CN1520288A

CN1520288A - 制备和使用1－α,24(S)－二羟维生素D2的方法

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Publication number: CN1520288A
Application number: CNA028128362A
Authority: CN
Inventors: W; 查尔斯·W·比晓普; ��C��Ŭɭ; 乔伊斯·C·克努森; ��׶��A��ڶ�; 斯蒂芬·A·斯特拉格内尔; B��÷˹; 理查德·B·梅兹斯
Original assignee: Bone Care International Inc
Current assignee: Bone Care International Inc
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2002-06-26
Publication date: 2004-08-11
Also published as: CA2451039A1; EP1408939A4; AU2002315463B2; WO2003002110A1; US20020032179A1; EP1408939A1; IL159067A0; KR20040011559A; US6538037B2; MXPA03011306A; JP2004535441A

Abstract

本发明涉及抑制恶性或肿瘤细胞过度增殖的方法，所述方法包括用抗增殖量的1－α，24(S)－二羟维生素D₂处理细胞。该方法还包括细胞毒性剂与1－α，24(S)－二羟维生素D₂的联合给药。附图阐明了用于合成24－羟基维生素D₂的制备步骤。

Description

制备和使用1α，24(S)-二羟维生素D2的方法

相关申请的交叉引用

本申请为美国专利申请09/211,991，现在的美国专利6,251,883的部分继续申请，美国专利申请09/211,991是美国专利申请08/515,801的部分继续申请，美国专利申请08/515,801是美国专利申请07/940,246的部分继续申请，美国专利申请07/940,246是1991年1月8日提交的美国专利申请07/637,867和1992年1月7日提交的指定美国的国际申请PCT/US92/00313的部分继续申请。

关于联邦赞助的研究或开发的声明

不适用

本发明涉及具有激素活性的天然代谢物，1α，24(S)-二羟维生素D₂和制备此代谢物与非生物差向异构体1α，24(R)-二羟维生素D₂的方法。本发明还涉及包含药学有效量的1α，24(S)-二羟维生素D₂的药物组合物，涉及通过给予药学有效量的该化合物而控制异常钙代谢的方法，并涉及通过给予该化合物而治疗过度增殖疾病的方法。

已知维生素D及其活性代谢物在动物和人的钙代谢的调节中是重要的。在动物和人体内天然存在维生素D形式是维生素D₃。已证明在包括人在内的动物体内，维生素D₃通过以下步骤被活化：在肝脏中在C₂₅位被羟基化，然后在肾脏中被1α-羟基化，产生激素1α，25-二羟维生素D₃[“1α，25-(OH)₂D₃”]。参见，美国专利3,880,894。维生素D₃代谢物，25-羟基维生素D₃和1α，25-(OH)₂D₃的主要生理分解代谢途径起始于C₂₄-氧化。Holick，M.F.，Kleiner-Bossallier，A.，Schnoes，H.K.，Kasten，P.M.，Boyle，I.T.和DeLuca，H.F.， J.Biol.Chem.，248，6691-6696(1973)。

另一方面，维生素D₂是在植物中发现的主要的天然存在维生素D形式。维生素D₂在结构上与维生素D₃的不同是维生素D₂在C₂₄具有甲基，而在C₂₂和C₂₃之间具有双键。

在发现它们的短时间之后，似乎清楚地看出维生素D₃和维生素D₂具有相似的(如不同等同的话)生物活性。通常也相信维生素D₂的代谢(即活化和分解代谢)与维生素D₃相同。参见，Harrison′s Principlesof Internal Medicine：Part Seven，″Disorders of Bone and MineralMetabolism：Chap.35，″in E.Braunwald，K.J.Isselbacher，R.G.Petersdorf，J.D.Wilson，J.B.Martin和H.S.Fauci(eds.)， Calcium， Phosphorus and Bone Metabolism：Calcium Regulating Hormones，McGraw-Hill，New York，PP.1860-1865。在这方面，相信维生素D₂的活性形式是1α，25-二羟维生素D₂[″1α，25(OH)₂D₂″]。而且，25-羟基维生素D₂和1α，25-(OH)₂D₂的24-羟基衍生物，即24，25-二羟维生素D₂和1α，24，25-三羟维生素D₂是已知的，这表明维生素D₂的分解代谢与维生素D₃一样，通过相同的C₂₄氧化步骤进行。Jones，G.，Rosenthal，D.，Segev，D.，Mazur，Y.，Frolow，F.，Halfon，Y.，Robinavich，D.和Shakked，Z.， Biochemistrv，18：1094-1101(1979)。

但是，最近发现，维生素D₂的活性类似物，1α-羟基维生素D₂[″1α-(OH)D₂″]具有明显不同于其维生素D₃对应物，1α-羟基维生素D₃[″1α-(OH)D₃″]的药理学性质。美国专利5,104,864公开了1α-(OH)D₂在以2.0μg/日或更高剂量给药时将逆转人骨质疏松患者的骨量丢失。由于毒性，用1α-(OH)D₃没有获得2.0μg/日或更高的给药水平。

这些不同的药理学性质可以完全或部分由本发明的发明人的以下发现来解释：以药理学剂量给予人的1α-(OH)D₂部分代谢为生物活性1α，24(S)-二羟维生素D₂[″1α，24(S)-(OH)₂D₂″]。如以下更为详细地解释，1-羟基化维生素D₂分子的C-24位的羟基化是维生素D₂分子的特殊活化途径。

虽然1α，24(S)-二羟维生素D₃和1α，24(R)-二羟维生素D₃[″1α，24(R/S)-(OH)₂D₃″]已被化学合成(美国专利4,022,891)，但仍未证明它们是在生物系统中发现的天然化合物。而且，本发明的发明人已发现，1α，24(S)-(OH)₂D₂具有明显不同于1α，24(R/S)-(OH)₂D₃的生物活性。例如，Ishizuka等人发现，与1，25-(OH)₂D₃自身相比，1α，24(R)-(OH)₂D₃与1，25-(OH)₂D₃受体部位更为紧密地结合。Ishizuka，S.，Bannai，K.，Naruchi，T.和Hashimoto，Y.， Steroids，37：1，33-42(1981)；Ishizuka，S.，Bannai，K.，Naruchi，T.和Hashimoto，Y.， Steroids，39：1，53-62(1982)。使用类似的测定法，本发明的发明人发现，1α，24(S)-(OH)₂D₂在结合1，25-(OH)₂D₃受体部位方面比1，25-(OH)₂D₃的竞争力小两倍。本发明的发明人还发现，1α，24(S)-(OH)₂D₂表现对维生素D血清结合蛋白的相对弱的结合亲合力，这是表明低毒性的相对短的半衰期的证据。

本发明的发明人已证明了在给予了1α-(OH)D₂的人中存在循环1α，24(S)-(OH)₂D₂。这表明在动物和人中，维生素D₂天然代谢成为1α，25-(OH)₂D₂和1α，24(S)-(OH)₂D₂。两种维生素D₂激素的相对比率似乎随前体和提供给C₂₄途径的前体的量而变。因此，似乎随着1α-(OH)D₂的剂量增加，1α，24(S)-(OH)₂D₂与1α，25-(OH)₂D₂的比率增加。

这些结果在以下更为详细地描述，它表明1α，24(S)-(OH)₂D₂具有理想的高生物活性和低毒性特征。当给予药理学水平的1α-(OH)D₂时，1α，24(S)-(OH)₂D₂是重要的代谢物这一事实表明，1α，24(S)-(OH)₂D₂可以调节1α-(OH)D₂的期望的药理作用，并且是用于治疗各种类型的涉及钙代谢的疾病的有用的治疗药物。

在过去二十年间所进行的广泛研究还确认，维生素D除具有典型的对骨和矿物质代谢的作用以外，还具有重要的生物作用。1α，25-二羟维生素D₃，维生素D的激素活性形式的特异性核受体存在于来自多种与钙体内稳态无关的器官的细胞中。例如，已证明人前列腺癌细胞系，LNCaP的特异性生物活性维生素D受体(Miller等人，52CancerRes.(1992)515-520)。还描述了关于许多其它肿瘤细胞，例如乳癌和结肠癌的维生素D受体。

已证明某些维生素D化合物和类似物是有效的抗增殖和促分化(prodifferentiative)剂。例如，授予Suda等人的美国专利4,391,802公开了1α-羟基维生素D化合物，特别是1α，25-二羟维生素D₃和1α-羟基维生素D₃，由于诱导恶性细胞(特别是白血病细胞)分化成为非恶性巨噬细胞(单核细胞)而具有有效的抗白血病活性，并用于治疗白血病。已报道1α，25-二羟维生素D₃和其它维生素D₃类似物对于前列腺癌细胞系的抗增殖和分化作用。更近些时候，已报道维生素D受体基因多态性和前列腺癌危险之间的关联，表明维生素D受体可能在前列腺癌的发展和可能的治疗中起作用。

这些先前的研究广泛关注维生素D₃化合物。尽管这些化合物可能在促进培养物中恶性细胞的分化中非常有效，但它们作为抗癌药在分化治疗中的实际应用大大受到限制，因为它们同样高度有效地用作影响钙代谢的药物。在体内有效用作，例如抗白血病药所要求的水平下，由于它们固有的钙血活性，这些相同的化合物可以导致显著升高和可能危险的血钙水平。也就是说，1α，25-二羟维生素D₃和其它维生素D₃类似物由于它们的包括高钙血症和高钙尿在内的副作用而使其作为抗癌药的治疗应用被排除或被严格限制。这表明需要具有更大特异性活性和作用选择性的化合物，即具有抗增殖和促分化作用但具有低钙血活性的维生素D化合物。这些化合物是“低血钙”维生素D化合物。对这种化合物的需求在肿瘤和过度增殖疾病的治疗中最强。

