ES2240159T3 - Prevencion del cancer colorrectal. - Google Patents

Abstract

Un medicamento farmacéutico que comprende una combinación de ácido acetilsalicílico (ASA), 1, 25- dihidroxicolecalciferol (1, 25 DHC) y calcio en una dosis de combinación junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Prevención del cáncer colorrectal.

La presente invención se refiere al uso de ácido acetilsalicílico (ASA), 1,25 dihidroxicolecalciferol (1,25 DHC) y calcio junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento para prevenir el inicio y/o la progresión del cáncer colorrectal en un ser humano. La invención también se refiere a un medicamento farmacéutico que comprende una combinación de ASA, 1,25 DHC y calcio en una dosificación de combinación junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales formas de cáncer en el mundo occidental (1,3 millones al año y aproximadamente 600.000 muertes anuales). En Dinamarca, la incidencia es de aproximadamente 65 por cada 100.000 habitantes y se correlaciona con la edad. De forma simultánea a un descenso del tabaquismo en los países occidentales industrializados y a un incremento de la esperanza de vida, cabe esperar que el CCR se convierta en el cáncer sólido más frecuente durante las próximas
décadas.

La gran mayoría de los casos de CCR son cánceres esporádicos para los que no es posible establecer una disposición genética. Una prevención eficaz del CCR en grupos de riesgo bien definidos tendría un efecto significativo sobre la salud de la población.

En la población media, el riesgo durante la vida de presentar CCR es de un 6 por ciento y el riesgo de morir de la enfermedad es del 3 por ciento (1, 2, 3). En los parientes de primer grado de pacientes con CCR, el riesgo es varias veces superior. En pocos casos, los factores de predisposición al CCR son cáncer colorrectal no poliposis hereditario (HNPCC), donde es posible establecer la presencia de mutaciones en genes de reparación de errores, poliposis adenomatosa familiar (FAP, mutación en el gen APC) o enfermedades intestinales inflamatorias (colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), representando estos factores del 5 al 15 por ciento en total.

No existen dudas acerca de que la alimentación es el factor causal más importante, incluidas las proteínas y grasas animales, de los cuales el mundo occidental está ingiriendo de forma creciente en cantidades excesivas en lugar de cereales, frutas y verduras. La incidencia de CCR es cada vez mayor, aunque en individuos vegetarianos es de sólo la mitad de la magnitud que en individuos que comen carne (4). El progreso que se ha producido durante las últimas décadas en las técnicas quirúrgicas, tratamiento adyuvante etc. ha reducido la mortalidad a un nivel mencionable. La detección de CCR significa seguir los cánceres en una etapa inicial y eliminar de los pólipos intestinales, sin embargo, hasta ahora, en los estudios realizados no se ha mostrado detección para reducir la incidencia. La supervivencia global a cinco años en Dinamarca es del 30 por ciento y depende de la etapa en el momento del diagnóstico. Aproximadamente el 25 por ciento de los pacientes presentan cáncer diseminado en el momento del diagnóstico y no se pueden curar. Tres cuartos de los pacientes de CCR se someten a cirugía que pretende curar; no obstante, el 50 por ciento de estos pacientes mueren en cinco años a causa de la recurrencia.

Con las elecciones y los resultados del tratamiento que se conocen hoy en día, sólo la profilaxis eficaz será capaz de reducir de forma decisiva la morbilidad y la mortalidad del CCR (3, 5).

En los últimos años, la atención se ha centrado principalmente en la profilaxis del cáncer, ya que se conoce el hecho de que en casi todos los casos la cirugía no basta como única modalidad y de que la mayoría de los regímenes citotóxicos son ineficaces contra los tumores sólidos.

El término quimioprofilaxis cubre el uso de agentes no citotóxicos farmacológicamente activos o nutrientes naturales que protegen contra la aparición y el desarrollo de clones de células malignas mutadas.

En 1994, para analizar los datos existentes e iniciar nuevos estudios, el Instituto Nacional del Cáncer, EE.UU., estableció un Grupo Quimiopreventivo. El NCI-CB ha concluido que el CCR es un objetivo atractivo para la quimioprofilaxis del cáncer, ya que es un cáncer frecuente con una mortalidad elevada. Sin embargo, no se dispone de un tratamiento aceptable.

Se ha realizado el mapa de una carcinogénesis bien definida de varias etapas con precursores bien definidos en forma de adenomas colorrectales, y los grupos de riesgo también están bien definidos.

En algunos estudios se ha apuntado a una correlación inversa entre la ingesta individual de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y de calcio y vitamina D_{3} y el riesgo de desarrollar CCR. Los estudios en cuestión son modelos experimentales con animales de carcinogénesis colorrectal, estudios prospectivos de pacientes con FAP y estudios epidemiológicos que toman la forma de estudios retrospectivos de casos y controles y cohorte prospectiva y estudios intervencionistas (6-17). En conclusión, en 21 de 23 estudios epidemiológicos se ha mostrado que el uso habitual de AINE reduce el riesgo de CCR en hasta un 50 por ciento (18). Sin embargo, no hay datos claros acerca de la dosificación y la duración del uso. Los fármacos estudiados con más frecuencia son el ácido acetilsalicílico, el sulindac, el piroxicam y la indometacina.

Se han publicado algunos artículos de revisión y editoriales en los que se encuentran resultados interesantes, aunque los datos existentes no han conducido a ninguna recomendación adecuada ni se ha probado ninguna significación clínica (12). Esto se debe, principalmente, a los bien conocidos efectos no deseados de los AINE y al conocimiento de que la prueba más fuerte del efecto de estos agentes no existe, es decir ensayos randomizados a doble ciego en poblaciones de seres humanos.

La Sociedad Americana del Cáncer ha concluido que los datos actuales de estudios epidemiológicos, clínicos, farmacológicos y toxicológicos muestran que el ácido acetilsalicílico protege contra el desarrollo de CCR (13) y la FDA está en la actualidad valorando si el ácido acetilsalicílico tomado solo debería aprobarse como quimioprofilaxis del CCR o si serán necesarios más estudios en fase III.

Los datos de experimentos animales dibujan un cuadro prometedor de fármacos farmacológicamente activos que, con diferentes mecanismos de acción, parecen ser agentes quimioprofilácticos eficaces. Sin embargo, los estudios epidemiológicos individuales de calcio y vitamina D (o productos lácteos) en relación con el CCR son inconsistentes. De 13 estudios de calcio (nueve estudios de casos y controles y cuatro de cohortes), en ocho se muestra una correlación inversa significativa, en tres se comunica una correlación no significativa y en dos no se muestra correlación
alguna.

De cinco estudios epidemiológicos (tres estudios de cohortes y dos estudios de casos y controles) del impacto de la vitamina D sobre el riesgo de CCR, en dos se muestra una correlación inversa, mientras que en el resto no se observa significación.

La secuencia epitelio-adenoma-carcinoma es un proceso que lleva muchos años (de 5 a 10 años). EL CCR difiere de muchos otros cánceres en que tantas mutaciones como se produzcan en los genes reguladores del ciclo celular y los productos génicos rara vez se ven. El CCR se caracteriza por mutaciones en los genes cruciales supresores tumorales (APC, DCC, p53, MCC) y oncogenes (K-ras) y el incremento de los factores de crecimiento (en especial la familia del EGF) y la actividad enzimática (en especial la ciclooxigenasa).

A pesar de que el CCR es una forma de cáncer frecuente, su incidencia es de sólo 65 por cada 100.000 habitantes y un estudio clínico controlado en el que los criterios de valoración fueran cáncer invasivo y muertes relacionadas con el cáncer requeriría la inclusión de decenas de miles de individuos y duraría varias décadas y requeriría recursos financieros astronómicos. Los individuos sanos no se sienten impulsados a participar en estudios clínicos en los que se incluya ingesta de medicinas a largo plazo, y los resultados de tales estudios estarían sujetos a confusión.

