CN1789238A

CN1789238A - 氰戊菊酯半抗原化合物、合成方法及其用途

Info

Publication number: CN1789238A
Application number: CN 200510061972
Authority: CN
Inventors: 程敬丽; 朱国念; 朱烈; 桂文君; 金仁耀; 金茂俊
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2005-12-13
Publication date: 2006-06-21
Anticipated expiration: 2025-12-13
Also published as: CN100340543C

Abstract

本发明公开了一种氰戊菊酯人工半抗原，它的分子结构式如右式，其中n＝1～5。本发明还提供了上述氰戊菊酯人工半抗原的合成方法，以及该氰戊菊酯半抗原的用途是用作动物免疫的抗原体系的原料。用本发明的氰戊菊酯人工半抗原所制备的抗体用于ELISA方法检测氰戊菊酯，最低检测限可达4.0±1.5ug/L(0.004ppm)，检测灵敏度高。

Description

氰戊菊酯半抗原化合物、合成方法及其用途

技术领域

本发明涉及选择一种具有-COOH的、又最大可能包含氰戊菊酯原有结构的化合物作为氰戊菊酯半抗原以及该半抗原的合成方法和用途。

背景技术

本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术领域，涉及有机合成，免疫化学及生物化学等，依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，定量地检测样本中超微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点，该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备，因此，目标分析物分子免疫学特性以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容，这一技术目前已成为农药残留痕量分析研究的一个崭新领域，被列为当前优先研究、开发和利用的农药残留分析技术，世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术，美国化学将免疫分析与气相色谱，液相色谱共同列为农药残留分析的支柱技术。

影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的选择性(或特异性)与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此，免疫半抗原的分子设计与合成是建立小分子免疫化学分析的关键步骤。分子是构成物质的基础结构，化合物内部分子结构特征及分子间的组合方式等结构信息决定了化合物所表现的性质，也就是说，化合物的理化性质，生物活性及免疫原性等都是以分子为主体来表示和解释的。

农药小分子必须与大分子物质连接后才能刺激动物产生特异性抗体，这已成为小分子免疫分析的基本模式。因此，半抗原的合成与鉴定试验是产生特异性抗体和建立农药残留快速检测技术研究最基础和最关键的步骤。理想的半抗原一方面应具备待测物的特征结构，特别是立体化学特征，另一方面半抗原与载体连接后应保证待测物的特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合，以制备出具有预期选择性的抗体。①半抗原通常由待测物衍生化制备，或由原料合成，待测物的代谢或降解产物往往是有用的半抗原；②除待测物特征结构外，在半抗原的未端需有可直接或间接与载体蛋白质偶联的活性基团；③在活性基团与载体之间，必须有一定长度的间隔臂，以便使半抗原突出于载体表面，易为有机免疫系统识别；④间隔臂应远离待测物的特征结构部分和官能团；⑤半抗原的设计应考虑到农药原药和有毒理学意义的代谢物，以及测定对象是单一的农药或某一类农药；⑥机体的免疫应答是个十分复杂的生化过程，半抗原诱导的抗体的选择性和亲合性尚难预测，多数情况下宜合成几种结构的半抗原进行研究。

氰戊菊酯又名速灭杀丁、敌虫菊酯、杀灭菊酯，是日本住友化学公司于1976年开发成功的一种高效、广谱、快速性拟除虫菊酯类杀虫剂。目前是我国产量最大的拟除虫菊酯类农药。氰戊菊酯杀虫谱广，对天敌无选择性，以触杀和胃毒为主要作用方式，无内吸传导和熏蒸作用，其击倒力强，杀虫速度快，对鳞翅目幼虫效果好，对同翅目、直翅目、半翅目等害虫也有较高效果，但对螨类无效，适用于棉花、果树、蔬菜、茶树、大豆及早田和林业作物。

氰戊菊酯广泛应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物等的害虫防治，但因其有效成分含量高导致施药后的原始沉积量高。氰戊菊酯对大鼠的毒性中等，对鱼和其他水生生物毒性大。人误服氰戊菊酯可能引起呕吐、神经过敏、悸惧、流涎等症状，严重时发生震颤和全身痉挛。目前，无论是单位面积用量还是总用量，氰戊菊酯是我国拟除虫菊酯类农药中使用量最大的品种，农产品中氰戊菊酯残留超标直接影响食品安全，对环境构成一定威胁。另外国际标准关于氰戊菊酯的最高残留限量(MRL)制定的比其它菊酯类农药低，而其在作物上的降解又比较慢，所以在蔬菜、茶叶、果树等无公害农药标准中，氰戊菊酯是必检的一种农药品种，其最大残留量都要求在2mg/Kg(我国标准)以下，欧盟将采用的标准0.1mg/Kg，因此开发一种简单、快速，适于农药残留现场监控的痕量分析法—免疫分析方法具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种氰戊菊酯人工半抗原以及该半抗原的合成方法和用途。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种氰戊菊酯人工半抗原，其分子结构式为：

