CN1778906A - 克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导成体细胞分化 - Google Patents

Abstract

克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导成体细胞分化技术涉及采用体细胞核移植技术克隆人自体基因的胚胎，建立胚胎干细胞系和体外定向诱导人成体细胞分化技术。解决人类细胞、组织和器官移植所面临的供体严重缺乏和排斥反应两大难题。采用核移植克隆技术将人体细胞的细胞核转移到健康人或动物的去核卵母细胞中，经融合激活后，培养发育至囊胚。取囊胚内细胞团，可得到与供者同基因的胚胎干细胞。建立胚胎干细胞系，大量扩增的胚胎干细胞在一定条件下可定向诱导分化为人体所需要的，具有相同组织特异性的神经细胞、造血干细胞、成骨细胞、胰岛细胞和心肌细胞等成体细胞，临床移植不会产生移植排斥反应。另外，胚胎干细胞系可用于基因治疗等多种类型研究。

Description

克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导成体细胞分化

发明领域

本发明涉及采用核移植技术克隆人自体基因的胚胎，建立胚胎干细胞系和体外定向诱导人成体细胞分化技术。

发明背景

美国《科学》杂志上列出了2002年值得关注的六大热门科技领域，干细胞研究位于首位。未来抢占生命科学制高点的将会是干细胞及组织工程技术。当前种子细胞来源不足是限制细胞、组织工程发展的瓶颈问题，而免疫排除反应则是限制细胞、组织和器官移植成功的一个重要原因。随着“治疗性克隆”技术的逐步成熟，采用体细胞克隆技术，可以从人体细胞中克隆出早期胚胎，然后从中提取胚胎干细胞。这种细胞具备分化成人体各种细胞的能力，利用它有可能在体外培育出与病人遗传特征完全相同的细胞、组织或器官，将同时解决人类细胞、组织和器官移植所面临的供体严重缺乏和排斥反应两大难题。

1997年英国科学家应用核移植克隆胚胎技术，培育出了世界上第一只用体细胞克隆绵羊(多利)，从此掀起了动物克隆的浪潮。1998年美国科学家不仅成功克隆鼠，而且将成年牛、羊、猪、猴和大鼠等的成纤维细胞核移植到去核的牛卵母细胞中，有效地使体细胞重新编程，获得重构胚。这些技术的成功极大促进了异种间核移植克隆技术的发展。采用核移植克隆技术生产囊胚，从囊胚内细胞团(inner cell mass，ICM)中获取胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)已成为国内外学者所关注的热门技术。因为克隆的胚胎干细胞与自然受精而产生的胚胎干细胞具有相似的无限扩增能力和在体内外分化的多能性，可分化成为人体200多种细胞类型，从而形成机体的任何组织和器官。随着此项技术的不断进步，在体外将产生全新的自体基因的细胞、组织和器官，用来取代病变的细胞、组织、器官，治疗目前不能治疗的许多疾病。

ES细胞是哺乳动物胚胎发育早期的一类未分化的二倍体细胞，研究表明它具有以下特性：(1)ES细胞在不分化前提下，通过体外培养可大量扩增。(2)ES细胞是一种具有很高分化潜能的细胞，可以分化形成各种类型的细胞。应该说ES细胞是具有全能分化特性的细胞。ES细胞的定向分化是目前组织工程领域研究的重点。(3)ES细胞具有种系传递能力。因此胚胎干细胞就成为研究哺乳动物早期胚胎发生、基因表达调控、组织形成及遗传病和癌症发生和治疗等工作的理想模型。

第一个未分化的小鼠ES细胞系是1981年由英国的Evans和Kaufman成功从延迟着床的囊胚内细胞团中分离获得。1995年美国的Thomson等从恒河猴的囊胚中分离建立了世界上第一株灵长类动物ES细胞，以后经过不懈地努力探索，直到1998年Thomson等从体外受精卵囊胚中分离到了人类的ES细胞，在科学界引起了轰动，从此人类ES细胞研究掀起了高潮，研究的焦点转向了调控其分化、细胞治疗和组织工程种子细胞等研究。

