CN1774242A - 1α,24(S)－二羟基维生素D2的制备方法及用途 - Google Patents

1α,24(S)－二羟基维生素D2的制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

一种抑制恶性或肿瘤细胞过度增生的方法，其中包括采用抗增生量的1α，24(S)－二羟基维生素D2治疗细胞。该方法还包括1α，24(S)－二羟基维生素D2与细胞毒性剂联合给药。

Description

1α，24(S)-二羟基维生素D2的制备方法及用途
相关专利申请的交互参考
本专利申请是美国专利申请09/891,963的部分继续，该专利申请于2001年6月26日提出申请，是美国专利申请09/211,991的部分继续。美国专利申请09/211,991现已成为美国专利6,251,883，该专利为美国专利申请08/515,801的部分继续，美国专利申请08/515,801是美国专利申请08/275,641的继续，美国专利申请08/275,641是美国专利申请07/940,246的继续，美国专利申请07/940,246又是1991年1月8日提出申请的美国专利申请07/637,867和1992年1月7日提出申请并指定美国的国际专利申请PCT/US92/00313的部分继续。
关于联邦政府资助的研究或开发项目的声明
不适用。
技术领域
本发明涉及具有激素样活性的天然代谢产物1α，24(S)-二羟基维生素D2以及这种代谢产物和非生源性差向异构体1α，24(R)-二羟基维生素D2的制备方法。本发明也涉及一种药物组合物，其含有药物学有效量的1α，24(S)-二羟基维生素D2。本发明还涉及一种通过给药药物学有效量的所述化合物以控制钙代谢异常的方法，以及一种通过给药该化合物治疗过度增生性疾病的方法。
背景技术
众所周知，维生素D及其活性代谢产物在动物和人体钙代谢的调控中发挥着重要的作用。在动物和人体内维生素D的天然形式为维生素D3。已经发现在动物包括人的体内，维生素D3在肝脏中发生C25羟基化，然后在肾脏中发生1α位羟基化生成激素1α，25-二羟基维生素D3[“1α，25-(OH)2D3”]而得以活化。参见第3,880,894号美国专利。维生素D3的代谢产物25-羟基维生素D3和1α，25-(OH)2D3分解代谢的主要途径从24位氧化开始，Holick，M.F.，Kleiner-Bossallier，A.，Schnoes，H.K.，Kasten，P.M.，Boyle，I.T.，以及DeLuca，H.F.，J.Biol.Chem.，248，6691-6696(1973)。
另一方面，在植物体内维生素D的天然形式主要为维生素D2。维生素D2在结构上与维生素D3的不同之处在于其C24上有一个甲基，并在C22和C23之间有一个双键。
在这些化合物被发现后不久，研究结果证明维生素D3和维生素D2似乎即使不等效也具有相似的生物活性。通常人们认为维生素D2的代谢(即活化和分解代谢)也和维生素D3相同。参见Harrison′s Principles ofInternal Medicine：Part Seven，″Disorders of Bone and Mineral Metabolism：Chap.35，″in E.Braunwald，K.J.Isselbacher，R.G.Petersdorf，J.D.Wilson，J.B.Martin and H.S.Fauci(eds.)，Calcium，Phosphorus and BoneMetabolism：Calcium Regulating Hormones，McGraw-Hill，New York，pp.1860-1865。在这一方面，维生素D2的活性形式被认为是1α，25-二羟基维生素D2[″1α，25-(OH)2D2″]。此外，25-羟基维生素D2和1α，25-(OH)2D2的24-羟基衍生物，即24，25-二羟基维生素D2和1α，24，25-三羟基维生素D2是已知的，说明维生素D2的分解代谢与维生素D3类似，均通过相同的C24氧化步骤，Jones，G，Rosenthal，D.，Segev，D.，Mazur，Y.，Frolow，F.，Halfon，Y.，Robinavich，D.以及Shakked，Z.，Biochemistry，18∶1094-1101(1979)。
但是，近期的研究发现维生素D2的一个活性类似物，1α-羟基维生素D2[″1α-(OH)D2″]的药理学性质与维生素D3系列的对应化合物1α-羟基维生素D3[″1α-(OH)D3″]明显不同。第5,104,864号美国专利中公开，给药2.0μg/天或更高剂量时，1α-(OH)D2能够使人类骨质疏松患者的骨量丢失得到逆转。因为毒性的原因，采用2.0μg/天或更高剂量的1α-(OH)D3不安全。
可以采用本专利发明人的发现完全或部分解释这种药理学性质的明显不同，即，给药于人体内的一部分1α-(OH)D2药理学剂量被代谢生成具有生物活性的1α，24(S)-二羟基维生素D2[″1α，24(S)-(OH)2D2″]。在以下更为详细的描述中可以看出，1-羟基化的维生素D2分子在C24位发生羟基化是一种维生素D2分子独特的活化途径。
虽然1α，24(S)-二羟基维生素D3和1α，24(R)-二羟基维生素D3[″1α，24(R/S)-(OH)2D3″]已经化学合成(第4,022,891号美国专利)，但是未被证实是否其中之一为生物系统内存在的天然化合物。此外，本专利发明人发现1α，24(S)-(OH)2D2的生物学性质与1α，24(R/S)-(OH)2D3明显不同。例如，Ishizuka等人发现1α，24(R)-(OH)2D3对1，25-(OH)2D3受体的结合力要大于1，25-(OH)2D3本身，Ishizuka，S.，Bannai，K.，Naruchi，T.以及Hashimoto，Y.，Steroids，37：1，33-42(1981)；Ishizuka，S.，Bannai，K.，Naruchi，T.以及Hashimoto，Y.，Steroids，39：1，53-62(1982)。通过类似的试验，本专利发明人发现1α，24(S)-(OH)2D2对1，25-(OH)2D3受体位点的竞争性结合比1，25-(OH)2D3低二倍。本专利发明人还发现1α，24(S)-(OH)2D2对于维生素D血清结合蛋白的亲和力相对较弱，证明其半衰期更短，毒性更低。
本专利发明人证明给药1α-(OH)D2后的人类存在循环中的1α，24(S)-(OH)2D2。这说明在动物和人体中，维生素D2被自然代谢为1α，25-(OH)2D2和1α，24(S)-(OH)2D2。这两种维生素D2激素的相对比例似乎依前体以及采取C24代谢途径的前体的数量而变化。因此，随1α-(OH)D2剂量增加，似乎1α，24(S)-(OH)2D2和1α，25-(OH)2D2的比例增加。
这些随后将被进一步描述的研究结果证明，1α，24(S)-(OH)2D2生物活性高，毒性低，具有理想的特征。给药药理学水平的1α-(OH)D2时，1α，24(S)-(OH)2D2成为优势代谢产物的事实说明，1α，24(S)-(OH)2D2可以介导1α-(OH)D2的药理学作用，并且是一种能治疗多种与钙代谢有关疾病的治疗药物。
近二十年的广泛研究证明，除传统的骨和矿物质代谢以外，维生素D扮演着重要的生物学角色。维生素D的激素样活性形式1α，25-二羟基维生素D3的特异性核受体存在于多种与钙平衡无关的器官的细胞中。例如，已经证实在人前列腺癌细胞株LNCaP中存在特异性的、具有生物学活性的维生素D受体(Miller等，52 Cancer Res.(1992)515-520)。据记载，在多种其它的癌细胞如乳腺癌和结肠癌细胞中也存在维生素D受体。
现已证实某些维生素D化合物及其类似物为强效抗增生剂和促分化(prodifferentiative)剂。例如Suda等人的第4,391,802号美国公开1α-羟基维生素D化合物，特别是1α，25-二羟基维生素D3和1α-羟基维生素D3具有能诱导癌细胞(特别是白血病细胞)分化成为非恶性巨噬细胞(单核细胞)的强效抗白血病活性，可用于治疗白血病。1α，25-二羟基维生素D3和其它的维生素D3类似物的抗增生或分化(differentiating)作用在前列腺癌细胞株中也有报道。最近有关维生素D受体基因多态性和前列腺癌风险性之间的联系已被报道，说明维生素D受体可能在前列腺癌的发展以及可能的治疗中发挥作用。
以前的研究全部集中于维生素D3化合物。虽然这些化合物能够高效促进培养物中癌细胞的分化，但是作为抗癌药物实际应用于分化治疗则严重受限，因为它们同时又是干扰钙代谢的强效药物。例如，在作为抗白血病药物所需的体内有效剂量下，因其本身所具有的钙血活性，这些化合物能够显著诱导血钙浓度升高，使血钙浓度达到具有潜在危险的水平。也就是说，因为具有包括高钙血症和尿钙过多症的副作用，1α，25-二羟基维生素D3和其它维生素D3类似物作为抗癌药物的治疗应用受到阻碍，或受到严重的限制。这说明需要更具特异性活性和选择性作用的化合物，即具有抗增生和促分化作用同时钙血活性低的维生素D化合物。这些化合物是“低钙血性的”维生素D化合物。在癌症或过度增生性疾病的治疗中对于这些化合物的需求更为迫切。
发明内容
本发明提供合成的1α，24(S)-二羟基维生素D2[1α，24(S)-(OH)2D2]，该化合物是生源性维生素D2的活性形式。这种生物学形式的化合物也被称作1α，24(S)-二羟基骨化醇，其结构式如下所述。这种生物学形式的化合物具有强烈的生物活性并且系统清除速度快，说明其毒性低。