其中n＝1～5。此种半抗原化合物是最大程度保留氰戊菊酯的结构，又具有可以与氨基酸偶联的基团-COOH。

当n＝2时，分子结构式为：

当n＝5时，分子结构式为：

本发明还提供了上述氰戊菊酯人工半抗原的合成方法，包括下列步骤：

1)、将氰化钠的水溶液和间苯氧基苯甲醛溶于溶剂中，在相转移催化剂和浓盐酸的作用下，在-15～40℃下反应1～4hr生成2-氰基-3-苯氧基苯甲醇；所述间苯氧基苯甲醛与氰化钠的克分子比为1∶1～2，相转移催化剂与间苯氧基苯甲醛的克分子比为0.003～0.03∶1，浓盐酸与间苯氧基苯甲醛的克分子比为1～2∶1；

2)、2-氰基-3-苯氧基苯甲醇在浓盐酸下水解得到2-羟基-3-苯氧苯乙酸，所述2-氰基-3-苯氧基苯甲醇与浓盐酸的克分子比为1∶1～5；

3)、2-羟基-3-苯氧苯乙酸和浓度为30.3％的异丙基对氯苯乙酰氯在极性溶剂中，在傅酸剂存在下0～50℃反应5～10个小时，分离后得到粉末状化合物，所述2-羟基-3-苯氧苯乙酸与异丙基对氯苯乙酰氯的克分子比为1∶1～5，傅酸剂的用量为控制反应液pH在7～9；

4)、叔丁醇与氯化亚砜在10℃以下反应5～20hr后，加入β-丙氨酸，在0～100℃下反应12hr，再浓缩、重结晶后得到β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐，氯化亚砜与叔丁醇的克分子比为1∶3～5，β-丙氨酸与氯化亚砜的克分子比为1∶3～6；

5)、将步骤3)所得的粉末状化合物在极性溶剂中与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺在-5～100℃中反应0.5～24hr，再与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐在缚酸剂存在下反应1～10hr；反应后依次经洗涤、干燥、浓缩、分离后得到氰戊菊酯半抗原，所述粉末状化合物与二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的克分子比为1∶1～2∶2～4；所述粉末状化合物与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐的克分子比为1∶0.5～2，傅酸剂的添加量为控制反应液pH在7～9；

作为本发明的氰戊菊酯人工半抗原的合成方法的改进：步骤1)中所使用的相转移催化剂为四丁基溴化铵。步骤3)中所使用的缚酸剂为三乙胺、三丁胺或吡啶。步骤3)和步骤5)均采用柱层析分离纯化。

本发明还提供了上述半抗原化合物的用途：是用作动物免疫的抗原体系的原料。

本发明的氰戊菊酯人工半抗原的合成方法，是通过这样的技术方案来实现的：

本发明的半抗原以间苯氧基苯甲醛(2)为原料，通过与氰化钠、盐酸等反应得到2-羟基-3-苯氧苯乙酸(4)，再与异丙基对氯苯乙酰氯(5)反应得到粉末状化合物(6)，粉末状化合物(6)与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐反应得到氰戊菊酯半抗原化合物(1)，反应路线如下所示：

本发明的氰戊菊酯半抗原化合物(QW-Hap)的合成方法进一步描述如下：

氰化钠与间苯氧基苯甲醛(2)在溶剂中，加入相转移催化剂，滴加浓盐酸，在-15～40℃下反应1～4hr，反应结束后加入水，洗涤有机相，得到化合物(3)——2-氰基-3-苯氧基苯甲醇。

化合物(3)在浓盐酸下水解，得到2-羟基-3-苯氧苯乙酸(4)。

2-羟基-3-苯氧苯乙酸(4)与浓度为30.3％的异丙基对氯苯乙酰氯(5)在极性溶剂中，在缚酸剂存在下反应5～10个小时，硅胶柱层析分离，得到粉末状化合物(6)。此极性溶剂可以是丙酮、乙酸乙酯等。

叔丁醇与氯化亚砜反应5～20hr后，加入β-丙氨酸，在0～100℃下反应12hr，浓缩，用无水乙醇重结晶，得到化合物(7)——β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐。

