CN1186435A - 维生素d4衍生物在治疗癌症中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用作用于治疗钙代谢疾病以及乳腺癌和结肠癌之药物组合物中的活性化合物的新型的1α－羟基维生素D4和新型的类似物,并优选为1,24－二羟基维生素D4。

Description

维生素D4衍生物在治疗癌症中的应用
技术领域
本发明涉及生物活性的维生素D4化合物。更具体而言，本发明涉及新型的1α-羟基维生素D4以及用于其合成的新型中间体，新型的1，25-二羟基维生素D4和新型的1，24-二羟基维生素D4。
本发明还涉及包含药物有效量之新型1α-羟基维生素D4化合物的药物组合物，以及通过给药药物有效量之所述新型化合物来控制非正常钙代谢的方法。
背景
已知维生素D在调节动物和人的钙代谢中是非常重要的。见Harrison’s Principals of Internal Medicine：Part Eleven，“Disorders ofBone and Mineral Metabolism，Chapter 335”；E.Braunwald等人，(eds.)，McGraw-Hill，NewYork，1987，pp.1860-1865。维生素D的两种最熟知的活性形式是维生素D3和维生素D2。维生素D3是在动物和人的皮肤中内源性合成的，而维生素D2是通过植物供给的维生素D的形式。维生素D2与维生素D3的不同之处在于，维生素D2在C22和C23之间存在一个双键，而且还包含一个C24甲基。在人和鼠中，维生素D3和维生素D2具有等同的生物效用。
维生素D4也被称为经照射的22，23-二氢麦角甾醇或22，23-二氢维生素D2或22，23-二氢麦角钙化甾醇，它与维生素D3的不同之处在于它包含一个C24甲基。维生素D4首次于1936年被披露出。见Grab，W.，Z.Physiol.Chem.243：63(1936)；McDonald，F.G.，J.Biol.Chem.，114：IVX(1936)。亦见Windaus，A.和Trautmann，G.，Z.Physiol.Chem.247：185-188(1973)。这些文献对维生素的生物活性水平有一些不同的报道，它们表明，在鼠中，维生素D4只有维生素D3活性的三分之一或四分之三，而在鸡中，则为维生素D3活性的十分之一或五分之一。
DeLuca等人于1968年对维生素D4之生物活性进行了更为明确的研究。见DeLuca等人，Arch.Biochem.Biophys.，124：122-128(1968)。作者们在该文章中确证维生素D4的活性比维生素D3的低。DeLuca等人报道，根据它们的手头资料，在鼠中，维生素D4的活性是维生素D3或维生素D2的三分之二，而在鸡中，是维生素D3活性的五分之一。
DeLuca等人指出“维生素D4自首次为Windhaus和Trautmann披露以来，它的合成显然是很少用到”，并评论到“这可能是因为维生素D4只有学术上的意义”。
就申请人所具有的知识来讲，维生素D4仍只是在学术上有意义，因为自从DeLuca等人报道以来，申请人尚未意识到对维生素D4进行进一步的研究。事实上，Merck Index对维生素D4的说明为，“其生物活性似有疑问”。Merck Index，S.Budavari(ed.)，第11版，Merck&Co.，Rahway，N.J.(1989)，1579页，#9930。
自从DeLuca等人发现维生素D3的活性形式--1，25-二羟基维生素D3(美国专利3,697,559)及其合成前体--1α-羟基维生素D3(美国专利3,741,996)以来，主要的兴趣都集中在研究这些活性维生素D3代谢物的治疗应用上。令人遗感的是，虽然维生素D3代谢物作为治疗药物有非常大的前途，但是由于这些药物的毒性极大，这种前途没有得以完全实现。例如，毒性限制了维生素D3、其活性形式和类似物防止骨流失或恢复流失骨的效用。许多研究表明，在这些药物可有效地预防和恢复骨流失所需的剂量时，产生了高钙血症和高钙尿症的问题。已有报道1-α羟基维生素D3在2μg/天(在某些研究中表明该剂量可有效防止骨流失)的每日剂量时，可在大约67％的病人中产生毒性。所需的是低毒性的生物活性维生素D代谢物，以使该药物可实际用作治疗药物。
发明概述
本发明之新型化合物，1α-羟基维生素D4、1，25-二羟基维生素D4和1，24-二羟基维生素D4都是维生素D4的活性形式。本发明之发明者发现维生素D4的这些活性形式要比基于先前报道之维生素D4的生物测试所预测的具有更大的生物作用。本发明之发明者还发现到，该新型生物活性化合物的毒性比基于它们的生物效能而预测的要低。高活性和低毒性兼而有之使本发明的化合物可用作治疗钙代谢疾病的治疗药物。本发明的新型化合物会可有利地用作用于治疗由非正常钙代谢所引发之疾病的药物组合物中的活性化合物。
为研究本发明的新型化合物，研制出它们的制备方法则是必须的。合成了α-羟基维生素D4，在该合成过程中还制备了新型中间体。分离出作为1α-羟基维生素D4之生物代谢产物的1，25-二羟基维生素D4和1，24-二羟基维生素D4。
在参考附图检查本发明之以下详细描述时，将可得到本发明的其他优点并对具体的适用症、组份变化、以及理化性质有更全面的了解。
附图简述
以下将参考附图对本发明进行描述，其中所用标号与文中的相同，在图中：
图1说明合成维生素D4的制备步骤；以及
图2描述由维生素D4起始合成1α-羟基维生素D4的制备步骤。
详细说明
本发明提供合成的1α-羟基维生素D4(1α-OH-D4)化合物，以及维生素D4的甲苯磺酰化和环化衍生物。
在此所用术语“生物活性”或“生物活性的”是指，化合物之如可影响代谢，如影响血清钙浓度，或与合适的受体蛋白结合，如与维生素D受体蛋白结合的生化性质。