本发明也涵盖一种1α，24(S)-二羟基维生素D2的新合成方法，其中以麦角甾醇为起始原料构成24-羟基维生素D2，然后对这种24-羟基化合物进行1α-羟基化，并将差向异构体1α，24(S)-二羟基维生素D2自1α，24(R)-二羟基维生素D2差向异构体中分离出来。在所述合成过程中，还得到了新型的中间体。并且还发现，1α，24(S)-二羟基维生素D2的结晶形式与其白色粉末形式相比，具有出人意料的稳定性和更好的生物活性。
本发明的化合物适用于多种以维生素D缺乏为特征的疾病和多种骨质损耗型疾病的治疗，特别地，在治疗过程中不会出现高钙血症和尿钙过多症。本发明的化合物可有利地用作治疗维生素D缺乏症、用于逆转或预防易于出现骨量丢失或骨矿物质含量丢失的人患上这些疾病、用于稳定肾性骨营养不良症患者的骨密度的药物组合物中的活性成分。
本发明的化合物也适用于作为治疗某些皮肤疾病的局部或口服药物。本发明的化合物可有利地作为一种活性成分用于如局部用组合物中，该组合物中还可以含有其它的能够缓解皮肤疾病的药物。
本发明的化合物也可以有利地作为抗增生和促分化药物用于治疗癌症和其它过度增生性疾病。该化合物也用于诱导细胞凋亡并抑制血管生成。
通过以下发明详述以及附图可以得出本发明的其它优点，更好地理解本发明的具体的调整，组成的变化以及物理和化学特性。
附图说明
以下辅以附图对本发明进行描述，其中采用类似的标识代表类似的元素：
图1显示24-羟基维生素D2的合成过程；
图2显示以24-羟基维生素D2为原料合成1α，24(S)-二羟基维生素D2的过程；
图3为生源性1α，24-二羟基维生素D2和合成1α，24-二羟基维生素D2的R和S型差向异构体的反相高压色谱图；
图4显示1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2的相对结合亲和力；
图5显示晶体1α，24-(OH)2D2和粉末状1α，24-(OH)2D2的相对结合亲和力。
具体实施方式
本发明采用术语“生物学活性”、“生物学活性的”、“生物活性的”或“生物有效的(biopotent)”是指化合物的生物化学性质，如影响代谢，如影响血清钙浓度，或者与适合的受体蛋白结合，如与维生素D受体蛋白结合。术语“基本纯的”是指化合物或物质的纯度至少为90％。
对于维生素D而言，术语“活性的”或“活化的”指至少在C1、C25或C24之一位置上被羟基化的维生素D化合物。
在本发明的一个方面中，本发明涉及分子式(I)所示的生物学活性的化合物，即1α，24(S)-二羟基维生素D2：
Figure A20048000747000131
在另一方面中，本发明涉及1α，24(S)-二羟基维生素D2的制备。按照图1和图2所示的合成路线合成1α，24(S)-二羟基维生素D2。此后如果述及24-羟基化合物，除非另有说明，否则均指R和S型差向异构体的混合物。如图1所示，合成中以麦角甾醇为起始原料。通过5步反应将麦角甾醇转化成24-羟基麦角甾醇(5，7，22-雌三烯-3β，24-二醇(7))。然后采用本领域所熟知的方法对24-羟基麦角甾醇进行照射或加热生成24-羟基维生素D2。如图2所示，然后采用与文献Paaren等，J.Org.Chem.，vol.45，p.3253(1980)中描述的类似的方法，通过5步反应对24-羟基维生素D2进行羟基化，生成1α，24-二羟基维生素D2，从中再分离出各差向异构体。
具体而言，麦角甾醇被乙酰化生成3β-乙酸酯(2)。通过3β-乙酸酯与三唑啉二酮反应，以麦角甾醇结构的B环形成加成物(3)。对加成物(3)进行臭氧化，截去侧链构成C-21醛(4)。将所得醛与适当羰基化合物反应重新构建侧链，得到24-烯酮(5)。然后将烯酮转化成24-甲基，3β，24-二羟基加成物(6)。该加成物与氢化锂铝反应对加成物脱保护，得到24-羟基麦角甾醇(7)。然后对24-羟基麦角甾醇进行照射或热处理生成24-羟基维生素D2。然后将24-羟基维生素D2对甲苯磺酰化得到24-羟基维生素D2的3β-对甲苯磺酸酯。将对甲苯磺酸酯溶剂解置换得到6-甲氧基-24-羟基-3，5-环维生素D2。对该环维生素D2进行烯丙位氧化得到1α，24-二羟基环维生素D2衍生物。然后将1α，24-二羟基环维生素D2衍生物溶剂解并进行Diels-Alder反应，除去6-甲氧基并且将1α，24-二羟基维生素D2(5，6位顺式)自5，6位反式1α，24-二羟基维生素D2中分离。
用反相高压液相色谱处理1α，24-(OH)2D2以分离两种差向异构体，得到本发明差向异构体形式的1α，24(S)-二羟基维生素D2。
本发明的化合物可用于多种临床或兽医学领域，特别适用于钙和磷代谢异常的治疗。具体而言，例如，如骨钙素血清测量所示，可以将1α，24(S)-二羟基维生素D2用于刺激成骨细胞活性。骨钙素是骨基质中一种主要的蛋白质。1α，24(S)-二羟基维生素D2对于维生素D血清结合蛋白的结合明显弱于1，25-(OH)2D3，指示其清除速度快，毒性低，从而使其药学性质得以提高。
在另一方面中，本发明涉及一种控制钙代谢的方法，如用于治疗例如因肝功能衰竭、肾衰竭、胃肠功能障碍等所致的钙代谢异常。1α，24(S)-二羟基维生素D2可用于防治维生素D缺乏症及相关疾病，例如肾性骨营养不良症、脂肪泻、抗惊厥药导致的骨软化病(anticonvulsantosteomalacia)、低磷酸盐维生素D抗药性佝偻症，骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、甾体诱导的骨质疏松症、以及其它特征在于骨量流失的疾病，假性缺乏性(维生素D依赖性)佝偻症、营养性或吸收不良性佝偻症、甲状旁腺功能减退继发的骨软化病和骨质减少症、术后甲状旁腺功能减退、突发性甲状腺低能症、假性甲状旁腺功能减退症以及酗酒。
1α，24(S)-二羟基维生素D2也可用于治疗过度增生型皮肤病如牛皮癣、湿疹、皮肤紧绷度及皮肤水化和皮脂分泌不足的治疗。
式(I)所示化合物也可适用于乳腺癌和结肠癌，其它癌症如胰腺癌、子宫内膜癌、肺小细胞癌或非小细胞癌(包括鳞状细胞型、腺细胞型以及大细胞型)、头颈部鳞状细胞癌、膀胱癌、卵巢癌、以及宫颈癌；肝脏肿瘤、髓质性甲状腺癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、以及软组织和骨骼肉瘤；以及多种血液瘤如急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤以及骨髓增生异常综合症。式(I)所示化合物也可用于治疗涉及产生血清M因子的单克隆细胞增生的肿瘤的治疗。这类疾病被定义为浆细胞恶性增生，包括肿瘤疾病如多发性骨髓瘤、Waldenstrm′s巨球蛋白血症、重链病、良性单克隆免疫球蛋白病、免疫细胞淀粉样变。式(I)所示化合物所给药的量能够使患有癌症或肿瘤的患者体内维生素D血清浓度增加至超生理水平，并且保持足够长的时间，从而诱导癌症或肿瘤分化或消退但不引起高钙血症。式(I)所示化合物是低钙血性的，因此允许达到这种超生理水平。
式(I)所示化合物可以每日给药或间隔给药，如每2-6天或每周给药一次。每日剂量可以为单剂量或者被分为2-4次分剂量，每次间隔1小时直至总剂量得以给药。
在本发明中，当对肿瘤或癌症患者给药有效剂量的1α，24(S)-二羟基维生素D2类似物时，肿瘤细胞的血管生成受到抑制、肿瘤细胞退化、癌细胞凋亡、高钙血得以降低、PTHrP血清浓度降低、异常细胞的增生活性被抑制、维持或缓解，细胞分化被诱导、促进或加强，且与采用先前已知的组合物给药相同量的活化的维生素D3(如1α-OH-D3或1α，25-(OH)2D3)相比，高钙血症和尿钙过多症明显减少。因此，与维生素D3类似物的活性形式相比，本发明的化合物具有更高的治疗指数。
为治疗恶性疾病，本发明的维生素D适于作为药物组合物中的活性成分单独给药，或者与其它治疗药物和/或单克隆抗体联合给药。
在另一方面中，本发明是一种药物组合物，其包含本发明维生素D化合物；以及一种选自(i)细胞毒性剂，(ii)骨骼药物，(iii)细胞分化剂，(iv)血管生成抑制剂，(v)生物调节剂及其混合物的药物；以及一种生理学可接受的载体。
此外，本发明包括一种联合给药式(I)所示维生素D化合物和细胞毒性剂或抗癌药物的方法。这些药物可适当地包括抗代谢药(如5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、氟达拉滨)、抗微管剂(如长春新碱、长春碱、紫杉烷类如紫杉醇、多西他赛)、烷基化剂(如环磷酰胺、美法仑、生物氯乙基亚硝基脲(biochoroethylnitrosurea)、羟基脲)、铂类药物(如顺铂、卡铂、奥沙利铂、JM-216、CI-973)、蒽环霉素类(如多柔比星、柔红霉素)、抗生素类(丝裂霉素、伊达比星、阿霉素、道诺霉素)、DNA拓扑异构酶抑制剂(如依托泊苷、喜树碱)或其它任何抗肿瘤药物(磷酸雌莫司汀、泼尼莫司汀)。这些共同给药的抗癌药物的剂量范围可以为约0.1-20mg/kg/天。
本发明还包括一种联合给药式(I)所示维生素D化合物和细胞分化剂的方法。该细胞分化剂包括全反式维甲酸(ATRA)。适当地，对于难治愈或不能采用蒽环霉素进行化疗的患者而言，可采用ATRA诱导急性早幼粒细胞性白血病的消退。适当地，ATRA的给药剂量为约45mg/m2/天，最多使用90天。
本发明还包括一种联合给药式(I)所示维生素D化合物和血管生成抑制剂的方法。该血管生成抑制剂包括美法仑、泼尼松、沙利度胺。优选地，沙利度胺的剂量范围为50至几百mg/天。
本发明还包括一种联合给药式(I)所示维生素D化合物和生物调节剂的方法。该生物调节剂包括多克隆抗体、单克隆抗体、疫苗、集落刺激因子(CSF)和细胞因子。优选地，可以采用单克隆抗体利妥昔单抗和曲妥单抗。利妥昔单抗虽然对多种肿瘤治疗有效，但多用于患有复发或难医治的、低度或滤泡的、CD20阳性的、B细胞非Hodgkin′s淋巴瘤的病人的治疗。优选地，利妥昔单抗的给药剂量为375mg/m2，每周经静脉滴注一次，给药4或8次剂量。曲妥单抗虽然对多种肿瘤治疗有效，但多用于其肿瘤表达HER2蛋白的乳腺癌患者。优选地，其负荷剂量为4mg/kg，滴注90min，维持剂量为2mg/kg，滴注30min。
可以预计式(I)所示维生素D与多种抗癌药物联合使用能够明显提升对肿瘤细胞的细胞毒性，从而提高治疗效果。具体而言，由于与单独使用抗癌药物的治疗方案相比，采用更低剂量抗癌药物的上述联合给药对肿瘤生长抑制效果显著更好，因此具有可能可提供一种与以大剂量单独使用抗癌药物通常所观察到的相比能显著降低与抗癌药物有关的毒副作用的方法。
术语“联合给药”指任何对病人或治疗对象给药2种或更多种药物的给药途径。例如，药物可以同时给药或先后给药。药物可以采用不同途径给药，如一种药物经静脉内给药，另一种通过肌肉内、静脉内或口服给药。药物可以同时或顺序给药，只要能够使两种药物在体内达到有效浓度即可。药物可以是一种混合物，例如一种片剂。在顺序给药中，一种药物可以紧接着另一种药物进行给药，或者进行间隔给药，即一种药物于此时间给药，而另一种药物在迟些时间给药，间隔一般控制在一周内。
本发明还包括一种联合给药有效剂量的式(I)所示化合物和激素或其它药物的方法。例如，所述激素或其它药物为雌激素，众所周知该药物可以缓解骨骼疾病。例如，前列腺癌经常转移至骨胳，造成骨质丢失和疼痛。这些骨骼药物可包括结合雌激素及其等价物、降血钙素、双膦酸盐药物、钙补充剂、维生素B12、百日咳毒素和硼。
1α，24(S)-二羟基维生素D2适于作为药物组合物中的活性化合物，与已知的维生素D3的活性形式相比，例如当用于因钙代谢异常所致的疾病或过度增生性疾病或肿瘤的治疗时，该药物组合物副作用更小、毒性更低。这些药物组合物构成了本发明的另一方面。
本发明的药理学活性化合物可以按照常规制药方法制成可向病人如哺乳动物(包括人)经肠道给药、非胃肠道给药、或局部给药的药物。例如，1α，24(S)-二羟基维生素D2可以与常规辅料如不与活性化合物发生有害反应的适用于肠道给药(如口服)、非胃肠道给药、或局部给药的药物学可接受的载体构成混合物。
优选的药物学可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油(如杏仁油、玉米油、棉籽油、花生油、橄榄油、椰子油)、矿物油、鱼肝油、油性酯如聚山梨酯80、聚乙二醇、明胶、糖类(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性凡士林、脂肪酸单甘油酯或二甘油酯、脂肪酸季戊四醇酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
可以对药物组合物进行灭菌处理，如果需要，将其与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、调整渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、矫味剂和/或一种或多种其它活性化合物，如维生素D3及其1α-羟基化的代谢产物、结合雌激素及其等价物、抗雌激素、降血钙素、双膦酸盐药物、钙补充剂、维生素B12、百日咳毒素和硼混合。
对于非胃肠道给药而言，特别适用的是可注射的灭菌溶液，优选为油性或水性溶液、以及混悬液、乳剂或植入体包括栓剂。适用的非胃肠道给药包括皮下、肌肉内或静脉内注射、鼻咽或粘膜吸收或透皮吸收。如果需要，可以将本发明化合物直接注射入肿瘤，如甲状旁腺腺瘤中，或通过区域传递(regional delivery)如经动脉内传递或通过门静脉传递。区域传递特别适用于肝癌的治疗。安瓿为方便的单位剂量。
对于肠道给药而言，特别适用的有片剂、糖锭剂、液体制剂、滴剂、栓剂、锭剂、散剂、或胶囊。如果需要甜化的载体，可以采用糖浆剂，酏剂等。
对于局部给药而言，优选地，可以采用不可喷雾的粘稠、半固体或固体形式，其包含一种适用于局部给药且动力粘度优选大于水的载体，如矿物油、杏仁油、自乳化蜂蜡、植物油，白软石蜡和丙二醇。适用的制剂包括但不限于乳膏、油膏、洗剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、搽剂、软膏、气雾剂、透皮贴剂等，如果需要，可经灭菌或与其他助剂如防腐剂、稳定剂、破乳剂、润湿剂等混合。优选地，本发明的乳膏制剂含有例如由水、杏仁油、矿物油以及自乳化蜂蜡所构成的混合物；优选地，油膏含有如杏仁油和白软石蜡；优选地，洗剂含有如无水丙二醇。
适用于治疗皮肤疾病的本发明化合物的局部制剂中还可含有上皮形成诱导剂(epithelialization-inducing agent)如类视色素(如维生素A)、色原烷醇如维生素E、β-激动剂如异丙肾上腺素、环磷腺苷(cAMP)、抗炎药物如皮质甾类(如氢化可的松及其乙酸酯，或地塞米松)以及角质促成剂如煤焦油或地蒽酚。这些药物的有效剂量为例如以组合物重量计，维生素A约为0.003至0.3％，维生素E约为0.1至10％，异丙肾上腺素约为0.1至2％，cAMP约为0.1至1％，氢化可的松约为0.25至5％，煤焦油约为0.1至20％，地蒽酚约为0.05至2％。
对于直肠给药而言，将化合物制成含有栓剂基质如可可油或其它甘油三酸酯的药物组合物中。为延长储存期，优选地组合物中含有抗氧剂如抗坏血酸、丁羟茴醚或氢醌。
为治疗钙代谢疾病，本发明药物组合物优选采用口服给药。一般而言，本发明化合物通过单位剂量形式给药，每个单位剂量于药物学可接受载体中含有约0.5μg至25μg所述化合物。本发明化合物的剂量一般为约0.01至1.0μg/kg/天，优选为约0.04至0.3μg/kg/天。治疗癌症或肿瘤或其它过度增生性疾病的口服剂量一般为约10μg至200μg/天。
对于局部给药治疗皮肤疾病而言，本发明化合物在局部给药组合物中的用量一般为每克组合物约0.01μg至50μg。对于治疗癌症而言，1α，24(S)-二羟基维生素D2在局部施用组合物中的用量一般为每克组合物约0.01μg至100μg。
如上所述，本发明化合物的给药可以采取间隔式，此时可以使用更高的剂量，一般为每2至7天给药一次，每次给药20μg至200μg。
如通过良好的医疗实践以及具体病人的临床病情所确定，本领域技术人员能够容易地优化有效剂量以及联合给药方案。无论给药方式如何，应该认识到具体情况下活性化合物的优选量依据所采用具体化合物的效能、所配制成的特定组合物、施用方式以及所治疗的特定部位和器官而变化。例如，针对具体病人的特定剂量取决于年龄、体重、健康状况和性别、饮食、给药时间和方式、排泄速度、同时使用的共用药物、以及所治疗疾病的严重程度。可以对常规因素加以考虑以确定给予给定主体的剂量，如通过适当的常规药理学方案对目标化合物和已知药物的细胞分化活性进行对比。
在另一个方面中，优选地，本发明化合物也可用于兽用组合物，例如，作为家畜的饲料组合物以预防或治疗低钙血症。一般而言，将本发明化合物分散于动物饲料中，使得正常食用这些饲料时，可以为动物提供约0.01至1.0μg/kg/天的所述化合物。
以下实施例仅起描述作用，完全不用于对本发明进行界定。在以下实施例中，核磁共振谱(1H NMR)采用配备有Aspect 3000型计算机的Bruker AM--400(400MHz)核磁共振仪在CDCl3中进行测量，CHCl3用作内标。化学位移单位为ppm。紫外光谱用Hitachi U-2000分光光度计进行测量，溶剂为乙醇溶液。
实施例
实施例1：与1α-(OH)D2一起温育的人肝脏细胞中1α，24(？)-(OH)2D2的产生、纯化和鉴定
基本纯的1α-(OH)D2取自Bone Care International，Inc.of Madison，Wisconsin。采用本领域已知的方法在无胎牛血清存在的培养基中将1α-(OH)D2和源自人肝细胞瘤的细胞温育48h。
采用本领域已知的方法对培养基和细胞混合物进行脂质萃取，然后进行高压液相色谱(HPLC)处理，色谱柱为Zorbax-S1L，流动相为己烷/异丙醇/甲醇(91∶7∶2)。认定的代谢产物1α，24(？)-(OH)2D2于母体化合物1α-(OH)D2和标准品1α，25-(OH)2D2(也取自Bone Care International，Inc.of Madison，Wisconsin)之间被洗脱(此处采用术语“1α，24(？)-(OH)2D2”表示差向异构体构型尚未确定)。在利用质谱分析鉴定代谢产物之前，采用HPLC系统对1α，24(？)-(OH)2D2进一步纯化。
纯化的代谢产物极性比起始原料1α-(OH)D2大，因此假定它为二羟基维生素D2代谢产物。该代谢产物具有维生素D的生色团，说明维生素D的顺式三烯系统得以保留。由于该代谢产物源自1α-(OH)D2，故其结构为1α，X-(OH)2D2，其中X指第二个羟基所在位置。
采用本领域已知的方法制备1α，X-(OH)2D2的三甲基甲硅烷基衍生物，对TMS衍生物和天然化合物进行质谱分析。用GC-MS分析所述TMS衍生物，主要通过对代谢产物的高温裂解方式的解释进行结构鉴定。分子离子峰m/z为644，说明二羟基维生素D2连接有3个TMS基，质量数增加了216。由于1α-(OH)D2具有3β和1α-基团，因此所认定的代谢产物中具有一个附加的羟基，3个羟基均被衍生化。特征碎片峰为m/z 601、511、421、331，分别代表仅脱去质量数为43的碎片、同时脱去1个，2个或3个质量数为90的TMS碎片的碎片。这种方式的最佳解释是C24-C25键断裂，脱去质量数为43的C3H7碎片。即脱去C26-C25-C27碎片。此外，质谱图中没有所有25-羟基化的维生素D化合物所特有的m/z131碎片峰。
质谱图中显示m/z 513碎片峰，表明因A环断裂，脱去质量数为131的C2-C3-C4碎片，这种裂解方式同样是维生素D类化合物所特有的。质谱图中还显示m/z 143碎片峰，可能源自C24-C23键断裂并脱去一个甲基。这种不寻常地脱去质量数为43的碎片说明C24-C25键脆弱，加之C24一C23发生断裂，说明1α，X-(OH)2D2中额外的羟基在C24位。因此结构确定为1α，24(？)-(OH)2D2。
将天然代谢产物以直接探针式质谱进行分析，结果也证明羟基在24位上，这一结果与以上所述的TMS衍生物GC-MS分析结果一致。天然代谢产物质谱图显示预计的分子离子峰为m/z 428，以及一个特征的碎片峰m/z 367，说明脱去一分子水和质量数为43的C26-C25-C27碎片。
实施例2：1α，24(S)-二羟基维生素D2的合成
(22E)-5，7，22-雌三烯-3β基-乙酸酯(2)
向50g(0.13mol)麦角甾醇(1)和300mL无水吡啶所构成的溶液中加入33.3mL(0.35mol)乙酸酐。反应混合物于室温下搅拌反应过夜，此后加入600mL水。所得沉淀经过滤，以乙腈(3×200mL)洗涤，风干得42.0g产品(2)，产率74％。
22-氧代-5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑啉-1，2-二基)23，24-二去甲-6-胆烯-3-基乙酸酯(4)
向33.0g(0.075mol)麦角甾醇乙酸酯(2)和1000mL氯仿所构成的溶液中加入13.2g(0.075mol)的4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮。将所得(3)的溶液于室温下搅拌反应30min，然后加入5ml吡啶。将反应液冷却至-78°NC，并于-78°NC，与臭氧-氧混合物反应2h，然后用氮气吹扫。加入50mL二甲亚砜，反应混合物用水(300mL)、2N HCl(2×200mL)和水(300mL)洗。分出有机相，无水MgSO4干燥，真空浓缩至干。残余物用硅胶柱纯化，流动相为30％乙酸乙酯的己烷溶液。得到16.0g(39％)目标化合物，形态为泡沫状固体。
1H NMR：(400MHz；CDCl3)：δppm 0.85(3H，s，18-CH3)，1.10(3H，s，19-CH3)，1.15(3H，d，21-CH3)，1.99(3H，s，3β-CH3CO)，5.45(1H，m，3α-H)，6.26(1H，d，7-H)，6.40(1H，d，6-H)，7.42(5H，m，Ph)，9.58(1H，d，HCO)。(22E)5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑啉-1，2-二基)胆甾-6，22-二烯-24-酮-3β-基乙酸酯(5)
氮气下，搅拌下将丁基锂(1.6M己烷溶液，8.94mL，0.014mol)加到冷的(0°NC)二异丙胺(1.45g，0.014mol)的无水四氢呋喃(20mL)溶液中。0°NC下滴加3-甲基丁酮-2(1.23g，0.014mol)的无水四氢呋喃(6mL)溶液，耗时15min。反应液于0°NC下继续搅拌反应1h，然后冷却至-70°NC，加入醛(4)(6.0g，0.011mol)的无水四氢呋喃(60mL)溶液。将反应温度升至-20°NC并于此温度下保持3h。于-20°NC下加入冰醋酸(20mL)，反应液升温至室温。加入乙醚(800mL)和水(400mL)，分出有机相，10％盐酸(2×300mL)、饱和碳酸氢钠(2×300mL)、水(2×300mL)洗，浓缩得粗产物7.5g，将其溶于含有1.5N盐酸(12mL)的四氢呋喃(100mL)中。回流反应1.5h后，加乙醚(600mL)稀释，用10％碳酸钠溶液(2×200mL)、水(2×200mL)洗，(无水MgSO4)干燥。减压浓缩得粗产品(7.0g)。硅胶柱色谱(50％乙酸乙酯的己烷溶液)分离得烯酮(5)4.0g(59％)。
1H NMR：(400MHz)：δppm 0.83(3H，s.18-CH3)，0.99(3H，s，19-CH3)，1.09(6H，dd，26和27-CH3)，1.12(3H，d，21-CH3)，2.0(3H，s，3β-CH3CO)，2.84(1H，m，25-H)，5.45(1H，m，3α-H)，6.06(1H，d，23-H)，6.24(1H，d，7-H)，6.39(1H，d，6-H)，6.71(1H，dd，22-H)，7.42(5H，m，Ph)。
(22E)-5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑啉-1，2-二基)-6，22-麦角二烯-3β，24-二醇(6)
将烯酮(5)(3.5g，5.7mmol)的无水乙醚(100mL)溶液冷却至0°NC，滴加甲基溴化镁(3.0M乙醚溶液，6.8mL，0.02mol)。1h后于0°NC下加入饱和氯化铵(100mL)。分出有机相。水相用乙醚(2×200mL)萃取。合并乙醚相，无水MgSO4干燥，真空浓缩至干得粗产物(6)3.0g(90％)。
(22E)-5，7，22-麦角三烯-3，24-二醇(7)
向3.0g(5.1mmol)(6)的无水四氢呋喃(250mL)溶液中加入3.6g(0.09mol)氢化锂铝。反应混合物加热回流反应3h，冰水浴冷却，小心滴加冰水(5mL)分解(decompose)反应混合物。过滤混合物，滤液真空浓缩除去大部分四氢呋喃。残余物溶于200mL乙酸乙酯，用饱和NaCl水溶液(2×200mL)洗，无水MgSO4干燥，真空浓缩。残余物硅胶柱色谱(30％乙酸乙酯的己烷溶液)分离得1.5g(71％)(7)。
1H NMR：(400MHz，CDCl3)：δppm 0.64(3H，s，18-H)，0.88(6H，dd，26和27-CH3)，0.93(3H，s，19-CH3)，1.06(3H，d，21-CH3)，1.19(3H，s，28-CH3)，3.55(1H，m，3α-H)，5.36(1H，d，7-H)，5.42(2H，m，22和23-H)，5.52(1H，d，6-H)。UV(乙醇)λmax：282nm。
24-羟基维生素D2(8)
将1g(2.4mmol)(7)溶于25omL乙醚和苯(4∶1)的溶液中，氮气下搅拌，在水冷却的石英浸入式阱中用Hanovia中压UV灯照射2h。反应液真空浓缩，重新溶于100mL乙醇中，加热回流反应过夜。反应液真空浓缩至干，残余物硅胶柱色谱(30％乙酸乙酯的己烷溶液)分离得0.55g(55％)(8)。
1H NMR：(400MHz，CDCl3)：δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.92(6H，dd，26和27-CH3)，1.06(3H，d，21-CH3)，1.20(3H，s，28-CH3)，3.93(1H，m，3-H)，4.79(1H，m(尖锐)，19-H)，5.01(1H，m，(尖锐)，19-H)，5.43(2H，m，22和23-H)，6.02(1H，d，7-H)，6.22(1H，d，6-H)。UV(乙醇)λmax：265nm。
24-羟基维生素D2对甲苯磺酸酯(9)
向0.55g(1.3mmol)(8)溶于5mL无水吡啶所构成的溶液中加入0.6g(3.2mmol)对甲苯磺酸氯。氮气下，于5°NC搅拌反应20h。将反应混合物倒入100mL冷的饱和碳酸氢钠溶液中，乙醚萃取(3×100mL)。合并有机相，用5％HCl溶液(2×200mL)、饱和碳酸氢钠(2×200mL)溶液、饱和NaCl溶液(2×200mL)洗涤，无水MgSO4干燥，真空浓缩得0.62g(84％)(9)。
1H NMR：(400MHz，CDCl3)：δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.92(6H，dd，26和27-CH3)，1.08(3H，d，21-CH3)，1.24(3H，s，28-CH3)，2.43(3H，s，CH3(对甲苯磺酸酯))，4.69(1H，m，3-H)，4.77(1H，m，(尖锐)，19-H)，5.0(1H，m，(尖锐)，19-H)，5.42(2H，m，22和23-H)，6.03(1-H，d，7-H)，6.25(1-H，d，6-H)7.31和7.83(4H，d，芳族)。
24-羟基-3，5-环维生素D2(10)
向0.6g(1.06mmol)(9)溶于50mL无水甲醇所构成的溶液中加入碳酸氢钠4.0g(0.047mol)。反应混合物加热回流反应6h。真空浓缩，加入100mL水，然后用乙醚萃取(2×200mL)。合并有机相，用无水MgSO4干燥。真空浓缩至干，得450mg(100％)油状物(10)。
1α，24-二羟基-3，5-环维生素D2(11)
氮气下，将叔丁基过氧化氢(870μL(2.61mmol)；3M甲苯溶液)加到73mg(0.66mmol)二氧化硒和50ml无水二氯甲烷所构成的混悬液中。氮气下室温搅拌混合物反应3h。加入0.1mL无水吡啶，再加入450mg(1.06mmol)(10)和15ml无水二氯甲烷所构成的溶液。氮气下室温搅拌反应10min。加入25mL 10％NaOH，乙醚萃取(3×100mL)。合并乙醚萃取物，并用10％NaOH溶液(2×100mL)、水(2×100mL)、饱和NaCl溶液(2×100mL)洗涤，用无水MgSO4干燥，真空浓缩至干。残余物以硅胶柱用30％乙酸乙酯的己烷溶液纯化，得到110mg(24％)的(11)。
1H NMR：(400MHz，CDCl3)：δppm，0.55(3H，s，18CH3)，0.90(6H，dd，26和27-CH3)，1.03(3H，d，21-CH3)，1.19(3H，s，28-CH3)，3.25(3H，s，-OCH3)，4.19(1H，d，6-H)，4.19(1H，m，1-H)，4.92(2H，d，7-H)，5.15(1H，m，(尖锐)，19-H)，5.2(1H，m，(尖锐)，19-H)，5.42(2H，m，22和23-H)。
5，6-顺式和5，6-反式1α，24-二羟基维生素D2(12，13)
将1α，24-二羟基-3，5-环维生素D2(11)110mg(0.25mmol)溶于2.0mL二甲亚砜和1.5mL醋酸中，氮气下50℃加热反应1h。反应液倒入冰和50mL饱和NaHCO3溶液中。乙醚萃取(3×100mL)。合并乙醚萃取物并用饱和NaHCO3溶液(3×100mL)、水(2×100mL)、饱和NaCl溶液(2×100mL)洗涤，用无水MgSO4干燥。真空浓缩得100mg(93％)粗产物(12)和(13)。
5，6-顺式-1α，24-二羟基维生素D2(12)
向(12)和(13)与5mL乙酸乙酯所构成的溶液中加入20mg(0.2mmol)马来酸酐，氮气下35℃搅拌混合物反应24h。将反应液真空浓缩至干。残余物用硅胶柱以50％乙酸乙酯的己烷溶液纯化，得到20mg(22％)(12)。
1H NMR：(400 MHz，CDCl3)：δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.89(6H，dd，26和27-CH3)，1.04(3H，d，21-CH3)，1.21(3H，s，28-CH3)，4.23(1H，m，3-H)，4.40(1H，m，l-H)，5.0(1H，m，(尖锐)，19-H)，5.33(1H，m，(尖锐)，19-H)，5.44(2H，m，22和23-H)，6.01(1H，d，7-H)，6.37(1H，d，6-H)UV(乙醇)λmax：265nm。
1α，24(S)-二羟基维生素D2(14)
利用高压液相色谱对1α，24-(OH)2D2的24位差向异构体进行分离，使用Waters仪器，色谱柱为反相Supelco C-8制备柱(25cm×21.2mm；粒径12μm)，溶剂体系为乙腈：水(60∶40)，流速10mL/min。差向异构体被标记为差向异构体1和差向异构体2。在上述色谱条件下，差向异构体1保留时间为63min，差向异构体2保留时间为71min，通过X射线晶体学证明，差向异构体2是的立体结构为1α，24(R)-(OH)2D2。差向异构体1的立体结构为1α，24(S)-(OH)2D2。
实施例3：对照化学合成的差向异构体1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2，确定生源性代谢产物1α，24(？)-(OH)2D2的立体结构
通过高压液相色谱和气相色谱将如实施例1中所述得到的生源性代谢产物的立体结构与如实施例2中所述得到的化学合成的差向异构体对比。通过这些对比，确定生源性代谢产物结构为1α，24(S)-(OH)2D2。图3显示了进行这种对比时的高压液相色谱图。在图3中，差向异构体1为化学合成的1α，24(S)-(OH)2D2
(a)高压液相色谱对比中采用了二种不同的色谱柱和溶剂体系。采用反相色谱柱Zorbax-ODS(Dupont Instruments；3μm，6.2mm×8cm)时，溶剂体系为乙腈∶水(60∶40)，流速1mL/min。生源性代谢产物保留时间为14.3min，1α，24(S)-(OH)2D2保留时间为14.2min，1α，24(R)-(OH)2D2保留时间为15.7min。
采用正相(straight-phase)色谱柱Zorbax-SIL(Dupont Instruments；3μ，6.2mm×8cm)时，溶剂体系为己烷/异丙醇/甲醇(94∶5∶1)，流速1mL/min。生源性代谢产物保留时间为22.4min，1α，24(S)-(OH)2D2保留时间为22.4min，1α，24(R)-(OH)2D2保留时间为22.8min。
(b)采用气相色谱时，1α，24(S)-(OH)2D2与生源性代谢产物一起流出，1α，24(R)-(OH)2D2的保留时间则明显不同(见表1)
表1：相对于热解1α，25-(OH)2D3的热解衍生物的气相色谱相对保留时间
  化合物   相对保留时间*
  1α，24(S)-(OH)2D21α，24(R)-(OH)2D2生源性代谢产物   1.01651.00981.0163
*进行对比的热解衍生物的保留时间与内标1α，25-(OH)2D3保留时间的比值。
实施例4：1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2生物活性的对比
利用维生素D依赖性的转录活化模型体外测试化学合成的1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2的生物活性，在该模型中，将表达维生素D受体(VDR)的质粒pSG5-hVDR1/3和受维生素D反应区控制的含有生长素(GH)基因的质粒p(CT4)4TKGH共转染至绿猴肾COS-1细胞中，这二个载体的DNA由Mark Haussler博士(Department ofBiochemistry，University of Arizona，Tucson，Arizona)提供。
被转染的细胞与维生素D代谢产物一起温育并测定生长素的产量。如表2所示，在该系统中1α，24(S)-(OH)2D2的活性明显高于1α，24(R)-(OH)2D2。
表2：转染的COS-1细胞中维生素D可诱导的生长素的产量
诱导剂 摩尔浓度   维生素D可诱导的生长素的产量
总GH产量* (ng/ml)   维生素D可诱导的生长素的净产量 (ng/ml)
  乙醇25-OH-D31α，25-(OH)2D31α，24(S)-(OH)2D21α，24(R)-(OH)2D2 10-710-610-510-1010-910-85×10-105×10-95×10-810-910-810-7   442451100775749251475425135011828011001300   02011056731308811441381130611383610561256
*双份测定结果的平均值。
实施例5：1α，24(S)-(OH)2D2对于维生素D受体(VDR)的亲和力
采用取自Incstar公司(Stillwater，Minnesota)的商品牛胸腺VDR试剂盒和1α，25-(OH)2D3标准溶液评价1α，24(S)-(OH)2D2对哺乳动物维生素D受体(VDR)的亲和力。采用二极管阵列分光光度计对纯化的1α，24(S)-(OH)2D2进行定量并进行放射性受体测定。1α，24(S)-(OH)2D2的半数最大结合浓度约为150pg/mL，而1α，25-(OH)2D3的半数最大结合浓度为80pg/mL。因此，1α，24(S)-(OH)2D2对牛胸腺VDR的亲和力比1α，25-(OH)2D3低两倍，说明1α，24(S)-(OH)2D2具有高生物活性。
实施例6：1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2对于维生素D受体的相对亲和力
采用取自Incstar公司(Stillwater，Minnesota)的商品牛胸腺VDR试剂和1α，25-(OH)2D3标准溶液评价1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2对于维生素D受体(VDR)的相对亲和力。采用紫外分光光度法对纯化的差向异构体1α，24(S)-(OH)2D2和1α，24(R)-(OH)2D2进行定量。如图4所示，为取得相同的示踪剂3H-1α，25-(OH)2D3置换效果，所需的1α，24(R)-(OH)2D2浓度比1α，24(S)-(OH)2D2高20至30倍。实验数据表明差向异构体1α，24(S)-(OH)2D2的活性明显高于差向异构体1α，24(R)-(OH)2D2。
实施例7：1α，24(S)-(OH)2D2对于维生素D血清结合蛋白(DBP)的亲和力
按本领域已知的方法，利用维生素D缺乏的大鼠血清评价1α，24(S)-(OH)2D2对于维生素D血清结合蛋白(DBP)的亲和力。实验结果表明1α，24(S)-(OH)2D2与DBP的结合至少比25-OH-D3弱1000倍。1α，24(S)-(OH)2D2对VDR结合力强，对DBP结合力弱，使得该化合物易于被靶细胞所吸收，因而具有强的生物活性。此外，与DBP结合弱也表明其清除速度更快，使毒性得以降低。
因此，以上实验证明1α，24(S)-(OH)2D2显示出了独特的活性谱，即，生物活性高并且毒性低，这与现有技术中的化合物以及其24(R)差向异构体明显不同。
实施例8：由维生素D2和24-OH-D2生成1α，24(S)-(OH)2D2
对维生素D缺乏的大鼠给药维生素D2或24-OH-D2(口服或腹膜内补充)。制备血浆的脂质萃取物，依照Horst等人(Horst，R.L.，Koszewski，N.J.和Reinhardt，T.A.，Biochem.，29∶578-82(1990))所述的以下用于合成生物源1α，24-(OH)2D2标样的方法纯化代谢产物。
在含有5mL 20％维生素D缺乏的鸡的肾组织匀浆的烧瓶中将10μg24-OH-D2温育，体外合成生物源1α，24-(OH)2D2标样。反应产物用HPLC纯化并用质谱进行鉴定。在给药维生素D2或24-OH-D2的维生素D缺乏大鼠的血浆脂质萃取物中，得到一个与1α，24-(OH)2D2标样同时洗脱的代谢产物，说明1α，24-(OH)2D2是维生素D2的天然代谢产物。反之，给药维生素D3的对照组中未检测到24-OH-D3。
实施例9：体外随底物浓度增加的1α，24-(OH)2D2优先生成