粉末状化合物(6)在极性溶剂中与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)，在-5～100℃中反应，再与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(7)在缚酸剂存在下反应1～10hr。反应后依次用稀HCl、饱和NaHCO₃、饱和盐水洗涤，无水NaSO₄干燥，浓缩，硅胶板分离(乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸＝25∶75∶0.6，R_f＝0.35)，得到白色粉状物质氰戊菊酯半抗原(1)，即QW-PS。

本发明的氰戊菊酯半抗原的设计的位点在氰戊菊酯分子结构中-CN位置，把-CN通过化学合成改造成-CONH(CH₂)nCOOH，使其具有一定的可长可短的连接臂(通过控制n的大小)，同时又具有可以与蛋白质偶联的-COOH。本发明中合成的氰戊菊酯半抗原化合物为国内外首创的新化合物，既最大程度地保留了氰戊菊酯的化学结构，又具有可调节长度的连接臂，用这一系列半抗原作为原料，用于制备适于动物免疫的抗原体系，免疫动物，所得的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，尤其是n＝2时，所得的抗体用于ELISA方法检测氰戊菊酯，最低检测限可达4.0±1.5ug/L(0.004ppm)，检测灵敏度高，与其他拟除虫菊酯类农药的交叉反应率低。

本发明的半抗原化合物，不仅合成方法简便、纯度较高，而且能应用于合成适于动物免疫的抗原体系。

具体实施方式

实施例1、

一种氰戊菊酯人工半抗原，分子结构式为(此时n＝2)：

是用作动物免疫的抗原体系的原料。

上述氰戊菊酯人工半抗原合成方法如下：

1)2-氰基-3-苯氧基苯甲醇的合成：250ml二口烧瓶中加入7.20g(0.14mol)氰化钠，20ml水，搅拌溶解后，加入40ml甲苯、20.60g(0.1mol)间苯氧基苯甲醛(2)，0.65g四丁基溴化铵，室温下滴加15ml36～38％的盐酸，加完后继续反应1.5hr，再加入12.5ml水，溶解其中的固体，用分液漏斗分掉水层，得到淡黄色有机相(主要含化合物(3))。

淡黄色有机相投入250ml三口烧瓶中，加入23.0ml(0.18mol)36～38％的盐酸，室温下(23℃)磁力搅拌过夜，停止反应，静置分层，分出上层黄色略浑浊状，用水洗涤，加入30ml乙酸乙酯稀释，先用5％NaOH提取(30ml×3)，合并，碱液用乙醚洗涤(20ml×3)，然后用浓盐酸调节pH值至3～5，析出大量白色固体。干燥称重，得到12.8g白色2-羟基-3-苯氧苯乙酸(4)。收率为52.5％(以间苯氧基苯甲醛(2)计)。

在250ml烧瓶中投入4.06g(15mmol)2-羟基-3-苯氧苯乙酸(4)、3.82g(35mmol)三乙胺，加入干燥过的70ml丙酮，冰水浴下(0～5℃)下滴加11.44g(15mmol)30.3％的异丙基对氯苯乙酰氯(5)，慢慢升温，在室温下反应10hr。反应液用稀盐酸调节pH至4～5，用乙酸乙酯萃取三次(30ml×3)，弃去水相；有机相无水NaSO₄干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸＝10∶90∶1)，得到3.76g黄色粉末状物(化合物(6))，收率为57.1％。

100ml三口烧瓶中加入干燥过的叔丁醇50ml，冷却至0℃以下；滴加13ml(0.1822mol)氯化亚砜，滴加完毕，室温反应12hr后，加入5.0g(0.0562mol)β-丙氨酸，升温回流反应12hr，至固体物消失，再室温反应12hr。反应液浓缩至干，得到淡黄色粘稠状固体，用无水乙醇重结晶，得到7.46g β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(化合物(7))。收率为73.2％(以β-丙氨酸计)。

三口烧瓶中加入87.8mg(0.2mol)化合物(6)，加入1.5ml DMF使其溶解成透明状，然后加入69mg(0.6mol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，60℃下搅拌反应45min，再加入70.8mg(0.3mol)二环己基碳二亚胺(DCC)，80℃下反应过夜，反应液溶于二氯甲烷，缓慢加入到36.3mg(0.2mol)β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(7)和几滴三乙胺的DMF溶液中，磁力搅拌反应4hr。反应液用二氯甲烷稀释，分别用0.1MHCl、1MNaHCO₃、饱和盐水各洗涤三次，无水NaSO4干燥，浓缩得到淡黄色固体，硅胶板分离(乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸＝25∶75∶0.6，Rf＝0.35)，得到白色粉状物质氰戊菊酯半抗原(1)，即QW-PS。