本发明提供合成的1α，24(S)-二羟维生素D₂[1α，24(S)-(OH)₂D₂]，它是维生素D₂的生物产生的活性形式。该生物形式还可以称为1α，24(S)-二羟基麦角钙化醇，并以下文给出的结构表示。该化合物的生物形式具有有效的生物活性和快速的系统清除率，表明低毒性。

本发明还包括制备1α，24(S)-二羟维生素D₂的新方法，所述方法需要使用麦角甾醇作为原料，形成24-羟基维生素D₂，然后将该24-羟基化合物1α-羟基化，并分离1α，24(S)-二羟维生素D₂差向异构体和1α，24(R)-二羟维生素D₂差向异构体。在此合成过程中，还产生新的中间产物。还发现结晶形式的1α，24(S)-二羟维生素D₂具有令人惊奇的稳定性和比该化合物的白色粉末形式更好的生物活性。

本发明的化合物用于治疗各种以维生素D缺乏为特征的疾病和各种骨干涸疾病，特别是不并发高钙血症或高钙尿症的治疗。本发明的化合物有利地用作用于维生素D缺乏疾病的药物组合物的活性成分，用于逆转或预防容易发生骨量或骨矿物质含量丢失的人的这种丢失，并用于稳定患有肾性骨营养不良的人的骨密度。

本发明的化合物还用作治疗某些皮肤病的局部和口服剂。本发明的化合物有利地用作诸如还可以包含其它能够改善皮肤病的试剂的局部组合物的活性成分。

本发明的化合物还有利地作为癌症和其它过度增殖疾病的治疗中的抗增殖和促分化剂。

在结合附图审查以下本发明的详细描述的基础上将获知本发明的其它优点，并更好地理解本发明的特定改变、成分变化和物理与化学性质。

以下结合附图描述本发明，其中同样的名称在全文中指同样的元素，其中：

图1阐明用于合成24-羟基维生素D₂的制备步骤；

图2阐明以24-羟基维生素D₂为原料合成1α，24(S)-二羟维生素D₂的制备步骤；

图3是生物1α，24-二羟维生素D₂和合成的1α，24-二羟维生素D₂的R和S差向异构体的反相高压液相色谱图；

图4为阐明1α，24(S)-(OH)₂D₂和1α，24(R)-(OH)₂D₂的相对结合亲合力的图；而

图5为阐明结晶1α，24-(OH)₂D₂和粉末1α，24-(OH)₂D₂的相对结合亲合力的图。

本文所用的术语“生物活性”、“生物活性的”或“生物有效的”意指化合物的生化性质，如影响代谢，例如影响血清钙浓度，或与适宜的受体蛋白结合，例如与维生素D受体蛋白结合。关于化合物或物质的术语“基本上纯的”意指纯度至少为90％。

关于维生素D的术语“活性的”或“活化的”指C₁、C₂₅或C₂₄位中至少一个位置被羟基化的维生素D化合物。

在一个方面，本发明包括式(I)的生物活性化合物：

即，1α，24(S)-二羟维生素D₂。

在另一方面，本发明涉及1α，24(S)-二羟维生素D₂的制备。1α，24(S)-二羟维生素D₂的合成根据图1和2所示的路线实现。下文中除非特别说明，当提及24-羟基化合物时，认为该化合物是R和S形式的差向异构体的混合物。如图1所示，该合成使用麦角甾醇作为原料。通过五步法将麦角甾醇转化为24-羟基麦角甾醇(5，7，22-麦角三烯-3，24-二醇(7))。然后照射24-羟基麦角甾醇，并通过本领域中已知的方法热转化得到24-羟基维生素D₂。如图2所示，随后在五步法中，使用类似于Paaren等人， J.Org.Chem.，vol.45，p.3253(1980)的方法将24-羟基维生素D₂羟基化，得到1α，24-二羟维生素D₂，并从中分离差向异构体。

具体地，将麦角甾醇乙酰化，形成3β-乙酸酯(2)。然后用麦角甾醇结构的B-环，通过3β-乙酸酯与三唑啉二酮的反应形成加合物(3)。然后将加合物(3)臭氧化以截去侧链，形成C-21醛(4)。通过所得的醛与适宜的酮化合物反应重建侧链，得到24-烯酮(5)。然后将该烯酮转化为24-甲基，3β，24-二羟基加合物(6)。然后使此加合物与氢化锂铝反应，以将加合物脱保护，并得到24-羟基麦角甾醇(7)。随后照射24-羟基麦角甾醇，并热处理之，形成24-羟基维生素D₂。接着将该24-羟基维生素D₂甲苯磺酰化，得到24-羟基维生素D₂的3β-甲苯磺酸盐。通过溶剂分解取代甲苯磺酸盐，得到6-甲氧基-24-羟基-3，5-环维生素D₂。使环维生素D₂进行烯丙基氧化，形成1α，24-二羟基环维生素衍生物。然后将该1α，24-二羟基环维生素衍生物溶剂分解，并进行Diels-Alder型反应，该反应除去6-甲氧基，分离5，6反式1α，24-二羟维生素D₂和1α，24-二羟维生素D₂(5，6顺式)。

使1α，24-(OH)₂D₂经历反相高压液相色谱，以分离两种差向异构体，并回收本发明的差向异构体形式，1α，24(S)-(OH)₂D₂。

本发明的化合物可应用于多种临床和兽医领域，并特别用于治疗异常钙和磷代谢。具体而言，例如打算将1α，24(S)-二羟维生素D₂用于刺激成骨细胞活性，所述活性通过骨钙素的血清水平测定。骨钙素是骨基质中的一种主要蛋白质。1α，24(S)-二羟维生素D₂比1，25-(OH)₂D₃对维生素D血清结合蛋白的结合弱，这表明其快速的清除率和低毒性，这提高了其药学性质。

在另一方面，本发明包括控制钙代谢的方法，如用于治疗由例如肝功能衰竭、肾衰竭、胃肠衰竭等导致的异常钙代谢的方法。1α，24(S)-二羟维生素D₂可以用于预防性或治疗性治疗维生素D缺乏疾病和相关的疾病，例如肾性骨营养不良、脂肪泻、抗惊厥药骨软化症、低磷酸血维生素D-耐受性佝偻病、包括绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、类固醇诱导的骨质疏松症和其它以骨量丢失为特征的病症在内的骨质疏松症、假性维生素D缺乏性(维生素D-依赖性)佝偻病、营养和吸收不良性佝偻病、继发于甲状旁腺功能减退症的骨软化症和骨质减少、术后甲状旁腺功能减退症、特发性甲状腺功能减退症、假性甲状旁腺功能减退症和酒精中毒。

1α，24(S)-二羟维生素D₂还对治疗过度增殖皮肤病如银屑病、湿疹、缺乏充足的皮肤坚韧性、皮肤水合作用和皮脂分泌有价值。

式(I)的化合物还对治疗乳癌和结肠癌以及其它肿瘤如胰腺癌、子宫内膜癌、小细胞和非小细胞肺癌(包括鳞状、腺癌和大细胞类型)、头和颈鳞状细胞癌、膀胱、卵巢和宫颈癌、骨髓和淋巴细胞白血病、淋巴瘤、肝肿瘤、甲状腺髓样癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、视网膜母细胞瘤，以及软组织和骨肉瘤有价值。式(I)的化合物以这样的量给药，该量将患有肿瘤(tumor或neoplasm)的受试者的血清维生素D水平升至超过生理水平并持续充足的时间，以诱导肿瘤(tumor或neoplasm)的分化或消退，同时不导致高钙血症。式(I)的化合物是低钙血的，并允许这种超生理水平。

式(I)的化合物可以每日剂量或阶段性剂量，例如每2-6天一次或一周一次给药。每天的剂量可以是一剂或分成2-4个分剂，它们可以每隔一小时给药，直至给予总剂量。

根据本发明，当给予患有癌症或肿瘤的患者有效量的1α，24(S)-二羟维生素D₂时，抑制或减小异常肿瘤细胞的增殖活性，诱导、促进或增强细胞分化，并与以先前已知的配方给予相同量的活化的维生素D₃(例如1α-OH-D₃或1α，25-(OH)₂D₃)后所观察的结果相比具有明显少的高钙血症和高尿血症。因此，相对于维生素D₃类似物的活性形式而言，本发明的化合物具有改善的治疗指数。

对于恶性病况的治疗，本发明的维生素D适于单独作为药物组合物中的活性成分给药或与细胞毒性剂联合给药。

在另一方面，本发明是包含以下成分的药物组合物：本发明的维生素D化合物；选自(i)细胞毒性剂，(ii)骨剂和它们的组合的试剂；以及生理学可接受的载体。

而且，本发明的范围包括联合给予式(I)的维生素D和细胞毒性剂或抗癌药的方法。这些试剂适宜地包括抗代谢药(例如5-氟-尿嘧啶、氨甲喋呤、氟达拉滨)、抗微管药(例如长春新碱、长春花碱、紫杉烷类如紫杉醇、多西他赛)、烷化剂(例如环磷酰胺、美法仑、生物色素乙基亚硝基脲(biochoroethylnitrosurea)、羟基脲)、铂剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、JM-216、CI-973)、蒽环类药(例如阿霉素、柔红霉素)、抗生素类(例如丝裂霉素、依达比星、多柔比星、柔红霉素)、拓朴异构酶抑制剂(例如依托泊苷、喜树碱)或任何其它抗肿瘤药(磷酸雌莫司汀、泼尼莫司汀(prednimustine))。

预期与多种抗癌药联合使用的式(I)的维生素D可以导致显著增加的对癌细胞的细胞毒性作用，从而提供增加的治疗作用。具体而言，由于用上述的组合，利用比单独使用药物的治疗方案低的浓度的抗癌药实现生长抑制作用的显著增加，因此可能提供这样的治疗，其中与抗癌药有关的不良副作用明显低于通常单独以较大剂量使用抗癌药时所观察到的不良副作用。这些联合给药的抗癌药的可能剂量范围为约0.1-20mg/kg/日。