建立ES细胞系时对体外培养条件要求十分严格，当培养条件有变化时，ES细胞就会分化。如果将胚胎干细胞进行悬浮培养就会形成“类胚体”(embryonic body，EB)，它是进一步定向诱导分化的前提，对类胚体进一步诱导可产生各种不同的细胞。近年来，小鼠或人的ES细胞已经被成功诱导分化为三胚层来源的多种组织细胞，如造血细胞、心肌细胞、肌肉细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞、胰岛素分泌细胞、血管和内皮细胞等。1999年Hole等先后诱导小鼠ES细胞体外分化出红系、粒-单系、巨核系、淋巴细胞系等；2000年Reubinoff等成功诱导ES细胞发育成造血干细胞。1994年Rohwedel等诱导出肌肉细胞。Fraichard等发现EB中表达神经细胞和神经胶质细胞的共同前体细胞的特有标志-巢蛋白。ES细胞体外可以定向分化为几乎所有类型的组织细胞，并且具有正常的核型，未分化状态下能够长时间的保持增殖能力，为体外大量扩增提供了可能。由于ES细胞具有无限增殖和多向分化的双重能力，人ES细胞可望为人类器官重建提供无限的种子细胞来源。

细胞、组织、器官移植性治疗是个性治疗的原则，异种、同种异体干细胞用于临床会引起免疫排斥反应。其主要原因是组织相容性复合体(MHC)不同。因此干细胞的来源与数量是细胞治疗最关键的问题，干细胞组织工程技术的发展和完善，将使人们能用上自己基因的干细胞或干细胞衍生的新组织器官，来替代病变或衰老的组织和器官，治疗目前不能治疗的多种疾病。所以，目前开发一种能提供相同组织特异性的人胚胎干细胞的技术势在必行。为此克隆人自体基因的ES细胞诱导定向目的干细胞分化移植治疗，或克隆人组织、器官工程是解决细胞、组织移植治疗的根本，是21世纪国际研究焦点。

经文献查阅和专利检索，目前虽然J.罗贝尔等(CN 1299408A，2001年6月13日公开)通过异种间核移植得到干细胞样细胞集落，但未对细胞集落性质进行鉴定，所以算不上干细胞系。黄禹锡(CN 1304444A，2001年7月18日公开)通过种间核转移技术生产人类克隆胚胎可以得到人类胚胎干细胞，但未得到胚胎干细胞系。黄绍良等(CN 1387565A，2003年6月18日公开)建立的胚胎干细胞系是利用受精卵囊胚内细胞团传代培养而获得。在本发明之前未见通过核移植克隆技术成功建立人自体基因的胚胎干细胞系的报道，更无将核移植克隆的人自体基因胚胎干细胞定向诱导分化为造血干细胞、神经细胞、成骨细胞、胰岛细胞、心肌细胞等人体细胞的报道。

发明目的和意义

胚胎干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，它所产生的子代细胞与其具有相同的基因型和表现型。作为“种子细胞”的干细胞可以通过细胞、组织工程技术在体外发育成人体各种组织器官中的细胞，供临床移植所需，并可作为基因疗法的靶细胞用于治疗和研究。要真正使胚胎干细胞的研究和应用进入临床领域，就必须建立人类胚胎干细胞系，获得能在体外大量增殖的人胚胎干细胞，我们才有足够的“种子”和“材料”为细胞治疗、器官移植、基因治疗和进行各类相关研究提供源源不断的供体。

采用核移植克隆技术创造与病人组织遗传构成完全相同的细胞，建立人胚胎干细胞系，在体外可定向诱导分化为人体所需要的全新的、无免疫异原性的细胞、组织和器官，用来取代病变的细胞、组织和器官，可避免移植排斥反应的发生，具有良好的临床应用前景。此技术平台的建立为人类治疗性克隆技术的发展做出突出贡献。

发明概述

采用体细胞核移植技术克隆人自体基因的胚胎，建立胚胎干细胞系和体外定向诱导人成体细胞分化，可同时解决人类细胞、组织和器官移植所面临的供体严重缺乏和排斥反应两大难题。

