NO330061B1 - Farmasoytisk medikament og anvendelse derav for forebyggelse av colorektal kreft - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et farmasøytisk medikament omfattende en kombinasjon av acetylsalisylsyre (ASA), 1,25 dihydroksykolekalsiferol (1,25DHC) og kalsium i en kombinasjonsdosering sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av ASA, 1,25DHC og kalsium sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer for fremstilling av et medikament for å hindre initiering og/eller progresjon av colorektal kreft i et menneske.

Colorektal kreft (CRC) er én av de viktigste kreftformer i den vestlige verden (1,3 mill. pr. år og over 600.000 dødsfall årlig). I Danmark er hyppigheten ca. 65 pr. 100.000 innbyggere og står i samsvar med alder. I takt med fall i tobakksrøyking i vestlige industriland og en økt forventet levetid, forventes det at CRC blir den hyppigste kreftform i de neste tiår.

De aller fleste CRC-tilfeller er sporadisk kreft som det ikke er mulig å etablere en genetisk disposisjon for. Effektiv CRC-forebyggelse i veldefinerte risikogrupper ville hatt en vesentlig effekt på folkehelsen.

I den gjennomsnittlige befolkning er risikoen gjennom levetiden for å få CRC 6 %, og risikoen for å dø av sykdommen er 3 % (1,2,3). Hos førstegrads-slektninger av pasienter med CRC, er risikoen adskillige ganger høyere. I sjeldne tilfeller er de CRC-disponerende faktorer arvelig ikke-polypose colorektal kreft (HNPCC), hvor det er mulig å etablere nærværet av mutasjoner i mismatch-reparasjonsgener, familiær adenomatøs polypose (FAP, mutasjon i APC-genet) eller inflammatoriske tarmsykdommer (ulcerøs kolitt og Crohns sykdom), hvor disse faktorer utgjør fra 5 til 15 % totalt.

Det er ingen tvil om at mat er den viktigste årsaksfaktor, omfattende animalske proteiner og fett, som den vestlige verden i økende grad spiser i for store mengder i stedet for kornprodukter, frukt og grønnsaker. Hyppigheten av CRC er økende, men den er bare halvparten så stor blant vegetarianere som blant kjøtt - spisere (4). Fremskrittet som er gjort i løpet av de siste tiår med kirurgiske teknikker, adjuvansbehandling etc. har ikke senket dødeligheten i noen nevneverdig grad. CRC-screening betyr sporing av kreft på et tidlig stadium og fjerning av polypper i tarmen, men så langt har imidlertid undersøkelser ikke vist at screening minsker hyppigheten. Den totale overlevelse etter 5 år i Danmark er ca. 30 % og avhenger av stadiet på diagnosetidspunktet. Ca. 25 % av pasientene har kreftspredning på diagnosetidspunktet og er utenfor en helbredelse. 3/4 av CRC- pasientene gjennomgår kirurgi som er ment å helbrede. Ikke desto mindre dør 50 % av disse pasienter innen 5 år pga. tilbakefall.

Med valgene og resultatene av behandling som er kjent i dag, vil bare effektiv forebyggelse være i stand til å minske CRC-sykelighet og dødelighet på avgjørende måte (3,5).

I de senere år er fokus i stor grad rettet mot kreftforebyggelse i bekjennelse av det faktum at kirurgi for det meste ikke er tilstrekkelig som den eneste modalitet og at de fleste cytotoksiske regimer er ineffektive mot alvorlige krefttyper.

Betegnelsen «kjemoprofylakse» dekker anvendelsen av farmakologisk aktive, ikke-cytotoksiske midler eller naturlig forekommende næringsstoffer som beskytter mot utbrudd og utvikling av kloner av muterte, ondartede celler.

I 1994 etablerte the National Cancer Institute, USA, en kjemopreventiv gren for å analysere eksisterende data og initiere nye studier. NCI-CB har konkludert med at CRC er et attraktivt mål for kjemoprofylakse av kreft, idet det er en hyppig kreft-type med høy dødelighet. Imidlertid er ingen akseptabel behandling tilgjengelig.

En veldefinert, flertrinns karsinogenese er blitt kartlagt med veldefinerte forstadier i form av colorektalt adenom, og risikogruppene er også veldefinerte.

Noen studier har pekt på en omvendt korrelasjon mellom det individuelle inntak av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID), og på kalsium og vitamin D3og risikoen for utvikling av CRC. Vedkommende studier er dyreforsøks-modeller for colorektal karsinogenese, prospektive studier av pasienter med FAP, samt epidemiologiske studier i form av retrospektive kasuskontrollstudier samt prospektive kohorts- og intervensjonsstudier (6-17). Som konklusjon har 21 av 23 epidemiologiske studier vist at regelmessig anvendelse av NSAID'er reduserer risikoen for CRC med opptil 50 % (18). Data er imidlertid ikke klare hva gjelder dosering og varighet av anvendelse. De oftest undersøkte legemidler er acetylsalisylsyre, sulindac, piroxicam og indometacin.

Noen få oversiktsartikler og utgivelser er blitt publisert, som finner resultatene interessante, men foreliggende data har ikke ført til noen skikkelige anbefalinger og heller ikke bevist noen klinisk signifikans (12). Dette skyldes primært de velkjente, uønskede virkninger av NSAID'er og erkjennelsen av at det sterkeste bevis på virkningen av disse midler ikke foreligger, dvs. prospektive, randomiserte, dobbelt blinde forsøk i menneskepopulasjoner.

The American Cancer Society har konkludert med at foreliggende data fra epidemiologiske, kliniske, farmakologiske og toksikologiske studier viser at acetylsalisylsyre beskytter mot utvikling av CRC (13), og FDA vurderer for tiden om acetylsalisylsyre tatt alene skal godkjennes som kjemoprofylakse av CRC eller om det vil være nødvendig med ytterligere fase III-studier.

Dyreforsøksdata tegner et lovende bilde av farmakologisk aktive legemidler som med forskjellige virkemåter synes å være effektive kjemoprofylaktiske midler. Men individuelle epidemiologiske studier av kalsium og vitamin D (eller melke-produkter) i forhold til CRC er inkonsekvente. Av 13 kalsiumstudier (ni kasuskontroll-og fire kohortstudier) viser åtte en betydelig invers korrelasjon, tre undersøkelser rapporterer insignifikant korrelasjon, mens to ikke viser noen korrelasjon.

Av fem epidemiologiske studier (tre kohortstudier og to kasuskontrollstudier) av virkningen av vitamin D på CRC-risikoen viser to en betydelig invers korrelasjon, mens resten ikke har noen signifikans.

Hyppigheten av epitel-adenom-karsinom er en prosess som tar mange år (fra fem til ti år). CRC avviker fra mange andre krefttyper ved at mutasjoner i celle-syklusregulerende gener og genprodukter sjelden iakttas. CRC er kjennetegnet ved mutasjoner i kritiske tumorsuppressorgener (APC, DCC, p53, MCC) og onkogener (K-ras) og oppregulering av vekstfaktorer (særlig EGF-familien) og enzymatisk aktivitet (særlig cyklooksygenase).