Aproximadamente el 95 por ciento del CCR se desarrolla a partir de adenomas, que son precursores aceptados de CCR en estudios científicos de seres humanos y en experimentos con animales. Entre otros marcadores biológicos se incluyen los cambios genómicos (mutaciones, etc.), focos crípticos aberrantes (FCA), actividad ornitina descarboxilasa, actividad ciclooxigenasa y el nivel de prostaglandinas en la mucosa, que se usan como criterios de valoración intermediarios.

Carcinogénesis colorrectal y calcio

En el mundo occidental, la ingesta media diaria está sustancialmente por debajo del aporte dietético recomendado (ADR) de 800 a 1200 mg/día, y aumenta hasta 1500 mg/día en ancianos. En los países occidentales, cada adulto tiene una ingesta media diaria de 750 a 850 mg de calcio (14).

Aproximadamente el 30 por ciento del calcio de la dieta se absorbe en el canal intestinal y la vitamina D_{3} estimula la absorción. La absorción es tanto transcelular (cuando el contenido de calcio en la dieta es bajo) como paracelular. La cantidad residual de calcio en la luz intestinal se une a los ácidos grasos libres y a los ácidos biliares secundarios mediante la formación de jabones y reduce el efecto de irritación local de estos ácidos en el colon.

En particular, el ácido desoxicólico (ADC), que produce epiteliolisis en la superficie epitelial del colon, se considera el más carcinogénico y mitogénico de los ácidos biliares secundarios (15). La epiteliolisis induce una potente proliferación de las criptas, probablemente como resultado de la exposición de la membrana basal. En la fase activada (fase S), las células son más sensibles a carcinógenos como el ADC, los ácidos grasos libres, etc. (16). In vivo, el efecto prejudicial de 5 mM de ADC se puede prevenir mediante el incremento de la concentración de Ca en la luz intestinal desde 0 a 4 mM.

En varios casos, los resultados de estudios de casos y controles y de estudios de cohortes han mostrado una correlación significativa entre un alto nivel de calcio en la dieta y una reducción del riesgo de desarrollar CCR. Sin embargo, los resultados no carecen de ambigüedad, aunque grandes volúmenes de datos procedentes de estudios experimentales animales apuntan en la misma dirección (14). En un estudio prospectivo se muestra una reducción significativa de la tasa de recurrencia de pólipos y un incremento significativo de la supervivencia relacionada con el cáncer tras cirugía CCR a complementos de calcio (carbonato cálcico 2 g/día (17).

Todavía se considera a la formación de jabones cálcicos insolubles como el mecanismo más importante de la acción preventiva del cáncer del calcio, aunque en los últimos años el centro de atención se ha ido dirigiendo de forma creciente al papel fundamental del calcio en la transducción de señal intracelular. El calcio es un factor clave en el mantenimiento de la función normal de la membrana celular y el flujo de calcio a través de la membrana celular desempeña un papel crucial en la mediación de la transducción de señal intracelular, que regula muchas funciones celulares. Además, la expresión de cadherinas de superficie celular, que son necesarias para mantener el contacto intercelular, depende de la presencia de calcio. En particular, sobre las células de cáncer de colon la expresión de cadherinas se correlaciona con la velocidad de diferenciación y con el resultado clínico (19).

La reducción de la concentración de calcio en el líquido intercelular disminuye la respuesta celular a los factores reguladores del crecimiento y reduce la permeabilidad de las membranas celulares. Cuando la concentración de calcio disminuye, las velocidades de proliferación y desdiferenciación aumentan.

El calcio contribuye a la regulación de todas las fases de división celular y de diferenciación celular, sobre todo a través de la activación de varias proteína quinasas (quinada dependiente de AMPc, proteína quinasas dependientes de Ca-calmodulina, proteína quinasa C) (20, 21). El calcio suprime la ornitina descarboxilasa, una enzima de estimulación tumoral (14) y reduce el número de mutaciones K-ras en el epitelio del colon estimulado con el carcinógeno 1,2-dimetilhidrazina (22). Las mutaciones K-ras son uno de los cambios genómicos tempranos que se producen en la carcinogénesis. Las mutaciones K-ras se producen en aproximadamente el 85 por ciento de los adenocarcinomas y en aproximadamente el 55 por ciento de adenomas, aunque las mutaciones ras existen incluso en hasta un 50 por ciento de FCA.

Los valores elevados de calcio producen un incremento de la diferenciación de las células epiteliales con una supresión simultánea del crecimiento, aunque las células epiteliales colónicas neoplásicas posiblemente pierden su respuesta al calcio en una de las últimas etapas de la secuencia epitelio-carcinoma (16).

La estimulación con carcinógenos en la etapa preneoplásica produce la proliferación luminal de las células en proliferación de las criptas colónicas, un aumento del índice de proliferación y un incremento de la incidencia de FCA, que también se observa en individuos con un riesgo elevado de presentar cáncer de colon (pacientes con HNPCC y FCA). Al administrar calcio, las células de las criptas se pueden convertir a un índice de proliferación normal y una distribución geográfica normal de las células que no están en división en los dos tercios luminales de las criptas y de las células en proliferación en el fondo de las criptas (23).

Montoya R. D. y col., "Chemoprevention of gastrointestinal cancer". CANCER AND METASTASIS REVIEWS (1997) 16/3 (405-419) describen varios compuestos usados para la prevención del cáncer de colon. No se menciona a la vitamina D_{3} y la referencia al calcio está relacionada con la teoría referente a la formación de jabones cálcicos insolubles.

En el documento WO 96 41645 se describe el uso de inhibidores de la COX_{2} par usar en el tratamiento de la inflamación.

Pence B C y col.: Experimental chemoprevention of colon carcinogenesis by combined calcium and aspirin (Resumen presentado en una reunión), Proc. Annu Meet AM Assoc Cancer Res (1994). Vol 35, página A3719. ISSN: 0197-016X describen que la carga tumoral fue la menor en los grupos tratados con Ca o ASA sólo durante la estimulación. La complementación durante la progresión fue menos eficaz.

Sokoloski, John A. y col.: Introduction of the differentiation of HL-I60 romyelocytic leukemia cells by nonsteroideal anti-inflammatory agents in combination with low levels of Vit D_{3}; Leuk. Res (1998), 22(2), 153-161, 1998. En este artículo se describe que la D_{3} posee un efecto creciente sobre los AINE, sin embargo sólo los derivados con propiedades de unión al receptor poseen este efecto y no los análogos de D_{3} sin efecto de unión al receptor y con el efecto creciente del Ca posee este efecto creciente sobre los AINE. El estudio se lleva a cabo con células de leucemia.

Carcinogénesis colorrectal y vitamina D_{3}

La vitamina D_{3} (D_{3}) aumenta el calcio sérico estimulando la absorción de calcio y fosfato en el canal intestinal y movilizando el calcio de los huesos. La D_{3} está presente en los alimentos; se forma mediante radiación ultravioleta del 7-deshidrocolesteroil, una provitamina presente en la piel humana y en los tejidos rasos de muchos animales. La D_{3} se metaboliza a través de sucesivas hidroxilaciones, en primer lugar en el hígado, a 25-hidroxicolecalciferol, y después en los riñones a 1,25-dihidroxicolecalciferol (1,25 DHC) 0 24,25DHC, que son los metabolitos activos a nivel hormonal de D3 (1,25DHC> 24,25DHC).

Además de su efecto antioxidante, el 1,25DHC se asemeja a las hormonas esteroideas en su estructura química y mecanismo de acción, dado que la 1,25DHC atraviesa la membrana celular y se une a una proteína receptora citoplásmica específica. Este complejo hormona-receptor se activa durante la traslocación al núcleo de la célula, donde se une a ADN e inicia la transcripción del ARNm y la síntesis de proteínas. En la membrana del núcleo hay receptores del 1,25DHC (receptores nucleares de vitamina D de alta afinidad, VDR), que contribuyen a la regulación del flujo de calcio a través de las membranas celulares (17).

El 1,25DHC modula la transducción de señal, inhibe la proliferación y la síntesis de ADN, modula la expresión d los oncogenes c-myc, c-fos y c-jun, induce la diferenciación y presumiblemente la apoptosis. Se han identificado VDR en mucosa colónica normal y en carcinomas colorrectales (24). El 1,25 DHC aumenta el calcio intracelular y estimula diversas proteína quinasas. El 1,25 DHC estimula la transcripción del gen de la calbindina D en los colonocitos, que se cree que incrementa la absorción transcelular de calcio.

En los colonocitos neoplásicos tiene lugar un potente incremento de los VDR (300-400 por ciento); esto se puede interpretar como una respuesta adaptativa al crecimiento de células tumorales mediante la cual la célula incrementa su potencial de diferenciación. Esta respuesta desaparece en etapas más avanzadas de la enfermedad (>T3), en las que se supone que el mecanismo de defensa de la vitamina D se inactiva (25).

In vitro, el 1,25DHC inhibe el crecimiento de líneas celulares de cáncer de colon humano (LoVo), incluidas las líneas celulares productoras de CEA. In vivo ( en ratones), el 1,25DHC puede suprimir el crecimiento de xenoinjertos sólidos humanos (17, 26). En algunos estudios con cohortes de poblaciones humanas se ha mostrado una reducción significativa del riesgo de presentar cáncer colorrectal tras la ingesta de vitamina D_{3} (o de su metabolito activo, 1,25DHC), lo que tiene como resultado concentraciones séricas por encima de 20 ng/ml (6,7).

El ADR de la vitamina D_{3} es de 10 \mug/día en mujeres ancianas sin sustitución de estrógenos (6,7,27). La dosis recomendada de 1,25DHC es 0,01 \mug/kg de PC tres veces a la semana. En estudios de osteoporosis, se ha mostrado que 0,75 \mug/día inducen hipercalcemia.

Las nuevas preparaciones de análogos sintéticos de la vitamina D_{3} poseen 100-200 veces el efecto antiproliferativo y el efecto sobre la diferenciación y sólo 0,5 veces el efecto hipercalcémico del 1,25DHC.

En 1994 se iniciaron dos estudios patrocinados por el NCI-CB con 0,25 \mug de 1,25 DHC 0 400 UI de D_{3} y 1500 mg de carbonato cálcico.

A partir de estudios del recambio mineral óseo se sabe que la vitamina D y el calcio son factores mutuamente dependientes, algo que se ha probado que también es el caso en la regulación de la división celular y la diferenciación celular.

Carcinogénesis colorrectal e inhibidores de la ciclooxigenasa (ácido acetilsalicílico (ASA) y otros AINE) y CCR

Se ha investigado el efecto regulador de los inhibidores de la ciclooxigenasa (inhibidores de la COX) sobre el epitelio del colon junto con el tratamiento de enfermedades intestinales inflamatorias crónicas y FAP. No se ha identificado un efecto preventivo del cáncer de los inhibidores de la COX al detalle a nivel de la biología molecular, aunque se considera que está relacionado con el impacto de estos fármacos sobre el metabolismo del ácido araquidónico y la síntesis de prostaglandinas a través del bloqueo de las enzimas ciclooxigenasa (COX).

Se han identificado dos formas isoméricas: COX_{1} y COX_{2}:

La COX_{1} es la forma constitutiva. En el tracto gastrointestinal superior afecta a la protección de la mucosa mediante la inducción de secreción de bicarbonato y producción de mucina sobre todo a través de la prostaglandina E (PGE), que es el producto dominante a nivel cuantitativo del recambio de ácido araquidónico mediante la COX_{1}. La COX_{2} es una forma inducible. Se induce, en particular, mediante estímulos inflamatorios y cataliza la formación de citoquinas proinflamatorias, incluidas la PGE_{2} y la PGF_{\alpha}, que refuerzan el efecto mutagénico de la carcinogénesis mediante inducción
de la proliferación, supresión del sistema inmunitario y estimulación de la angiogénesis. La PGE_{2} ejerce su efecto inhibidor a través de una retroalimentación negativa de la proliferación de células T y la producción de linfoquinas.

El ácido araquidónico (AA, ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico) se origina del recambio celular de los fosfolípidos (PL) que se localizan en la membrana celular. El AA principalmente se libera de los PL mediante hidrólisis del enlace éster que une el AA al PL. En la mayoría de los tipos de células, esto se produce mediante activación directa de la enzima fosfolipasa A2. La actividad fosfolipasa A2 constituye el factor común regulador de la velocidad de liberación de AA y, por tanto, de la velocidad de producción para todos los eicosanoides (PG, prostaciclinas, tromboxanos y leucotrienos).

El AA se metaboliza en eicosanoides a través de la vía de la COX, que estimula la división celular, como se ha observado en trastornos inflamatorios, o a través de la vía de la lipoxigenasa en hidroperóxidos (HPETE) y compuestos hidroxi (HETE). La tercera ruta para el metabolismo del ácido araquidónico es la vía del citocromo P450 en HETE y EET (ácido epoxieicosatriénico). Se ha mostrado que el bloqueo de la actividad lipoxigenasa inhibe la proliferación de células tumorales en el colon inducida por factores de crecimiento (28).

EL inhibidor de la COX ASA (aspirina y otros) y su metabolito el salicilato bloquean la formación de PG a partir de AA mediante acetilación irreversible de la COX (29), impidiendo el acceso del AA a la parte activa de la enzima. La actividad COS sólo puede restablecerse mediante la producción de nuevas moléculas de COX, y por tanto las células carentes de síntesis proteica, como las plaquetas, no son capaces de retomar la actividad COX. Se ha considerado que el principal efecto quimiopreventivo del ASA es la inhibición de la COX_{2} (30), que tiene como resultado la metabolización del AA a través de la vía de la lipoxigenasa a 15-HETE (leucotrieno con efectos antiinflamatorios y antimitogénicos).

La mayoría de los AINE (piroxicam, sulindac e indometacina) bloquea la COX de forma reversible y dependiente de la dosis, por tanto el ASA es un inhibidor más potente de las PG. Como parece desprenderse de lo anterior, existen diversos mecanismos de acción y la cascada de las PG también depende del sistema de transducción de señal regulado por calcio (21).

Varios carcinógenos típicos se usan como donantes de electrones durante la reacción de la COX y se activan mediante esta reacción (afinidad elevada por ADN). Entre ellos se encuentran los hidrocarburos aromáticos policíclicos, las aflatoxinas, los pesticidas halogenados, las aminas aromáticas y los compuestos de fenol. Por tanto, la COX activa posibles carcinógenos en metabolitos activos perjudiciales para el ADN.

En estudios in vitro se muestra que la mayoría de los AINE poseen un efecto antiproliferativo sobre líneas celulares de cáncer de colon humano (Ht-29, SW-80, DLD-1) (31).

En estudios in vitro también se muestra que aunque se elimina el efecto de los AINE sobre la síntesis de PG (por ejemplo mediante el uso de metabolitos de sulindac sin inhibición de la COX), el crecimiento de líneas celulares de cáncer de colon humano se inhibe de todas formas. Esto apunta a la existencia de varios mecanismos de acción, incluidos la capacidad de inducir significativamente apoptosis (28, 32) y la modulación del flujo transmembrana de calcio y las uniones intercelulares (33).

Se ha mostrado que los AINE inhiben varias endonucleasas; éstas son enzimas que escinden moléculas de ADN. Presumiblemente desempeñan un papel crucial en la inestabilidad genómica, que es una de las características de la carcinogénesis colorrectal de múltiples etapas (32). Otros mecanismos de biología molecular se analizan con detalle en (35).

Un punto interesante es que, al contrario que otros AINE, se ha mostrado que el ASA inhibe la proliferación y la formación luminal en células cocultivadas epiteliales de colon normal (células de carcinoma en el compartimento 2). Esto se toma como una expresión de la inhibición de las señales estimuladoras del crecimiento de las células de carcinoma. Otras áreas en las que el ASA difiere de otros AINE son la inhibición irreversible de la COX, menor unión plasmática (aproximadamente un 50 por ciento en comparación con aproximadamente un 90 por ciento).

Se ha descubierto que las neoplasias colorrectales humanas, tanto adenomas como adenocarcinomas, producen grandes cantidades de PG, en especial del tipo E (31, 36) y precisamente se ha descubierto que la actividad COX_{2} está acentuada de 2 a 50 veces más en el 85-90 por ciento de los carcinomas colorrectales (35). En particular, se cree que la pérdida APC de heterozigocidad (LOH) estimula la expresión de COX_{2} en una etapa temprana del desarrollo neoplásico en células tanto epiteliales como estromales. Sin embargo, puede ser precisamente la actividad de COX_{1} estromal la que estimula la expresión de varios factores angiogenéticos (VEGF, Bfgf y TGF_{\beta 1}).

Otros efectos proneoplásicos de la COX son el cambio de TGF-beta desde un factor antiproliferativo a un factor de crecimiento proproliferativo y una reducción de la comunicación/contacto intercelular y célula-estroma, lo que estimula la angiogénesis y la metástasis. Estas propiedades de la COX sugieren que las inhibiciones de ambas isoformas pueden ejercer efectos importantes contra el CCR (38).

En si mismo, uno de los tres dominios de la molécula de COX (Dominio COX, dominio EGF y motivo de unión a la membrana) se asemeja al factor de crecimiento epidérmico (el ligando del receptor del EGF es también TGF\alpha). Por esta razón, una posible activación de todo el dominio sería interesante al intentar conseguir una profilaxis óptima.

El inhibidor de la COX ASA (Aspirina y otros) y su metabolito el salicilato bloquean la formación de PG a partir de AA mediante acetilación irreversible de la COX (37), impidiendo el acceso del AA a la parte activa de la enzima. La actividad de la COX sólo puede restablecerse mediante la producción de nuevas moléculas de COS, y por tanto células carentes de síntesis proteica, como las plaquetas, no son capaces de retomar la actividad COX. Se ha considerado que el principal efecto quimiopreventivo del ASA es la inhibición de la COX_{2} (38), que tiene como resultado la metabolización del AA a través de la vía de la lipoxigenasa a 15-HETE (leucotrieno con efectos antiinflamatorios y antimitogénicos).

La mayoría de los AINE (piroxicam, sulindac e indometacina) bloquea la COX de forma reversible y dependiente de la dosis, por tanto el ASA es un inhibidor más potente de las PG. Como parece desprenderse de lo anterior, existen diversos mecanismos de acción y la cascada de las PG también depende del sistema de transducción de señal regulado por calcio (21).

En varios estudios epidemiológicos de importancia de inhibidores de la COX en forma de estudios con cohortes, varios estudios de casos y controles y prospectivos intervencionistas se ha mostrado un efecto preventivo significativo (reducción del riesgo relativo del 40-50 por ciento), en particular del ASA, sobre el CCR tras el tratamiento a largo plazo (de 2 a 10 años) en las dosis usadas para prevenir la enfermedad cardíaca isquémica (11-13, 39-42). En una cohorte de pacientes con colitis ulcerosa se ha descubierto una reducción del riesgo relativo de 0,38 (0,2 a 0,7) después de sólo 3 meses de tratamiento con sulfasalazina.

En ensayos con animales se ha podido demostrar un efecto protector significativo (50-60 por ciento) de, por ejemplo, indometacina y piroxicam en ratas expuestas al carcinógeno dimetilnitrosamina o azoximetano (metilazoximetanol) (43-46).

Los efectos no deseados más frecuentes relacionados con la administración a largo plazo de AINE son ulceración gastroduodenal y hemorragia causados por niveles bajos de PG y del tromboxano A_{2} en el tracto gastrointestinal. La PG estimula la producción de mucina y la secreción de bicarbonato, y el tromboxano A_{2} indica agregación plaquetaria. Estas complicaciones están relacionadas principalmente con la inhibición de la enzima COX_{1} constitutiva.

Los efectos y complicaciones no deseados se relacionan principalmente con el uso de AINE como analgésicos o antiinflamatorios a dosis significativamente elevadas, aunque también se han observado secuelas potenciales tras el uso a largo plazo también a dosis bajas.

En una revisión de 16 estudios con cohortes y estudios de casos y controles se mostró que el riesgo de desarrollar efectos gastrointestinales no deseados inducidos por los AINE llega hasta el 2-4 por ciento al año a dosis diarias analgésicas y antiinflamatorias (14). En la profilaxis de la enfermedad cardiovascular con dosis bajas de aspirina, se encontró una reducción del riesgo relativo en relación con el ictus, el infarto agudo de miocardio y/o la muerte cardiovascular de aproximadamente un 25% (47).

En el Physicians'Health Study (325 mg de ácido acetilsalicílico a días alternos) se descubrió que, además de una reducción significativa del riesgo de infarto agudo de miocardio, se observaron significativamente más casos de melena y epistaxis que en el grupo de placebo, pero no de hemorragia cerebral ni de hemorragia gastrointestinal inespecífica (incluida hematemesis) (39).

Existen numerosos datos sobre la farmacocinética y la toxicidad de los inhibidores de la COX, en especial en lo que se refiere al ASA. La FDA ha encontrado que el ácido acetilsalicílico, por ejemplo, es un agente antiinflamatorio y analgésico seguro y eficaz y adecuado para ventas de medicamentos sin receta. No son necesarios más estudios toxicológicos para valorar el uso del ácido acetilsalicílico en la quimioprevención (48-49).

Dwerryhouse y col. (53) describen la influencia positiva de la ingesta de calcio/vitamina D_{3} sobre el CCR. Se identifica al 1,25-dihidroxicolecalciferol cono el metabolito activo de la vitamina D_{3}. En este documento también se menciona el efecto beneficioso de la aspirina en la prevención del CCR.

La patente US-5770215 está dirigida a composiciones multivitamínicas para la inhibición de oclusiones vasculares. Se describen composiciones que contienen vitaminas, una sustancia inhibidora de la oclusión vascular, preferentemente ASA, y minerales. Las vitaminas incluyen vitamina D_{3} y los minerales incluyen calcio. Se menciona la utilidad para tratar y prevenir una amplia variedad de enfermedades, en la que también se incluye la reducción del peligro de
CCR.

Pence y col. (54) describen los resultados de pruebas de un modelo de cáncer de colon inducido por azoximetano en ratas. El calcio resultó ser un agente quimiopreventivo más eficaz que el ASA en la carcinogénesis de colon estimulada por ácido cólico. En este estudio el ASA carecía de ningún efecto protector de importancia.

La carcinogénesis del cáncer colorrectal implica una serie de cambios genéticos y factores epigenéticos tales como la expresión incrementada de factores de crecimiento y la supresión de inhibidores del crecimiento, lo que no necesariamente implica mutaciones subyacentes (pero que, por ejemplo, se producen a una mayor expresión de COX). Los datos procedentes de estudios epidemiológicos y ensayos con animales muestran que la vitamina D_{3} y el calcio pueden ser farmacológicamente activos cuando se usan como quimioprofilaxis de CCR. Sin embargo, el efecto es moderado. En algunos estudios epidemiológicos en poblaciones humanas se indica una reducción (del 40 al 50 por ciento) del riesgo relativo de cáncer en poblaciones que usan ASA de forma continua; sin embargo, no hay consenso acerca de la dosis y la duración del tratamiento. La reducción del riesgo en relación con el CCR podría ser dos veces la reducción del riesgo de episodios cardiovasculares.

Breve descripción de la invención

No existen estudios prospectivos, randomizados, a doble ciego. Los estudios de quimioprofilaxis del cáncer son extremadamente caros, ya que obligatoriamente tienen que incluir un número elevado de individuos y llevarse a cabo durante años, si los criterios de valoración son cáncer invasivo y mortalidad relacionada con cáncer. Por estas razones existe una tendencia creciente hacia los estudios epidemiológicos de criterios de valoración intermedios (por ejemplo, pólipos, FCA, etc.), ensayos animales de poblaciones animales sometidos a ingeniería genética o estimulados carcinogénicamente y modelos biológicos para analizar diferentes marcadores biológicos (mutaciones, factores de crecimiento, etc.).

Según la presente invención, el efecto preventivo de CCR de la siguiente combinación de preparaciones se manifiesta por sí mismo mediante una reducción significativa de la incidencia y de la morbilidad y la mortalidad global del cáncer colorrectal. Sin embargo, para alcanzar este efecto, se cree que es importante tomar la preparación de forma consistente como profilaxis durante un periodo de tiempo prolongado (probablemente más de un año), exactamente como para la prevención de enfermedad cardíaca isquémica y osteoporosis.

Mediante la combinación de ASA con 1,25 DHC con calcio se consigue un efecto sinérgico, de forma que presumiblemente se reducen las cantidades de los fármacos individuales y, por tanto, la toxicidad se reduce a un nivel insignificante.

Según la presente invención, se puede obtener un efecto sorprendente mediante una combinación de dosis que comprende fármacos individuales que ejercen su efecto sobre áreas específicas de la carcinogénesis: modificación de la transducción de señal y expresión de oncogenes, reducción del impacto carcinogénico sobre el epitelio colónico y la transducción de señal intracelular e intercelular, inhibición de la COX y probablemente apoptosis.

En una forma de realización preferida, el ser humano que se va a tratar es un paciente que a causa de una enfermedad subyacente o de un defecto genético se encuentra en riesgo de desarrollar cáncer colorrectal, tal como: pacientes HNPCC, pacientes con pólipos, pacientes con antecedentes de CCR. Además, individuos de más de 50 años de edad que son parientes en primer grado de pacientes con cáncer colorrectal (riesgo de presentar CCR de 2 a 4 veces mayor (12 a 25 por ciento).

Para los parientes de primer grado de individuos con CCR diagnosticado antes de los 50 años de edad o para los individuos con dos parientes de primer grado con CCR, el riesgo aumenta hasta de 4 a 6 veces (24 a 36 por ciento) con independencia de la edad.

Para los portadores de mutaciones HNPCC, el riesgo de CCR es del 75 por ciento a la edad de 65 años y el riesgo de cáncer metacronoso es de 45 por ciento diez años después de la resección del tumor primario.

Para los pacientes con enfermedades intestinales inflamatorias crónicas (colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), el riesgo aumenta de 4 a 25 veces (riesgo durante la vida del 12-75 por ciento en pacientes no tratados con cirugía tras más de diez años de enfermedad) en función de la diseminación y la duración de la enfermedad.

En consecuencia, el uso según la presente invención es en una forma de realización preferida adecuada en la que el ser humano se selecciona del grupo en riesgo de desarrollar cáncer colorrectal a causa de ser un pariente de primer grado de un paciente con cáncer colorrectal y/o porta el/los gen(es) del cáncer colorrectal no poliposis hereditario (HNPCC) y/o tiene poliposis adenomatosa familiar, adenomas colorrectales y/o un enfermedad intestinal inflamatoria tal como colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.

Las preparaciones podrían combinarse como sigue:

500 mg de calcio (Carbonato cálcico 1250 mg) y/o

0,5 \mug de 1,25 DHC (o 400 UI de vitamina D_{3}, o un análogo de D_{3}, 0,25 \mug de calcitriol o 0,005 \mug de calcitriol/kg de PC) y

75 mg de ASA o un inhibidor análogo reversible o irreversible de la COX_{2}.

Los principales requerimientos para una preparación designada para quimioprofilaxis incluyen; precio bajo, cumplimiento elevado y toxicidad ultrabaja; se supone que mediante la adición de 1,25 DHC y calcio, la cantidad de inhibidor de COX (ASA) se puede reducir, de forma que los efectos no deseados relacionados con el ASA se pueden reducir hasta un nivel insignificante sin reducir su acción. Para el ácido acetilsalicílico, los efectos no deseados tras el uso a largo plazo han hecho que la FDA vacile antes de aprobar al ácido acetilsalicílico como quimioprofilaxis del CCR.

Las preparaciones con acción específica en el colon, tales como, por ejemplo, 5-ASA, pueden resultar adecuadas, posiblemente en combinación con agentes protectores de la mucosa.

EL ASA y otros AINE están aprobados para ventas sin receta para uso analgésico y antiinflamatorio. De igual forma, las preparaciones de combinación que contienen D_{3} y calcio (por ejemplo 1250 mg de carbonato cálcico= 500 mg
de calcio + UI de D_{3}) se venden como productos de venta sin receta para la profilaxis de la osteoporosis.

Al principio, los estudios in vivo del efecto de lo anterior se han llevado a cabo en forma de experimentos animales con el Instituto de Toxicología de la Administración Danesa de Veterinaria y Alimentación (DVFA). Los resultados de los estudios se muestran en la Tabla 1.

Descripción detallada de la invención

En una forma de realización, la invención se refiere a la reducción de la dosis eficaz de ASA en un tratamiento quimioprofiláctico del cáncer colorrectal en un ser humano mediante la coadministración con una dosis inocua de 1,25 DHC y Ca en forma de una dosis de combinación. Esto se debe al hecho de que sorprendentemente se ha mostrado que la adición de 1,25 DHC y calcio puede disminuir la dosis necesaria de ácido acetilsalicílico con el fin de reducir la formación de focos crípticos aberrantes en un modelo de ratas, tanto en relación con el tamaño como con el número. En consecuencia, la invención también se refiere a la prevención del inicio y/o la progresión de cáncer colorrectal en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una dosis de combinación de ASA, 1,25 DHC y calcio.

Por prevención y efecto quimioprofiláctico se quiere decir prevención de cáncer colorrectal o el inicio y/o la progresión del cáncer colorrectal y/o el efecto de reducir la formación de trastornos que son premalignos de cáncer colorrectal.

Según la presente invención, se cree que la administración de la dosis de combinación debería administrarse con regularidad, con una dosis diaria media de ASA en e intervalo de 50 mg a 500 mg, preferentemente en el intervalo de 25 a 400 mg, más preferentemente en el intervalo de 50 a 300 mg, todavía más preferentemente en el intervalo de 75 a 150 mg, tal como en el intervalo de 75 a 100 mg.

La dosis de combinación además comprende el metabolito de la vitamina D_{3} 1,25-dihidroxicolecalciferol en el intervalo de 0,1 microgramos a 2 microgramos. El calcio en la dosis de combinación puede estar preferentemente en el intervalo de 200 mg a 3500 mg, tal como el calcio está en el intervalo de 250 mg a 3000 mg, tal como en el intervalo de 300 mg a 2500 mg, preferentemente en el intervalo de 400 a 2000 mg, más preferentemente en el intervalo de 500 a 1000 mg, tal como 750 mg.

Como se ha mencionado anteriormente, el tratamiento o prevención debería continuar durante un periodo prolongado, con el fin de proporcionar el mejor efecto, sin embargo se cree que se puede obtener un efecto beneficioso tras un tratamiento de al menos 3 meses. En consecuencia, la administración preferentemente continúa durante al menos 6 meses, tal como durante al menos 1 año, preferentemente durante al menos 2 años. Sin embargo, las personas con riesgo elevado pueden tratarse según la presente invención durante el resto de sus vidas.

En un aspecto importante, la administración de la dosis de combinación puede tener como resultado la prevención del inicio o la progresión de cáncer colorrectal superando el efecto de la administración de cualquiera de los ingredientes por separado a la misma dosis diaria y en el mismo periodo.

En el uso según la invención, la dosis de combinación tiene un efecto preventivo que es sinérgico en comparación con el efecto de los ingredientes eficaces individuales.

Se puede calcular un efecto aditivo según la invención como un efecto de la suma de la prevención por cada una de las sustancias ASA, vitamina D_{3} y CA, respectivamente, o mediante un efecto de la suma de la prevención mediante la selección de dos de las sustancias ASA, vitamina D_{3} y calcio y el efecto preventivo por la sustancia
restante.

Por efecto sinérgico según la presente invención se quiere decir, preferentemente, un efecto que es superior al efecto aditivo como se ha descrito antes. Una referencia adecuada para el cálculo se describe en el Ejemplo 1 en el que se describe un estudio de la formación de focos crípticos aberrantes en colon de rata inducido.

El inhibidor de la COX puede ser uno cualquiera que actúe sobre uno o más de los mecanismos seleccionados de entre acetilación reversible o irreversible de la COX_{1}, acetilación reversible o irreversible de la COX_{2}, inhibición de la angiogénesis, inhibición del metabolismo del ácido araquidónico, bloqueo del metabolismo del AA, inhibición de la estimulación de la estimulación de la proliferación producida por le Factor de crecimiento epidérmico y estimulación de la apoptosis. El inhibidor de la COX es el ASA. La vitamina D_{3} es 1,25-dihidroxicolecalciferol.

Preferentemente, el ASA actúa a través de uno o más de los siguientes mecanismos:

inhibición de la proliferación celular;

inhibición de la regulación por incremento de agentes pro-proliferativos tales como factores de crecimiento;

modulación de la transducción de la señal; e

inducción de apoptosis.

Asimismo, la inhibición de la angiogénesis, la inhibición del metabolismo del ácido araquidónico pueden ser el objetivo del ASA.

En otro aspecto más, el inhibidor de la ciclooxigenasa actúa mediante la disminución de la formación de potenciales carcinógenos en metabolitos perjudiciales para el ADN.

La vitamina 1,25 DHC actúa preferentemente a través de uno o más de los siguientes mecanismos: inhibición de la proliferación celular; inhibición de la síntesis de ADN, modulación de la transducción de la señal; inducción de diferenciación e inducción de apoptosis.

El mecanismo activo del calcio es según la presente invención preferiblemente un efecto sobre la expresión de cadherinas de superficie celular y transmisión de señal intra y extracelular.

Un aspecto muy importante de la presente invención es el hallazgo de que el uso puede reducir el riesgo de desarrollar cáncer colorrectal en el ser humano individual que está recibiendo el tratamiento en al menos un 10% o más en comparación con el efecto obtenido con cualquiera de los ingredientes por separado a la misma dosis y en el mismo periodo de administración. La reducción puede ser de al menos un 20% o más y, en ciertas circunstancias, por ejemplo para pacientes con riesgo elevado, puede ser de incluso un 30% o más.

El efecto se puede medir como se ha descrito en el ejemplo mediante el número de focos crípticos aberrantes en ratas estimuladas con AOM a las que se administra la dosis de combinación.

La dosis de combinación según la invención es la dosis de combinación que comprende ASA, 1,25 DHC y Ca y esos ingredientes son fármacos bien conocidos.

En otra forma de realización más, la invención se refiere al uso de ASA, 1,25 DHC y calcio junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento para prevenir el inicio y/o la progresión del cáncer colorrectal en un ser humano. En una forma de realización preferida, el medicamento está en forma de una dosis de combinación que comprende el ASA, el 1,25 DHC y el calcio.

El uso puede ser de acuerdo con cualquiera de los usos descritos antes y en otra forma de realización más, la invención se refiere a cualquier medicamento farmacéutico de ellos. El medicamento farmacéutico puede comprender de acuerdo con esto una combinación de inhibidor de la ciclooxigenasa (COX), una vitamina D_{3}, incluidos análogos y metabolitos de los mismos, y/o calcio. En otro aspecto, el medicamento farmacéutico es un medicamento tal como cualquiera de las dosis de combinación administradas de acuerdo con cualquiera de los usos descritos anteriormente.

En consecuencia, otro aspecto de la invención se refiere al uso de un inhibidor de la ciclooxigenasa (COX), una vitamina D_{3}, incluidos análogos y metabolitos de los mismos, y calcio junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento para prevenir el inicio y/o la progresión del cáncer colorrectal en un ser humano.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un medicamento farmacéutico que comprenda una combinación de inhibidor de la ciclooxigenasa (COX), una vitamina D_{3}, incluidos análogos y metabolitos de los mismos, y calcio en una dosis de combinación junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

EL medicamento farmacéutico según la invención es, preferentemente, un medicamento en el que la dosis de combinación comprende el metabolito de la vitamina D_{3} 1,25.dihidroxicolecalciferol en el intervalo de 0,1 \mug a 2 \mug, tal como en el intervalo de 0,2 \mu a 1,5 \mug, preferentemente en el intervalo de 0,3 a 1 \mug, más preferentemente en el intervalo de 0,4 \mug a 0,75 \mug, tal como 0,5 \mug.

En otra forma de realización, el medicamento farmacéutico es uno en el que la dosis de combinación comprende calcio en el intervalo de 200 mg a 3000 mg, tal como en el intervalo de 300 mg a 2500 mg, preferible en el intervalo de 400 a 2000 mg, más preferible en el intervalo de 500 a 1000 mg, tal como 750 mg.

En una forma de realización preferida, el medicamento farmacéutico según la invención es en el que la dosis de combinación comprende ASA en el intervalo de 50 mg a 500 mg, preferentemente en el intervalo de 25 a 400 mg, más preferentemente en el intervalo de 50 a 300 mg, todavía más preferido en el intervalo de 75 a 150 mg tal como en el intervalo de 75 a 100 mg. El medicamento más preferido comprende de 50 a 75 mg de ASA, 500-1000 mg de Ca y 0,5 a 1 \mug de 25 hidroxicolecalciferol.

Por dosis según la presente invención se quiere decir dosis individuales, por ejemplo en un paquete o una entidad física de uno o más de los ingredientes. La dosis de combinación también puede comprender diferentes inhibidores de la COX así como distintos análogos y/o metabolitos de la vitamina D_{3}.

En consecuencia, en una forma de realización preferida, la farmacéutica es una farmacéutica que comprende los tres ingredientes con el fin de asegurar la correcta dosis individual y el cumplimiento por parte del paciente.

Los inhibidores de la COX según la invención, además del ASA, incluyen otros AINE conocidos en la técnica.

Ejemplo 1

Influencia del 1\alpha,25(OH)_{2}-vitamina D_{3}, el calcio y el ácido acetilsalicílico sobre focos crípticos aberrantes inducidos por AOM y tumores colorrectales en colon de ratón.

Materiales y procedimientos Animales

Las 128 ratas macho F344/Mol, SPS (F344/Ntac@Mol) de tres a cuatro semanas de edad se adquirieron en M & B (LI. Skensved, Dinamarca).

Dietas

Todos los grupos de ratas recibieron dieta purificada en polvo. Las cantidades de 1\alpha,25(OH)_{2}-vitamina D_{3}, calcio y ácido acetilsalicílico en la dieta para cada grupo se presentan en la tabla 1.

Productos químicos

El azoximetano (AOM) se obtuvo de Sigma Chemical (St. Louis, MO). El \alpha,25(OH)_{2}-vitamina D_{3} fue proporcionado por Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Dinamarca. El ácido acetilsalicílico (ASA) se obtuvo de Nycomed Danmark A/S.

Enjaulamiento

Los animales se enjaularon en jaulas de plástico desechables con un suelo insertado de malla de acero, dos animales por jaula, en aislamientos peliculares flexibles (Isotec 12134, Olac, Oxford, RU) durante el periodo de dosificación, y una semana tras la interrupción de la dosis con AOM. Durante el resto del periodo del estudio, los animales se conservaron en jaulas de alambre de acero inoxidable con dos animales por jaula. Durante el estudio, la temperatura se mantuvo a 21 \pm 1ºC, una humedad relativa a 55 \pm 5%, el aire se cambió 10 veces/hora y con luz fluorescente desde las 21:00 a las 9:00.

Diseño experimental

Los animales se asignaron de forma aleatoria a ocho grupos experimentales de 16 animales y se les alimentó con sus respectivas dietas durante 19 días (tabla 1). A continuación, a todos los grupos se administraron dosis de AOM; 15 mg/kg de peso corporal, por vía subcutánea dos veces con una diferencia de una semana. Se mantuvo a los animales con sus dietas respectivas durante un periodo de observación de 16 semanas. Todas la semanas se midieron el peso corporal y el consumo de alimentos y de agua. Al final del estudio, diez animales de cada uno de los grupos 1, 6, 7 y 8 se colocaron por separado en jaulas metabólicas durante 24 horas, Después de lavar con 10 ml de agua, se recogió la orina para determinar el volumen, el pH, los niveles de calcio y de creatinina. Dieciocho semanas después de la primera inyección de AOM; se sacrificó a los animales y se recogió el suero para futuros análisis de ácido acetilsalicílico. Se analizó el abdomen y la cavidad torácica de todos los animales para poner de manifiesto cambios macroscópicos. Se registró el peso de los riñones y de las glándula suprarrenales. Estos órganos, el estómago, el intestino delgado y la glándula tiroides con la paratiroides se conservaron en formaldehído tamponado al 4%, pendientes de su requerimiento posterior para el análisis histopatológico. El intestino grueso se cortó longitudinalmente, se lavó con NaCl al 0,9% y se dividió en dos piezas de igual longitud, se colocó en corcho aglomerado, y se fijó en formaldehído neutro tamponado al 4% frío según (1).