如上所述，将Hep 3B细胞与1α-OH-D2一起温育，1α-OH-D2的终浓度为1、10或100nM(实验1)和1或10μM(实验2)，对1α，24(S)-(OH)2D2进行萃取并纯化。通过回收放射性标记(实验1)或二极管阵列分光光度计(实验2)对代谢产物1α，24(S)-(OH)2D2和1α，25-(OH)2D2进行定量分析。如表3所示，随底物浓度的增加，1α，24(S)-(OH)2D2相对于1α，25-(OH)2D2的量增加。说明在该系统中，底物浓度更高时1α-OH-D2的优势天然活性代谢产物为1α，24(S)-(OH)2D2。
表3
  实验号   底物浓度   所生成的产物
  1   nM 1α，24(S)-(OH)2D2和1α，25-(OH)2D2的比例
  110100 1∶41∶11.5∶1
  2   μM 产物的比例，pmol/106细胞/天
  11O 1α，24(S)-(OH)2D2   1α，25-(OH)2D2
4.959   N.D.*7.4
*N.D.表示未能检出。
实施例10：给药1α-OH-D2的骨质疏松妇女体内产生1α，24(S)-(OH)2D2
作为以1α-OH-D2治疗骨质疏松的一部分研究工作，本专利发明人在接受1α-OH-D2的妇女中也发现了1α，24(S)-(OH)2D2相对于1α，25-(OH)2D2的生成增加。给药单剂量2μg 1α-OH-D2或给药8μg/天共计一周后，收集血样，分析其中的代谢产物1α，24(S)-(OH)2D2和1α，25-(OH)2D2。从血样中萃取出脂质，按照标准方法利用HPLC对代谢产物进行纯化，并用Incstar公司(Stillwater，Minnesota)生产的放射受体分析仪进行定量分析。给药2μg剂量一天后，1α，24(S)-(OH)2D2未能检出，1α，25-(OH)2D2浓度约为11pg/ml。相对而言，当最后一次8μg剂量给药一天后，1α，24(S)-(OH)2D2平均浓度为9pg/ml，1α，25-(OH)2D2浓度平均为30pg/ml。
实施例11：绝经后骨质疏松妇女剂量范围研究
20名绝经后骨质疏松妇女参加了这次开放性研究。所选择病人年龄段在55至75岁之间，LUNAR骨密度测定仪(Lunar Corporation，Madison，Wisconsin)测出L2-L3椎骨骨矿物质密度在0.7至1.05g/cm2之间。
进入该项研究时，所有病人均被建议选择每日含400至600mg钙的饮食。通过每周一次的24小时饮食记录以及与每个病人会面确定遵守饮食规定的情况。
所有病人均完成了1周的基线期，5周的治疗期以及1周的治疗后观察期。在治疗期间，病人自己口服给药1α，24(S)-(OH)2D2，第1周采用起始剂量0.5μg/天，在随后的4周内，每周依次逐渐将剂量增大为1.0、2.0、4.0和8.0μg/天。所有药物均在早饭前服用。
研究中每周监测血和尿的化学指标。重要的血化学指标包括钙、磷、骨钙素、肌酸酐和脲氮的空腹水平。重要的尿化学指标包括钙、磷、肌酸酐24小时排泄率。
该临床试验所得到的血和尿的数据表明：肌酸酐清除率和脲氮的血液浓度说明该化合物对肾功能无负面影响，也不增加羟脯氨酸的尿排泄率，说明对骨的再吸收无任何刺激作用。该化合物对常规血清指标无影响作用，说明不存在有害的代谢作用。
1α，24(S)-(OH)2D2对钙平衡的正面作用表现为可中度增加24小时尿钙水平，说明该化合物能增加肠道钙吸收；以及可增加血清骨钙素浓度，说明该化合物刺激了成骨细胞。
实施例12：绝经后骨质疏松妇女骨量流失的预防性治疗
对年龄段在55至75岁的绝经后骨质疏松门诊病人进行临床研究。该项研究涉及多达120名的病人，她们被随机分成3个治疗组，连续进行试验24至36个月。2个治疗组接受恒定剂量的1α，24(S)-二羟基维生素D2(u.i.d，两个在1.0μg/天或更高的剂量水平)，另一个组接受相应的安慰剂。所有病人维持正常的饮食钙的摄入量(500至800mg/天)并且避免使用钙补充剂。参照(a)身体钙总保留量，以及(b)利用双光子吸收测量法(DPA)或双能X线吸收测量法(DEXA)测定的挠骨和脊骨骨矿物质密度，对患者组进行治疗前和治疗后对比，以评价疗效。通过对比尿羟脯氨酸排泄率、血清和尿钙水平、肌酸酐清除率、脲氮以及其它常规指标评价安全性。
结果显示，与对照组病人相比，用1α，24(S)-二羟基维生素D2治疗的病人具有明显更高的身体总钙和更高的挠骨和脊骨骨矿物质密度。所监测的安全性参数证明，1α，24(S)-二羟基维生素D2治疗不导致明显高钙血症和尿钙过多症，以及其它任何的代谢失调。
实施例13：绝经后骨质丢失的预防
对年龄段在55至60岁之间的绝经后健康妇女进行临床研究。研究中将多达80的实验对象随机分成两个治疗组，连续进行试验24至36个月。一个治疗组接受恒定剂量的1α，24(S)-二羟基维生素D2(u.i.d，一个在1.0μg/天或更上的剂量水平)，另一个组接受相应的安慰剂。如实施例2所示进行试验。
结果显示，与基线值相比，用1α，24(S)-二羟基维生素D2治疗的病人身体总钙量丢失以及挠骨和脊骨骨矿物质密度下降减少。相对而言，与基线值相比，接受安慰剂治疗的病人的这些参数明显降低。所监测的安全性参数证明，在此剂量水平长期给药1α，24(S)-二羟基维生素D2是安全的。
实施例14：长期透析患者中低钙血症以及所导致的代谢性骨疾病的治疗
在一个为期12个月的、双盲、安慰剂对照的临床试验中，有30名患有肾病、长期透析的男性和女性患者进入试验。所有病人进入一个为期8周的控制期，在此期间接受维持剂量的维生素D3(400IU/天)。经过此控制期后，病人被随机分成两个治疗组，一个治疗组接受恒定剂量的1α，24(S)-二羟基维生素D2(u.i.d，剂量大于3.0μg/天)，另一组接受相应的安慰剂。两个治疗组均给药维持剂量的维生素D3，维持正常的饮食钙的摄入量，并避免使用任何钙补充剂。参照(a)肠道钙吸收的直接测量结果、(b)身体钙总保留量、(c)挠骨和脊骨骨矿物质密度、(d)血清钙测量结果，对两治疗组治疗前和治疗后进行对比以评价疗效。通过定期监测血清钙含量评价安全性。
临床数据分析显示，如采用双同位素示踪技术所得的直接测量结果所示，1α，24(S)-二羟基维生素D2能显著增加肠道钙吸收。经该化合物治疗的患者显示正常化的血清钙浓度、身体总钙量稳定、挠骨和脊骨骨矿物质密度稳定。反之，接受安慰剂治疗患者经常出现低钙血症，身体总钙量、挠骨和脊骨骨矿物质密度明显降低。治疗组中未观察到明显的高钙血症发生。
                      药物制剂
实施例15
将1.0mg 1α，24(S)-二羟基维生素D2溶于1g杏仁油中制备局部用乳膏。向该溶液中加入40g矿物油和20g自乳化蜂蜡。加热使其液化。加入40ml热水并充分混合。所得乳膏中每克约含10μg 1α，24(S)-二羟基维生素D2。
实施例16
将1.0mg 1α，24(S)-二羟基维生素D2溶于30g杏仁油制备油膏。向该溶液中加入70g经加热仅至液化的白软石蜡。充分搅拌后使其冷却。所得油膏中每克约含10μg 1α，24(S)-二羟基维生素D2。
实施例17
充分混合下向实施例14中的油膏中加入0.5g腺苷和2.0g罂粟碱，二者均用最少量的二甲亚砜溶解。这些其它成分的含量约为0.5wt％(腺苷)和2.0wt％(罂粟碱)。
实施例18
充分混合下向实施例14中的油膏中加入溶于最少量植物油中的10,000U维生素A。所得油膏中每克约含100U维生素A。
实施例19
将1.0mg 1α，24(S)-二羟基维生素D2溶于100g无水丙二醇中制备皮肤科用洗剂。将洗剂装入棕色瓶中，置于冰箱中储存。每克洗剂中约含10μg1α，24(S)-二羟基维生素D2。
实施例20
在1g杏仁油中溶解0.2mg的1α，24(S)-二羟基维生素D2。向该溶液中加入40g矿物油和20g自乳化蜂蜡。然后加入40ml热水。充分搅拌混合物使所得美容霜(cosmetic cream)中每克约含2.0μg的1α，24(S)-二羟基维生素D2。
实施例21
向实施例18中的美容霜中加入100mg腺苷。充分混合所得膏体，其中含约0.1wt％腺苷。
实施例22
将100μg 1α，24(S)-二羟基维生素D2溶于30g杏仁油制备油膏。向该溶液中加入70g经加热仅至液化的白软石蜡。充分搅拌该油膏后放冷。所得油膏中每克约含1.0μg的1α，24(S)-二羟基维生素D2。
实施例23
充分混合下向实施例18中的美容霜剂中加入溶于最少量植物油中的200U/g维生素A。
实施例24
将300μg 1α，24(S)-二羟基维生素D2溶于100g无水丙二醇中制备美容洗剂。将洗剂装入棕色瓶中，置于冰箱中储存。每克洗剂中约含3.0μg的1α，24(S)-二羟基维生素D2。
实施例25：皮肤病学试验
评价使用含有1α，24(S)-二羟基维生素D2的组合物局部治疗皮炎(接触性或异位性)的效果。所述组合物为每克约含10μg的1α，24(S)-二羟基维生素D2、以石蜡油-杏仁油为基质的油膏。对照组合物的成分相同，只是不含活性药物1α，24(S)-二羟基维生素D2。在门诊病人诊所治疗病人。建议这些病人每天使用2次。
油膏被尽可能地涂于单一病灶或皮肤病的一定区域中。在治疗开始前对油膏和容器称重，治疗结束后回收所有未用完的油膏，重新称重。
对所治疗的病灶面积进行估计并记录，如果需要，对病灶以及适当的“对照病灶”照相。后者优选为具有类似面积和发展阶段的病灶，处于被治疗病灶的附近或对侧。记录照相过程的相关细节(距离，光圈，角度，背景等)，以便下一次对病灶照相时可以重复。油膏每天施用两次，优选使其处于裸露状态。“对照”病灶不进行治疗，如果条件不允许，记录对其所作的治疗情况。
每周由医师对红斑、剥落和厚度情况进行评价，将病灶的严重程度分为0-3级。通常在4至6周的治疗结束后进行最终评价。与对照病灶相比，采用1α，24(S)-二羟基维生素D2治疗的病灶得分更低。同时没有观察到明显的高钙血症发生。
实施例26：表皮细胞分化和增生试验