术语“联合给药”意指任何给予患者或受试者两种或更多种试剂的给药途径。例如，可以将这些试剂一起给予，或彼此先后给予。所述试剂可以通过不同的途径给予，例如一种试剂可以静脉内给予，而第二种试剂肌内、静脉内或口服给予。所述试剂可以同时或相继给予，只要它们以足以使两种试剂在体内达到有效浓度的方式给予。所述试剂还可以是混合物，例如单一片剂。在相继给予的情况下，可以在给予一种试剂之后直接给予另一种试剂，或者可以阶段性地给予所述试剂，即可以在某一时间给予一种试剂，然后在晚些时候给予另一种试剂，一般在一周内。

本发明的范围还包括联合给予有效剂量的式(I)的化合物和激素或其它试剂，例如已知改善骨疾病或病症的雌激素。例如，前列腺癌通常转移到骨，导致骨丢失和相关的疼痛。这些骨试剂可以包括缀合的雌激素或它们的等同物、降血钙素、二膦酸盐、钙补剂、钴胺素、百日咳毒素和硼。

1α，24(S)-二羟维生素D₂用作药物组合物中的活性化合物，在应用于例如由异常钙代谢导致的疾病或过度增殖疾病或肿瘤疾病时，具有比维生素D₃的已知活性形式类似物低的副作用和低毒性。这些药物组合物构成本发明的另一方面。

本发明的药理活性化合物可以根据常规的制药方法压制而生产用于肠(entically)、肠胃外或局部给予患者，例如包括人在内的哺乳动物的药物。例如，1α，24(S)-二羟维生素D₂可以与常规赋形剂如适于肠(如口服)、肠胃外或局部施用并不与活性化合物发生有害反应的药学可接受的载体物质混和而使用。

适宜的药学可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯胶、植物油(例如杏仁油、玉米油、棉籽油、花生油、橄榄油、椰子油)、矿物油、鱼肝油、油酯如聚山梨醇80、聚乙二醇、明胶、糖类(例如乳糖、直链淀粉或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、脂肪酸单酸甘油酯和二酸甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

该药物制剂可以被灭菌，如果需要的话，可以与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或一种或多种其它活性化合物如维生素D₃及其1α-羟基化代谢物、缀合的雌激素或它们的等同物、抗雌激素、降血钙素、二膦酸盐、钙补剂、钴胺素、百日咳毒素和硼混合。

对于肠胃外施用，特别适宜的是可注射的无菌溶液，优选是油溶液或水溶液，以及混悬剂、乳剂或植入物，包括栓剂。肠胃外给予适宜地包括皮下、肌内或静脉内注射、鼻咽或粘膜吸收，或者透皮吸收。当说明时，本发明的化合物可以通过直接注射到肿瘤，例如副甲状腺瘤中，或通过局部递送，例如提供动脉内递送或经门静脉递送而给予。局部递送特别适于治疗肝癌。安瓿是方便的单元剂量。

对于肠施用，特别适宜的是片剂、糖衣丸、液体、滴剂、栓剂、锭剂、散剂或胶囊剂。如果需要甜味赋形剂的话，可以使用糖浆、酏剂等。

对于局部施用，可以使用适宜的不可喷雾的粘性、半固体或固体形式，它包括与局部施用相容并具有优选大于水的动态粘度的载体，例如矿物油、杏仁油、自乳化蜂蜡、植物油、白色软石蜡和聚乙二醇。适宜的配方包括但不限于乳膏、软膏、洗剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、擦剂、药膏、气雾剂、透皮贴等，所述制剂如果需要的话被灭菌或与助剂如防腐剂、稳定剂、去乳化剂、润湿剂等混合。例如，本发明的乳膏制剂适宜地包含水、杏仁油、矿物油和自乳化蜂蜡的混合物；例如，软膏制剂适宜地包含杏仁油和白色软石蜡；例如，洗剂制剂适宜地包含无水聚乙二醇。

用于治疗皮肤病的本发明的化合物的局部制剂还可以包含上皮形成诱导剂如类维生素A(例如维生素A)、色原烷醇如维生素E、β-拮抗剂如异丙基肾上腺素或环磷酸腺苷(cAMP)、抗炎药如皮质类固醇(例如氢化可的松或其乙酸盐或地塞米松)和皮肤角质层增生剂(keratoplastic agents)如煤焦油或蒽啉。这些药物的有效量为，例如，维生素A为组合物重量的约0.003至约0.3％；维生素E为约0.1至约10％；异丙基肾上腺素为约0.1至约2％；cAMP为约0.1至约1％；氢化可的松为约0.25至约5％；煤焦油为约0.1至约20％；而蒽啉为约0.05至约2％。

对于直肠给药，将化合物形成含有栓剂基质如可可油或其它甘油三酸酯的药物组合物。为了延长贮存期，该组合物有利地包含抗氧化剂如抗坏血酸、丁基化羟基苯甲醚或氢醌。

对于钙代谢疾病的治疗，优选口服给予本发明的药物组合物。一般地，本发明的化合物由单元剂型分散，每个单元剂型包含在药学可接受的载体中的约0.5μg至约25μg的本发明的化合物。本发明的化合物的剂量一般为约0.01至约1.0μg/kg/日，优选为约0.04至约0.3μg/kg/日。治疗癌症和肿瘤和其它过度增殖疾病的口服剂量一般为约10μg-200μg/日。

对于皮肤病的局部治疗，在局部组合物中的本发明的化合物的剂量一般为约0.01μg至约50μg/克组合物。对于癌症的治疗，局部施用的组合物中的1α，24(S)-(OH)₂D₂的剂量一般为约0.01μg-100μg/克组合物。

如上指出，本发明的化合物的给药也可以分阶段进行，在这种情况下可以使用更高的剂量，一般每2-7天一次给予约20μg至约200μg。

本领域普通技术人员将容易地将有效剂量和联合给药方案最优化，这可以通过良好的医疗实践和个体患者的临床症状来确定。不管给药方式如何，可以理解在特定情况下的实际优选的活性化合物量将随所用的特定化合物的功效、配方的特定组合物、施用方式和治疗的特定部位和生物体而变。例如，特定患者的特定剂量取决于年龄、体重、一般健康状况和性别、饮食、时间选择和给药方式、排泄速率和联合使用的药物以及治疗应用的特定疾病的严重程度。给定宿主的剂量可以经常规考虑确定，例如通过常规比较主题化合物和已知试剂的不同活性，如通过适宜的常规药理学方案来确定。

在另一方面，本发明的化合物还可以有利地用于兽医组合物，例如，用于治疗或预防家畜的高钙血症的饲料组合物。一般而言，将本发明的化合物分散在动物饲料中，以使这种饲料的正常消耗给动物提供约0.01至约1.0μg/kg/日。

以下实施例应理解为仅是例示性的，而不以任何方式对本说明书的其余部分进行限定。在以下实施例中，用Bruker AM--400(400MHz)，用aspect 3000计算机，在CDCl₃溶液中以CHCl₃作为内标记录质子核磁共振(¹H NMR)谱。以ppm为单位报道化学位移。用HitachiU-2000分光光度计记录紫外光谱，并对乙醇溶液进行报道。

实施例1：与1α-(OH)D₂一起培养的人肝细胞的1α，24(？)-(OH)₂D₂的产生、纯化和鉴定

从Madison，Wisconsin的Bone Care Intemational，Inc.获得基本上纯的1α-(OH)D₂。将该1α-(OH)D₂与来自人肝细胞瘤的细胞，Hep 3B一起，在不含胎牛血清的培养基中，使用本领域中已知的方法培养48小时。

通过本领域中已知的方法产生混合的培养基和细胞的脂质萃取物，并用Zorbax-S1L对其进行高压液相色谱处理(HPLC)，用己烷/异丙醇/甲醇(91∶7∶2)显色。推定的1α，24(？)-(OH)₂D₂代谢物在母体1α-(OH)D₂和标准1α，25-(OH)₂D₂(也从Madison，Wisconsin的BoneCare International，Inc.获得)之间洗脱出。(本文所用的术语“1α，24(？)-(OH)₂D₂”意指差向异构体形式未被鉴定)。在使用质谱分析对代谢物进行鉴定之前进一步通过此HPLC系统纯化该1α，24(？)-(OH)₂D₂。

纯化的代谢物具有比原料1α-(OH)D₂更大的极性，因而暂时断定它是二羟维生素D₂代谢物。这种代谢物还具有维生素D发色团，表明保留了维生素D的顺式-三烯系统。由于该代谢物来自1α-(OH)D₂，因而其结构为1α，X-(OH)₂D₂，其中“X”指第二个羟基的位置。

根据本领域中已知的方法制备1α，X-(OH)₂D₂的三甲基甲硅烷基衍生物，并对TMS-衍生物和天然化合物进行质谱分析。通过GC-MS分析TMS-衍生物，而鉴定主要通过解释焦-代谢物(pyro-metabolite)的碎片图案进行。该分子离子的m/z为644，表明是加入三个占216个附加质量单位的TMS基团的二羟维生素D₂。由于1α-(OH)D₂具有3β-和1α-基团，且推定的代谢物具有一个附加的羟基，因而衍生出总共三个羟基。在m/z 601、511、421、331处发现特征碎片，代表缺失43个质量单位的单独碎片或者还缺失每个90个单位的一、二或三个TMS基团。这种图案最可能由占43个质量单位的C₃H₇的C₂₄至C_-25键的断裂解释。这代表C₂₆-C₂₅-C₂₇碎片的缺失。而且，该质谱缺少所有25-羟基化维生素D化合物的m/z 131碎片特征。

该质谱显示m/z 513碎片，表明由于A-环断裂和C₂-C₃-C₄的缺失导致缺失131个质量单位，这也是维生素D化合物的特征。该质谱还含有m/z 143，它可能来自C-24至C-23断裂和甲基缺失。代表C₂₄-C₂₅的脆弱性的43个单位的异常缺失与由C₂₃-C₂₄断裂导致的碎片的缺失一起表明1α，X-(OH)₂D₂上的额外羟基是在C-24。因此，其结构被鉴定为1α，24(？)-(OH)₂D₂。

通过直接探针质谱分析天然代谢物。该分析与24位羟基一致，还与上述的TMS-衍生物的GC-MS分析一致。天然代谢物表现出预期的在m/z 428的分子离子和在m/z 367的特征碎片，表明缺失一个水和43个质量单位的C₂₅-C₂₆-C₂₇碎片。

实施例2：合成1α，24(S)-二羟维生素D₂

(22E)-5，7，22-麦角三烯-3β-基乙酸酯(2)

向在300mL无水吡啶中的50gm(0.13mol)麦角甾醇( 1)的溶液中加入33.3mL(0.35mol)乙酸酐。将混合物于室温下搅拌过夜，然后加入600mL水。将沉淀过滤，用200mL部分乙腈洗涤三次，然后风干得到42.0g(74％)( 2)。

22-氧-5α，8α-(4-苯基-3.5-二氧-1，2，4-三唑烷-1.2-二基)23，24-二降-6-胆烯-3β-基乙酸酯(4)

向在1000mL氯仿中的33.0g(0.075mol)麦角甾醇乙酸酯( 2)的溶液中加入13.2g(0.075mol)4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮。将如此形成的溶液( 3)于室温下搅拌30分钟，然后加入5ml吡啶。将溶液冷却至-78℃，并在-78℃下用臭氧-氧混合物处理2小时，然后用氮充分清洗。接着加入50mL二甲亚砜，并用300mL水洗涤混合物，然后用200mL 2N HCl洗涤两次，最后用300mL水洗涤。分离有机层，用无水MgSO₄干燥，并在真空下浓缩至干。在硅胶柱上用在己烷中的30％乙酸乙酯纯化残余物，得到16.0g(39％)标题化合物，为泡沫状固体。

¹H NMR：(400 MHz；CDCl₃)：δppm 0.85(3H， s，18-CH₃)，1.10(3H， s，19-CH₃)，1.15(3H， d，21-CH₃)，1.99(3H， s，3β-CH₃CO)，5.45(1H， m，3α-H)，6.26(1H， d，7-H)，6.40(1H， d，6-H)，7.42(5H，m，Ph)，9.58(1H， d，HCO)。

(22E)5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧-1，2，4-三唑烷-1，2-二基)胆甾-6，22-二烯-24-酮-3β-基乙酸酯(5)

在氮气氛下，将丁基锂(在己烷中的1.6M溶液，8.94mL，0.014mol)加入搅拌着的冷却(0℃)的在无水四氢呋喃(20mL)中的二异丙胺(1.45g，0.014mol)的溶液中。在0℃下在15分钟内滴加在无水四氢呋喃(6mL)中的3-甲基丁-2-酮(1.23g，0.014mol)。将溶液于0℃下再搅拌1小时，然后冷却至-70℃，并加入在无水四氢呋喃(60mL)中的醛( 4)(6.0g，0.011mol)的溶液。将温度升至-20℃，并在此温度下保持3小时。然后于-20℃下加入冰醋酸(20mL)，并使溶液达到室温。加入乙醚(800mL)和水(400mL)，分离有机层，并用10％盐酸(2×300mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×300mL)和水(2×300mL)洗涤。浓缩得到粗产物(7.5g)，将粗产物溶于含有1.5N-盐酸(12mL)的四氢呋喃(100mL)中。回流1.5小时后，用乙醚(600mL)稀释混合物，用5％碳酸钠溶液(2×200mL)和水(2×200mL)洗涤，并干燥(无水MgSO₄)。减压浓缩，得到粗产物(7.0g)。用硅胶色谱处理(在己烷中的50％乙酸乙酯)，得到烯酮( 5)4.0g(59％)。

¹H NMR：(400MHz)：δppm 0.83(3H， s.18-CH₃)，0.99(3H， s，19-CH₃)，1.09(6H， dd，26和27-CH₃)，1.12(3H， d，21-CH₃)，2.0(3H，s，3β-CH₃CO)，2.84(1H， m，25-H)，5.45(1H， m，3α-H)，6.06(1H，d，23-H)，6.24(1H， d，7-H)，6.39(1H， d，6-H)，6.71(1H， dd，22-H)，7.42(5H， m，Ph)。

(22E)-5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧-1，2，4-三唑烷-1，2-二基)-6，22-麦角二烯-3β，24-二醇(6)

将在无水乙醚(100 mL)中的烯酮( 5)(3.5g，5.7mmol)冷却至0℃，并滴加甲基溴化镁(在乙醚中的3.0M溶液，6.8mL，0.02mol)。0℃下1小时后，加入饱和氯化铵(100mL)。分离有机层。用乙醚(2×200mL)萃取水层。用无水MgSO₄干燥合并的乙醚相，并在真空下浓缩至干，得到粗产物3.0 g(90％)( 6)。

(22E)-5，7，22-麦角三烯-3β，24-二醇(7)

向在无水四氢呋喃(250 mL)中的3.0 g(5.1mmol)( 6)的溶液中加入3.6g(0.09mol)氢化锂铝。将混合物加热回流3小时，用冰水浴冷却，并通过小心滴加冰水(5mL)来分解反应混合物。将混合物过滤，并在真空下浓缩滤液以除去大部分四氢呋喃。将残余物溶于200mL乙酸乙酯中，并用饱和NaCl溶液(2×200mL)洗涤两次，用无水MgSO₄干燥，并在真空下浓缩。在硅胶柱上使用在己烷中的30％乙酸乙酯将残余物纯化，得到1.5g(71％)( 7)。

¹H NMR：(400MHz，CDCl₃)：δppm 0.64(3H， s，18-H)，0.88(6H，dd，26和27-CH₃)，0.93(3H， s，19-CH₃)，1.06(3H， d，21-CH₃)，1.19(3H， s，28-CH₃)，3.55(1H， m，3α-H)，5.36(1H， d，7-H)，5.42(2H， m，22和23-H)，5.52(1H， d，6-H)。UV(乙醇)λ_max：282nm。

24-羟基维生素D₂(8)

将一克(2.4mmol)(7)溶于250mL乙醚和苯(4∶1)中，并使用Hanovia介质-压力UV灯，在搅拌下，在氮气氛下，在水冷却的石英浸渍孔中照射2小时。将溶液真空浓缩，再溶于100mL乙醇，并加热回流过夜。将溶液在真空下浓缩至干，在硅胶柱上使用在己烷中的30％乙酸乙酯纯化残余物，得到0.55g(55％)( 8)。

¹H NMR：(400MHz，CDCl₃)：βppm 0.57(3H， s，18-CH₃)，0.92(6H， dd，26和27-CH₃)，1.06(3H， d，21-CH₃)，1.20(3H， s，28-CH₃)，3.93(1H， m，3-H)，4.79(1H， m，(尖锐)，19-H)，5.01(1H， m，(尖锐)，19-H)，5.43(2H， m，22和23-H)，6.02(1H， d，7-H)，6.22(1H，d，6-H)。UV(乙醇)λ_max：265nm。

24-羟基维生素D甲苯磺酸盐(9)

向溶于5mL无水吡啶中的0.55g(1.3mmol)( 8)的溶液中加入0.6g(3.2mmol)甲苯磺酰氯。将混合物于氮气氛和5℃下搅拌20小时。将反应混合物倾入100mL冷的饱和NaHCO₃溶液中，并用乙醚(3×100mL)萃取。用5％HCl溶液(2×200mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×200mL)和饱和NaCl溶液(2×200mL)洗涤合并的有机萃取物，用无水MgSO₄干燥，并真空浓缩，得到0.62g(84％)( 9)。

¹H NMR：(400MHz，CDCl₃)：δppm 0.57(3H， s，18-CH₃)，0.92(6H， dd，26和27-CH₃)，1.08(3H， d，21-CH₃)，1.24(3H， s，28-CH₃)，2.43(3H， s，CH₃(甲苯磺酸盐))，4.69(1H， m，3-H)，4.77(1H， m，(尖锐)，19-H)，5.0(1H， m，(尖锐)，19-H)，5.42(2H， m，22和23-H)，6.03(1-H， d，7-H)，6.25(1-H， d，6-H)7.31和7.83(4H， d，芳香)。

24-羟基-3，5-环维生素D₂(10)

向溶于50ml无水甲醇中的0.6g(1.06mmol)( 9)的溶液中加入碳酸氢钠4.0g(0.047mol)。将混合物加热回流6小时。将反应混合物在真空下浓缩。加入水(100mL)，然后用乙醚(2×200mL)萃取。用无水MgSO₄干燥合并的乙醚萃取物，并在真空下浓缩至干，得到450mg(100％)( 10)，为一种油。

1α，24-二羟基-3，5-环维生素D₂( 11)

在氮气氛下将叔丁基过氧化氢(870μL(2.61mmol)；3M，在甲苯中)加入在50mL无水二氯甲烷中的73mg(0.66mmol)二氧化硒的悬浮液中。将混合物于室温和氮气氛下搅拌3小时。然后加入0.1mL无水吡啶，随后加入溶于15mL无水二氯甲烷中的450mg(1.06mmol)( 10)的溶液。将混合物于氮气氛和室温下搅拌10分钟，然后加入25mL 10％NaOH溶液，并用乙醚(3×100mL)萃取混合物。用10％NaOH溶液(2×100mL)、水(2×100mL)、饱和氯化钠溶液(2×100mL)洗涤合并的乙醚萃取物，用无水MgSO₄干燥，并在真空下浓缩至干。在硅胶柱上使用在己烷中的30％乙酸乙酯混合物将残余物纯化，得到110mg(24％)( 11)。