在其一方面中，本发明包括通式(I)的生物活性化合物，及其盐、水合物和溶剂化物：其中，R1是H或OH，R2是H或OH。式(I)化合物中优选的化合物是其中R1和R2都是H；R1＝OH，而R2＝H；以及R1＝OH的化合物。
在另一方面中，本发明涉及式(I)化合物的制备。1α-羟基维生素D4，即其中R1和R2都是H的式(I)化合物的合成是根据图1和2所示的路线来完成的。如图1所示，合成中使用麦角甾醇作为起始物。使用类似于Barton等人，JCS Perkin I.1976，821-826的方法，麦角甾醇在六步的方法中经过侧链饱和，产生22，23-二氢麦角甾醇(VIII)。然后按照Windaus等人，Z.Physiol.Chem.，1937，147：185所述的方法对22，23-二氢麦角甾醇进行照射，产生维生素D4(22，23-二氢麦角钙化甾醇)(IX)。如图2所示，然后使用类似于Paaren等人，J.Org.Chem.，1980，45：3253中所描述的方法，在四步方法中对维生素D4进行羟基化，产生1α-羟基维生素D4。
具体而言，对麦角甾醇进行乙酰化，形成3β-乙酸酯。该麦角甾醇乙酸酯于5，6双键上进行羟卤化反应，形成6α-氯-5α羟基衍生物。还原并再乙酰化该氯代醇，形成5α-羟基(即5α-醇)衍生物。5α-醇进行氢化，以饱和侧链。所得的3β-乙酰氧基麦角甾-7烯-5α-醇进行还原，产生22，23-脱氢麦角甾醇乙酸酯，再将其还原成22，23-脱氢麦角甾醇。然后照射该22，23-脱氢麦角甾醇，形成维生素D4。接着对维生素D4进行甲苯磺酰化，产生3β-甲磺酰基维生素D4。通过溶剂解来置换该甲苯磺酸酯，产生6-甲氧基-3，5-环维生素D4。环维生素D4进行烯丙位氧化，形成1α-羟基环维生素衍生物。再对该1α-羟基环维生素衍生物进行溶剂解，然后进行Diels-Alder型反应，除去5-甲氧基并从5，6反式-1α羟基维生素D4中分离出1α-羟基维生素D4(5，6-顺式)。
1α-羟基维生素D4的1，24-二羟基维生素D4和1，25-二羟基维生素D4代谢物是通过以下方法合成的：将1α-羟基衍生物与人肝细胞一起温育，培养细胞，然后回收1，24-二羟基或1，25-二羟基维生素D4。使用维生素D受体蛋白结合试验，确定这些代谢物是生物活性的。
已发现式(I)的化合物具有有价值的药理活性，即作为钙代谢，特别是血清钙浓度的控制药物。具体而言，式(I)的化合物可在维生素D缺乏的鼠中增加血清钙浓度。还发现式(I)的化合物具有低毒性，这也增加了它们的药物性质。通过LD50测试，式(I)化合物所具有的毒性与相应的维生素D2化合物类似，但低于相应的维生素D3化合物。因此，本发明的化合物可在各种的临床和兽医领域中应用，而且特别是可用于治疗非正常的钙和磷代谢。
在另一方面中，本发明提供控制钙代谢的方法，例如用于治疗由肝衰竭、肾衰竭、胃肠道衰竭等引起的非正常钙代谢。式(I)的化合物可用于预防性或治疗性地治疗维生素D缺乏疾病及其相关的疾病，例如肾病性骨营养不良，脂肪痢，抗惊厥药引起的骨软化，低磷酸盐血症的抗维生素D佝偻病，骨质疏松症、包括绝经后的骨质疏松症、老年性骨质疏松症、甾体化合物诱发的骨质疏松症，以及其他的以骨质流失为特征的疾病状态、假性缺乏性(维生素D依赖性)佝偻病、营养性和吸收障碍性佝偻病，甲状旁腺机能减退、术后的甲状旁腺机能减退、自发性甲状旁腺机能减退、假性甲状旁腺机能减退和酗酒继发的骨软化和骨质减少。
式(I)的化合物，优选那些其中R1或R2是OH的化合物，如1α，24-二羟基维生素D4，对治疗过度增殖性皮肤疾病如牛皮癣、湿疹、皮肤缺乏足够的牢固度、皮肤水化和皮脂分泌是非常有价值的。用于治疗上述皮肤疾病特别优选的是1α，24-二羟基维生素D4的(R)立体异构体，即1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式，或者是仅含有少量的(S)形式。因此，本发明提供治疗皮肤疾病的方法：向患有所述疾病的患者给药治疗有效量的式(I)化合物，优选其中R1或R2是OH的式(I)化合物，如1α，24-二羟基维生素D4。更优选的式(I)化合物是1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式。
式(I)化合物，优选其中R1或R2是OH的那些化合物，如1α，24-二羟基维生素D4另外对抑制恶性细胞，如癌细胞的过度增殖活性也是有价值的。换言之，式(I)的化合物，特别是如1α，24-二羟基维生素D4在施用到恶性细胞上时可起到抗增殖药物的作用。用作抗增殖药物时特别优选的是1α，24-二羟基维生素D4的(R)立体异构体，即1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式或者是仅含有少量的(S)形式。因此，本发明提供用有效量的式(I)化合物，优选其中R1或R2是OH的式(I)化合物，如1α，24-二羟基维生素D4治疗恶性细胞如人癌症细胞(即抑制它们的过度增殖活性)的方法。式(I)化合物中更优选的是1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式。有效量的范围在约1-500μg/剂量。式(I)化合物在治疗癌症中特别有价值的是用于治疗皮肤癌，这构成了本发明的另一方面。
具体而言，式(I)化合物在治疗乳腺癌和结肠癌中是非常有价值的。在另一方面中，本发明提供治疗乳腺癌和结肠癌之过度增殖性细胞作用的方法：其是向患有此病的患者给药治疗有效量的式(I)化合物，优选其中R1或R2是OH的式(I)化合物，如1α，24-二羟基维生素D4。更优选的是1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式。
式(I)化合物另外可用于治疗非癌性皮肤疾病如接触性和异位皮炎。
式(I)化合物可作为在治疗例如由非正常钙代谢诱发的疾病时，与维生素D3之活性形式的已知类似物相比具有较低副作用和毒性之药物组合物中的活性化合物。这些药物组合物构成本发明的另一方面。
本发明的药物活性化合物可根据药学中常规的方法进行加工，以制备用于向患者如包括人的哺乳动物给药的药物。例如，式(I)化合物可以是与常规赋形剂的混合物，所述赋形剂例如是适用于经肠(如口服)、非胃肠道、或局部给药，但不与活性化合物反应的药物学上可接受的载体物质。
合适的药物学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯胶、植物油(例如玉米油、棉籽油、花生油、橄榄油、椰子油)、鱼肝油、油性酯如多乙氧基醚、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(例如乳糖、直链淀粉或淀粉)、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
药物制剂可进行灭菌，而且如果需要的话可与辅剂混合，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、颜料、调味剂和/或一种或更多种其他活性化合物，例如维生素D3或D2以及它们的1α-羟基化代谢物、缀合的雌激素或它们的等同物、抗雌激素、降钙素、二磷酸酯、钙补充剂、维生素B12、百日咳毒素和硼。
对于非胃肠道给药来说，特别合适的是可注射的无菌溶液，优选的是油性或含水溶液，以及悬浮液、乳液、或植入物，包括栓剂。安瓿也是常规的单元剂量。
在治疗癌症如皮肤癌、乳腺癌和结肠癌时，式(I)的化合物，优选1α，24-二羟基维生素D4，以及更优选的1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式，它们的非胃肠道剂量是每单元剂量约0.5-50μg。
在治疗过度增殖性皮肤病如牛皮癣时，式(I)的化合物，优选1α，24-二羟基维生素D4，以及更优选的1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式，它们的非胃肠道剂量是每单元剂量约0.5-50μg。
在经肠给药时，特别合适的是片剂、糖衣丸、液体、滴剂、栓剂、锭剂、粉剂或胶囊剂。如果需要甜味载体时，可使用糖浆剂、甘香酒剂等。
可配制成缓释的或直接释放的组合物，如脂质体或那些活性化合物被用那些不同的可降解的包衣如微囊、多层包衣等等保护的组合物。
对于局部使用，可使用合适的非喷雾剂型的粘性、半固体剂型或固体剂型，它们含有一种与局部使用相容并最好有大于水的动力学粘度的载体。合适的制剂包括但不局限于溶液、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、粉末、擦剂、油膏剂、气溶胶、透皮药贴等等，如果需要它们可以被消毒或与辅剂如防腐剂、稳定剂、反乳化剂、润湿剂等等混合。
根据本发明之化合物的局部制剂在用于治疗皮肤疾病时可包括如促上皮形成药物如视黄酸类药物(retinoids)(如维生素A)、色原烷醇如维生素E、β-激动剂如异丙基肾上腺素或环腺苷单磷酸酯(cAMP)、抗炎药物如皮质甾类药物(如氢化可的松或其乙酸酯，或地塞米松)以及角膜成形(keratoplastic)药物如煤焦油或anthralin。以组合物的重量计，这些药物的有效量例如为，维生素A是约0.003-3％，维生素E是约0.1-10％；异丙基肾上腺素是约0.1-2％；cAMP是约0.1-1％；氢化可的松是约0.25-5％；煤焦油是约0.2-20％，anthralin是约0.05-2％。
在局部治疗皮肤疾病时，式(I)化合物，优选1α，24-二羟基维生素D4，以及更优选的1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式，它们在局部施用之组合物中的剂量是每克组合物约1-100μg。
在治疗癌症时，如皮肤癌、乳腺癌和结肠癌，式(I)化合物，优选1α，24-二羟基维生素D4，以及更优选的1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式，它们在局部施用之组合物中的剂量是每克组合物约1-100μg。
在治疗过度增殖性皮肤疾病时，如牛皮癣，式(I)化合物，优选1α，24-二羟基维生素D4，以及更优选的1α，24(R)-二羟基维生素D4，基本上不包含其(S)形式，它们在局部施用之组合物中的剂量是每克组合物约1-100μg。
在直肠给药时，化合物形成在包含栓剂基物如可可油或其他甘油三酯的药物组合物中。为延长储存期，组合物可有利地包含抗氧剂如抗坏血酸、羟基苯甲醚丁酯或氢醌。
优选口服给药本发明的药物组合物。本发明的化合物一般以单元剂量的形式配制，而每单元剂量在药物学上可接受的载体中含有大约0.5-大约25μg。按照本发明之化合物的剂量一般大约为0.01至0.5μg/kg/天，优选大约0.04至0.3μg/k/kg天。
可以理解的是，根据使用的特别化合物的效用、配制成的特殊组合物、使用方式和治疗的特殊部位和器官，活性化合物的实际优选量在特殊情况下会改变。例如，每个特殊病人的专门剂量依赖于许多种因素，如年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药的时间和方式、排泄的速率和合用的药物以及所治疗之特殊疾病的严重程度。例如通过常规的考虑，如目标化合物与已知物的不同活性的常规对比，或者是通过一种合适的常规药理试验方法，可以确定所用剂量。
在另一方面中，本发明的化合物还可有利地用于兽药组合物中，例如用于治疗或预防低钙血症之家畜的饲料组合物。一般情况下，本发明的组合物可配制在动物饲料中，使得正常消耗该饲料时提供给动物约0.01-0.5μg/kg/天。
以下实施例只是用于说明，而非限制本发明。在以下实施例中，所有温度都是摄氏度；除非另有说明，所有的份数和百分比都是以重量为计。质子核磁(1H NMR)光谱是用IBM Sy-200(200mHz)、带有aspect3000计算机的BrukerAm-400(400mHz)，在CDCl3溶液中，以CHCl3为内标测定的。红外光谱是用富立叶转换(FTIR)、使用样品以及溴化钾(KBr)片或液体测定的。质谱是用Finnigan MAT-90质谱仪在20eV/C1下测定的。熔点是在Hoover-Thomas(毛细管)Uni-Melt和Fisher-Johns熔点仪(cover-slip型)上测定的。实施例1：1α-羟基维生素D4的合成
将100g(0.25mol)麦角甾醇溶解在600ml无水吡啶和68ml(0.7mol)乙酸酐中，将麦角甾醇(II)转化为麦角甾醇乙酸酯(III)。在室温下搅拌溶液过夜，此后通过添加1.2L冰将溶液冷却，产生沉淀。沉淀物用每份400ml的水洗涤5次，然后用400ml的CH3CN洗涤一次。所得产物在空气下干燥，产生79g(71％)的白色晶体状的麦角甾醇乙酸酯，其具有以下特征：熔点(m.p.)：169-171℃；1H NMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-CH3CO)，4.65-4.75(1H，m，3α-H)，5.15-5.25(2H，m，22-H和23-H)，5.4(1H，d，6-H)，5.6(1H，d，7-H)，FTIR(KBr)：1734cm-1(C＝O伸缩)，968cm-1(C-H弯曲)。
将麦角甾醇乙酸酯(III)(26gm，0.062M)溶解在2.5L的新蒸馏出的脱氧甲苯中。在氮气、-78℃下，在30分钟的时间内向该溶液中添加9ml(0.111mol)溶解在240ml无水二氯甲烷中的铬酰氯。再在-78℃下搅拌该反应系统15分钟，然后一次性添加62ml饱和的硼氢化钠乙醇溶液。在-78℃下又搅拌了15分钟后，反应溶液倾倒至3N盐酸(3L)和苯(3L)组成的两相系统中。分离有机层，然后用水(2L)洗涤，再用盐水溶液(2×1L)洗涤二次，接着用无水硫酸镁干燥。经干燥的溶液过滤，在真空下浓缩。用CH3CN(280ml)处理粗晶体产物，然后过滤由此形成的浆液，产生12.5g(41％)的白色晶体状3β-乙酰氧基-6α-氯麦角甾-7，22-二烯-5α-醇(IV)，其具有以下特征：m.p.：190-192℃；1H NMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-OAc)，4.65(1H，d，6β-H)，5.1(1H，s，7-H)，5.1-5.3(2H，m，22-H和23-H)；FTIR(KBr)：1732cm-1(C＝O伸缩)，968cm-1(C-H弯曲)，3437cm-1(O-H伸缩)。
在室温和氮气下，将3β-乙酰氧基-6α-氯麦角甾-7，22-二烯-5α-醇(IV)(21.4g，0.044mol)在无水THF(900ml)中的溶液缓慢加至氢化锂铝(2.66g，0.07mol)在无水THF(750ml)中的搅拌悬浮液中。混合物回流3小时，然后冷却至0℃。用饱和硫酸钠溶液分解过量的氢化物。由无水硫酸钠中过滤，蒸发滤液，产生一固体，该固体直接用乙酸酐(110ml)和无水吡啶(220ml)在0℃下处理。减压除去溶剂，产生乙酸酯(12.75g，61％)，3β-乙酰氧基-麦角甾-7，22-二烯-5α-醇(V)，其具有以下特征：m.p.：229-232℃；FTIR(KBr)1736cm-1(C＝O伸缩)，3460cm-1(O-H伸缩)，972cm-1(C-H弯曲)。
3β-乙酰氧基-麦角甾-7，22-二烯-5α-醇(V)(2.5g，0.0055mol)与新制的PtO2(0.5g)之乙酸乙酯溶液(820ml)在H2气(15psi)下一起振摇16小时。过滤除去催化剂，蒸发滤液，产生粗的乙酸酯，将该乙酸酯溶解在二氯甲烷中，然后在硅胶上层析。用二氯甲烷洗脱，产生基本上为纯的白色晶体状的3β-乙酰氧基-麦角甾-7-烯-5α-醇(VI)(2.15g，85％)，其具有以下特征：m.p.：228-232℃；1H NMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-OAc)，5.05-5.20(2H，s，3α-H和7-H)；FTIR(KBr)：1736cm-1(C＝O伸缩)，3462cm-1(O-H伸缩)。
在0℃和氮气下，将在无水吡啶(170ml)中的重新蒸馏的亚硫酰氯(9.7ml)添加至化合物3β-乙酰氧基-麦角甾-7-烯-5α-醇(VI)之无水吡啶(800ml)溶液中。2.5小时后，用冰水(1.5L)稀释溶液，并用2份醚(2.5L+1.5L)萃取。合并的醚萃取液用碳酸氢钠溶液(1.0L×2)洗涤，然后再用1NHCl(1.5L×2)和水(1L)洗涤。醚溶液用硫酸镁干燥，然后过滤，再减压蒸发，产生粗产物，该产物用CH3CN(100ml)转化成浆液。过滤收集产物，并用CH3CN重结晶，得到4.5g(39％)白色晶体状22，23-二氢麦角甾醇乙酸酯(VII)，其具有以下特征：m.p.：144-147℃；1H NMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-OAc)，4.65-4.75(1H，m，3α-H)，5.4(1H，d，6-H)，5.6(1H，d，7-H)；FTIR(KBr)：1734cm-1(C＝O伸缩)。
立即在室温下将22，23-二氢麦角甾醇乙酸酯(VII)(4.8g，0.011mol)添加至氢化锂铝(2.5g，0.066mol)之无水醚(1.1L)搅拌悬浮液中。在室温下搅拌混合物2小时。添加5N氢氧化钠，以破坏过量的氢化锂铝，然后再加入水(500ml)。含水溶液用4份250ml的醚萃取。合并的醚萃取液以及合并的有机层用盐水溶液(1L)洗涤，然后用硫酸钠干燥。减压蒸发醚，得到白色晶体状化合物22，23-二氢麦角甾醇(VIII)(4.1g，94％)，其具有以下特征：m.p.：147-150℃；1H NMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 3.6-3.7(1H，m，3α-H)，5.4(1H，d，6-H)，5.6(1H，d，7-H)；FTIR(KBr)：3400(O-H伸缩)。