我们从需要救治的病人身上提取一个体细胞，然后将该细胞的遗传物质植入一个去核卵母细胞内，培养发育形成囊胚。从囊胚内细胞团中提取到的胚胎干细胞，建立胚胎干细胞系，大量扩增的胚胎干细胞在一定条件下可定向诱导分化为人体所需要的，具有相同组织特异性的神经细胞、造血干细胞、成骨细胞、胰岛细胞和心肌细胞等成体细胞，临床移植不会产生移植排斥反应。另外，胚胎干细胞系可用于基因治疗等多种类型研究。

申请专利技术

1、建立克隆人自体基因的胚胎干细胞技术

2、建立克隆人自体基因的胚胎干细胞系

3、克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导人成体细胞分化

(1)定向诱导神经细胞分化技术

(2)定向诱导造血干细胞分化技术

(3)定向诱导成骨细胞分化技术

(4)定向诱导心肌细胞分化技术

(5)定向诱导胰岛细胞分化技术

发明内容

一、构建人自体基因的胚胎干细胞

1、卵细胞的获得与处理：经促排卵获得人或动物(兔、牛、鼠等)卵母细胞，将卵母细胞放于少量M199培养基中，加入透明质酸酶消化，用毛细玻璃管轻轻吹几次，将细胞周围的颗粒层去除，洗去卵母细胞上的透明质酸酶待用。

2、人供体细胞的来源与处理：取人皮肤成纤维细胞、骨髓单个核细胞、外周血单个核细胞，用1640培养液+10％胎牛血清+100IU双抗培养，在37℃、5％CO2培养箱中培养待用。

3、核移植与融合细胞的体外培养：将处理后的卵母细胞和供体细胞置入含细胞松弛素B199细胞培养基中，放入5％CO2温箱中孵育10分钟，在纺锤体观测仪观察下用针取出极体和M期的染色体后，将供体单个核细胞沿着去核时的通道插入去核的卵母细胞的卵周隙内，经过电融合后，放入含15％胎牛血清的199细胞培养基中，在5％CO2，37℃温箱中培养形成囊胚。囊胚内细胞团含有胚胎干细胞。

二、建立人自体基因的胚胎干细胞系

1、囊胚内细胞团的分离：

采用胰蛋白酶消化法、物理方法或免疫方法去除囊胚透明带，取出内细胞团(ICM)，将ICM分散成单个细胞进行培养。

2、饲养层的准备：将传代培养第3-5代的单层小鼠胚胎成纤维细胞，用丝裂霉素C处理后，培养于明胶水溶液处理过的培养瓶中，待细胞贴壁长成单层细胞后，置培养箱中备用。

3、人自体基因胚胎干细胞的培养：

将ICM分散得到的单个胚胎干细胞或细胞小团块，接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，在适宜条件下培养、观察，培养2天可长出小细胞集落，培养至10天集落变大，可进行传代培养。挑出克隆，机械分离，接种到新的饲养层上；待长出多个克隆后，用分散酶消化后再传代培养。

4、胚胎干细胞的鉴定。通过碱性磷酸酶染色、胚胎干细胞特异性表面标志检测、染色体核型分析、线粒体基因鉴定和STR-DNA序列分析，对在体外连续传30-80代仍保持未分化状态的细胞进行鉴定。

5、细胞分化实验。ES细胞是体外研究诱导分化的较理想模型。在不同诱导因子、微环境的作用下，干细胞可以向三胚层来源的多种组织细胞分化。干细胞的多向分化潜能检测采用拟胚体形成、畸胎瘤形成和体外定向诱导造血干细胞、神经干细胞、成骨细胞、心肌细胞和胰岛细胞分化实验证明。

三、定向诱导人自体基因的胚胎干细胞向成体细胞分化

①拟胚体形成：采用机械法收集扩增培养20代以上的人自体基因的胚胎干细胞，在体外含有拟胚体形成溶液(含有非必需氨基酸、2-巯基乙醇、谷氨酰胺和甲基纤维素)悬浮培养7天后形成拟胚体。将拟胚体转入细胞培养板内进行贴壁培养，供定向诱导人体不同组织干细胞分化。

②定向诱导分化研究：拟胚体贴壁后应用特定条件培养液进行定向诱导分化，人自体基因胚胎干细胞可发育为造血干细胞、神经干细胞、成骨细胞、心肌细胞和胰岛细胞等。

具体实施祥述

一、核移植克隆人自体基因的胚胎

1、家兔促排卵与卵细胞的处理：选择体重在3kg、兔龄6个月的健康雌性家兔1只，注射100IU/mL孕马血清，第五天注射75IU/mL HCG后将家兔空气栓塞致死，无菌操作取出兔输卵管，用含15％胎牛血清的M199冲洗输卵管，将获得的兔卵母细胞，用1∶30000的透明质酸酶消化处理，用毛细玻璃管轻轻吹几次，将细胞周围的颗粒层去除，洗去兔卵母细胞上的透明质酸酶待用。

2、人供体细胞的处理：取志愿者外周血2ml，用淋巴细胞分离液进行分离，将获取的淋巴细胞用1640培养液+10％胎牛血清+100IU双抗培养，在37℃5％培养箱中待用。

3、核移植与融合细胞体外培养：将处理后的兔卵母细胞与淋巴细胞置入含7.5μg/ml细胞松弛素B199细胞培养基中，放入5％CO2温箱中孵育10分钟，用10μm外径的针在显微Spindle View操作仪观察下取出极体和M期的染色体，再沿着去核时的通道将供体单个核细胞插入去核的兔卵母细胞的卵周隙内，然后将卵细胞放于6-DMAP中，采用融合仪进行电融合，条件设为140-200v/cm，脉冲2次，持续时间80-160μs，融合后的细胞用M199冲洗后，放入融合液中于培养箱中放置2h-4h。融合后的卵细胞用M199+10％胎牛血清培养，6-8天后，发育到囊胚。囊胚的内细胞团含有胚胎干细胞。

二、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞的培养和处理

(1)饲养层细胞的培养：取12天的昆明鼠胚胎，去除头、尾、四肢和内脏，用PBS洗尽血迹，剪成碎块，吸于离心管中。加入消化液0.25％胰蛋白酶2ml，置37℃消化5min或4℃消化过液，加入含5％胎牛血清(FBS)的DMEM液，吹打分散细胞。室温静置10min，去上清，离心洗涤2次，接种于盛有含10％FBS的DMEM培养液的培养瓶中。在37℃，5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

(2)饲养层细胞的处理：①第3-5代的小鼠胚胎成纤维细胞生长连成一片时，换成含10μg/ml的丝裂霉素C(MMC)培养液，培养箱中作用2-3h。或用γ射线照射，照射量为30-100Gy。②将0.1％明胶水溶液加入培养瓶内，以能覆盖培养瓶表面即可，在室温静置2h以上。使用前，吸弃多余的明胶水溶液。用PBS洗涤1次。③弃含有MMC的饲养层细胞培养液。用PBS洗涤培养物5次。若用γ射线处理，则省去PBS洗涤。④消化饲养层细胞。用培养液制备成密度为3×10⁵个/ml的细胞悬液，种植到预先处理过的培养瓶(皿)内。⑤37℃，5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养。⑥待细胞贴壁后进行观察。如发现细胞过稀，须补加处理过的细胞，以保证细胞能连成一片而没有间隙。⑦将制备好的饲养单层细胞放置在培养箱中备用。在5天内使用，使用前要更换成胚胎干细胞培养液。

三、人自体基因胚胎干细胞的传代培养。

①37℃条件下，0.25％胰蛋白酶消化去除囊胚透明带，取出内细胞团(ICM)，培养液洗涤3次。②将ICM分散成单个细胞或小团块，接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，胚胎干细胞培养液：高糖DMEM培养基、20％FBS、0.1mmol/L β-巯基乙醇(β-ME)、10ng/ml人白血病抑制因子(LIF)、1％非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5ng/mlbFGF、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。37℃，5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养。③每天观察，2d后，见胚胎干细胞小集落出现；3-4d集落进一步增大；6-10天，可消化进行传代。具体步骤：待长出单个细胞克隆时，挑出克隆，机械分离为小的细胞团，接种到新的饲养层上；待长出多个克隆后，用分散酶消化2-3min，或用0.1％胶原酶消化8min，离心收集细胞沉淀，进行培养。④胚胎干细胞呈集落状(岛屿状)生长，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚。消化成单细胞后可见细胞小而圆，核大，胞浆小。如果胚胎干细胞分化时，细胞集落变得扁平，边缘不清楚，表面粗糙，见有较大内胚层样结构，碱性磷酸酶检查呈阴性。这类细胞已经失去干细胞特性，应终止培养。

四、胚胎干细胞系的鉴定。

取体外连续传代培养20代，仍保持未分化状态的细胞进行鉴定：①采用STR-DNA分析技术鉴定细胞DNA：提取胚胎干细胞和供体细胞DNA，经过STR-DNA序列分析表明构建的胚胎干细胞具有与供体细胞相同的DNA；②核型鉴定：取对数生长期的细胞，加入0.4μg/ml秋水仙素培养6h，用KCI10.5ml在37℃条件下孵育30min，经丙醋酸膨胀及甲醛固定，Giemsa染色。在油镜下观察，同时进行染色体显带分析。染色体核型为正常二倍体核型XY型；③线粒体基因特异PCR鉴定：人、兔细胞线粒体PCR引物设计：

A；人细胞线粒体PCR引物F：5’-ATACCCATGACCAACCTCCTACTCCTCATT-3’(3308-3346)

                      B：5’-CTGCTCGCAGTGCGCCGATCAGGGCGTAGT-3’(3713-3684)

B；兔细胞线粒体PCR引物F：5’-TTAGCCATAGCATTCCTCACCTTAGTCGAA-3’(2791-2820)

                      B：5’-GAGGATGCATAGGAGGATAATTGCAAGTGT-3’(3210-3181)

行PCR扩增后，凝胶电泳，可见胚胎干细胞中同时存在人和兔线粒体基因，人405bp为阳性，兔380bp为弱阳性。④碱性磷酸酶(AKP)染色。未分化的胚胎干细胞除具有典型的克隆形态外，表面标记AKP呈强阳性。采用偶氮偶联法。收集几代胚胎干细胞涂片，10％冷甲醛—甲醇液固定30s，加入新鲜基质液于37℃水浴处理20min，然后室温孵育10min，流水冲洗，1％亮绿复染2min，流水冲洗，晾干镜检，细胞染紫黑色或紫黑色颗粒为阳性。⑤干细胞特异性表面标志物的检测：采用免疫组织化学染色法，检测细胞特异性表面标志物。结果为：SSEA-1阴性SSEA-3和SSEA-4阳性表明是处于未分化状态的人胚胎干细胞；TRA-1-60阳性证明细胞为多能干细胞。

五、细胞分化实验。

1、畸胎瘤形成：人ES细胞具有分化为三胚层的潜能。将分离的1×10⁶人ES细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，小鼠在注射部位长出了包括内胚层、中胚层、外胚层结构的畸胎瘤。组织活检发现这些肿瘤有浸润能力。

2、拟胚体形成：采用机械法收集扩增培养的ES细胞系，在体外含有拟胚体形成溶液(含有非必需氨基酸、2-巯基乙醇、谷氨酰胺和甲基纤维素)悬浮培养4-7天后形成拟胚体(Embryoid body，EB)。将拟胚体转入细胞培养板内进行贴壁培养，供定向诱导人体不同组织干细胞分化。

3、定向诱导神经细胞分化

定向诱导神经细胞分化培养液：GXBZX-A-1(20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF及2％ B27而不含血清)。GXBZX-A-2(是GXBZX-A-1培养液中去除生长因子，加入10％血清)。

定向神经干细胞分化：将拟胚体挑出，吹散后种植于底部铺有盖薄片的神经干细胞完全培养液GXBZX-A-1，进行选择性培养7~14天，待细胞出现神经干细胞克隆球形态后，在显微镜下挑出少部分细胞球进行免疫细胞化学鉴定，显示表达神经干细胞标志物Nestin。

定向神经细胞分化：将以上培养体系更换为神经细胞培养液GXBZX-A-2(GXBZX-A-1培养液中去除生长因子，加入10％血清)进行分化培养，待出现神经细胞形态后取出细胞爬片应用MAP2单抗进行免疫细胞化学鉴定，神经细胞标志物MAP2阳性。

4、定向诱导造血干细胞分化

定向诱导造血细胞分化培养液：GXBZX-B-1(15％FBS、10ng/mlSCF、10ng/mlVEGF，DMEM添加体积到1.5ml)。GXBZX-B-2(DMEM中含有15％FBS、10ng/mlSCF、10ng/mlIL-3、10ng/mlIL-6、2IU/mlEPO、20％胎肝组织液)。

取生长状态良好的人自体基因胚胎干细胞，分散种植在GXBZX-B-1培养基37℃，5％CO2培养箱进行拟胚体培养，每3天换液一次，2次换液后，补加10ng/ml IL-3、10ng/ml IL-6、2IU/mlEPO，待形成拟胚体后，将拟胚体挑出吹散后种植于GXBZX-B-2培养基，8天后开始每2天鉴定CD34、CD133、AKP和瑞氏染色观察细胞形态。免疫细胞化学鉴定示CD34、CD133阳性。

5、定向诱导成骨细胞分化

定向诱导人成骨细胞分化培养液：GXBZX-C即采用包含成骨添加成分(osteogenicsupplements)、抗坏血酸(50mg/L)、地塞米松(1×10-8mol/L)、β-甘油磷酸(10mmol/L)并且含15％胎牛血清的α-MEM矿化培养基

将拟胚体挑出吹散后种植于成骨定向诱导GXBZX-C细胞培养基内进行贴壁培养，7天后用倒置显微镜实时观测诱导中的细胞形态学变化。人成骨细胞，呈现多伪足样或鳞片样表面存在钙盐颗粒沉积，具有钙结节形成，茜素红染色阳性，S-P法免疫组化染色示骨组织中的主要表达胶原蛋白成分-I型胶原以及骨组织中的主要非胶原蛋白成分、晚期成骨标志物—骨钙素呈阳性。

6、定向诱导胰岛素分泌细胞分化

拟胚体挑出吹散后种植于覆盖有左旋赖氨酸和纤维素的培养板中，用添加有胰岛素、人转铁蛋白和硒酸钠的无血清培养基中培养6天。此期其它细胞死亡，nestin阳性细胞比例增加。细胞在N2无血清培养基中培养，N2培养基中含10ng/ml bFGF和B27添加剂，促进细胞分裂扩增6天后，细胞在含有B27、10mM尼可酰胺和10uM LY294002的N2培养基中培养至少6天，LY294002可以促进分化细胞的生长。对分化细胞进行免疫细胞化学鉴定，显示Nestin阳性的胰岛前体细胞，并表达胰岛细胞早期分化标志PDX-1。在培养时加入HGF/activin A，在2.5mM葡萄糖浓度下胰岛前体细胞形成细胞团，并表达胰岛素、胰高血糖素和GLP-1。

7、定向诱导心肌细胞分化

拟胚体形成后，添加5-氮杂胞苷，二甲基亚砜作为诱导分化剂诱导向心肌细胞进行定向分化；在诱导后4-13天密切观察自发搏动的心肌细胞的出现并拍照记录。比较诱导前后发育早期心肌细胞特异性转录因子和蛋白表达的变化(包括量和类型)如，半定量RT-PCR和Western blot检测GATA4，Nkx2.5和MEF2C；MLC-2v，cTnI和ANP。在诱导后不同时间取细胞进行心肌细胞鉴定(免疫荧光标记)。如，cTnT，β-MHC，ANP，Cx43。采用β-MHC和ANP作为标记物，采用流式细胞仪检测自体基因胚胎干细胞的心肌分化率为20％。

应用前景和展望

通过体细胞核移植技术构建的与病人细胞核基因完全相同的ES细胞，由此而建立的ES细胞系可望为人类组织器官重建提供无限的种子细胞来源，经体外定向诱导分化获得大量自体同源组织细胞，可从根本上解决组织工程种子细胞来源不足和移植排斥反应问题，对临床医学有着极其重要的应用开发价值。如果能将人胚胎干细胞及其衍生的细胞、组织等成功应用于临床，许多疑难疾病(如帕金森病、阿尔茨海姆病、糖尿病等)都将根治，干细胞、组织工程技术使再生医学得到飞速发展，成为21世纪生命科学研究领域的焦点之一，并标志着医学将走出器官移植的范畴，步入再生组织和器官的新时代。治疗性克隆的科学价值、医学应用价值和市场前景不言而喻。

Claims (22)

1、克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导人成体细胞分化技术主要包括以下步骤：(1)、采用体细胞核移植克隆技术构建人自体基因的胚胎干细胞；(2)建立人自体基因的胚胎干细胞系；(3)人胚胎干细胞系的鉴定；(4)人自体基因的胚胎干细胞定向诱导成体细胞分化。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，核移植所采用的供体细胞为人皮肤成纤维细胞、血液单个核细胞、骨髓有核细胞等。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，核移植所采用的受体细胞为去极体和纺锤体的动物(兔、牛和鼠等)卵母细胞和人卵母细胞。

4、如权利要求1所述的人自体基因的胚胎干细胞系的建立方法，其特征在于培养液组成为：高糖DMEM培养基、20％FBS、0.1mmol/L β-巯基乙醇(β-ME)、10ng/ml人白血病抑制因子(LIF)、1％非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5ng/ml bFGF、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所建立的人胚胎干细胞系含人自体基因。

6、如权利要求5所述，其特征在于，所获得的胚胎干细胞细胞核基因与人供体细胞的细胞核基因完全相同。

7、如权利要求6所述，其特征在于，所采用的鉴定技术为DNA-微卫星序列测定。

8、如权利要求1所述的方法，其特征在于，异种间核移植构建的人胚胎干细胞线粒体含有人和动物(兔、牛或鼠等)线粒体DNA两种成分。

9、如权利要求1所述的方法，其特征在于，人自体基因的胚胎干细胞体外在一定条件下可定向诱导分化成为各种人成体细胞。

10、如权利要求9所述的定向诱导分化为人成体细胞主要包括：神经细胞、造血干细胞、成骨细胞、胰岛细胞和心肌细胞等机体细胞。

11、如权利要求9所述的定向诱导分化过程中，其特征在于，拟胚体形成是进一步定向诱导分化的前提。

12、如权利要求11所述，其特征在于，拟胚体形成所用培养液含有非必需氨基酸、2-巯基乙醇、谷氨酰胺和甲基纤维素。

13、如权利要求11所述，其特征在于，拟胚体培养采用悬浮培养。

14、如权利要求13所述，其特征在于，悬浮培养采用低粘附细胞培养板或用明胶处理培养板底阻止细胞贴壁生长。

15、如权利要求10所述，定向诱导神经细胞分化，其特征在于，条件培养基有两组。

16、如权利要求15所述，其特征在于，定向神经干细胞分化条件培养基为：GXBZX-A-1(20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF及2％B27，不含血清)。

17、如权利要求15所述，其特征在于，神经干细胞定向神经细胞分化条件培养基为：GXBZX-A-2(GXBZX-A-1培养液中去除生长因子，加入10％胎牛血清或脐血血清)。

18、如权利要求10所述，定向诱导造血干细胞分化，其特征在于，条件培养基有两组。

19、如权利要求18所述，其特征在于，条件培养基，GXBZX-B-1为：15％FBS、10ng/mlSCF、10ng/mlVEGF，DMEM添加体积到1.5ml。GXBZX-B-2为：DMEM中含有15％FBS、10ng/mlSCF、10ng/mlIL-3、10ng/mlIL-6、2IU/mlEPO、20％胎肝组织液。

20、如权利要求10所述，定向诱导成骨细胞分化，其特征在于，条件培养基GXBZX-C为包含成骨添加成分(osteogenic supplements)、抗坏血酸(50mg/L)、地塞米松(1×10-8mol/L)、β-甘油磷酸(10mmol/L)，并且含15％胎牛血清的α-MEM矿化培养基。

21、如权利要求10所述，定向诱导胰岛素分泌细胞分化，其特征在于，条件培养基为：用添加有胰岛素、人转铁蛋白和硒酸钠的无血清培养基。

22、如权利要求10所述，定向诱导心肌细胞分化，其特征在于，条件培养基为：基础培养基中加有5-氮杂胞苷，二甲基亚砜作为诱导分化剂。