¹H NMR：(400MHz，CDCl₃)：δppm，0.55(3H， s，18CH₃)，0.90(6H， dd，26和27-CH₃)，1.03(3H， d，21-CH₃)，1.19(3H， s，28-CH₃)，3.25(3H， s，-OCH₃)，4.19(1H， d，6-H)，4.19(1H， m，1-H)，4.92(2H， d，7-H)，5.15(1H， m，(尖锐)，19-H)，5.2(1H， m，(尖锐)，19-H)，5.42(2H， m，22和23-H)。

5，6-顺式和5，6-反式-1α，24-二羟维生素D₂(12，13)

将1α，24-二羟基-3，5-环维生素D₂( 11)110mg(0.25mmol)溶于2.0mL二甲亚砜和1.5mL乙酸中，并在50℃和氮气氛下加热1小时。将溶液倾入冰和50mL饱和NaHCO₃溶液中。用乙醚(3×100mL)萃取混合物。用饱和NaHCO₃溶液(3×100mL)、水(2×100mL)、饱和NaCl溶液(2×200mL)洗涤合并的乙醚萃取物，用无水MgSO₄干燥，并真空浓缩，得到粗产物100mg(93％)( 12)和( 13)。

5，6-顺式-1α，24-二羟维生素D₂(12)

向在5 mL乙酸乙酯中的( 12)和( 13)的溶液中加入20mg(0.2mmol)马来酸酐，并将混合物于35℃和氮气氛下搅拌24小时。将溶液在真空下浓缩至干。在硅胶柱上使用在己烷中的50％乙酸乙酯纯化残余物，得到20mg(22％)( 12)。

¹H NMR：(400MHz，CDCl₃)：δppm 0.57(3H， s，18-CH₃)，0.89(6H， dd，26和27-CH₃)，1.04(3H， d，21-CH₃)，1.21(3H， s，28-CH₃)，4.23(1H， m，3-H)，4.40(1H， m，1-H)，5.0(1H， m，(尖锐)，19-H)，5.33(1H， m，(尖锐)，19-H)，5.44(2H， m，22和23-H)，6.01(1H，d，7-H)，6.37(1H， d，6-H)。UV(乙醇)λ_max：265nm。

1α，24(S)-二羟维生素D₂(14)

通过高压液相色谱分离1α，24-(OH)₂D₂的24差向异构体，所述分离在Waters仪器上进行，使用反相Supelco C-8制备柱(25cm×21.2mm；粒径12μm)和溶剂系统，乙腈∶水，60∶40，10mL/分。将差向异构体命名为差向异构体1和差向异构体2。在这些条件下，差向异构体1的保留时间为63分钟，而差向异构体2的保留时间为71分钟。使用X射线结晶学确定差向异构体2的立体化学为1α，24(R)-(OH)₂D₂。因此得知差向异构体1的立体化学为1α，24(S)-(OH)₂D₂。

实施例3：通过与化学合成的差向异构体，1α，24(S)-(OH)₂D₂和1α，24(R)-(OH)₂D₂比较而鉴定立体化学和生物衍生的1α，24(？)-(OH)₂D₂代谢物

通过高压液相色谱法和气相色谱法将如实施例1所述得到的生物产生的代谢物的立体化学与如以上实施例2所述得到的化学合成的差向异构体进行比较。基于这些比较，确定生物产生的代谢物的结构为1α，24(S)-(OH)₂D₂。图3显示进行这种比较的高压液相色谱实验图。在图3中，差向异构体1是化学合成的1α，24(S)-(OH)₂D₂。

(a)利用两种不同的柱和溶剂系统进行高压液相色谱比较。在反相柱Zorbax-ODS(Dupont Instruments；3μ；6.2mm×8cm)上，使用溶剂系统，乙腈∶水，60∶40，1mL/分，生物代谢物出现在14.3分钟，而1α，24(S)-(OH)₂D₂在14.2分流出；但是，1α，24(R)-(OH)₂D₂在15.7分流出。

在单一相(straight-phase)柱Zorbax-SIL(Dupont Instruments；3μ；6.2mm×8cm)上，使用溶剂系统，己烷∶异丙醇∶甲醇94∶5∶1，1ml/分，生物代谢物出现在22.4分钟，而1α，24(S)-(OH)₂D₂在22.4分钟流出；但是，1α，24(R)-(OH)₂D₂在22.8分钟流出。

(b)用气相色谱法，1α，24(S)-(OH)₂D₂与生物产生的化合物共同迁移，而1α，24(R)-(OH)₂D₂的保留时间相当不同(表1)。

表1：焦-衍生物相对于焦-1α，25-(OH)₂D₃的气相色谱保留时间

化合物相对保留时间 ^*

1α，24(S)-(OH)₂D₂ 1.0165

1α，24(R)-(OH)₂D₂ 1.0098

生物代谢物 1.0163

^*其中焦-衍生物是相对于内标1α，25-(OH)₂D₃表示的比较保留时间。

实施例4：1α，24(S)-(OH)₂D₂和1α，24(R)-(OH)₂D₂的生物活性比较

使用维生素D依赖性转录活化模型系统测定化学合成的1α，24(S)-(OH)₂D₂和1α，24(R)-(OH)₂D₂的体外生物活性，在该模型系统中，在维生素D-应答成分(VDRE)的调控下，将维生素D受体(VDR)表达质粒pSG5-hVDR1/3和含有生长激素(GH)-基因的质粒p(CT4)⁴TKGH共同转染到绿猴肾，COS-1细胞中。这两种载体的DNA′s由Mark Haussler博士，生物化学系，亚利桑那大学，图森，亚利桑那州提供。

将转染的细胞与维生素D代谢物一起培养，并测定生长激素产生。如表2所示，1α，24(S)-(OH)₂D₂在此系统中具有明显大于1α，24(R)-(OH)₂D₂的活性。

表2：在转染的COS-1细胞中维生素D诱导的生长激素产生

维生素D诱导的生长激素产生

净

诱导剂摩尔浓度总GH产生 ^* 维生素D诱导的GH产生

(ng/ml) (ng/ml)

乙醇 44 0

25-OH-D₃ 10^-7 245 201

10^-6 1100 1056

10^-5 775 731

1α，25-(OH)₂D₃ 10^-10 74 30

10^-9 925 881

10^-8 1475 1441

1α，24(S)-(OH)₂D₂ 5×10^-10 425 381

5×10^-9 1350 1306

1α，24(R)-(OH)₂D₂ 5×10^-8 1182 1138

10^-9 80 36

10^-8 1100 1056

10^-7 1300 1256

^*平行两份测定的平均值

实施例5：1α，24(S)-(OH)₂D₂对维生素D受体(VDR)的亲合力

使用从Incstar(Stillwater，Minnesota)商购的牛胸腺VDR试剂盒和标准1，25(OH)₂-D₃溶液评价1α，24(S)-(OH)₂D₂对哺乳动物维生素D受体(VDR)的亲合力。通过光电二极管阵列分光光度法对纯化的1α，24(S)-(OH)₂D₂进行定量，并在放射性受体测定中进行测定。1α，24(S)-(OH)₂D₂的半数最大结合约为150pg/mL，而1α，25-(OH)₂D₂的半数最大结合为80 pg/mL。因此，1α，24(S)-(OH)₂D₂对牛胸腺VDR的亲合力比1α，25-(OH)₂D₃小2倍，表明1α，24(S)-(OH)₂D₂具有有效的生物活性。

实施例6：1α，24(S)-(OH)₂D₂和1α，24(R)-(OH)₂D₂对维生素D受体的相对亲合力

使用可以从Incstar(Stillwater，Minnesota)商购得到的牛胸腺VDR和标准1α，25-(OH)₂D₃溶液的试剂评价1α，24(R)-(OH)₂D₂和1α，24(S)-(OH)₂D₂对维生素D受体(VDR)的相对亲合力。通过紫外光谱法对纯化的1α，24(R)-(OH)₂D₂和1α，24(S)-(OH)₂D₂差向异构体进行定量。产生相同的来自受体的³H-1α，25-(OH)₂D₃示踪剂的位移所需的1α，24(R)-(OH)₂D₂的浓度是所需的1α，24(S)-(OH)₂D₂的浓度的20至30倍，如图4所示。这些数据表明，1α，24(S)-(OH)₂D₂差向异构体的活性明显高于1α，24(R)-(OH)₂D₂差向异构体。

实施例7：1α，24(S)-(OH)₂D₂对维生素D血清结合蛋白(DBP)的亲合力

根据本领域中已知的方法，使用维生素D缺乏大鼠血清评价1α，24(S)-(OH)₂D₂对维生素D血清结合蛋白(DBP)的亲合力。数据表明，1α，24(S)-(OH)₂D₂与DBP的结合至少比25-OH-D₃弱1000倍。如果1α，24(S)-(OH)₂D₂对VDR是强结合而对DBP是弱结合，则此化合物趋于被靶细胞吸收，从而具有有效的生物活性。此外，DBP的弱结合表明更为快速的清除率，允许低毒性。

因此，前述测定证明，新的1α，24(S)-(OH)₂D₂表现出截然不同和独特的活性谱—即，高生物效力和低毒性，这清楚地将该化合物与现有技术中的化合物和其24(R)差向异构体区别开来。

实施例8：由维生素D₂和24-OH-D₂产生1α，24(S)-(OH)₂D₂

将维生素D₂或24-OH-D₂给予(口服或腹膜内补充)维生素D缺乏大鼠。制备血浆的脂质萃取物，并通过以下描述的合成标准生物1α，24-(OH)₂D₂的Horst等人的方法(Horst，R.L.，Koszewski，N.J.和Reinhardt，T.A.， Biochem.，29：578-82(1990))将代谢物纯化。