将22，23-二氢麦角甾醇(VIII)(2.0g，5.0mmol)溶解在乙醚和苯(4∶1，600ml)的溶液中，然后在氩气和搅拌下，在水冷石英容器中照射(Hannovia浸没灯，450瓦)3小时。在真空下浓缩该溶液，产生胶状固体，将该固体重新溶解在100ml乙醇中，在氩气下加入回流8小时。然后在真空下浓缩该溶液，残留物用硅胶柱吸附，用30％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到维生素D4(22，23-二氢钙化甾醇)(IX)，收率为1.2g(60％)，其具有以下特征：1H NMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 0.55(3H，s，18-H3)，0.78(6H，dd，26H3和27-H3)，0.87(3H，d，21-H3)，0.93(3H，d，28-H3)，3.94(1H，m，3-H)，4.82(1H，m(尖峰)，19-H)，5.04(1H，m(尖峰)，19-H)，6.04(1H，d，7-H)，6.24(1H，d，6-H)。
在0℃下将新重结晶的对甲苯磺酰氯(3.6g，19mmol)添加至维生素D4(IX)(3.0g，7.5mmol)之10ml无水吡啶搅拌溶液中。反应混合物在5℃下搅拌24小时，然后立即将混合物倾倒至冰和饱和碳酸氢钠(100ml)上，并同时搅拌。用二氯甲烷(3×300ml)萃取含水悬浮液。合并的有机萃取液用10％盐酸(3×200ml)、饱和的碳酸氢钠(3×200ml)和饱和的氯化钠(2×200ml)洗涤，用硫酸镁干燥，然后在真空下浓缩，产生3.5g(84％)的新中间体化合物维生素D4甲苯磺酸酯(X)，其具有以下特征：1HNMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 0.54(3H，s，18-H3)，0.78(6H，dd，26H3和27-H3)，0.87(3H，d，21-H3)，0.93(3H，d，28-H3)，2.45(3H，s，CH3(甲苯磺酸酯))，4.68(1H，m，3-H)，4.82(1H，m(尖峰)，19-H)，5.04(1H，m(尖峰)，19-H)，5.95(1H，d，7-H)，6.09(1H，d，6-H)，7.34和7.79(4H，d，芳香)。
在碳酸氢钠(17.0g，202mmol)之甲醇(200ml)搅拌悬浮液中滴加维生素D4甲苯磺酸酯(X)(3.5g，6.3mmol)之无水二氯甲烷(10ml)溶液。反应混合物在氩气下回流过夜，然后冷却至室温，在真空下浓缩至约50ml。反应浓缩液用醚(600ml)稀释，用水(3×300ml)洗涤，用硫酸镁干燥，再在真空下浓缩。残留物通过硅胶柱，用10％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到新中间体化合物3，5环维生素D4(XI)(粘稠油状物)，收率1.5g(58％)，其具有以下特征：1H NMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 0.56(3H，s，18-H3)，0.78(6H，dd，26H3和27-H3)，0.87(3H，d，21-H3)，0.94(3H，d，28-H3)，3.28(3H，s，OCH3)，4.2(1H，d，6-H)，4.91(1H，m(尖峰)，19-H)，4.98(1H，d，7-H)，5.08(1H，m(尖峰)，19-H)。
在三颈烧瓶中，将t-丁基过氧化氢之甲苯(3M)(2.6ml，7.8mmol)溶液添加至二氧化硒(0.22g，2mmol)之无水二氯甲烷溶液中。混合物在氩气下搅拌3小时。然后添加吡啶(0.3ml，3.7mmol)，以在二氯甲烷中之溶液的形式引入环维生素D4(XI)(1.5g，3.6mmol)。搅拌30分钟后，添加10％氢氧化钠水溶液(200ml)。反应混合物用醚(50ml)稀释，并产生相分离。有机相用10％氢氧化钠(3×200ml)、水(2×200ml)和饱和氯化钠溶液(2×200ml)洗涤，用硫酸镁干燥，然后在真空下浓缩。残留物用硅胶柱吸附，用30％乙酸乙酯之己烷溶液洗脱，得到0.45g(29％)新中间体混合物1α-羟基3，5-环维生素D4(XII)(油状物)，其具有以下特征：1H NMR：(400MHz，CDCl3)，δppm 0.54(3H，s，18-H3)，0.78(6H，dd，26H3和27-H3)，0.86(3H，d，21-H3)，0.95(3H，d，28-H3)，3.26(3H，s，OCH3)，4.2(1H，d，6-H)，4.22(1H，m，1-H)，4.95(1H，d，7-H)，5.18(1H，d，19-H)，5.22(1H，d，19-H)。
于氩气下将在二甲基亚砜(4.5ml)和冰醋酸(3.6ml)溶液中的1α-羟基3，5-环维生素D4(XII)(0.45g，1.05mmol)加热至50℃1小时。反应混合物倾倒至冰和饱和碳酸氢钠溶液(100ml)上，然后用醚(3×200ml)萃取。合并的醚萃取液用饱和碳酸氢钠溶液(3×200ml)、水(3×200ml)和饱和氯化钠溶液(3×200ml)洗涤，用硫酸镁干燥，然后在真空下浓缩，得到包含5，6-顺和5，6-反式1α-羟基维生素D4的混合物(1H NMR测定约为4∶1)0.4g(92％)。将5，6-顺和5，6-反式1α-羟基维生素D4的混合物(0.4g，0.97mmol)溶解在乙酸乙酯(25ml)中，然后用新重结晶的马来酸酐(0.08g，0.8mmol)处理。反应混合物在氩气下加热至35℃24小时。在真空下蒸发溶剂后，粗混合物用硅胶柱色谱纯制，其使用乙酸乙酯和己烷(1∶1)作为洗脱液，得到维生素D4的新活性形式，5，6-顺式1α-羟基维生素D4(XIII)，收率90mg(23％)，其具有以下特征：m.p.：128-130℃；IR Vmax(净)：3400cm-1(OH伸缩)；1HNMR：(400MHz，CDCl3)，δppm0.55(3H，s，18-H3)，0.79(6H，dd，26H3和27-H3)，0.87(3H，d，21-H3)，0.94(3H，d，28-H3)，4.24(1H，m，3-H)，4.44(1H，m，1-H)，5.02(1H，m(尖峰)，19-H)，5.34(1H，m(尖峰)，19-H)，6.02(1H，d，7-H)，6.4(1H，d，6-H)；质谱[Cl]m/e(相对强度)：415(M+1，41％)，397(M+1-OH，100％)，379(27％)，135(22％)。实施例2：1α-羟基维生素D4的生物测试
雄性weanling鼠(Holtzman系，Holtzman公司，Madison，Wisconsin)用包含足量钙(0.47％)和磷(0.3％)的维生素D缺乏饲料喂养。在3-4周内，该饮食诱发以低血清钙和生长差为特征的极度维生素D缺乏症。用该饲料喂养4周后，鼠的血清钙值低于7mg/dl。然后将鼠分为4组，并口服给药在如椰子油之类的载体中的1α-羟基维生素D4或者载体(对照)各14天。在最后给药后的24小时，将鼠杀死，并用标准实验室技术测定血钙。测量结果见表1。
                              表1
                       血清钙浓度的增加
  化合物     剂量(gμ/kg/天)   鼠的数量 血清钙浓度(mg/dl)±标准差
  对照     -     10     6.1±0.48
  1α-OH-D4     0.042     8     7.1±0.80
  1α-OH-D4     0.250     7     11.6±0.45
  1α-OH-D4     1.500     9     12.7±0.37
表1的数据表明，1α-羟基维生素D4对于增加维生素D缺乏鼠的血清钙是有效的，而且该应答似乎是剂量依赖型的。令人惊奇的是，应答水平相比于Wientroub等人报导的在类似于上述实验条件下向维生素D缺乏鼠给药1，25-二羟基维生素D3，是更有利的。见Wientroub，S.，Price，P.A.，Reddi，A.H.，“The Dichotomy in the Effects of 1，25dihydroxy vitamin D3 and 24，25 digydroxy vitamin D3 on Bone Gamma-Carboxyglutamic Acid-Containing Protein in Serum and Bone in vitamin D-Deficient Rats，”Calcif.Tissue Int.(1987)40：166-172。实施例3：毒性测试
使用已知的方法通过测定平均致死剂量(LD50)来估测1α-OH-D4的口服急性毒性。给鼠喂养标准的实验室饲料8-10周。向各性别的5只鼠给药一个口服剂量的1α-OH-D4。观察动物14天，记录死亡数量。确定LD50值在雄性中为约1.0mg/kg，在雌性中为3.0mg/kg。
相比而言，申请人发现1α-羟基维生素D2在相同条件下的LD50值在雄性和雌性鼠中分别为1.7和1.8mg/kg。1α-羟基维生素D2的毒性已有报导比1α-羟基维生素D3低。Sjoden，G.，Smith，C.，Lindgren，U.，和DeLuca，H.F.，Proc.Soc.Experimental Biol.Med.，178：432-436(1985)。实施例4：1，25-二羟基维生素D4的产生和分离
将本发明的1α-羟基维生素D4与经培养的人肝细胞一起温育，该肝细胞可将化合物代谢成几种包括1，25-二羟基维生素D4的代谢物。分离1，25代谢物，并用高压液相色谱纯制，用气相色谱-质谱鉴定。结合实验证明1，25-二羟基维生素D4对哺乳动物维生素D受体蛋白具有良好的结合亲和性，这表明其具有生物活性。所用方法类似于Strugnell等人在Biochem.Pharm.，卷40，333-341页(1990)中所描述的。实施例5：1，24-二羟基维生素D4的产生和分离
1，24-二羟基维生素D4的产生和分离与上述实施例4相同。将本发明的1α-羟基维生素D4与经培养的人肝细胞一起温育，该肝细胞可将化合物代谢成几种包括1，24-二羟基维生素D4的代谢物。分离1，24代谢物，并用高压液相色谱纯制，用气相色谱-质谱鉴定。用新代谢物的结合实验证明该代谢物对哺乳动物维生素D受体蛋白具有良好的结合亲和性，这表明其具有生物活性。实施例6：高钙血症测试
雌性鼠喂养包含0.8％钙(0.8％)和磷(0.6％)的市售饲料。将鼠分为4组，各组每日口服给药在如椰子油之类的载体中的1α-羟基维生素D4或者载体(对照)各13天。在最后给药后的24小时，将鼠杀死，并用标准方法测定血清钙。
该实验证明，在最高至2.5μg/kg/天剂量的1α-羟基维生素D4时，血清钙浓度未受影响或者是只略微上升。实施例7：进一步的生物测试
雄性weanling鼠给予维生素D缺乏并低钙(0.02％)的饲料。4周过后，将鼠分为4组，并静脉给药在如乙醇之载体中的1α-OH-D4或载体(对照)。在给药16小时后，将鼠杀死，根据Martin和Deluca，Am.J.Physiol.216：135-1359的方法，用外翻十二指肠囊测定钙的肠内转运。
该实验证明钙肠内转运的刺激是剂量依赖性的。实施例8：
用年龄在55-75岁之间的绝经后骨质疏松症患者进行临床研究。该研究涉及多至120位患者，这些患者随机分为3个治疗组，并持续12-24个月。两个治疗组接受固定剂量的1α-OH-维生素D4(u.i.d.；两种大于3.0μg/天的不同剂量水平)，另外一组接受相应的安慰剂。所有患者都维持饮食中钙的正常吸收(500-800mg/天)，并避免使用钙补充剂。通过患者组在以下方面的治疗前和治疗后的对比估测效用：(a)通过X-射线吸收计(DEXA)确定的总体、桡骨、股骨和/或脊椎骨的矿物质密度；(b)髂骨嵴的骨活组织检查；和(c)血清骨钙素的确定。通过比较尿羟基脯氨酸排泄、血清和尿钙水平、肌酸酐清除、血尿素氮、以及其他常规测定，评价安全性。
该研究证明用1α-OH-维生素D4治疗的患者与用安慰剂治疗的患者相比，具有明显更高的总体、桡骨、股骨和/或脊椎骨的矿物质密度。治疗的患者还表现出明显升高的血清骨钙素。经治疗之患者的骨活组织检查表明，1α-OH-维生素D4刺激正常的骨形成。监测的安全参数证实，没有明显地发生高钙血症或高钙尿症，而且1α-OH-维生素D4治疗没有引起任何代谢紊乱。实施例9：
用年龄在55-60岁之间的健康绝经后妇女进行临床研究。该研究涉及多至80位患者，这些患者随机分为2个治疗组，并持续12-24个月。一个治疗组接受固定剂量的1α-OH-维生素D4(u.i.d.；大于3.0μg/天的剂量水平)，而另一组接受相应的安慰剂。按与实施例2所述进行该研究。
该研究表明，用1α-OH-维生素D4治疗的患者相对于基线值降低了总体、桡骨、股骨和/或脊椎骨的矿物质密度的流失。相反地，相对于基线值，用安慰剂治疗之患者的这些参数都表现出明显的减少。监测的安全参数证实在该剂量水平下长期给药1α-OH-维生素D4是安全的。实施例10：
在患有肾病经过长期血液透析的男人和/或女人中进行了一项12月的双盲安慰剂对照的临床实验。所有病人参加了一个八周对照期，在此期间他们接受维生素D3的维持剂量(400IU/天)。对照期后病人被随机分为两个治疗组：一组接受固定剂量的1α-OH-维生素D4(u.i.d.；剂量大于3.0μg/天)，另外一组接受相应的安慰剂。所有治疗组接受维生素D3的维持剂量，维持饮食中钙的正常吸收并避免使用钙补充剂。通过患者组在以下方面的治疗前和治疗后的对比估测效用：(a)肠内的钙吸收的直接测量；(b)总体、桡骨、股骨和/或脊椎骨的矿物质密度；和(c)血清钙和骨钙素的确定。通过监测血清钙，评价安全性。
该临床数据的分析表明，通过使用单或双同位素技术的测定，1α-OH-维生素D4显著增加血清骨钙素水平和肠内钙吸收。用该化合物治疗的患者表现出正常的血清钙水平，与基线相比稳定的总体、桡骨、股骨和/或脊椎骨的矿物质密度。相反地，用安慰剂治疗的患者表现出频繁发生低钙血症，总体、桡骨、股骨和/或脊椎骨的骨密度显著降低。在治疗组中，观察到高钙血症无显著发生。实施例11：药物制剂
将1.0mg 1α，24-二羟基维生素D4溶解在1g杏仁油中，制得局部用乳膏。在该溶液中添加40gm矿物油和20g自乳化性的蜂蜡。将混合物加热，以便液化。在添加40ml热水后，将混合物混合完全。所得乳膏包含大约10μg 1α，24-二羟基维生素D4每克乳膏。实施例12：
将1.0mg1α，24-二羟基维生素D4溶解在30g杏仁油中，制得软膏。在该溶液中添加70gm白色软石蜡，该石蜡已加热至足以液化的程度。将软膏混合完全，然后冷却。所得软膏包含大约10μg1α，24-二羟基维生素D4每克软膏。实施例13：
在实施例12的软膏中添加0.5g腺苷和2.0g罂粟碱，并同时彻底混合，后两种化合物都溶解在最小量的二甲基亚砜中。所添加组份的量为约0.5wt％(腺苷)和2wt％(罂粟碱)。实施例14：
在实施例12的软膏中添加溶解在最小量之植物油中的10000U维生素A，并同时彻底混合。所得软膏包含约100U维生素A每克软膏。实施例15：
将1.0mg 1α，24-二羟基维生素D4溶解在100g无水丙二醇中，制得皮肤用洗剂。将该洗剂盛放在棕色瓶中，存放在冰箱中，该洗剂包含约10μg 1α，24-二羟基维生素D4每克洗剂。实施例16：
将0.2mg 1α，24-二羟基维生素D4溶解在1g杏仁油，制得局部用乳膏。在该溶液中添加40gm矿物油和20g自乳化性的蜂蜡，然后添加40ml热水。将混合物混合完全，制得包含大约2.0μg 1α，24-二羟基维生素D4每克乳膏的化妆用乳膏。实施例17：
在实施例16制得的化妆用乳膏中添加100mg腺苷。将乳膏混合完全，该乳膏包含约0.1wt％腺苷。实施例18：
将100μg 1α，24-二羟基维生素D4溶解在30g杏仁油中，制得软膏。在如此制得的溶液中添加70g白色软石蜡，该石蜡已加热至足以液化的程度。将软膏混合完全，然后冷却。所得软膏包含大约1.0μg 1α，24-二羟基维生素D4每克软膏。实施例19：
在实施例18制得的化妆用软膏中添加溶解在最小量植物油中的200U/g维生素A，并同时彻底混合。实施例20：
将300μg 1α，24-二羟基维生素D4溶解在100g无水丙二醇中，制得皮肤用洗剂。将该洗剂盛放在棕色瓶中，存放在冰箱中，该洗剂包含约3.0μg 1α，24-二羟基维生素D4每克洗剂。实施例21：皮肤病学测试
评价包含1α，24-二羟基维生素D4的组合物在局部治疗皮炎(接触性和异位)时的组合物治疗效用。所要评价的组合物是在凡士林油-杏仁油基料中每克软膏包含10μg 1α，24-二羟基维生素D4的软膏。对照组合物是不包含活性药物1α，24-二羟基维生素D4的相同软膏。在非临床中治疗患者。要求他们一天使用该制剂两次。
该软膏要尽可能地用于一个损害处或者是患病区域。在治疗开始之前称量软膏及其内含物的重量，并在治疗结束时再称量任何未使用之组份的重量。