Til tross for at CRC er en hyppig kreftform, er dens hyppighet bare 65 pr. 100.000 innbyggere, og en klinisk kontrollert studie hvor endepunktene er invasiv kreft og kreftrelatert død, ville kreve innlemmelse av titusentalls individer og den ville gå over adskillige tiår og kreve astronomiske finansielle ressurser. Friske individer føler seg ikke tvunget til å delta i vitenskapelige studier som medfører lang tids medisininntak, og resultatene av alle slike studier ville være utsatt for forvirring.

Over 95 % av CRC utvikler seg fra adenom, som er aksepterte CRC-forstadier i vitenskapelige studier av mennesker og i dyreforsøk. Andre biomarkører omfatter genomiske forandringer (mutasjoner etc), aberrante kryptfoki (ACF), omitin-dekarboksylaseaktivitet, cyklooksygenaseaktivitet og prostaglandinnivået i slim-hinner, som benyttes som mellomliggende endepunkter.

Colorektal karsinogenese og kalsium:

I den vestlige verden er det gjennomsnittlige daglige inntak av kalsium vesentlig under den anbefalte kosttilførsel (RDA) på fra 800 til 1200 mg/dag, økende til 1500 mg/dag for de eldre. I vestlige land har hver voksen et gjennomsnittlig daglig inntak på fra 750 til 850 mg kalsium (14).

Ca. 30 % av kalsiumet i kosten absorberes fra tarmkanalen, og vitamin D3stimulerer absorpsjonen. Absorpsjonen er både transcellulær (ved lavt kalsium-innhold i kosten) og paracellulær. Restmengden av kalsium i tarmkanalen binder fettsyrer og sekundære gallesyrer ved dannelse av uløselige såper og minsker lokalt irriterende virkninger av disse syrer i tarmen.

Særlig deoksykolsyre (DCA) som frembringer epiteliolyse i tarmens epitel-overflate, anses for å være den mest karsinogene og mitogene av de sekundære gallesyrer (15). Epiteliolyse forårsaker kraftig formering i kryptene, sannsynligvis som et resultat av eksponering av basalmembranen. I den aktiverte fase (S-fase) er cellene mer ømfintlige overfor karsinogener som DCA, frie fettsyrer etc. (16). In vivo kan den skadelige virkning av 5 mM DCA hindres ved å øke Ca-konsentrasjonen i tarmkanalen fra 0 til 4 mM.

I adskillige tilfeller har resultatene av kasuskontrollstudier og kohortstudier vist en betydelig korrelasjon mellom et høyt kalsiumnivå i kosten og en minskning av risikoen for CRC-utvikling. Men resultatene er ikke utvetydige, selv om store volumer data fra dyreforsøk alle peker i den samme retning (14). Én prospektiv studie viser en betydelig minskning i raten av polypptilbakevending og en betydelig økning av kreftrelatert overlevelse etter CRC-kirurgi ved kalsiumsupplementer (kalsiumkarbonat 2 g/dag (17)).

Dannelsen av uløselige kalsiumsåper anses fremdeles for å være den viktigste mekanisme for kalsiums krefthindrende virkning, men i de senere år er fokus i økende grad blitt rettet mot kalsiumets sentrale rolle i intracellulær signaloverføring. Kalsium er en nøkkelfaktor for bibehold av normal cellemembranfunksjon, og kalsiumstrømning over cellemembranen spiller en sentral rolle ved forsterkning av intracellulær signaloverføring, som regulerer mange cellefunksjoner. Videre avhenger uttrykkingen av celleoverflatekadheriner, som er nødvendige for å opprettholde intercellulær kontakt, av kalsiums nærvær. Særlig på tarm kreftceller korrelerer uttrykkingen av kadheriner med graden av differensiering og med det kliniske resultat (19).

Nedsettelse av kalsiumkonsentrasjon i intercellulær væske senker cellerespons på vekstregulerende faktorer og minsker cellemembranenes permeabilitet. Når kalsiumkonsentrasjonen senkes øker proliferasjonen og de-differensiering.

Kalsium bidrar til å regulere alle celledelings- og celledifferensieringsfaser, primært ved aktivering av forskjellige proteinkinaser (cAMP-avhengig kinase, Cakalmodulin-avhengige proteinkinaser, proteinkinase C) (20, 21). Kalsium undertrykker omitin-dekarboksylase, et tumorfremmende enzym (14) og nedsetter antallet K-ras-mutasjoner i tarmepitel stimulert med karsinogenet 1,2-dimetyl-hydrazin (22). K-ras-mutasjoner er én av de tidlige genomiske forandringer i karsinogenesen. K-ras-mutasjoner forekommer i ca. 85 % av adenokarsinom og ca. 55 % av adenom, men ras-mutasjoner eksisterer sogar i opptil 50 % av ACF.

Forhøyede kalsiumverdier bevirker økt differensiering av epitelceller med samtidig vekstundertrykkelse, men neoplastiske tarmepitelceller taper sannsynligvis sin kalsiumrespons i ett av de sene trinn i epitel-karsinom-sekvensen (16).

Stimulering med karsinogener i det pre-neoplastiske trinn bevirker luminal proliferasjon av de tarmkryptprolifererende celler, et økt proliferasjonsforhold og økt forekomst av ACF, som også ses hos individer med økt risiko for tarmkreft (HNPCC-og FAP-pasienter). Ved kalsiumadministrering kan celler i kryptene omdannes til et normalt proliferasjonsforhold og normal geografisk fordeling av ikke-delende celler i luminalen 2/3 av kryptene og prolifererende celler ved bunnen av kryptene (23).

R.G. Montoya et al., «Chemoprevention of gastrointestinal cancer», i CANCER AND METASTASIS REVIEWS, vol 16/3-4, 1997, s. 405-419, beskriver adskillige forbindelser for å forebygge tarmkreft. Det nevnes intet om vitamin D3, og henvisningen til Ca vedrører teorien vedrørende dannelse av uløselige kalsiumsåper.

I WO 96 41645 beskrives anvendelse av COX2-inhibitorer i behandlingen av inflammasjon.

B.C. Pence et al. : «Experimental chemoprevention of colon carcinogenesis by combined calcium and aspirin» (møtesammendrag), Proe. Annu. Met. AM. Assoc. Cancer Res., vol 35, 1994, s. A3719. ISSN: 0197-016X beskriver at tumor-byrden var lavest i grupper som ble tilført Ca eller ASA bare under promosjon. Supplementering under progresjon var mindre effektivt.

John A. Sokoloski, et al. : «Introduction of the differentiation of HL- 160 romyelocytic leukemia cells by nonsteroidal anti- inflammatory agents in combination with low levels for Vit D3», Leuk. Res., vol 22(2), 1998, s. 153-161. Denne artikkel beskriver at D3har en økende effekt på NSAID, men at bare derivater med reseptorbindende egenskaper har denne effekt og ikke D3-analoger uten reseptorbindende effekt, og med den Ca-økende effekt har dette økende effekt på NSAID. Studien ble utført med leukemiceller.

Colorektal karsinogenese og Vitamin D3:

Vitamin D3(D3) øker serumkalsium ved at absorpsjonen av kalsium og fosfat fra tarmkanalen økes og at kalsium fra ben mobiliseres. D3er til stede i mat. Det dannes ved ultrafiolett stråling av 7-dehydrokolesterol, et provitamin som foreligger i huden hos mennesker og i fettvev hos mange dyr. D3metaboliseres med suksessiv hydroksylering, først i leveren, til 25-hydroksykolekalsiferol, og deretter i nyrene til 1,25-dihydroksykolekalsiferol (1,25DHC) eller 24,25DHC, som er de hormonelt aktive metabolitter av D3(1,25DHC > 24,25DHC).

I tillegg til sin antioksidative effekt ligner 1,25DHC steroidhormoner i sin kjemiske struktur og virkemåte, idet 1,25DHC passerer cellemembranen og binder seg til et spesifikt cytoplasmatisk reseptorprotein. Dette hormonreseptorkompleks aktiveres under translokasjon inn i cellekjernen hvor det bindes til DNA og initierer mRNA-transkripsjon og proteinsyntese. I kjernemembranen befinner reseptorene for 1,25DHC seg (høyaffinitetskjernevitamin-D-reseptorer, VDR), som bidrar til regulering av kalsium-strømmen over cellemembraner (17).

1,25DHC modulerer signaltransduksjon, inhiberer proliferasjon og DNA-syntese, modulerer c-myc, c-fos og c-jun onkogen ekspresjon, induserer differensiering og sannsynligvis apoptose. VDR'er er blitt identifisert både i normal tarmslimhinne og i colorektalt karsinom (24). 1,25DHC øker intracellulært kalsium og stimulerer forskjellige proteinkinaser. 1,25DHC stimulerer transkripsjon av kalbindin-D-genet i colonocytter, som antas å øke transcellulær kalsiumabsorpsjon.

En kraftig oppregulering (300-400 %) av VDR finner sted i neoplastiske colonocytter. Dette kan tolkes som en adaptiv respons på tumorcellevekst, hvorved cellen øker sitt differensieringspotensiale. Denne respons forsvinner i mer avanserte stadier av sykdommen (>T3), hvor det antas at vitamin D-forsvarsmekanismen blir inaktivert (25).

In vitro inhiberer 1,25DHC veksten av humane tarmkreftcellelinjer (LoVo), inklusive CEA-produserende cellelinjer. In vivo (mus) kan 1,25DHC undertrykke vekst av faste, humane xenografter (17,26). Noen få kohortstudier av humane populasjoner har vist en betydelig reduksjon av risikoen for utvikling av colorektal kreft ved inntak av vitamin D3(eller dets aktive metabolitt 1,25DHC), som resulterer i serum konsentrasjoner på over 20 ng/ml (6,7).

RDA for vitamin D3er 10 ug/dag økende til 20 ug/dag hos eldre kvinner uten østrogensubstitusjon (6,7,27). Den anbefalte dose av 1,25DHC er 0,01 ug/kg BW 3 ganger pr. uke. I osteoporosestudier har 0,75 ug/dag vist seg å indusere hyperkalsemi.

Nye syntetiske D3-analogpreparater har 100-200 ganger den antiproliferative effekt og effekten på differensiering og bare 0,5 ganger den hyperkalsemiske effekt av 1,25DHC.

To NCI-CB-sponsede studier av 1,25DHC, 0,5 ug eller D3, 400 IU, og kalsiumkarbonat 1500 mg, er blitt startet i 1994.

Det er kjent fra disse studier av benmineral-turnover at Vitamin D og kalsium er gjensidig avhengige faktorer, og dette har vist seg å være tilfellet også i reguleringen av celledeling og celledifferensiering.

Colorektal karsinogenese og cyklooksygenaseinhibitorer (acetylsalisylsyre(ASA) og andre NSAID'er)) og CRC: Den regulerende effekt av cyklooksygenase-inhibitorer (COX-inhibitorer) på tarmepitelet er blitt undersøkt i forbindelse med behandling av kroniske betennelsessykdommer i tarmene og FAP.

En kreftforebyggende effekt av COX-inhibitorer er ikke blitt identifisert i detalj på det molekylærbiologiske nivå, men den anses å være forbundet med disse legemidlers virkning på arachidonsyremetabolisme og prostaglandinsyntese via blokkering av cyklooksygenase-enzymer (COX).

To isomere former er identifisert: COXiog COX2:

COXier grunnformen. I den øvre magetarmkanal påvirker den beskyttelsen av slimhinne ved å bevirke hydrogenkarbonatsekresjon og mucin-produksjon primært gjennom prostaglandin E (PGE), som er det kvantitativt dominerende produkt i COXi-turnoveren av arachidonsyre. COX2er en induserbar form. Den dannes særlig ved inflammatoriske stimuli, og den katalyserer dannelsen av pro-inflammatoriske cytokiner, inklusive PGE2og PGFa, som styrker karsinogeners mutagene effekt ved proliferasjonsinduksjon, undertrykkelse av immunsystemet og stimulering av angiogenese. PGE2utøver sin inhiberende effekt via negativ motkoblings-T-celle-proliferasjon og lymfokinproduksjon.

Arachidonsyre (AA, 5,8,11,14-eikosatetraen-syre) har sin opprinnelse i celle-turnover av fosfolipider (PL) som befinner seg i cellemembranen. AA frigjøres primært fra PL ved hydrolyse av esterbindingen som binder AA til PL. I de fleste celletyper skjer dette ved direkte aktivering av enzymet fosfolipase A2. Aktiviteten til fosfolipase A2 utgjør den felles faktor som regulerer hastigheten for AA-frigjøring og derved hastigheten for produksjon av alle eicosanoider (PG, prostacykliner, tromboksaner og leukotriener).

AA metaboliserer via COX-veien til eicosanoider, som stimulerer celledeling idet den ses under inflammatoriske betingelser, eller via lipooksygenaseveien til hydroperoksider (HPETE) og hydroksyforbindelser (HETE). Den tredje vei til arachidonsyremetabolisme er via cytokromet P450 til HETE og EET (epoksyeicosatriensyre). Det er blitt påvist at blokkering av lipoksygenaseaktiviteten inhiberer vekstfaktorindusert tarmtumorcelleproliferasjon (28).

COX-inhibitoren ASA (aspirin og andre) og dens metabolitt salicylat blokkerer dannelsen av PG fra AA ved irreversibel acetylering av COX (29), noe som nekter AA adgang til den aktive del av enzymet. COX-aktiviteten kan bare gjenopprettes ved dannelse av nye COX-molekyler, og derfor er celler uten proteinsyntese, så som blodplater, ikke istand til å gjenoppta COX-aktivitet. Den viktigste kjemopreventive effekt av ASA bedømmes å være COX2-inhibering (30), som resulterer i metabolisering av AA via en lipoksygenasevei til 15-HETE (leukotrien med antiinflammatoriske og antimitogene effekter).

De fleste andre NSAID'er (piroxicam, sulindac og indometacin) blokkerer COX på en reversibel og doseavhengig måte, og derfor er ASA en kraftigere PG-inhibitor. Som det fremgår av det som er angitt ovenfor, er det adskillige virkemekanismer, og PG-kaskaden avhenger også av det kalsiumregulerte signaltransduksjonssystem (21).

Adskillige klassiske karsinogener anvendes som elektrondonorer under COX-reaksjonen, og de aktiveres ved denne reaksjon (høy DNA-affinitet). Blant dem er poly-cykliske aromatiske hydrokarboner, aflatoksiner, halogenerte pesticider, aromatiske aminer samt fenolforbindelser. Således aktiverer COX potensielle karsinogener til aktive DNA-skadelige metabolitter.

In wtro-studier viser også at de fleste NSAID'er har en antiproliferativ virkning på humane koloncancercellelinjer (Ht-29, SW-80, DLD-1) (31).

In wtro-studier viser også at selv om NSAID-effekten på PG-syntesen elimineres (f.eks. ved anvendelsen av sulindac-metabolitter uten COX-inhibering), inhiberes ikke desto mindre veksten av humane tarmkreftcellelinjer. Dette peker mot adskillige virkemekanismer, inkludert evnen til å indusere betydelig apoptose (28,32) og modulering av transmembran kalsiumfluks og intercellulære koblinger (33).

NSAID har vist seg å inhibere adskillige endonukleaser. Disse er enzymer som spalter DNA-molekyler. Sannsynligvis spiller de en sentral rolle i den genomiske ustabilitet som er ett av kjennetegnene ved colorektal flertrinns karsinogenese (32). Andre molekylære biologimekanismer ble diskutert i detalj i (35).

Et interessant punkt er at ASA, i motsetning til andre NSAID'er, har vist seg å inhibere proliferasjon og lumendannelse i kodyrkede, normale tarmepitelceller (karsinomceller i kammer 2). Dette tas som et uttrykk på inhibering av de vekst - fremmende signaler av karsinomceller. Andre områder hvor ASA er forskjellig fra andre NSAID'er er irreversibel COX-inhibering, lavere plasmabinding (ca. 50 % sammenlignet med ca. 90 %).

Humane, colorektale neoplasma, både adenom og adenokarsinom, har vist seg å produsere store mengder PG, særlig av E-typen (31,36), og nøyaktig COX2-aktivitet har vist seg å bli fremhevet fra 2 til 50-fold i fra 85 til 90 % av colorektale karsinomer (35). Særlig APC-tap av heterozygositet (LOH) antas å stimulere COX2-ekspresjon på et tidlig stadium av neoplastisk utvikling i både epitel-og stromaceller. Det kan imidlertid nøyaktig være den stromale COXi-aktivitet som stimulerer uttrykkingen av forskjellige angiogenetiske faktorer (VEGF, bFGF og TGFPi).

Andre pro-neoplastiske virkninger av COX er forandringen av TGF-beta fra en antiproliferativ vekstfaktor til en pro-proliferativ vekstfaktor og nedsatt inter-cellulær og cellulær-stromal kontakt/kommunikasjon og derved fremming av angiogenese og metastase. Disse egenskaper hos COX antyder at inhiberinger av begge isoformer kan ha viktige virkninger mot CRC (38).

I seg selv ligner ett av de tre domener i COX-molekylet (COX-domenet, EGF-domenet og membranbindende motiv) den epidermale vekstfaktor (ligand for EGF-reseptoren er også TGFQ). Av denne årsak vil en mulig inaktivering av hele domenet være interessant i forsøk på å oppnå optimal profylakse.

COX-inhibitoren ASA (aspirin og andre) og dens metabolitt salicylat blokkerer dannelsen PG fra AA ved irreversibel acetylering av COX (37), noe som nekter AA adgang til den aktive del av enzymet. COX-aktiviteten kan bare gjenopprettes ved dannelse av nye COX-molekyler, og derfor er celler uten proteinsyntese, så som blodplater, ikke istand til å gjenoppta COX-aktivitet. Den viktigste kjemopreventive effekt av ASA bedømmes til å være COX2-inhibering (38), som resulterer i metabolisering av AA via en lipoksygenasevei til 15-HETE (leukotrien med antiinflammatoriske og antimitogene virkninger).

De fleste andre NSAID'er (piroxicam, sulindac og indometacin) blokkerer COX på en reversibel og doseavhengig måte, og derfor er ASA en kraftigere PG-inhibitor. Som det fremgår av det som er anført ovenfor, er det adskillige virkemekanismer, og PG-kaskaden avhenger også av det kalsiumregulerte signaltransduksjonssystem (21).

Adskillige store epidermiologiske studier av COX-inhibitorer i form av kohortstudier, kasuskontrollstudier og fremtidige intervensjonsstudier har vist en betydelig preventiv effekt (minskning av relativ risiko med fra 40 til 50 %), særlig av ASA på CRC, etter lang tids terapi (fra 2 til 10 år) i doser som benyttes for å hindre iskemisk hjertesykdom (11-13,39-42). I en kohort av pasienter med ulcerøs kolitt er det funnet en relativ risikominskning på 0,38 (fra 0,2 til 0,7) etter bare 3 måneder med sulfasalazin-terapi.

Dyreforsøk har kunnet vise en betydelig beskyttende effekt (fra 50 til 60 %) av f.eks. indometacin og piroxicam i rotter som ble eksponert for karsinogenet dimetylnitrosamin eller azoksymetan (metylazoksymetanol) (43-46).

De hyppigste, uønskede virkninger forbundet med langtidsadministrering av NSAID'er er gastroduodenal ulcerasjon og blødning pga. lave PG- og tromboksan-A2-nivåer i magetarmkanalen. PG stimulerer mucin-dannelse og hydrogenkarbonatsekresjon, og tromboksan A2indikerer blodplateaggregering. Disse komplikasjoner er hovedsakelig knyttet til inhibering av det konstitutive COXi-enzym.

Uønskede virkninger og komplikasjoner angår primært anvendelsen av NSAID'er som analgetiske eller antiinflammatoriske midler i vesentlig høyere doser, men de er potensielle sekveler etter langtidsanvendelse også i lavere doser.

En oversikt over 16 kohortstudier og case-kontrollstudier viser at risikoen for å utvikle alvorlige NSAID-forårsakede, uønskede virkninger i magetarmkanalen utgjør fra 2-4 % pr. år ved analgetiske og antiinflammatoriske daglige doser (14). I lav-dose aspirinprofylakse av kardiovaskulær sykdom ble den relative risikominskning for slag, akutt myokardinfarkt og/ eller kardiovaskulær død funnet å være ca. 25 % (47).

Legenes helsestudie (325 mg acetylsalisylsyre) fant at i tillegg til en vesentlig minskning av risikoen for akutt myokardinfarkt, var det vesentlig flere tilfeller av melaena og neseblødning enn i placebogruppen, men verken av cerebral blødning eller uspesifikk blødning i magetarmkanalen (inkludert hematemesi) (39).

Det foreligger tallrike data av farmakokinetikken og toksiciteten til COX-inhibitorer, særlig angående ASA. FDA har funnet at f.eks. acetylsalisylsyre er et sikkert og effektivt antiinflammatorisk og analgetisk middel og velegnet for salg over disk. Ingen ytterligere toksikologiske studier er nødvendige for å vurdere anvendelsen av acetylsalisylsyre i kjemoterapi (48,49).

Karsinogenesen i colorektal kreft involverer et antall genetiske forandringer og epigenetiske faktorer, så som økt uttrykking av vekstfaktorer og undertrykkelse av vekstinhibitorer, noe som ikke nødvendigvis medfører underliggende mutasjoner (men som f.eks. forekommer ved økt COX-ekspresjon). Data fra epidemiologiske studier og dyreforsøk viser at Vitamin D3og kalsium kan være farmakologisk aktive når de anvendes som kjemoprofylakse av CRC. Men virkningen er moderat. Noen epidemiologiske undersøkelser i humane populasjoner indikerer minskning (fra 40 til 50 %) av den relative kreftrisiko i populasjoner som anvender ASA kontinuerlig. Det er imidlertid ikke konsensus når det gjelder doseringen og varigheten av behandlingen. Risikominskningen i forhold til CRC kunne være to ganger risikominskningen for kardiovaskulære tilfeller.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

Det foreligger ingen prospektive, randomiserte, dobbeltblinde studier. Studier av kreft-kjemoprofylakse er ekstremt kostbare idet de nødvendigvis må omfatte et meget høyt antall individer og forsøk over år dersom endepunktene for studien skal være invasiv kreft- og kreftrelatert dødelighet. Av disse årsaker er det en økende tendens til å stole på epidemiologiske studier av mellomliggende endepunkter (f.eks. polypper, ACF, etc), dyreforsøk av genmodifiserte og karsinogent stimulerte dyrepopulasjoner og biologiske modeller for undersøkelse av forskjellige biomarkører (mutasjoner, vekstfaktorer etc).

Ifølge den foreliggende oppfinnelse manifesterer den CRC-preventive effekt av den nedenfor angitte kombinasjon av preparater seg ved en vesentlig minskning av hyppigheten og den totale sykelighet og dødelighet av colorektal kreft. For å oppnå denne effekt, antas det imidlertid å være viktig å ta preparatet konsekvent som profylakse over lang tid (sannsynligvis mer enn 1 år), nøyaktig som for å hindre iskemisk hjertesykdom og osteoporose.

Ved å kombinere ASA med 1,25DHC og med kalsium oppnås en synergistisk effekt, slik at mengdene av de enkelte legemidler sannsynligvis blir minsket og toksisiteten derved nedsatt til et neglisjerbart nivå.

Ifølge oppfinnelsen kan en overraskende effekt oppnås med en kombinasjonsdosering som omfatter individuelle legemidler som utøver sine virkninger på spesifikke områder av karsinogenesen: modifikasjon av signaltransduksjon og ekspresjon av onkogener, nedsettelse av karsinogen virkning på tarmepitelet samt intracellulær og intercellulær signaltransduksjon, COX-inhibering og sannsynligvis apoptose.

I en foretrukket utførelsesform er mennesket som skal behandles en pasient som pga. underliggende sykdom eller en genetisk defekt har risiko for å utvikle colorektal kreft, så som: HNPCC-pasienter, polypp-pasienter, pasienter med en CRC-historie. I tillegg individer over 50 år, som er førstegrads slektninger av pasienter med colorektal kreft (risiko for å utvikle CRC økt fra 2 til 4 ganger (fra 12-25 %)).

For førstegrads slektningene til individer med CRC diagnostisert før 50-års alderen eller for individer med to førstegrads slektninger med CRC, øker risikoen fra 4 til 6 ganger (fra 24 til 36 %) uavhengig av alder.

For bærere av HNPCC-mutasjoner er risikoen for CRC 75 % i 65-års alderen og risikoen for metakronisk kreft er 45 % 10 år etter reseksjon av den primære tumor.

For pasienter med kronisk inflammatoriske tarmsykdommer (ulcerøs kolitt og Crohns sykdom) øker risikoen fra 4 til 25 ganger (levetidsrisiko fra 12 til 75 % hos pasienter som ikke behandles med kirurgi etter mer enn 10 års sykdom) avhengig av sykdommens utbredelse og varighet.

Følgelig er anvendelsen ifølge oppfinnelsen i en foretrukket utførelsesform egnet når mennesket velges fra gruppen som har risiko for utvikling av colorektal kreft som følge av å være en førstegrads slektning av en pasient med colorektal kreft, og/eller bærere av gen(er) for arvelig ikke-polypose colorektal kreft (HNPCC), og/eller som har familiær adenomatøs polypose, colorektalt adenom og/eller en inflammatorisk tarmsykdom, så som ulcerøs kolitt eller Crohns sykdom.

Preparatene vil kunne blandes som følger:

500 mg kalsium (1250 mg kalsiumkarbonat) og/eller

0,5 ug av 1,25DHC (eller 400 IU vitamin D3eller

D3-analog, f.eks. 0,25 ug calcitrol eller

0,005 ug calcitrol/kg kroppsvekt), samt

75 mg ASA eller analog, reversibel eller irreversibel COX2-inhibitor.

Hovedkravene til et preparat som er utformet for kjemoprofylakse omfatter: lav pris, høyt samsvar og ultralav toksisitet. Det antas at ved tilsetning av 1,25DHC og kalsium kan mengden COX-inhibitor (ASA) senkes, slik at de ASA-relaterte, uønskede virkninger kan minskes til et neglisjerbart nivå uten å minske dens virkning. For acetylsalisylsyre har de uønskede virkninger etter lang tids anvendelse gjort FDA tvilende før godkjennelse av acetylsalisylsyre som kjemoprofylakse for

CRC.

Preparater med spesifikk virkning i kolon, så som f.eks. 5-ASA, kan vise seg å være passende, eventuelt i kombinasjon med slimhinnebeskyttende midler.

ASA og andre NSAID'er er godkjent for salg over disk til analgetisk og antiinflammatorisk anvendelse. Tilsvarende selges kombinasjonspreparater inneholdende D3og kalsium (f.eks. kalsiumkarbonat 1250 mg = kalsium 500 mg + D3400 IU) over disk til profylakse av osteoporose.

Først er in wVo-studier blitt utført av det ovenfor angitte i form av dyreforsøk ved Instituttet for Toksikologi ved Den Danske Veterinær- og Matvareadministrasjon (DVFA). Resultatene av studien er vist i tabell 1.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I én utføre I sesform vedrører den foreliggende oppfinnelse minskingen av den effektive dose av ASA i en kjemoprofylaktisk behandling av colorektal kreft i et menneske ved koadministrering med en ikke-toksisk dose av 1,25DHC og Ca i form av en kombinasjonsdosering. Dette skyldes det faktum at det overraskende er vist at tilsetningen av 1,25DHC og kalsium kan senke den nødvendige dose av acetylsalisylsyre for å minske dannelsen av aberrante kryptfoki i en modellrotte både med hensyn til størrelse og antall. Følgelig vedrører oppfinnelsen også hindring av initieringen og/eller progresjonen av colorektal kreft i et menneske omfattende administrasjon til mennesket av en kombinasjonsdosering av ASA, 1,25DHC og kalsium.

Med hindring og kjemoprofylaktisk effekt menes hindring av colorektal kreft eller initieringen og/eller utviklingen av colorektal kreft og/eller virkningen av å minske dannelsen av betingelser som er prekankrøse for colorektal kreft.

Ifølge oppfinnelsen antas det at administreringen av kombinasjonsdoseringen bør administreres regelmessig med en gjennomsnittlig daglig dose av ASA i området fra 50 mg til 500 mg, fortrinnsvis i området fra 25 til 400 mg, mer foretrukket i området fra 50 til 300 mg, enda mer foretrukket i området fra 75 til 150 mg, så som i området fra 75 til 100 mg.

Kombinasjonsdoseringen omfatter videre vitamin D3-metabolitten 1,25-dihydroksykolekalsiferol i området fra 0,1 ug til 2 ug. Kalsiumet i kombinasjonsdoseringen kan fortrinnsvis være i området fra 200 mg til 3500 mg, så som kalsium i området fra 250 mg til 3000 mg, så som i området fra 300 mg til 2500 mg, fortrinnsvis i området fra 400 til 2000 mg, mer foretrukket i området fra 500 til 1000 mg, så som 750 mg.

Som nevnt ovenfor, bør behandlingen eller hindringen fortsettes i et langt tidsrom for å gi den beste effekt, men det antas at en gunstig effekt kan oppnås etter en behandling på minst 3 måneder. Følgelig fortsettes administreringen fortrinnsvis i minst 6 måneder, så som i minst 1 år, fortrinnsvis i minst 2 år. Imidlertid kan personer med høy risiko behandles ifølge oppfinnelsen resten av livet.

I et viktig aspekt resulterer administreringen av kombinasjonsdoseringen i hindring av initieringen eller utviklingen av colorektal kreft som overskrider virkningen av administreringen av enhver av de individuelle ingredienser i den samme daglige dosering og i det samme tidsrom.

I anvendelsen ifølge oppfinnelsen har kombinasjonsdoseringen en preventiv effekt som er synergistisk sammenlignet med effekten av de individuelle effektive ingredienser.

En additiv effekt ifølge oppfinnelsen kan beregnes som en effekt av summen av hindring av henholdsvis hver av substansene ASA, vitamin D3og Ca, eller ved en effekt av summen av hindring ved utvelgelse av to av substansene ASA, vitamin D3og Ca og den preventive effekt av den gjenværende substans.

Med synergistisk effekt ifølge oppfinnelsen menes fortrinnsvis en effekt som er høyere enn den additive effekt som er beskrevet ovenfor. En passende referanse for beregningen er beskrevet i eksempel 1 som beskriver en studie av dannelsen av aberrante krypt-foki i indusert rottekolon.

COX-inhibitoren kan være enhver som virker på én eller flere av mekanismene valgt blant reversibel eller irreversibel acetylering av COX., reversibel eller irreversibel acetylering av COX2, inhibering av angiogenese, inhibering av arachidonsyremetabolisme, blokkering av AA-metabolisme, inhibering av stimulering av proliferasjonsstimulering fra epidermal vekstfaktor og stimulering av apoptose. COX-inhibitoren er ASA. Vitamin D3er 1,25-dihydroksykolekalsiferol.

ASA virker fortrinnsvis ved én eller flere av de følgende mekanismer: inhibering av celleproliferasjon; inhibering av oppregulering av pro-proliferative midler, så som vekstfaktorer; modulering av signaltransduksjon; og induksjon av apoptose. Også inhibering av angiogenese, inhibering av arachidonsyremetabolisme kan være målet for ASA'en. I et ytterligere aspekt virker cyklooksygenaseinhibitoren ved at dannelsen av potensielle karsinogener til DNA-skadelige metabolitter minskes.

Vitaminet 1,25DHC virker fortrinnsvis ved én eller flere av de følgende mekanismer: inhibering av celleproliferasjon; inhibering av DNA-syntese; modulering av signaltransduksjon; induksjon av differensiering; samt induksjon av apoptose.

Den aktive mekanisme for kalsiumet er ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis en effekt på uttrykkingen av celleoverflatekad heri ner og intra- og ekstracelle-signaltransmisjon.

Ett meget viktig aspekt ved oppfinnelsen er iakttakelsen at anvendelsen kan minske risikoen for å utvikle colorektal kreft hos det individuelle mennesket som mottar behandlingen med minst 10 % eller mer, sammenlignet med effekten oppnådd ved enhver av de individuelle ingredienser i den samme dosering og i den samme administreringsperiode. Minskningen kan være minst 20 % eller mer, og under visse omstendigheter, f.eks. for høyrisikopasienter, sogar 30 % eller mer. Effekten kan måles slik som beskrevet i eksemplet ved antallet aberrante kryptfoki i AOM-induserte rotter som mottar administrering av kombinasjonsdoseringen.

Kombinasjonsdoseringen ifølge oppfinnelsen er kombinasjonsdoseringen som omfatter ASA, 1,25DHC og Ca ved at disse ingredienser alle er velkjente legemidler.

I enda en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen anvendelsen av ASA, 1,25DHC og kalsium sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer for fremstilling av et medikament til hindring av initieringen og/eller utviklingen av colorektal kreft hos et menneske. I en foretrukket utførelsesform er medikamentet i form av en kombinasjonsdosering som omfatter ASA, 1,25DHC og kalsiumet.

Anvendelsen kan være i overensstemmelse med enhver av anvendelsene beskrevet over, og i enda en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen ethvert slikt farmasøytisk medikament. Det farmasøytiske medikament kan følgelig omfatte en kombinasjon av en cyklooksygenase (COX)-inhibitor, et vitamin D3, inklusivt analoger og metabolitter derav, og/eller kalsium. I et ytterligere aspekt er det farmasøytiske medikament et slikt medikament som enhver av kombinasjons-doseringene administrert ifølge enhver av anvendelsene beskrevet over.

Følgelig vedrører et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen anvendelsen av en cyklooksygenase (COX)-inhibitor, et vitamin D3, inklusivt analoger og metabolitter derav, og kalsium sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer for fremstilling av et medikament for hindring av initieringen og/eller utviklingen av colorektal kreft hos et menneske.

I enda et annet aspekt vedrører oppfinnelsen et farmasøytisk medikament som omfatter en kombinasjon av en cyklooksygenase (COX)-inhibitor, et vitamin D3, inklusivt analoger og metabolitter derav, og kalsium i en kombinasjonsdosering sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Det farmasøytiske medikament ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis et medikament hvor kombinasjonsdoseringen omfatter vitamin D3-metabolitten 1,25 dihydroksykolekalsiferol i området fra 0,1 ug til 2 ug, så som i området fra 0,2 ug til 1,5[jg, fortrinnsvis i området fra 0,3 ug til 1 ug, mer foretrukket i området fra 0,4 ug til 0,75[jg, så som 0,5M9-

I en ytterligere utførelsesform er det farmasøytiske medikament ett hvor kombinasjonsdoseringen omfatter kalsium i området fra 200 mg til 3000 mg, så som i området fra 300 mg til 2500 mg, fortrinnsvis i området fra 400 til 2000 mg, mer foretrukket i området fra 500 til 1000 mg, så som 750 mg.

I en foretrukket utførelsesform er det farmasøytiske medikament ifølge oppfinnelsen et hvor kombinasjonsdoseringen omfatter ASA i området fra 50 mg til 500 mg, fortrinnsvis i området fra 25 til 400 mg, mer foretrukket i området fra 50 til 300 mg, enda mer foretrukket i området fra 75 til 150 mg, så som i området fra 75 til 100 mg. Det mest foretrukne medikament omfatter fra 50 til 75 mg ASA, 500-1000 mg Ca og 0,5-1M925 dihydroksykolekalsiferol.

Med en dosering ifølge oppfinnelsen menes individuelle doseringer f.eks. i én pakke eller en fysisk enhet av én eller flere av ingrediensene. Kombinasjonsdoseringen kan også omfatte forskjellige COX-inhibitorer samt forskjellige vitamin D3-analoger og/eller metabolitter.

Følgelig er i en foretrukket utførelsesform farmasøytikumet et farmasøytikum som inneholder alle tre ingredienser for å sikre den riktige individuelle dose og pasientføyelighet.

COX-inhibitorene ifølge oppfinnelsen inneholder i tillegg til ASA andre NSAID'er som er kjent på området.

Eksempel 1

Innvirkningen av la,25(OH)2-vitamin D3, kalsium og acetylsalisylsyre på AOM-induserte aberrante kryptfoki og colorektale tumorer hos tarm hos rotte.

Materialer og metoder

Dyr

128 hann-F344/Mol-rotter, SPF (F344/Nta@Mol) som var fra 3 til 4 uker gamle ble innkjøpt f ra M & B (LI. Skensved, Danmark).

Dietter

Alle grupper av rotter ble gitt en pulverisert, renset diett. Mengdene av la,25 (OH)2D3, kalsium og acetylsalisylsyre i dietten til hver gruppe er presentert i tabell 1.

Kjemikalier

Azoksymetan (AOM) ble oppnådd fra Sigma Chemical (St. Louis, MO), la,25 (OH)2D3ble levert av Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Danmark. Acetylsalisylsyre (ASA) ble oppnådd fra Nycomed Danmark A/S.

Losjering

Dyrene ble holdt i plastbur som ble kastet etter bruk og som var utstyrt med innsatt stålgittergulv, 2 dyr pr. bur, i isolater av fleksibel film («Isotec» 12134, Olac, Oxford, UK) i doseringstidsrommet, og 1 uke etter termineringen av doseringen med AOM. For resten av tidsrommet for undersøkelsen, ble dyrene holdt i bur av rustfri ståltråd med 2 dyr pr. bur. Under undersøkelsen ble temperaturen holdt på 21 ± 1 °C, en relativ fuktighet på ± 5 %, luft ble utskiftet 10 ganger pr. time, og fluorescerende lys var på fra 2100 til 0900.

Forsøksutforming

Dyrene ble tilfeldig henvist til 8 forsøksgrupper med 16 dyr og foret med deres respektive dietter i 19 dager (tabell 1). Deretter ble alle grupper dosert med AOM, 15 mg/kg kroppsvekt subkutant 2 ganger med 1 uke fra hverandre. Dyrene ble holdt på sine respektive dietter i et 16-ukers observasjonstidsrom. Kroppsvekt, for- og vannforbruk ble målt ukentlig. Ved avslutning av undersøkelsen ble 10 dyr fra hver av gruppene 1, 6, 7 og 8 anbrakt separat i metabolismebur i 24 timer. Etter skylling med 10 ml vann ble urinen oppsamlet for bestemmelse av volum, pH, kalsium og kreatinin. 18 uker etter den første AOM-injeksjon, ble dyrene avlivet, og serum ble oppsamlet for fremtidig analyse av acetylsalisylsyre. Alle dyrenes bukhule og brysthule ble undersøkt for å avsløre makroskopiske forandringer. Nyrenes- og binyrenes vekt ble registrert. Disse organer, magen, tynntarmen og skjoldbrusk-kjertelen med biskjoldbruskkjertler ble konservert i 4 % bufret formaldehyd, i påvente av fremtidig krav for histopatologisk undersøkelse. Tykktarmen ble skåret på langs, skylt i 0,9 % NaCI og delt i to stykker ved samme lengde, pinnet på en korkflate og fiksert i kald, 4 %, nøytral, bufret formaldehyd ifølge (1).

Tabell 1:

Behandlingsskjema

Uri na na lyse

Analyse for kreatinin og kalsium ble analysert med et Combas Mira S-analyseapparat ved anvendelse av relevant utstyr for hver parameter (Roche Diagnostic Systems).

Vurdering av ACF

ACF ble visualisert ved Giemsa-farging, registrert ved anvendelse av et stereomikroskop med 40-gangers forstørrelse og gruppert i små (1-3 krypter), medium (4,6 krypter), stor (7-9 krypter), ekstra stor (>.10 krypter) og ACF>7 (>7 krypter). ACF ble skjelnet fra normale krypter ifølge (1).

Vurdering av tumorer

Tarmvev-avvik som ble mistenkt for å være tumorer ved grovundersøkelse eller under stereomikroskop ble innleiret i parafin, seksjonert 4-6 um og farget med heratoksylin og eosin for histopatologisk undersøkelse.

Statistisk analyse

Alle de presenterte data er gjennomsnitt ± statistisk feil. Énveis-analyse av varians med gjentatte målinger av én faktor ble benyttet for å analysere kroppsvekt og for- og vannkonsum. Analysene ble fulgt av en test av minst signifikant differanse om signifikant. Data om organvekter, urinkjemi og ACF ble analysert ved énveis-analyse av varians etterfulgt av minste kvadraters gjennomsnitt. Homogeniteten i variansen blant gruppene ble evaluert ved vurdering av standard rest-plotter (generell lineær modellprosess). Data om tumorbærende dyr ble analysert ved Fishers eksakte test. En p<0,05 ble ansett for å være signifikant. Alle statistiske analyser ble utført under anvendelse av SAS-frigjøring 6,12.

Resultater og diskusjon

Urinkjemi

Urinvolumet, pH, konsentrasjon av kalsium og kreatinin i gruppe 1, 6, 7 og 8

ble undersøkt (se tabell 2). Kalsiumkonsentrasjonen var statistisk signifikant minsket i gruppen 6 og 8. En ikke-signifikant minskning ble også iakttatt i gruppe 7. Effekten skyldes sannsynligvis en renal retensjon av kalsium indusert av la,25 (OH)2D3. pH i gruppe 7 var statistisk signifikant høyere enn kontrollverdien. Idet ingen signifikante forandringer ble iakttatt i gruppene 6 og 8, er dette sannsynligvis en tilfeldighet. Resultatene viser videre at ingen bivirkning av kombinasjonsbehandlingen ifølge oppfinnelsen iakttas.

a: Gjennomsnitt ± standardavvik.

b: Gruppe 1, kontrolldiett (5000 ppm Ca); gruppe 6, 0,02 ug la,25(OH)2D3, 300 ppm acetylsalisylsyre og 7500 ppm Ca i dietten; gruppe 7, 0,02 ug la,25(OH)2D3, 300 ppm acetylsalisylsyre og 5000 ppm Ca i dietten, gruppe 8, 0,02 Mg la,25(OH)2D3, 300 ppm acetylsalisylsyre og 2500 ppm Ca i dietten.

<*>markerer statistisk signifikans til kontrollgruppe når en test av minste kvadraters gjennomsnitt ble utført (p<0,05).

Organvekt

Den relative organvekt ble beregnet pr. 100 g/kroppsvekt. Sluttkroppsvekten, den absolutte vekt av nyrene og binyrene samt den relative vekt av binyrene ble ikke påvirket av behandling. Den relative nyrevekt i gruppe 5 og 8 ble øket sammenlignet med kontrollgruppen. Forandringene er mindre og antas ikke relatert til behandling.

ACF og tumorer

ACF som mellomliggende biomarkører og ikke tumorer/ kreft var endepunktene for denne undersøkelse. Ikke desto mindre utviklet et antall dyr tumorer under forsøket. Ifølge adenom-karsinomsekvensen representerer tumorer karsinogenese i sent stadium og er derfor ikke inkludert i resultatene. ACF, ekstra stor ACF og tumorer representerer lesjoner med signifikant korrelasjon til etterfølgende invasiv kreft og kreftrelatert død. Gruppen av dyr med lesjoner inneholdende mer enn 7 krypter (ACF>7) anses for å være høyrisikodyr når det gjelder utvikling av kreft.

Det totale antall og fordelingen av ACF og tumorer er angitt i tabell 3 og i tillegg 3.

Dyr som ble foret med lavkalsiumdiett av 2500 ppm (som etterlignet en gammel menneskepopulasjon i den vestlige verden) var mest utsatt for ACF-utvikling. Økende kalsiumnivåer i dietten senket antallet ACF vesentlig. I dyr som ble foret med 7500 ppm kalsium og l,25(OH)2-D3ble det iakttatt en statistisk signifikant minskning av det totale antall ACF sammenlignet med gruppe 1 og 2 (henholdsvis 35,1 i forhold til 61,7 og 35,1 i forhold til 88,3). I dyr som ble foret med 7500 ppm kalsium, l,25(OH)2D3og ACF ble det iakttatt en uvesentlig minskning av total ACF sammenlignet med gruppe 1 (44,6 i forhold til 61,7).

a: Gjennomsnitt ± standard feil

b: Små-foki: 1-3 krypter: Middels foki: 4-6 krypter; Store foki: 7,9 krypter; Ekstra store foki: >. 10 krypter; ACF>7: >7 krypter.

c: Gruppe 1: Normal kalsiumkontrollgruppe (5000 ppm Ca); Gruppe 2: Lav kalsiumkontrollgruppe (2000 ppm Ca); Gruppe 3: Supplert kalsiumgruppe (7500 ppm Ca); Gruppe 4: 0,02 ug la,25(OH)2D3og 7500 ppm Ca; Gruppe 5: 300 ppm acetylsalisylsyre og 7500 Ca; Gruppe 6: 0, 02 ug la,25(OH)2D3, 300 ppm acetylsalisylsyre og 7500 Ca; Gruppe 7: 0,02 ug la,25(OH)2D3, 300 ppm

acetylsalisylsyre og 5000 ppm Ca; Gruppe 8: 0,02 ug la ,25(OH)2D3, 300 ppm acetylsalisylsyre og 2500 ppm Ca.

Ved sammenligning av høyrisikogruppen (ACF>7) og lavkalsiumdietten (2500 ppm) med høyrisikogruppen behandlet med de tre aktive ingredienser (Gruppe 6) ses det en høyst signifikant minskning av antallet tarmlesjoner (ACF>7) (6,1 i forhold til 1,8, p=0,0001).

Separat tilsetning av kalsium, la,25(OH)2D3eller ASA, eller kombinasjoner av to, ga også signifikante minskninger i ACF, noe som indikerer en beskyttende effekt. Den mest uttalte effekt blir oppnådd med kombinasjonen av alle tre ingredienser, noe som antyder en additiv/synergistisk effekt.

Ved betraktning av lavkalsiumdietter skyldtes økningen av totalt antall ACF i Gruppe 8 primært en økning i liten ACF. Mens i Gruppe 2, i tillegg til en ikke-statistisk signifikant økning liten ACF (p=0,061) ble statistisk signifikante økninger i middels, store ACF og ACF>7 iakttatt. Dette viser at tilsetning av la,25(OH)2D3og ASA til foret beskytter mot utvikling av ACF i dyr som gis mindre enn optimalt kalsium (2500 ppm). Ved økning av kalsium til et høyere nivå (5000 ppm) ses det en innlysende trend (1,8 i forhold til 3,2, p=0.19), noe som understøtter antikreft-effekten av la,25(OH)2D3og ASA.

Som konklusjon resulterer behandling av dyr som er gitt en lavkalsiumdiett med kombinasjonen av la,25 (OH)2D3, Ca og ASA i en statistisk signifikant minskning i utviklingen av pre-neoplastiske tarmlesjoner.

Tumorer

Tumorbærende rotter ble iakttatt i alle grupper (tabell 4). De presenterte resultater bør tas med forsiktighet idet ytterligere histiologisk undersøkelse er nødvendig for endelig evaluering. