六步检测合格的吸收峰洗脱液，冷冻干燥，得脂肪酸-肌肽复合物的纯品，分子量为409D。
实施例3 脂肪酸-肌肽复合物的制备方法。本实施例的特征在于，脂肪酰氯是十六酰氯CH3(CH2)nCClO(n＝14)，分子量为274.88D，操作步骤：
第一步 将100mg肌肽干粉与8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液混和，得反应溶液；
第二步 向第一步制得的反应溶液中滴入134.0μL～6.7mL十六酰氯，搅拌反应；
第三步 将经第二步处理的反应溶液置于0～40℃下，反应0.5～24h，期间用NaOH调节反应溶液的pH值至10；
第四步 用HCl调节经第三步处理的反应溶液的pH值至5.0，终止反应，用pH值为10的100mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液补足反应溶液的体积至10mL，制得脂肪酸-肌肽复合物粗品溶液，取250μL粗品溶液进行茚三酮比色法测定修饰程度；
第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC层析柱，用20％乙腈洗脱，流速为1ml/min，210nm紫外检测吸收峰值；
第六步 对第五步收集到的各吸收峰洗脱液进行LC/MS检测，检查脂肪酸-肌肽复合物的分子量；
第七步 将第六步检测合格的吸收峰洗脱液，冷冻干燥，得脂肪酸-肌肽复合物的纯品，分子量为465D。
实施例4 脂肪酸-肌肽复合物的制备方法。本实施例的特征在于，脂肪酰氯是辛酰氯CH3(CH2)nCClO(n＝6)，分子量为162.66D，操作步骤：
第一步 将100mg肌肽干粉与8mL的pH10.14的100mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液混和，得反应溶液；
第二步 向第一步制得的反应溶液中滴入75.5μL～3.75mL辛酰氯，搅拌反应；
第三步 将经第二步处理的反应溶液置于0～40℃下，反应0.5～24h，期间用NaOH调节反应溶液的pH值至10；
第四步 用HCl调节反应溶液的pH值至5.0，终止反应，用pH10.14的100mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液补足反应溶液的体积至10mL，制得脂肪酸-肌肽复合物粗品溶液，取250μL粗品溶液进行茚三酮比色法测定修饰程度；
第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC层析柱，用20％乙腈洗脱，流速为1ml/min，210nm紫外检测吸收峰值，检测图谱见图1，保留时间为12min的峰的对应物质为脂肪酸-肌肽复合物。
第六步 将第五步收集到的修饰吸收峰溶液，冷冻干燥，得脂肪酸-肌肽复合物的纯品，分子量为352D。
实施例5 C8-Car复合物的抗氧化活性。
实验材料与方法：
雄性健康昆明小鼠(清洁级，20-25g，上海复旦大学医学院动物中心提供)；
MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)；
雄性健康昆明小鼠禁食过夜，分为4组，每组8只。第1组，对照组；第2组，溴代苯损伤组；第3组，肌肽保护组；第4组，C8-Car复合物保护组。所述的C8-Car复合物是实施例4的制备产物。
第1组腹腔注射200μL pH7.0磷酸缓冲液；第2组腹腔注射200μL pH7.0磷酸缓冲液；第3组腹腔注射肌肽，4.5mmol/kg；第4组腹腔注射C8-Car复合物，4.5mmol/kg。记此时为零时刻。3小时后，第1组的每只昆明小鼠胃部灌注0.2mL溶媒；第2，3，4组的每只昆明小鼠胃部灌注0.2mL 0.5mol/L溴代苯，形成损伤。18～24小时后，取肝，用生理盐水洗净，冰浴匀浆，得到肝细胞匀浆液，用MDA试剂盒测定其中MDA含量。测得：对照组的MDA含量为0.105，溴代苯损伤组的MDA含量为0.193，肌肽保护组的MDA含量为0.146，C8-Car复合物保护组的MDA含量为0.085。溴代苯损伤组小鼠肝细胞匀浆液的MDA含量明显高于对照组，C8-Car复合物保护组小鼠肝细胞匀浆液的MDA含量明显低于肌肽保护组与溴代苯损伤组的小鼠肝细胞匀浆液的MDA含量，说明C8-Car复合物具有良好的抗氧化活性。实验结果示于图2。
实施例5的动物实验充分证明本发明的脂肪酸-肌肽复合物具有天然肌肽所具有的抗氧化活性，此外，还具有天然肌肽所不具有的体内生物稳定性高、半衰期长和生物利用率高的优点，有望成为治疗老年痴呆症、动脉粥样硬化、白内障、胃溃疡等疾病的新型抗氧化药物的活性成分。
Claims (6)
1、一种脂肪酸-肌肽复合物，其特征在于，该复合物具有下列的分子结构通式和简式：His-Ala-C(O)-(CH2)nCH3和Cn+2-Car，其中n＝4，6，8，10，12，14，该复合物的分子量为324～465D。
2、权利要求1所述的脂肪酸-肌肽复合物的制备方法，其特征在于，操作步骤：
第一步将100mg肌肽干粉与8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液混和，得反应溶液；
第二步向第一步制得的反应溶液中滴入6.13μL～6.7mL脂肪酰氯CH3(CH2)nCClO，搅拌反应，脂肪酰氯分子式中的n＝4，6，8，10，12，或14；
第三步将经第二步处理的反应溶液置于0～40℃下，反应0.5～24h，期间用NaOH调节反应溶液的pH值至10；
第四步用HCl调节经第三步处理的反应溶液的pH值至5.0，终止反应，用pH10的100mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液补足反应溶液的体积至10mL，得脂肪酸-肌肽复合物粗品溶液，取250L粗品溶液进行茚三酮比色法测定修饰程度；
第五步用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC层析柱，用20％乙腈洗脱，流速为1ml/min，210nm紫外检测吸收峰值；
第六步对第五步收集到的各吸收峰洗脱液进行LC/MS检测，检查脂肪酸-肌肽复合物的分子量；
第七步将第六步检测合格的吸收峰洗脱液，冷冻干燥，得到脂肪酸-肌肽纯品，分子量为324～465D。
3、根据权利要求2所述的脂肪酸-肌肽复合物的制备方法，其特征在于，第二步中，向第一步制得的反应溶液中滴入6.13～306.5μL己酰氯，搅拌反应，己酰氯的分子式为CH3(CH2)nCClO，其中n＝4，分子量为134.61D；第七步中，得到的脂肪酸-肌肽复合物的纯品的分子量为324D。
4、根据权利要求2所述的脂肪酸-肌肽复合物的制备方法，其特征在于，第二步中，向第一步制得的反应溶液中滴入102.2μL～5.1mL十二酰氯，搅拌反应，十二酰氯的分子式为CH3(CH2)nCClO，其中n＝10，分子量为218.78D；第七步中，得到的脂肪酸-肌肽复合物的纯品的分子量为409D。
5、根据权利要求2所述的脂肪酸-肌肽复合物的制备方法，其特征在于，第二步中，向第一步制得的反应溶液中滴入134.0μL～6.7mL十六酰氯，搅拌反应，十六酰氯的分子式为CH3(CH2)nCClO，其中n＝14，分子量为274.88D；第七步中，得到的脂肪酸-肌肽复合物的纯品的分子量为465D。
6、根据权利要求2所述的脂肪酸-肌肽复合物的制备方法，其特征在于，第二步中，向第一步制得的反应溶液中滴入75.5μL～3.75mL辛酰氯，搅拌反应，辛酰氯的分子式为CH3(CH2)nCClO，其中n＝6，分子量为162.66D；第七步中，得到的脂肪酸-肌肽复合物的纯品的分子量为352D。
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