估算并记录待治疗之损害区域，如果需要的话，将该损害处和合适的“对照”损害一起照相。后者优选是相同面积和发展阶段的损害，这既可以是在治疗损害处的附近也可以是相互对称的。记录照相过程的相关细节(距离、孔径、角度、背景等)，以便在下次照相损害处时进行重复。每日施用软膏两次，优选没有覆盖物。“对照”损害是未经处理的，但如果这是不可能的话，记录在其上进行的治疗。
以每周间隔，由医师进行对红斑、结痂和厚度的估测，损害的严重程度分为0-3级。最终估测通常是在4-6周的治疗结束后进行。用1α，24-二羟基维生素D4治疗的损害比对照损害的分值低。还观察到没有显著发生高钙血症。实施例22：表皮细胞的分化和增殖测试
根据对原始由Rheinwald和Green(细胞，卷6，331页(1975))描述之系统的已知改进，培养人角化细胞。将溶解在乙醇中的1α，24-二羟基维生素D4添加至细胞中，产生在0.05-5μg/ml之间的各种浓度，其中乙醇的浓度不超过0.5％v/v。对照培养是补充乙醇至最终浓度0.5％v/v。
通过以下方法检查表皮细胞在培养基中的分化和增殖：
1、测定角化膜；
2、测定附着在培养皿上的细胞的细胞密度；
3、监测转谷氨酶的活性；或
4、通过掺入3H-胸苷来监测DNA的合成。
与1α，24-二羟基维生素D4一起温育的培养物比对照培养物具有更多的角化膜，非常少的附着细胞，更高的转谷氨酶活性，以及较低的DNA合成。实施例23：1α，24-二羟基维生素D4在HL-60细胞分化试验中的活性
如DeLuca和Ostrom(DeLuca，H.F.和Ostrem，V.K.，Prog.Clin.Biol.Res.，259卷，41-55页(1988))所述，用1α，24-二羟基维生素D4进行HL-60细胞分化试验中的剂量-应答研究。在该研究中，1α，25-二羟基维生素D3作为阳性对照，并用合适的溶剂作为阴性对照。估测以下变量：非特异性酸酯酶的活性、氮蓝四唑(NBT)的还原、和胸苷的掺入。结果表明1α，24-二羟基维生素D4具有促进HL-60细胞前髓细胞分化为单核细胞的较强活性。实施例24：1α，24-二羟基维生素D4在人癌细胞株中的抗增殖活性
在人癌细胞株组中用1α，24-二羟基维生素D4进行剂量-应答研究。如Shieh，H.L.等人，Chem.Biol.Interact.，81卷，35-55页(1982)的描述，这些细胞株包括但不限于：BCA-1或ZR-75-1(乳)和COL-1(结肠)。在该研究中，合适的溶剂用作阴性对照。结果表明，通过抑制胸苷的掺入，1α，24-二羟基维生素D4具有较强的(且可逆的)抗增殖活性。实施例25：治疗牛皮癣
在对治疗皮炎(接触性和异位)之组合物的治疗效用进行双盲研究中，估测包含1α，24-二羟基维生素D4的口服剂量组合物。所估测的组合物包含1.0-10.0μg 1α，24-二羟基维生素D4。对照组合物除不包含1α，24-二羟基维生素D4外都相同。患者在非临床中治疗，并分成实验和对照人群。指示他们每日在早饭前用药一次。
在各患者(实验和对照)中，选择包括损害的皮肤区域，该区域通常为衣服所覆盖，并指示患者勿将选用于研究中的皮肤暴露在阳光下。估算并记录待治疗之损害区域，并将该损害处照相。记录照相过程的相关细节(距离、孔径、角度、背景等)，以便在下次照相损害处时进行重复。
以每周间隔，由医师进行对红斑、结痂和厚度的估测。最终估测通常是在4-6周的治疗结束后进行。研究的结果表明，每日口服1α，24-二羟基维生素D4与对照相比可显著减少红斑、结痂和厚度的程度。
虽然已对本发明进行了描述，并用某些实施例进行了例举，但是本领域技术人员还可进行各种改进，包括对已描述的东西改动、添加和删除。因此，这些改进亦欲包括在本发明的范围内，而且本发明的范围只能由与所附权利要求书相一致的最宽的法律解释来限定。

Claims (15)

1、抑制人癌症细胞过度增殖活性的方法，其包括用有效量的式(I)化合物和其盐、水合物和溶剂化物治疗癌细胞：其中，R1是H或OH，R2是H或OH。
2、如权利要求1的方法，其中，式(I)的化合物是1α，24-二羟基维生素D4。
3、如权利要求2的方法，其中，式(I)的化合物是1α，24(R)-二羟基维生素D4，其基本上不含其(S)形式。
4、如权利要求1的方法，其中，所述量为约1-500μg/剂量。
5、治疗人以缓解乳腺癌和结肠癌之过度增殖性细胞活性的方法，其包括向人给药治疗有效量的式(I)化合物和其盐、水合物和溶剂化物：
Figure A9619446000031
其中，R1是H或OH，R2是H或OH。
6、如权利要求5的方法，其中，式(I)的化合物是1α，24-二羟基维生素D4。
7、如权利要求6的方法，其中，式(I)的化合物是1α，24(R)-二羟基维生素D4，其基本上不含其(S)形式。
8、如权利要求5的方法，其中，所述治疗量为约1-500μg/剂量。
9、一种药物组合物，其包括式(I)化合物及药物学上可接受的载体：
Figure A9619446000041
其中，R1是H或OH，R2是H或OH。
10、如权利要求9的药物组合物，其中，所述组合物是口服组合物，而且所述式(I)化合物在组合物中的浓度为约1μg/g-100μg/g。
11、如权利要求10的组合物，其中，式(I)的化合物是1α，24-二羟基维生素D4。
12、如权利要求11的方法，其中，式(I)的化合物是1α，24(R)-二羟基维生素D4，其基本上不含其(S)形式。
13、如权利要求9的药物组合物，其中，所述组合物是局部给药组合物，而且所述式(I)化合物在组合物中的浓度为约1μg/g-100μg/g。
14、如权利要求13的组合物，其中，式(I)的化合物是1α，24-二羟基维生素D4。
15、如权利要求14的方法，其中，式(I)的化合物是1α，24(R)-二羟基维生素D4，其基本上不含其(S)形式。
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