采用公知的改良的首先由Rheinwald和Green(Cell，vol.6，p.331(1975))描述的系统培养人角质形成细胞。将1α，24(S)-二羟基维生素D2溶于乙醇后加到细胞中，调整浓度在0.05至5μg/ml之间，同时乙醇浓度不超过0.5体积％。对照培养物中补充终浓度为0.5体积％的乙醇。按以下指标检查表皮细胞的分化和增生：
1.角质化包膜的定量；
2.贴盘壁细胞的细胞密度的定量；
3.监测谷氨酰胺转移酶的活性；
4.采用3H-胸苷参入法监测DNA合成。
与对照培养物相比，与1α，24(S)-二羟基维生素D2一起温育的培养物具有更多的角质化包膜、贴壁细胞更少、谷氨酰胺转移酶活性更高、DNA合成更低。
虽然已对本发明进行了描述并通过一些实例进行说明。本领域技术人员应该认识到能够对以上所描述的内容进行多种修改，包括改变，添加和删减。因此，这些修改也在本发明范围内，本发明的范围应该在最宽的解释范围内由具有法律效能的权利要求所规定。
实施例27：HL-60细胞分化试验中1α，24(S)-二羟基维生素D2的活性
在如DeLuca和Ostrom(DeLuca，H.F.和Ostrem，V.K.，Prog.Clin.Biol.Res.，vol.259，pp.41-55(1988))所述的HL-60细胞分化试验中用1α，24(S)-(OH)2D2进行剂量一应答研究。在该研究中，采用1α，25-(OH)2D3作为阳性对照，采用适当的溶剂作为阴性对照。评价以下变量：非特异性酸酯酶活性、氮蓝四唑(NBT)的还原、胸苷参入。结果证明，1α，24(S)-(OH)2D2具有能促进HL-60前髓细胞分化成单核细胞的高活性。
实施例28：1α，24(S)-(OH)2D2对于人癌细胞株的抗增生作用
在一组人癌细胞株中进行1α，24(S)-(OH)2D2的剂量—应答试验。如Shieh，H.L.等人(Chem.Biol.Interact.，vol.81，pp.35-55(1982))所述，这些细胞株包括但不限于BCA-1或ZR-75-1(乳腺)和COL-1(结肠)。在这项研究中，采用适当的溶剂作为阴性对照。以胸苷参入抑制为判定标准，实验结果表明，1α，24(S)-(OH)2D2具有高的(且可逆的)抗增生活性。
实施例29.化学稳定性试验
将约5mg结晶或粉末1α，24-二羟基维生素D2分别置于5mL容量瓶中。将容量瓶置于相同的各种光和热环境条件下。众所周知，光和热是对维生素D类化合物造成破坏的环境因素。
一周后对容量瓶中的内容物作目视观察，与晶体样品相比粉末样品略微变黄。向各样品中加入5mL乙醇将样品溶解，在200至320nm处测定紫外吸收。将1α，24(S)-二羟基维生素D2标准品溶于乙醇中配成相同浓度并在制冷器中储存相同时间，并进行类似的分析。
1α，24-二羟基维生素D2参比标准品表现维生素D结构中三烯官能团的特征紫外谱，即λmax＝265nm，λmin＝228nm。晶体样品保持了这种特征的紫外谱(λmax＝265nm，λmin＝228nm)。相对而言，粉末样品的紫外谱为λmax＝255nm，λmin＝228nm，说明发生了向其它化合物的转化。根据Beer定律，265nm的吸收与浓度呈线性关系，参比标准品保持了100％的吸光度，因此浓度为100％。暴露于光和热的晶体样品保持了93％的吸光度。与之相反，粉末样品仅保持了45％的原始吸光度/浓度。
按照以下条件对晶体和粉末1α，24-二羟基维生素D2的乙醇溶液进行高压液相色谱(HPLC)分析：
NovaPakC18柱：                 3.9mm×15cm
流动相：                       乙腈/水(50∶50)
流速：                         0.5mL/min
检测器：                       二极管阵列检测器，265nm
压力(psi)                      1310
进样体积：                     10μl
参比标准品和结晶1α，24-二羟基维生素D2的HPLC图相同，参比标准品中96％的UV吸收性物质为1α，24-二羟基维生素D2，晶体样品中95％为1α，24-二羟基维生素D2。这些数据证明，结晶的1α，24(S)-二羟基维生素D2经热和光处理后超过88％的化合物保持不变。
另一方面粉末1α，24-二羟基维生素D2的HPLC分析结果证明仅有78％紫外吸收性物质为1α，24-二羟基维生素D2，仅有35％的化合物得到保持。以重量为计，对HPLC图中的1α，24-二羟基维生素D2的峰面积进行归一化，结果表明参比标准品结构得到100％的保持，结晶样品保持93％，粉末样品保持23％。粉末样品的HPLC图中出现了两个保留时间小于1α，24-二羟基维生素D2的色谱峰，在对照品和结晶样品的HPLC图中未出现。
这些数据证明与粉末1α，24-二羟基维生素D2相比，结晶1α，24(S)-二羟基维生素D2对于环境影响具有出人意料的稳定性。
实施例30：1α，24-(OH)2D2的结晶和白色粉末形式的维生素D受体结合试验
采用本领域已知的，如实施例6中所描述的方法评价经暴露于环境的晶体1α，24-二羟基维生素D2和粉末1α，24-二羟基维生素D2对维生素D受体(VDR)的结合亲和力。结果发现晶体1α，24-二羟基维生素D2的结合亲和力与参比标准1α，24-二羟基维生素D2基本相同，但是粉末形式则明显偏低。图5显示了百分结合率和化合物用量(pg/管)的关系。
如图5所示，自受体产生等量3H-1α，25-二羟基维生素D3示踪剂置换所需的晶体1α，24-二羟基维生素D2与参比标准1α，24-二羟基维生素D2基本相同，而相同条件下的粉末样品的小于25％。标准品和晶体样品的ED50(置换50％结合3H-1α，25-二羟基维生素D3所需的用量)约为10pg/管，粉末样品的ED50约为40pg/管。这些数据证明暴露于环境条件下的粉末样品生物活性明显降低。换而言之，与白色粉末样品相比，暴露于环境后晶体样品保持了更多的生物活性物质。
实施例31：细胞增生的抑制
采用Skowronski等人(132 Endocrinology(1993)1952-1960和136Endocrinology(1995)20-26)所描述的方法验证对细胞增生的抑制，此处引用这两篇文献作为参考。将源自人前列腺腺癌的细胞株LNCaP和PC-3种于6孔组织培养板中，密度为约50,000个细胞/板。细胞粘壁并固定后约2-3天，将培养基更新为含有载体或浓度在10-11M至10-7M之间的活性维生素D类似物1α，24-(OH)2D2的培养基。每3天更换含有受试类似物或载体的培养基。6至7天后，除去培养基，清洗细胞，用冷的5％三氯乙酸溶液沉淀，并用冷的乙醇清洗。用0.2N氢氧化纳溶解细胞，并用标准方法测定DNA含量。与对照培养物相比，结果显示与本发明1α，24-(OH)2D2一起温育的培养液中细胞数量明显更少。
实施例32：细胞分化
采用Skowronski等人(132 Endocrinology(1993)1952-1960和136Endocrinology(1995)20-26)所描述的方法，此处引用这两篇文献作为参考。将源自人转移性前列腺腺癌的已知能够表达PSA的细胞株LNCaP置于6孔组织培养板中，密度为约50,000个细胞/板。细胞贴壁并固定约2至3天后，将培养基更新为含有载体或浓度在10-11M至10-7M之间的活性维生素D类似物1α，24-(OH)2D2的培养基。6至7天后，除去培养基，于-20℃储存，用于前列腺特异性抗原(PSA)分析。
将平行培养液中的细胞清洗、沉淀，并用标准方法测定DNA含量。用标准方法检测PSA。与对照培养物相比，与1α，24-(OH)2D2一起温育的培养液中含有明显更多的PSA，检测数据表示为PSA数量/细胞。
实施例33：癌症治疗的一般方法
患有维生素D受体阳性肿瘤(如前列腺、乳腺、肺、结肠或胰腺腺癌，或膀胱移行上皮癌，或黑素瘤)的患者参加有关1α，24(S)-(OH)2D2的开放性试验。治疗前病人首先接受低钙饮食，以助于尽可能减少肠道吸收并且允许使用更高剂量的1α，24(S)-二羟基维生素D2。这种低钙饮食可以在治疗期间继续维持，并且一直持续到最后一次给药1α，24(S)-二羟基维生素D2一周以后。优选地，饮食中每日钙摄入量为400至500mg。同时，患者要中断任何的维生素补充剂或维生素D替代治疗。为确保达到适当的口腔湿润度，病人被要求比平常多饮用4至6杯液体。
定期对每个病人进行下列监测：(1)高钙血症、高磷酸盐血症、尿钙过多症、高磷酸盐尿症及其它毒性；(2)转移性疾病的进展变化情况，和(3)遵守用药剂量方案的情况。
典型地，用药方案为日剂量10μg或20μg至100μg，共用药24个月。或者还可以采用一种不需每日服药的用药方案，如每两天给药一次，每次40μg或每周给药一次，每次100μg。给药途径可以是口服、经静脉内或区域传递(如动脉输注、通过门静脉)，当然口服给药是最容易和效价比最高的给药途径。区域传递允许采用高剂量，并且一般能够避免产生高钙血症。但是对本发明化合物而言，该化合物基本上是低钙血活性的。
经过18个月的治疗后，采用CAT扫描、X-射线和骨扫描作为检查手段，评价采用低剂量进行治疗的多数患者中转移性疾病的进展情况或部分消退的情况，评价采用较高剂量进行治疗的许多病人中稳定的病情以及部分或完全消退的情况。
实施例34：前列腺癌的治疗
患有晚期雄激素依赖性前列腺癌的患者参加1α，24(S)-(OH)2D2的开放性试验。患者不应小于40岁、具有病理学证据证明其患有前列腺癌、并且疾病先前对激素干预疗法有响应但目前表现为进行性。在进入实验时，病人开始持续26周的口服1α，24-(OH)2D2的治疗。同时，患者要中断任何的钙补充剂、维生素D补充剂以及维生素D替代治疗。定期对每个病人进行下列监测：(1)高钙血症、高磷酸盐血症、尿钙过多症、高磷酸盐尿症及其它毒性；(2)转移性疾病的进展变化情况，和(3)遵守用药剂量方案的情况。