TABLA 1 Esquema de tratamiento

1

Análisis de orina

El análisis de creatinina y calcio se analizaron usando un analizador Combas Mira S usando el kit relevante para cada parámetro (Roche Diagnostic Systems).

Valoración de los FCA

Los FCA se visualizaron mediante tinción de Giemsa, se registraron usando un estereomicroscopio a un aumento x 40 y se agruparon en FCA pequeños (1-3 criptas), medianos (4-6 criptas), grandes (7-9 criptas), extragrandes (\geq 10 criptas) y > 7 (> 7 criptas). Los FCA se distinguieron de las criptas normales según (1).

Valoración de los tumores

Las desviaciones del tejido colónico que se sospechaban que eran tumores según la exploración macroscópica o al estereomicroscopio se incluyeron en parafina, se seccionaron 4-6 \mum y se tiñeron con hematoxilina y eosina para su análisis histopatológico.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como la media \pm ET. Para analizar el peso corporal y el consumo de alimentos y agua se usó un análisis de una vía de la varianza con medidas repetidas en un factor. El análisis se siguió de una prueba de la mínima diferencia significativa si era significativo. Los datos relativos a los pesos de los órganos, el perfil bioquímico en orina y los FCA se analizaron mediante un análisis de una vía de la varianza, seguido por una media de mínimos cuadrados. La homogeneidad de la varianza entre grupos se evaluó mediante el juicio de los gráficos residuales estándar (procedimiento de Modelo Lineal General). Los datos acerca de los animales con tumores se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher. Una p< 0,05 se consideró significativa. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando SAS versión 6,12.

Resultados y comentarios Perfil bioquímico en orina

Se analizaron el volumen de orina, el pH, la concentración de calcio y de creatinina en los grupos 1, 6,7 y 8 (véase la Tabla 2). La concentración de calcio disminuyó de forma estadísticamente significativa en los grupos 6 y 8. También se observó una disminución no significativa en el grupo 7. Es probable que el efecto se deba a la retención renal inducida por 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3} de calcio. El pH del grupo 7 fue estadísticamente significativo superior al valor control. Dado que no se observaron cambios significativos en los grupos 6 y 8, es probable que esto sea fortuito. Los resultados además demuestran que no se observa un efecto secundario del tratamiento de combinación según la invención.

TABLA 2 Perfil bioquímico en orina ^{a}

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a:  Media  \pm  ET\cr  b:   \begin{minipage}[t]{147mm} Grupo 1,
dieta control (5000 ppm Ca); grupo 6, 0,02  \mu g de
1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3} , 300 ppm de ácido
acetilsalicílico y 7500 ppm de Ca en la dieta; grupo 7, 0,02  \mu g
de 1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3} , 300 ppm de ácido
acetilsalicílico y 5000 ppm de Ca en la dieta; grupo 8, 0,02  \mu g
de 1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3} , 300 ppm de ácido
acetilsalicílico y 2500 ppm de Ca en la
dieta.\end{minipage} \cr  *   \begin{minipage}[t]{147mm}
marca la significación estadística con el grupo control cuando se
realizó una prueba de los mínimos cuadrados (p < 0,05).
\end{minipage} \cr}

Peso de los órganos

El peso relativo de los órganos se calculó por 100 g de peso corporal. El peso corporal terminal, el peso absoluto de los riñones y las glándulas suprarrenales y el peso relativo de las glándulas suprarrenales no se ven afectados por el tratamiento. El peso renal relativo de los grupos 5 y 8 se vio aumentado en comparación con el grupo control. Los cambios son menores y no se cree que estén relacionados con el tratamiento.

FCA y tumores

Los FCA son marcadores biológicos intermedios y no los cánceres/tumores fueron los criterios de valoración para este estudio. Sin embargo, numerosos animales desarrollaron tumores durante el ensayo. Según la secuencia adenoma-carcinoma, los tumores representan carcinogénesis de etapa tardía y por tanto se incluyen en los resultados. Los FCA grandes, los FCA extragrandes y los tumores representan lesiones con correlación significativa a cáncer invasivo posterior y a muerte relacionada con el cáncer. El grupo de animales con lesiones que contienen más de siete criptas (FCA> 7) se considera como un grupo de animales de alto riesgo en relación con el desarrollo del cáncer.

El número total y la distribución de FCA y tumores se presentan en la Tabla 3 y el Apéndice 3.

Los animales alimentados con una dieta pobre en calcio de 2500 ppm (similar a una población humana mayor del mundo occidental) fueron más susceptibles al desarrollo de FCA. El incremento de los niveles de calcio en la dieta redujo de forma significativa el número de FCA. En animales alimentados con 7500 ppm de calcio y 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3}, se observó una disminución estadísticamente significativa del número total de FCA en comparación con los grupos 1 y 2 (35,1 frente a 61,7, y 35,1 frente a 88,3, respectivamente). En animales alimentados con 75000 ppm de calcio,1\alpha,25(OH)_{2}D_{3} y ASA una reducción no significativa de los FCA totales en comparación con el grupo 1 (44,6 frente a 61,7).

TABLA 3 Número medio de focos crípticos aberrantes (FCA) o tumores en ratas inducidas con AOM alimentadas con dietas que contenían 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3}, ácido acetilsalicílico y varias dosis de calcio ^{a-b}

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a} :  media  \pm  ET\cr   ^{b} : 
 \begin{minipage}[t]{147mm}focos pequeños: 1-3
criptas; focos medianos: 4-6 criptas; focos grandes:
7-9 criptas; focos extra grandes:  \geq  10 criptas;
FCA> 7: > 7 criptas. \end{minipage} \cr  C: 
 \begin{minipage}[t]{147mm} Grupo 1: grupo control con calcio
normal (5000 ppm de Ca); Grupo 2: grupo control con bajos niveles de
calcio (2500 ppm de Ca); Grupo 3: grupo con suplemento de calcio
(7500 ppm de Ca); Grupo 4: 0,02  \mu g de
1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3}  y 7500 ppm de Ca; Grupo
5: 300 ppm de ácido acetilsalicílico y 7500 ppm de Ca; Grupo 6: 0,02
 \mu g de 1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3} , 300 ppm de
ácido acetilsalicílico y 7500 ppm de Ca; Grupo 7: 0,02  \mu g de
1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3} , 300 ppm de ácido
acetilsalicílico y 5000 ppm de Ca; Grupo 8: 0,02  \mu g de
1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3} , 300 ppm de ácido
acetilsalicílico y 2500 ppm de
Ca.\end{minipage} \cr}

Al comparar el grupo de alto riesgo (FCA> 7) alimentado con la dieta pobre en calcio (2500 ppm) con el grupo de alto riesgo tratado con los tres componentes activos (grupo 6) se observó una reducción muy significativa en el número de lesiones colónicas (FCA> 7) (6,1 frente a 1,8; p= 0,0001).

TABLA A

Procedimiento de los Modelos Lineales Generales Media de mínimos cuadrados

GRUPO: FCA> 7
Medias mínimas cuadradas Número
1	3,20000000	_{1}
2	6,12500000	_{2}
3	2,37500000	_{3}
4	2,56250000	_{4}
5	1,93750000	_{5}
6	1,75000000	_{6}
7	2,93750000	_{7}
8	3,43750000	_{8}

\vskip1.000000\baselineskip

Probabilidad de la MEDIAMC (i): MEDIA MC(j)

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

La adición por separado de calcio, de 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3} o ASA, o de una combinación de dos, también proporcionó reducciones significativas de los FCA, lo que es indicativo de un efecto protector. El efecto más pronunciado se observó con la combinación de los 3 ingredientes, lo que sugiere un efecto aditivo/sinérgico.

En cuanto a las dietas pobres en calcio, el incremento en el número total de FCA en el grupo 8 se debí principalmente a un incremento de los FCA pequeños. Mientras que en el grupo 2, además de un incremento no significativo de los FCA pequeños (p= 0,061), se observaron incrementos estadísticamente significativos de los FCA medianos, grandes y FCA> 7. Esto demuestra que la adición de 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3} y ASA al pienso protege contra la progresión de los FCA pequeños en animales alimentados con un nivel subóptimo de calcio (2500 ppm). Al aumentar el calcio a un nivel superior (5000 ppm) se observa una tendencia evidente (1,8 frente a 3,2, p= 0,19), lo que respalda el efecto anticanceroso del de 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3} y el ASA.

En conclusión, el tratamiento de animales a los que se administra una dieta pobre en calcio con la combinación de de 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3}, Ca y ASA, tiene como resultado una reducción estadísticamente significativa en el desarrollo de lesiones colónicas pre neoplásicas.

Tumores

Se observaron ratas con tumores en todos los grupos (Tabla 4). Los resultados presentados deberían tomarse con precaución, ya que es necesario realizar nuevas pruebas histológicas para la evaluación final. En la autopsia, algunas de las lesiones tenían un aspecto muy prominente y parecidas a un tumor, enrojecidas, elevadas y con un diámetro de uno a quince milímetros. Mientras que otras lesiones eran menos elevadas y tenían el mismo color que la mucosa. Algunos animales presentaban más de un tumor, a menudo de 2 a 3. Otras lesiones sólo se vieron cuando se observó el intestino al estereomicroscopio para contar los FCA. También se observaron tumores en el intestino delgado de un animal de los grupos 1, 5, 7 y 8. En el grupo 2, dos animales presentaban tumores en su intestino delgado (no analizados a nivel histológico). El número más elevado de animales con tumores y del número total de tumores se observaron en los grupos 3 y 4. El grupo 8, que recibió el menor nivel de calcio combinado con ASA y 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3} presentó la menor carga tumoral, seguido por el grupo 1. Al comparar los números de animales con tumores de los grupos 2 y 8 (ambos recibieron el menor nivel de calcio), los resultados indican un efecto protector de la combinación de ASA y 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3}. Una tendencia similar aunque menos pronunciada se observa al comparar los grupos 3 y 6 (ambos recibieron el mayor nivel de calcio).

Los datos de los tumores indican que la combinación de 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3} y ASA administrada a animales alimentados con el nivel alto o bajo de calcio (grupos 6 y 8) tendían a reducir el número de animales con tumores y el número total de tumores al compararlos con el grupo control relevante que recibía el mismo nivel de calcio. Aunque la reducción no era significativa a nivel estadístico, esto indica protección contra la progresión de los FCA a adenomas. Especialmente al nivel menor de calcio, en el que se registró el número total más elevado de FCA pero el menor número de animales con tumores.

TABLA 4 Tumor colorrectal en ratas inducidas con AOM alimentadas con dietas con 1\alpha,25(OH)_{2}D_{3}, ácido acetilsalicílico y varias dosis de calcio; datos preliminares^{a}

\vskip1.000000\baselineskip

5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a} :   \begin{minipage}[t]{148mm}Grupo 1, dieta control
(5000 ppm de Ca); grupo 2, 2500 ppm de Ca en la dieta; grupo 3, 7500
ppm de Ca en la dieta; grupo 4, 0,02  \mu g de
1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3}  en la dieta; grupo 5,
300 ppm de ácido acetilsalicílico y 7500 ppm de Ca en la dieta;
grupo 6, 0,02  \mu g de 1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3} 
en la dieta, 300 ppm de ácido acetilsalicílico y 7500 ppm de Ca en
la dieta; grupo 7, 0,02  \mu g de
1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3}  en la dieta, 300 ppm de
ácido acetilsalicílico y 5000 ppm de Ca en la dieta; grupo 8, 0,02
 \mu g de 1 \alpha ,25(OH) _{2} D _{3}  2500 ppm de Ca
en la dieta. \end{minipage} \cr   ^{b} : 
 \begin{minipage}[t]{148mm}incluido adenocarcinoma mucinoso y
carcinoma de un
anillo.\end{minipage} \cr}

Ejemplo 2 Estudio in vivo del efecto sobre la prevención del CCR en ratas inducidas con AOM (azoximetano)

Las ratas se estimulan por vía s.c. 1 vez a la semana con una solución de AOM.

El efecto del tratamiento específico se evalúa a causa del número de focos crípticos aberrantes (FCA) del colon/ recto en las ratas estimuladas con AOM. El número de criptas aberrantes se evalúa mediante estereomicroscopia (40 aumentos) tras tinción con solución de Giemsa (conc. De 6 ml de Giemsa en 50 ml de PBS, pH 7,1). El tamaño de las criptas se clasifica como pequeña, medio, grande y extragrande. El número de animales es de 80, con 16 en cada grupo. Los medicamentos se administran con los alimentos. La sección se hace 18 semanas tras la primera dosis. El Ca en los alimentos es de 5000/10000 ppm y 2,5 microgramos/kg de 1,25 DHC. Los datos del peso, alimentos y agua se registran y analizan.

Tratamiento

Grupo 1. Animales control

Grupo 2. 200 ppm de aspirina (ácido acetilsalicílico)

Grupo 3. Ca y 1,25 DHC

Grupo 4. 200 ppm de aspirina, Ca y 1,25 DHC

Grupo 5. 100 ppm de aspirina, Ca y 1,25DHC.

TABLA 1

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En la tercera columna "pequeños" es la suma de pequeños y medianos de la primera columna

En la tercera columna "grandes" es la suma de grandes y extragrandes de la segunda columna

El riesgo de desarrollo maligno (mutaciones APC y ras) se correlaciona con las criptas grandes y extragrandes.

La dosis de aspirina considerada en general como preventiva es de 400-500 ppm en ratas F344 estimuladas con AOM.

Los resultados muestran que no es posible reducir la dosis de aspirina hasta 200 ppm, ya que esta dosis carece de efecto (Grupo 2). Sin embargo, la adición de Ca y de 1,25 DHC tiene como resultado una reducción significativa de los FCA grandes (Grupo 4). Los resultados de los grupos 3 y 4 son peculiares porque parece como si la presencia de aspirina es un efecto adverso. Debe observarse que las ratas sufrían hipercalcemia, como queda demostrado por los cálculos renales.

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Claims (10)

1. Un medicamento farmacéutico que comprende una combinación de ácido acetilsalicílico (ASA), 1,25-dihidroxicolecalciferol (1,25 DHC) y calcio en una dosis de combinación junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Un medicamento farmacéutico según la reivindicación 1, en el que la dosis de combinación comprende 1,25 DHC en el intervalo de 0,1 \mug a 2 \mug.

3. Un medicamento farmacéutico según la reivindicación 1 ó 2, en el que la dosis de combinación comprende calcio en el intervalo de 200 mg a 3000 mg.

4. Un medicamento farmacéutico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la dosis de combinación comprende ASA en el intervalo de 50 mg a 500 mg.

5. Un medicamento farmacéutico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la dosis de combinación comprende de 50 a 75 mg de ASA, de 500 a 1000 mg de calcio y de 0,5 \mug a 1 \mug de 1,25 DHC.

6. Uso de ácido acetilsalicílico (ASA), del metabolito de la vitamina D_{3} 1,25-dihidroxicolecalciferol (1,25 DHC) y calcio junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un médicamente para prevenir el inicio y/o la progresión del cáncer colorrectal en un ser humano.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que el ácido acetilsalicílico (ASA) está en el intervalo de 50 mg a 500 mg.

8. Uso según la reivindicación 6 ó 7, en el que el calcio está en el intervalo de 200 mg a 3000 mg.

9. Uso según la reivindicación 6 ó 7, en el que el 1,25 DHC está presente en una cantidad de 0,1 \mug a 2 \mug.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que la combinación está en forma de una dosis de combinación que comprende ASA, 1,25 DHC y calcio.