半抗原化合物(1)，即QW-PS的结构鉴定：

3-(2-(2-(4-氯苯基)-3-甲基丁羰氧基)-2-(3-苯氧基苯基)乙酰胺)丙酸(C₂₈H₂₈NClO₆)

取上述合成的产物分别经ESI-MS：和¹H-NMR测定其分子结构。质谱(MS，+c ESI)测定结果：m/z为508(M-H)⁺(100％)，510(M+2-H)⁺(33.3％)，可以看出化合物(1)的分子量为509，分子中含有一个Cl。

核磁共振氢谱数据：¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：

0.70(d，3H，-CH₃)；1.03(d，3H，-CH₃)；2.39(m，1H，-CH-(CH₃)₂))；2.52(t，2H，-CH₂COOH)；3.34(t，2H，-NHCH₂)；3.52(d，1H，-CH-CH-(CH₃)₂)；6.03(s，1H，-CH-O-C(＝O)-Ph)；6.87～7.34(m，13H，-ArH)；8.03(s，1H，-NH)。

元素分析(％，计算值)：C：65.85(65.94)；H：5.43(5.53)；N：2.89(2.75)。

实施例2、

一种氰戊菊酯人工半抗原，分子结构式为(此时n＝5)：

是用作动物免疫的抗原体系的原料。

上述氰戊菊酯人工半抗原合成方法如下：

1)2-氰基-3-苯氧基苯甲醇的合成250ml二口烧瓶中加入7.20g(0.14mol)氰化钠，20ml水，搅拌溶解后，加入40ml甲苯、20.60g(0.1mol)间苯氧基苯甲醛(2)，0.65g四丁基溴化铵，用冰水浴冷却到0度以下，滴加15ml36～38％的盐酸，控制速度，大约30min滴完，加完后继续反应1.5hr，再加入12.5ml水，溶解其中的固体，用分液漏斗分掉水层，得到淡黄色有机相(主要含化合物(3))。

淡黄色有机相投入250ml三口烧瓶中，加入23.0ml(0.18mol)36～38％的盐酸，室温下磁力搅拌过夜，停止反应，静置分层，分出上层黄色略浑浊状，用水洗涤，加入30ml乙酸乙酯稀释，先用5％NaOH提取(30ml×3)，合并，碱液用乙醚洗涤(20ml×3)，然后用浓盐酸调节pH值至3～5，析出大量白色固体。干燥称重，得到12.8g白色2-羟基-3-苯氧苯乙酸(4)。收率为52.5％(以间苯氧基苯甲醛(2)计)。

100ml三口烧瓶中加入干燥过的叔丁醇50ml，冷却至0℃以下；滴加13ml(0.1822mol)氯化亚砜，滴加完毕，慢慢升至室温，反应12hr后，加入5.0g(0.0562mol)6-氨基己酸，回流反应12hr，至固体物消失，再室温反应12hr。反应液浓缩至干，得到淡黄色粘稠状固体，用无水乙醇重结晶，得到7.03g 6-氨基己酸叔丁酯盐酸盐(化合物(7))。收率为56.02％(以6-氨基己酸计)。

三口烧瓶中加入87.8mg(0.2mol)化合物(6))，加入1.5ml DMF使其溶解成透明状，然后加入69mg(0.6mol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，60℃下搅拌反应45min，再加入70.8mg(0.3mol)二环己基碳二亚胺(DCC)，80℃下反应过夜，反应液溶于二氯甲烷，缓慢加入到36.3mg(0.2mol)6-氨基己酸叔丁酯盐酸盐和几滴三乙胺的DMF溶液中，磁力搅拌反应4hr。反应液用二氯甲烷稀释，分别用0.1MHCl、1MNaHCO₃、饱和盐水各洗涤三次，无水NaSO₄干燥，浓缩得到淡黄色固体，硅胶板分离(乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸＝20∶80∶1.0，Rf＝0.33)，得到白色粉状物质氰戊菊酯半抗原(1)、即QW-He。

半抗原化合物(1)、即QW-He的结构鉴定：

6-(2-(2-(4-氯苯基)-3-甲基丁羰氧基)-2-(3-苯氧基苯基)乙酰胺)己酸(C₃₁H₃₄NClO₆)