该研究分为两个阶段进行。在第一个阶段中，对各组患者不断提高用药剂量以确定每日口服1α，24-(OH)2D2的最大耐受剂量(MTD)。所有药物均在早餐前服用。第一组病人用25.0μg/天的1α，24-(OH)2D2进行治疗，随后几组病人用50.0、75.0和100.0μg/天进行治疗。研究过程中，持续给药，除非观察到血清钙超过11.6mg/dL，或其它毒性指标达到3或4级(NCI一般毒性标准)，此时，中止用药直到所观察的毒性效应消退，此后将剂量降低10.0μg继续用药。
该研究第一阶段的结果显示，1α，24-(OH)2D2的MTD大于20.0μg/天，是1α，25-(OH)2D3所能达到的水平的10至40倍。对定期自参与的病人收集的血样进行分析，结果表明循环中的1α，24-(OH)2D2随给药剂量线性增加，在最高剂量下所达到的峰值浓度大大超过100pg/mL，而循环中的1α，25-(OH)2D3的浓度常常降低至不可检测的水平。血清和尿钙浓度以剂量依赖性方式增加。采用最大耐受剂量的1α，24-(OH)2D2治疗6个月以上的患者宣称与转移性疾病有关的骨骼疼痛显著减轻。
在第二阶段中，病人在0.5至1倍MTD的剂量水平下采用1α，24-(OH)2D2治疗24个月，经过1年和2年的治疗，采用CAT扫描、X-射线和骨扫描作为检查手段，评价转移性疾病的进展情况，结果显示，较低剂量组中的许多病人病情稳定或部分消退，在较高剂量组中的许多病人病情稳定或部分或完全消退。
实施例35：黑素瘤的治疗
采用实施例33和34中的方法，对例如下巴(jaw)患有转移性恶性黑素瘤的患者进行治疗。经过18个月的治疗，转移性疾病的进展得到稳定或部分消退。
实施例36：视网膜母细胞瘤的治疗
采用实施例33和34中的方法，对转移性视网膜母细胞瘤患者进行治疗。经过18个月的治疗，转移性疾病的进展得到稳定或部分消退。
实施例37：肝癌的治疗
采用实施例33和34中的方法，对肝癌患者进行治疗。局域传递即进行动脉输注给药本发明化合物。经过18个月的治疗，转移性疾病的进展得到稳定或部分消退。
实施例38：急性淋巴性白血病的治疗
采用实施例33和34中的方法，对急性淋巴性白血病患者进行治疗。经过18个月的治疗，转移性疾病的进展得到稳定或部分消退。
实施例39：急性骨髓性白血病的治疗
采用实施例33和34中的方法，对急性骨髓性白血病患者进行治疗。经过18个月的治疗，转移性疾病的进展得到稳定或部分消退。
实施例40：慢性淋巴性白血病的治疗
采用实施例33和34中的方法，对慢性淋巴细胞白血病进行治疗。经过18个月的治疗，转移性疾病的进展得到稳定或部分消退。
实施例41：慢性骨髓性白血病的治疗
采用实施例33和34中的方法，对慢性骨髓性白血病患者进行治疗。经过18个月的治疗，转移性疾病的进展得到稳定或部分消退。
实施例42：浆细胞恶性增生的治疗
采用实施例33和34中的方法，对浆细胞恶性增生患者进行治疗。经过18个月的治疗，转移性疾病的进展得到稳定或部分消退。
实施例43：骨髓增生异常综合症(MDS)的治疗
采用Mellibovsky L等人(Br.J.Haematol.1998；100：516-520)所描述的方法(此处引用该文献作为参考)对骨髓增生异常综合症患者给药0.25mg/天至0.75mg/天的1α，24(S)-(OH)2D2。经过为期26个月的治疗，患者粒细胞或血小板计数增加50％和/或血红蛋白增加1-5g/dl和/或输血需求降低50％。在这些剂量下副作用非常小，不出现高钙血症。

Claims (55)

1.一种抑制恶性肿瘤或肿瘤细胞过度增生的方法，其包括以抗增生量的1α，24(S)-二羟基维生素D2治疗所述细胞，所述细胞为急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病和浆细胞恶性增生的癌细胞。
2.一种抑制恶性肿瘤或肿瘤细胞过度增生的方法，其包括向患病病人给药抗增生量的1α，24(S)-二羟基维生素D2，所述细胞为急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病和浆细胞恶性增生的癌细胞。
3.权利要求2中的方法，其中1α，24(S)-二羟基维生素D2按每日给药或间隔给药方案进行给药。
4.权利要求3中的方法，其中间隔给药方案为每2至7天给药一次。
5.权利要求3中的方法，其中1α，24(S)-二羟基维生素D2以约为1至100μg/天的日剂量给药。
6.权利要求2中的方法，其中1α，24(S)-二羟基维生素D2的给药方式为口服给药、静脉内给药、直接注射入癌症部位或区域性传递至癌症部位。
7.权利要求6中的方法，其中1α，24(S)-二羟基维生素D2通过口服给药。
8.权利要求2中的方法，其中1α，24(S)-二羟基维生素D2与细胞毒性剂联合给药。
9.权利要求8中的方法，其中细胞毒性剂为抗代谢药、抗微管剂、烷基化剂、铂类药物、蒽环霉素、拓扑异构酶抑制剂或抗生素类药物。
10.权利要求9中的方法，其中抗代谢药为5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或氟达拉滨。
11.权利要求9中的方法，其中抗微管剂为长春新碱、长春碱或紫杉烷。
12.权利要求11中的方法，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
13.权利要求9中的方法，其中烷基化剂为环磷酰胺、美法仑、生物氯乙基亚硝基脲或羟基脲。
14.权利要求9中的方法，其中铂类药物为顺铂、卡铂、奥沙利铂、JM-216或CI-973。
15.权利要求9中的方法，其中蒽环霉素为多柔比星或柔红霉素。
16.权利要求9中的方法，其中抗生素类药物为丝裂霉素、伊达比星、阿霉素或道诺霉素。
17.权利要求9中的方法，其中拓扑异构酶抑制剂为依托泊苷或喜树碱。
18.权利要求9中的方法，其中细胞毒性剂为磷酸雌莫司汀或泼尼莫司汀。
19.权利要求8中的方法，其中细胞毒性剂的抗增生有效量低于单独使用细胞毒性剂时的抗增生有效量。
20.一种缓解人急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、浆细胞恶性增生和骨髓增生异常综合症病理作用的治疗方法，其包括向所述人给药有效量的1α，24(S)-二羟基维生素D2。
21.一种在骨髓增生异常综合症患者中诱导分化的方法，其包括采用促分化量的1α，24(S)-二羟基维生素D2治疗细胞。
22.权利要求1中的方法，其中浆细胞恶性增生选自以下组中：Waldenstrm′s巨球蛋白血症、重链病、良性单克隆免疫球蛋白病、免疫细胞淀粉样变。
23.权利要求2中的方法，其中浆细胞恶性增生选自以下组中：Waldenstrm′s巨球蛋白血症、重链病、良性单克隆免疫球蛋白病、免疫细胞淀粉样变。
24.权利要求20中的方法，其中浆细胞恶性增生选自以下组中：Waldenstrm′s巨球蛋白血症、重链病、良性单克隆免疫球蛋白病、免疫细胞淀粉样变。
25.权利要求22中的方法，其中浆细胞恶性增生为Waldenstrm′s巨球蛋白血症。
26.权利要求22中的方法，其中浆细胞恶性增生为重链病。
27.权利要求22中的方法，其中浆细胞恶性增生为良性单克隆免疫球蛋白病。
28.权利要求22中的方法，其中浆细胞恶性增生为免疫细胞淀粉样变。
29.权利要求23中的方法，其中浆细胞恶性增生为Waldenstrm′s巨球蛋白血症。
30.权利要求23中的方法，其中浆细胞恶性增生为重链病。
31.权利要求23中的方法，其中浆细胞恶性增生为良性单克隆免疫球蛋白病。
32.权利要求23中的方法，其中浆细胞恶性增生为免疫细胞淀粉样变。
33.权利要求24中的方法，其中浆细胞恶性增生为Waldenstrm′s巨球蛋白血症。
34.权利要求24中的方法，其中浆细胞恶性增生为重链病。
35.权利要求24中的方法，其中浆细胞恶性增生为良性单克隆免疫球蛋白病。
36.权利要求24中的方法，其中浆细胞恶性增生为免疫细胞淀粉样变。
37.权利要求1中的方法，其中癌症为急性淋巴性白血病。
38.权利要求1中的方法，其中癌症为急性骨髓性白血病。
39.权利要求1中的方法，其中癌症为慢性淋巴性白血病。
40.权利要求1中的方法，其中癌症为慢性骨髓性白血病。
41.权利要求2中的方法，其中癌症为急性淋巴性白血病。
42.权利要求2中的方法，其中癌症为急性骨髓性白血病。
43.权利要求2中的方法，其中癌症为慢性淋巴性白血病。
44.权利要求2中的方法，其中癌症为慢性骨髓性白血病。
45.权利要求2中的方法，其中1α，24(S)-二羟基维生素D2与分化剂联合给药。
46.权利要求45中的方法，其中分化剂包括全反式维甲酸。
47.权利要求2中的方法，其中1α，24(S)-二羟基维生素D2与血管生成抑制剂联合给药。
48.权利要求47中的方法，其中血管生成抑制剂为美法仑。
49.权利要求47中的方法，其中血管生成抑制剂为泼尼松。
50.权利要求47中的方法，其中血管生成抑制剂为沙利度胺。
51.权利要求2中的方法，其中1α，24(S)-二羟基维生素D2与生物调节剂联合给药。
52.权利要求51中的方法，其中生物调节剂为抗体、单克隆抗体、疫苗、集落刺激因子(CSF)或细胞因子。
53.权利要求52中的方法，其中生物调节剂单克隆抗体。
54.权利要求53中的方法，其中单克隆抗体为利妥昔单抗。
55.权利要求53中的方法，其中单克隆抗体为曲妥单抗。
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