通过在含有5mL 20％从维生素D缺乏小鸡制备的肾匀浆的烧瓶中温育10μg 24-OH-D₂而在体外从24-OH-D₂合成标准生物1α，24-(OH)₂D₂。通过HPLC分离此反应的产物，并通过质谱鉴定。在给予了维生素D₂或24-OH-D₂的维生素D缺乏大鼠的血浆的脂质萃取物中，一种分离的代谢物与标准1α，24-(OH)₂D₂在HPLC中共同迁移，表明1α，24-(OH)₂D₂为维生素D₂的天然代谢物。相反，给予了维生素D₃的参照大鼠没有可检测的24-OH-D₃。

实施例9：用增加的体外底物浓度优先生产1α，24(S)-(OH)₂D₂

将Hep 3B细胞与终浓度为1、10或100nM(实验1)和1或10μM(实验2)的上述1α-OH-D₂一起培养，并萃取和纯化1α，24(S)-(OH)₂D₂。通过回收的放射性标记(实验1)或通过光电二极管阵列分光光度法(实验2)对1α，24(S)-(OH)₂D₂和1α，25-(OH)₂D₂代谢物进行定量。如表3所示，当底物浓度增加时，1α，24(S)-(OH)₂D₂的量相对于1α，25-(OH)₂D₂的量增加。这表明，在此系统中，1α，24(S)-(OH)₂D₂是更高底物浓度下1α-OH-D₂的主要天然活性代谢物。

表3

实验底物浓度形成的产物
实验底物浓度形成的产物				1	nM	1α，24(S)-(OH)₂D₂与1α，25-(OH)₂D₂的比率
	110100	1∶41∶11.5∶1		1	nM	1α，24(S)-(OH)₂D₂与1α，25-(OH)₂D₂的比率
	110100	1∶41∶11.5∶1		2	μM	产生速率，pmol/10⁶细胞/日
	110	1α，24(S)-(OH)₂D₂	1α，25-(OH)₂D₂	2	μM	产生速率，pmol/10⁶细胞/日
		1α，24(S)-(OH)₂D₂	1α，25-(OH)₂D₂	4.9 N.D.^*59 7.4

^*N.D.意指不可检测

实施例10：给予了1α-(OH)₂D₂的骨质疏松妇女中1α，24(S)-(OH)₂D₂的产生

本发明的发明人还已观察到，在作为1α-OH-D₂治疗骨质疏松的研究的一部分的接受了该药物的女性中，1α，24(S)-(OH)₂D₂产生相对于1α，25-(OH)₂D₂产生增加。依据2μg 1α-OH-D₂的单一剂量或8μg/日的日剂量持续1周，收集血液，并分析代谢物1α，24(S)-(OH)₂D₂和1α，25-(OH)₂D₂。从血液中萃取脂质，并通过HPLC使用标准方法将代谢物纯化，并用Incstar(Stillwater，Minnesota)生产的放射性受体测定进行定量。在单一2μg剂量一天后，1α，24(S)-(OH)₂D₂的水平不可检测，而1α，25-(OH)₂D₂水平为约11pg/ml。相反，在最后一次8μg剂量后一天，1α，24(S)-(OH)₂D₂的水平平均为9pg/mL，而1α，25-(OH)₂D₂水平平均为30pg/mL。

实施例11：绝经后骨质疏松妇女的剂量范围研究

在开放标签研究中有二十名绝经后骨质疏松妇女登记。所选择的患者的年龄为55-75岁，且L2-L3椎骨矿物密度为0.7-1.05g/cm²，所述矿物密度用LUNAR Bone Densitometer(Lunar Corporation，Madison，Wisconsin)测定。

在研究允许的情况下，所有患者接受关于选择含有400-600mg钙的每日饮食的指令。以每周的时间间隔通过24小时食物记录和与每名患者面谈来核实对这种饮食的遵从。

所有患者完成一周的基线期，五周的治疗期和一周的治疗后观察期。在治疗期间，患者自己口服1α，24(S)-二羟维生素D₂，第一周初始剂量为0.5μg/日，然后在随后的四周中每周连续升高剂量为1.0、2.0、4.0和8.0μg/日。所有的剂量在早餐前给予。

在整个研究中每周监测血液和尿液化学。重要的血液化学包括禁食血清钙、磷、骨钙素、肌酸酐和血尿氮水平。重要的尿液化学包括钙、磷和肌酸酐的24小时排泄。

来自临床研究的血液和尿液数据表明，此化合物不有害地影响肾功能，这通过肌酸酐清除率和脲氮的血液水平来确定；也没有增加羟脯氨酸的尿排泄，表明不存在任何对骨吸收的刺激作用。该化合物对任何常规监测的血清参数无影响，表明不存在不良的代谢作用。

从24小时尿钙水平的适度增加明显看出1α，24(S)-二羟维生素D₂对钙体内稳态的正作用，证实了该化合物增加肠钙吸收，而血清骨钙素水平增加表明该化合物刺激成骨细胞。

实施例12：绝经后骨质疏松妇女的骨量丢失的预防性治疗

对年龄为55-75岁的绝经后骨质疏松的门诊患者进行临床研究。研究包括随机分成三个治疗组的达120名患者，并持续24-36个月。两个治疗组接受恒定剂量的1α，24(S)-二羟维生素D₂(u.i.d.；两个不同的处在或高于1.0μg/日的剂量水平)，而另一组接受颜色及外表相同的安慰剂。所有患者均保持正常的饮食钙摄入(500-800mg/日)，并避免使用钙补剂。通过治疗前和治疗后比较患者组的以下指标来评价效力：(a)总体内钙保留，和(b)通过双光子吸光测定法(DPA)或双能量X-射线吸光测定法(DEXA)测定的桡骨和椎骨矿物密度。通过比较尿羟脯氨酸排泄、血清和尿钙水平、肌酸酐清除率、血尿氮和其它常规测定来评价安全性。

结果表明，相对于用安慰剂治疗的患者而言，用1α，24(S)-二羟维生素D₂治疗的患者表现出明显更高的总体内钙，以及桡骨与椎骨密度。监测的安全性参数证实了1α，24(S)-二羟维生素D₂治疗没有明显的高钙血症或高钙尿症，或任何其它代谢紊乱的发生。

实施例13：绝经后骨丢失的预防

对年龄为55-60岁的健康绝经后妇女进行临床研究。该研究包括随机分成两个治疗组的达80名患者，并持续24-36个月。一个治疗组接受恒定剂量的1α，24(S)-二羟维生素D₂(u.i.d.；剂量水平为或高于1.0μg/日)，而另一组接受颜色及外表相同的安慰剂。如以上实施例2所示进行研究。

结果表明，相对于基线值而言，用1α，24(S)-二羟维生素D₂治疗的患者表现出总体内钙、桡骨或椎骨密度丢失减少。相反，用安慰剂治疗的患者表现出相对于基线值而言的这些参数的显著的损失。监测的安全性参数证实了以此剂量水平长期给予1α，24(S)-二羟维生素D₂的安全性。

实施例14：长期血液透析患者中低钙血症及作为结果的代谢性骨病的控制

对三十名患有肾病，进行长期血液透析的男性和女性进行十二个月的双盲安慰剂对照临床试验。所有患者均进入8周对照期，在此期间它们接受维持剂量的维生素D₃(400 IU/日)。在此对照期之后，将患者随机分成两个治疗组：一组接受恒定剂量的1α，24(S)-二羟维生素D₂(u.i.d.；剂量高于3.0μg/日)，而另一组接受颜色及外表相同的安慰剂。两个治疗组都接受维持剂量的维生素D₃，保持正常的饮食钙摄入，并避免使用钙补剂。通过治疗前和治疗后对患者组的以下指标进行比较而评价效力：(a)直接测量肠钙吸收，(b)总体内钙保留，(c)桡骨和椎骨矿物密度，或(d)测定血清钙。通过监测常规血清钙评价安全性。

临床数据的分析表明，1α，24(S)-二羟维生素D₂显著增加肠钙吸收，这通过使用双同位素技术直接测定。用此化合物治疗的患者表现出正常的血清钙水平、总体内钙的稳定值和相对于基线值而言稳定的桡骨和椎骨密度。相反，用安慰剂治疗的患者表现出频繁的高钙血症、总体内钙和桡骨及椎骨密度的显著减少。在治疗组中观察到显著的高钙血症发病率。

药物制剂

实施例15：

通过将1.0mg 1α，24(S)-二羟维生素D₂溶于1g杏仁油中而制备局部乳膏。向此溶液中加入40gm矿物油和20gm自乳化蜂蜡。将混合物加热至液化。在加入40ml热水之后，将混合物良好混合。所得的乳膏含有约10μg 1α，24(S)-二羟维生素D₂/克乳膏。

实施例16：

通过将1.0mg 1α，24(S)-二羟维生素D₂溶于30g杏仁油而制备软膏。向此溶液中加入70gm已加热到正好足以液化的白色软石蜡。将软膏良好混合，并使之冷却。这种软膏含有约10μg 1α，24(S)-二羟维生素D₂/克软膏。

实施例17：

向实施例14的软膏中加入彻底混合的0.5g腺苷和2.0g罂粟碱基质，将这两种成分溶于最小量的二甲亚砜中。附加成分以约0.5wt％(腺苷)和2wt％(罂粟碱基质)的程度存在。

实施例18：

向实施例14的软膏中加入溶于最少量的植物油中的完全混合的10000 U维生素A。所得的软膏含有约100 U维生素A/克软膏。

实施例19：

通过将1.0mg 1α，24(S)-二羟维生素D₂溶于100g无水丙二醇而制备皮肤病洗剂。将该洗剂在冰箱中在棕色瓶内贮存，其含有约10μg1α，24(S)-二羟维生素D₂/克洗剂。

实施例20：

在1g杏仁油中溶解0.2mg 1α，24-二羟维生素D₂。向该溶液中加入40g矿物油和20g自乳化蜂蜡，随后加入40ml热水。将混合物良好混合以产生含有约2.0μg 1α，24(S)-二羟维生素D₂/克乳膏的化妆乳膏。