取上述合成的产物分别经ESI-MS：和¹H-NMR测定其分子结构。质谱(MS，+c ESI)测定结果：m/z为550(M-H)⁺(100％)，552(M+2-H)⁺(33.3％)，可以看出化合物(1)的分子量为551，分子中含有一个Cl。

核磁共振氢谱数据：¹H NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：

0.75(d，3H，-CH₃)；1.13(d，3H，-CH₃)；1.31(m，2H，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH)；1.50～1.55(m，4H，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH)；1.25(t，2H，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH)；2.39(m，1H，-CH-(CH₃)₂))；3.25(t，3H，-NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH)；3.56(d，1H，-CH-CH-(CH₃)₂)；6.03(s，1H，-CH-O-C(＝O)-Ph)；6.87～7.34(m，13H，-ArH)；8.03(s，1H，-NH)。

元素分析(％，计算值)：C：67.38(67.44)；H：6.03(6.21)；N：2.66(2.54)。

实施例3、

免疫原的制备：

免疫原的合成利用碳二亚胺法。将化合物(1)(QW-PS)或(QW-He)(50～80微摩尔)，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理盐水透析，分装保存于-20℃的冰箱中。

人工抗原的鉴定：

按合成氰戊菊酯免疫抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。；偶联物QW-PS-BSA在286nm处；偶联物QW-He-BSA在287nm处出现最大吸收峰，与QW-PS、QW-He、BSA的最大吸收峰(QW-PS、QW-He、BSA分别为：290nm、290nm、278nm)相比，发生了明显的变化，表明人工抗原QW-PS-BSA、人工抗原QW-He-BSA的合成是成功的。

经计算结果如下：半抗原QW-PS与BSA的结合比为15∶1；半抗原QW-He与BSA的结合比为12∶1。

实施例4：

动物免疫制备单克隆抗体与多克隆抗体：

1)多抗制备：

实验选用半周岁左右，体重为2～3公斤，健康的雄性家兔。每种免疫原免疫三只兔子(由浙江省中医学院负责兔子的饲养工作)，分别编号为兔子1～3。

实验免疫剂量基础免疫为0.5～1.0mg/kg，加强免疫剂量为1.0～1.5mg/kg，用生理盐水稀释适量QW-PS-BSA，加入等体积弗氏完全佐剂(加强免疫时采用弗氏不完全佐剂)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫6点，大腿肌肉注射2点，3周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后第8天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。

待免疫血清效价上去后，就可进行采血。本实验采用心脏取血法。采血后，将采血瓶放置于37℃温箱中半小时，待瓶中的血液凝固，然后用接种针沿瓶内壁将血块与玻璃脱离，再放到4℃冰箱中3～4小时，待血块收缩后，用毛细吸管将血清吸入试管中，离心，分离出血清。

2)单抗制备：

实验选用6-10周龄的BaLb/c小鼠，20-22g，免疫5-10只小鼠。取6-8周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠，将制备的QW-PS-BSA交联物与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射，剂量为50μg/每只，以后每隔3周，取抗原(与一免等剂量)和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔和皮下注射加强免疫，加强免疫共4次，末免以加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。后经3-4次有限稀释法克隆筛选得到一株细胞株2E3，经多次体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于抗体制备和液氮保存。

抗体的纯化：

辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清液中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。最后将抗体制成冻干粉，分装，-20℃保存。

抗血清效价测定：

免疫原复合物按常规方法免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。第5次免疫后，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价为1∶51200(指OD_490nm值等于1.0)。小鼠腹水效价在10^-6左右。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1、一种氰戊菊酯人工半抗原，其特征在于它的分子结构式为：

其中n＝1～5。

2、根据权利要求1所述的氰戊菊酯人工半抗原，其特征在于n＝2，分子结构式为：

3、根据权利要求1所述的氰戊菊酯人工半抗原，其特征在于n＝5，分子结构式为：

4、一种如权利要求1～3所述的氰戊菊酯人工半抗原的合成方法，其特征在于包括下列步骤：

5、根据权利要求4所述的氰戊菊酯人工半抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤1)中所使用的相转移催化剂为四丁基溴化铵。

6、根据权利要求5所述的氰戊菊酯人工半抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤3)中所使用的缚酸剂为三乙胺、三丁胺或吡啶。

7、根据权利要求6所述的氰戊菊酯人工半抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤5)均采用柱层析分离纯化。

8、一种如权利要求1～3所述的氰戊菊酯半抗原的用途，其特征在于：是用作动物免疫的抗原体系的原料。