实施例21：

向根据实施例18制备的化妆乳膏中加入100mg腺苷。将该乳膏良好混合，其含有约0.1wt％腺苷。

实施例22：

通过将100μg 1α，24(S)-二羟维生素D₂溶于30g杏仁油而制备软膏。向如此产生的溶液中加入70g已加热至正好足以液化的白色软石蜡。将该软膏良好混合并使之冷却。如此生产的软膏含有约1.0μg1α，24-二羟维生素D₂/克软膏。

实施例23：

向实施例18的化妆软膏中加入充分混合的溶于最小量的植物油中的200U/g维生素A。

实施例24：

通过将300μg 1α，24-二羟维生素D₂溶于100g无水丙二醇而制备化妆洗剂。将该洗剂在冰箱中在棕色瓶内贮存，其含有约3.0μg1α，24(S)-二羟维生素D₂/克洗剂。

实施例25：皮肤病试验

评价含有1α，24(S)-二羟维生素D₂的组合物在皮炎(接触性和异位性)治疗中的功效。所评价的组合物为含有在矿脂-杏仁油基质中的10μg 1α，24-二羟维生素D₂/克软膏的软膏。对照组合物除了其不含活性试剂1α，24(S)-二羟维生素D₂之外其它情况相同。在门诊部治疗患者。要求他们每天使用制剂两次。

将软膏尽可能地施用于一处伤口，或施用于疾病区域。在治疗开始前将软膏及其容器称重，并在治疗结束时带回任何未使用的内容物以再称重。

评价并记录被治疗的伤口区域，按照要求对伤口和适宜的“对照”伤口拍照。后者优选为具有类似大小和类似发展阶段的伤口，其在治疗的伤口部位附近或对称地在对侧。记录照相过程的相关细节以在下次对伤口部位进行拍照时重复(距离、光圈、角度、背景等)。该软膏每天施用两次，并优选不被覆盖。不对“对照”伤口进行治疗，但如果这不可能的话，则记录在其上使用的治疗。

以每周间隔由医师评价红斑、剥落(scaling)和厚度，并将伤口的严重程度分级为0-3。最后的评价通常在四至六周的治疗结束时进行。用1α，24(S)-(OH)₂D₂治疗的伤口具有比对照伤口低的分值。还观察到高钙血症发生不明显。

实施例26：表皮细胞分化和增殖实验

根据最初由Rheinwald和Green(Cell，vol.6，p.331(1975))所述的系统的已知的改型培养人角质形成细胞。将溶于乙醇的1α，24(S)-二羟维生素D₂加入细胞中以得到0.05-5μg/ml的各种浓度，乙醇浓度不超过0.5％v/v。将对照培养物补充以乙醇，至终浓度为0.5％v/v。通过以下方法检查培养物中的表皮细胞的分化和增殖：

1.对角质外壳进行定量；

2.对与圆盘结合的细胞的细胞密度进行定量；

3.监测转谷氨酰胺酶活性；或者

4.通过掺入³H-胸苷而监测DNA合成。

与1α，24(S)-二羟维生素D₂一起培养的培养物具有比对照培养物更多的角质外壳、更少的结合细胞、更高的转谷氨酰胺酶活性和更低的DNA合成。

虽然已用一些具体实施方案描述和例示了本发明，但本领域技术人员将认识到，可以对所述的内容进行多种修改，包括改变、加入和省略。

因此，意在使这些改型也包括在本发明的范围内，而本发明的范围仅受与所附的权利要求在法律上一致的最宽解释的限制。

实施例27：1α，24(S)-(OH)₂D₂在HL-60细胞分化测定中的活性

如DeLuca和Ostrom(DeLuca，H.F.和Ostrem，V.K.， Prog.Clin. Biol.Res.，vol.259，pp.41-55(1988))所述，用1α，24(S)-(OH)₂D₂进行HL-60细胞分化测定中的剂量反应研究。在此研究中，将1α，25-(OH)₂D₃用作阳性对照，而适宜的溶剂用作阴性对照。评价以下变量：非特异性酸性酯酶活性、氮蓝四唑(NBT)还原和胸苷掺入。结果表明，1α，24(S)-(OH)₂D₂在促进HL-60前髓细胞分化成单核细胞方面具有有效活性。

实施例28：1α，24(S)-(OH)₂D₂对人癌细胞系的抗增殖活性

如Shieh，H.L.等人， Chem.Biol.Interact.，vol.81，pp.35-55(1982)所述，在一组人癌细胞系中用1α，24(S)-(OH)₂D₂进行剂量反应研究。这些细胞系包括，但不限于，BCA-1或ZR-75-1(乳房)和COL-1(结肠)。在此研究中，将适宜的溶剂用作阴性对照。结果表明，1α，24(S)-(OH)₂D₂具有有效的(和可逆的)抗增殖活性，这种活性由胸苷掺入的抑制来判定。

实施例29：化学稳定性实验

将约5mg结晶或粉末1α，24-二羟维生素D₂样品分别放置在5 mL容量瓶中。使该瓶暴露于相同的热和光的变化环境条件中。热和光是已知不利地影响维生素D化合物的环境参数。

一周的时间后，对该瓶的内容物进行目视检查。与结晶样品相比，粉末样品似乎在颜色上略微发黄。将5ml乙醇加入各样品中，并将各样品溶解。分析这些溶液在200-320nm的紫外吸收。对以相同的浓度溶于乙醇并在冰箱中贮存相同时间的参比标准1α，24-二羟维生素D₂进行类似的分析。

参比标准1α，24-二羟维生素D₂表现出鉴别维生素D结构的三烯官能团的紫外光谱，即λ_max为265nm，而λ_min为228nm。结晶样品保留特征性的λ_max265nm和λ_min 228nm。相反，粉末样品的λ_max为255nm，而λ_min为228nm，表明已转化为另一种或多种实体。根据比尔定律(Beer§s Law)，265nm处的吸光度与浓度成线性关系。参比标准保留100％的吸光度，因而其保留了100％的浓度。暴露于热和光的结晶样品保留93％的吸光度。相反，粉末样品仅保留最初吸光度/浓度的45％。

还通过高压液相色谱法(HPLC)，在以下条件下分析了结晶和粉末1α，24-二羟维生素D₂的乙醇溶液：

NovaPak C18柱： 3.9mm×15cm

流动相： 50∶50水∶乙腈

流速： 0.5mL/分

检测：光电二极管阵列，265nm

Psi： 1310

注射体积： 10μL

参比标准和结晶1α，24-二羟维生素D₂的HPLC图谱相同，其中标准UV吸收物质的96％为1α，24-二羟维生素D₂，而结晶物质的95％为1α，24-二羟维生素D₂。这些数据表明，在结晶1α，24-二羟维生素D₂接触热和光之后，大于88％的该化合物保持原样。

另一方面，粉末1α，24-二羟维生素D₂的HPLC分析表明，仅78％的UV吸收物质为1α，24-二羟维生素D₂，总共仅保留该化合物的35％。对HPLC图谱中的1α，24-二羟维生素D₂的峰面积进行基于重量的归一化表明，100％保留了参比标准的结构，而结晶样品保留93％，粉末样品保留23％。两个保留时间小于1α，24-二羟维生素D₂的保留时间的HPLC峰在使用粉末样品时出现，但在使用参比或结晶样品时没有出现。

这些数据表明，与粉末1α，24-二羟维生素D₂相比，暴露于环境的结晶1α，24-二羟维生素D₂具有令人惊奇的稳定性。

实施例30：结晶和白色粉末形式的1α，24-(OH)₂D₂的维生素D受体结合测定

使用如在实施例6中所述的本领域中已知的方法评价暴露于环境的化合物，结晶1α，24-二羟维生素D₂和粉末1α，24-二羟维生素D₂对维生素D受体(VDR)的结合亲合力。发现结晶1α，24-二羟维生素D₂的结合亲合力大约与参比标准1α，24-二羟维生素D₂的相同，而粉末形式则小得多。将百分比结合对以pg/管为单位的化合物量绘图，如图5所示。

从图5可见，产生相同来自受体的³H-1α，25-二羟维生素D₃示踪物的位移所需的结晶1α，24-二羟维生素D₂的浓度基本上与所需的标准1α，24-二羟维生素D₂的浓度相同，而暴露于相同条件的粉末形式低于25％。标准和结晶物质的ED₅₀(取代50％结合³H-1α，25-二羟维生素D₃的物质量)为约10pg/管；粉末物质的ED₅₀为约40pg/管。这些数据证明，暴露于环境条件的粉末形式具有明显更低的生物活性。换句话说，结晶形式在暴露于环境后比白色粉末形式保留更多的生物活性物质。

实施例31：细胞增殖的抑制

使用Skowronski等人，132 Endocrinology(1993)1952-1960和136Endocrinology(1995)20-26的技术证明细胞增殖的抑制，本文引用这两篇文献作为参考。将源自人前列腺癌的细胞系，LNCaP和PC-3以约50000个细胞/平板的密度接种到六孔组织培养平板上。在细胞结合和稳定后，约2-3天，用含有载体或浓度为10^-11M至10^-7M的活性维生素D类似物1α，24-(OH)₂D₂的培养基补充培养基。每三天更换含有测试类似物或赋形剂的培养基。在6-7天后，除去培养基，洗涤细胞，用冷的5％三氯乙酸沉淀，并用冷乙醇洗涤。用0.2N氢氧化钠溶解细胞，并用标准程序测定DNA的量。结果表明，根据本发明与1α，24-(OH)₂D₂一起培养的培养物具有比对照培养物明显更少的细胞。

实施例32：细胞分化

使用Skowronski等人，132 Endocrinology(1993)1952-1960和136Endocrinology(1995)20-26的技术，本文引用这两篇文献作为参考，将源自人转移前列腺癌并已知表达PSA的细胞系，LNCaP的细胞以约50000个细胞/平板的密度接种到六孔组织培养平板中。在细胞已结合和稳定后，约2-3天，用含有载体或浓度为10^-11M至10^-7M的活性维生素D类似物，1α，24-(OH)₂D₂的培养基补充培养基。在6-7天后，除去培养基，并在-20℃下保存以进行前列腺特异性抗原(PSA)分析。

将来自平行培养物的细胞洗涤、沉淀并用标准方法测定DNA的量。用标准的已知方法测定PSA。在以PSA的质量/细胞表示时，与1α，24-(OH)₂D₂一起培养的培养物具有比对照培养物明显更多的PSA。

实施例33：癌症的一般治疗

患有已知的维生素D受体阳性肿瘤(例如前列腺、乳房、肺、结肠或胰的腺癌，或过渡性膀胱细胞癌或黑素瘤)的患者参加1α，24(S)-(OH)₂D₂的开放标签研究。在治疗前使患者遵循减少钙的饮食，以有助于将肠吸收最小化，并允许甚至更高剂量的1α，24(S)-二羟维生素D₂。这种减少钙的饮食可以持续治疗期间，并在1α，24(S)-二羟维生素D₂最后给药之后继续一周。该饮食理想地将每日钙摄入限制到400-500mg。患者还停止使用任何维生素补剂或维生素D替代治疗。还要求每名患者饮用比平常摄入多4-6杯的液体，以确保充足的口服水合作用(oral hydration)。

定期监测每名受试者的：(1)高钙血症、高磷酸盐血症、高钙尿症、高磷酸盐尿症和其它毒性；(2)转移性疾病的发展中变化的证据；和(3)对处方测试药物剂量的服从。

给药方案一般为日剂量10μg或20μg/日至约100μg/日，持续24个月。或者，可以采用非每日给药方案，例如每隔一天给予40μg，一周一次给予100μg。给药途径可以改变，口服或静脉内或局部递送(例如经门静脉动脉输液)。当然，口服是最容易和最有效的途径。局部递送允许高剂量，且一般避免了任何高钙血症的产生。但是，在本发明的化合物的情况下，该化合物基本上是低钙血的。

治疗18个月后，使用CAT、扫描、X-射线和骨扫描评价转移性疾病的发展，或者许多以更低剂量治疗的患者的部分缓解，以及许多以更高剂量治疗的患者的稳定疾病和部分或完全缓解。

实施例34：前列腺癌的治疗

患有晚期(advanced)雄激素依赖性前列腺癌的患者参加1α，24-(OH)₂D₂的开放标签研究。符合条件的患者至少为40岁，表现出前列腺癌的组织学证据，并表现出先前对激素干预反应的渐进性疾病。在研究允许的情况下，患者开始持续26周的1α，24-(OH)₂D₂口服疗程，同时停止任何先前使用的钙补剂、维生素D补剂和维生素D激素替代治疗。在治疗期间，定期监测患者的：(1)高钙血症、高磷酸盐血症、高钙尿症、高磷酸盐尿症和其它毒性；(2)转移性疾病的发展中变化的证据；和(3)对处方测试药物剂量的服从。

该研究分两个阶段进行。在第一阶段，通过给予连续的患者组渐增剂量来确定每日口服1α，24-(OH)₂D₂的最大耐受剂量(MTD)。所有剂量在清晨于早餐前给予。第一组患者用25.0μg/日的1α，24-(OH)₂D₂治疗。其后的患者组以50.0、75.0和100.0μg/日治疗。在研究期间不间断地持续给药，除非血清钙超过11.6mg/dL，或者观察到毒性等级为3或4(NCI普通毒性标准(NCI Common Toxicity Criteria))，在这种情况下暂时中止给药，直至观察到的毒性作用解决，然后以减少10.0μg的水平继续下去。

来自研究的第一阶段的结果表明，1α，24-(OH)₂D₂的MTD高于20.0μg/日，该水平是用1α，25-(OH)₂D₃所能够达到的10至40倍。对定期从参加的患者中收集的血样进行分析表明，循环1α，24-(OH)₂D₂的水平与给药剂量成比例地升高，在最高剂量下升高到远大于100pg/ml的最高水平，而1α，25-(OH)₂D₃的循环水平通常被抑制到不可检测的水平。血清和尿钙以剂量反应方式升高。用1α，24-(OH)₂D₂的MTD治疗至少六个月的患者报道与转移性疾病有关的骨痛显著减少。

在第二阶段，以0.5和1.0倍于MTD的1α，24-(OH)₂D₂治疗患者24个月。在治疗一年和两年之后，用CAT扫描、X-射线和骨扫描评价转移性疾病的发展，表明许多以更低剂量治疗的患者表现疾病稳定或部分缓解，而许多以更高剂量治疗的患者表现疾病稳定和部分或完全缓解。

实施例35：黑素瘤的治疗

将实施例33和34的方法用于治疗患有例如颚的转移性恶性黑素瘤的患者。在治疗18个月后，转移性疾病的发展表现出疾病稳定或部分缓解。

实施例36：视网膜母细胞瘤的治疗

将实施例33和34的方法用于治疗患有转移性视网膜母细胞瘤的患者。在治疗18个月后，转移性疾病的发展表现出疾病稳定或部分缓解。

实施例37：肝癌的治疗

将实施例33和34的方法用于治疗患有肝细胞瘤的患者。局部递送本发明的化合物，即经动脉输液局部递送。在治疗18个月后，转移性疾病的发展表现出疾病稳定或部分缓解。

Claims

1.抑制恶性或肿瘤细胞过度增殖的方法，所述方法包括用抗增殖量的1α，24(S)-二羟维生素D₂处理细胞，所述细胞为以下癌细胞：肺、颈和头、胰腺、子宫内膜、膀胱、宫颈、卵巢、鳞状细胞癌、骨髓和淋巴细胞白血病、淋巴瘤、甲状腺髓样癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、视网膜母细胞瘤或软组织和骨肉瘤。

2.抑制恶性或肿瘤细胞的过度增殖活性的方法，所述方法包括给予其患者抗增殖量的1α，24(S)-二羟维生素D₂，该细胞为以下癌细胞：肺、颈和头、胰腺、子宫内膜、膀胱、宫颈、卵巢、鳞状细胞癌、骨髓和淋巴细胞白血病、淋巴瘤、甲状腺髓样癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、视网膜母细胞瘤或软组织和骨肉瘤。

3.根据权利要求2的方法，其中以日给药方案或阶段性给药方案给予1α，24(S)-二羟维生素D₂。

4.根据权利要求3的方法，其中该阶段性方案为每2-7天给药一次。

5.根据权利要求3的方法，其中1α，24(S)-二羟维生素D₂的日给药剂量为约10-100μg/日。

6.根据权利要求2的方法，其中该1α，24(S)-二羟维生素D₂口服给药，静脉内给药，直接注射到癌症部位或局部递送到癌症部位。

7.根据权利要求6的方法，其中该1α，24(S)-二羟维生素D₂口服给药。

8.根据权利要求2的方法，其中该1α，24(S)-二羟维生素D₂与细胞毒性剂联合给药。

9.根据权利要求8的方法，其中该细胞毒性剂是抗代谢药，以及抗微管药、烷化剂、铂剂、蒽环类药、拓朴异构酶抑制剂或抗生素。

10.根据权利要求9的方法，其中该抗代谢药为5-氟-尿嘧啶、氨甲喋呤或氟达拉滨。

11.根据权利要求9的方法，其中该抗微管药为长春新碱、长春花碱或紫杉烷。

12.根据权利要求11的方法，其中该紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。

13.根据权利要求9的方法，其中该烷化剂为环磷酰胺、美法仑、生物色素乙基亚硝基脲或羟基脲。

14.根据权利要求9的方法，其中该铂剂为顺铂、卡铂、奥沙利铂、JM-216或CI-973。

15.根据权利要求9的方法，其中该蒽环类药为阿霉素或柔红霉素。

16.根据权利要求9的方法，其中该抗生素为丝裂霉素、依达比星、多柔比星或柔红霉素。

17.根据权利要求9的方法，其中该拓朴异构酶抑制剂为依托泊苷或喜树碱。

18.根据权利要求9的方法，其中该细胞毒性剂为磷酸雌莫司汀或泼尼莫司汀。

19.根据权利要求8的方法，其中该细胞毒性剂的抗增殖有效量低于单独给药时的细胞毒性剂的抗增殖有效量。

20.治疗人以缓解胰腺癌、子宫内膜癌、小细胞和非小细胞肺癌(包括鳞状、腺癌和大细胞类型)、头和颈鳞状细胞、膀胱、卵巢和宫颈癌、骨髓和淋巴细胞白血病、淋巴瘤、肝肿瘤、甲状腺髓样癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、视网膜母细胞瘤或软组织和骨肉瘤的病理作用的方法，所述方法包括给予人有效量的1α，24(S)-二羟维生素D₂。

21.增强细胞毒性剂在患有需要用细胞毒性剂治疗的疾病的患者中的抗增殖作用的方法，所述方法包括给予该患者1α，24(S)-二羟维生素D₂和细胞毒性剂。

22.根据权利要求21的方法，其中该1α，24(S)-二羟维生素D₂在给予该细胞毒性剂之前0.5-7天给药。

23.根据权利要求22的方法，其中该1α，24(S)-二羟维生素D₂在给予该细胞毒性剂之前2-4天给药。

24.诱导恶性或肿瘤细胞分化的方法，所述方法包括用促分化量的1α，24(S)-二羟维生素D₂处理细胞。

25.治疗受试者中表达维生素D受体的肿瘤的方法，所述方法包括给予该受试者有效量的1α，24(S)-二羟维生素D₂以将维生素D的血液水平升高至足够的超生理水平并持续充足的时间，从而抑制肿瘤的生长，同时不在受试者中诱导高钙血症。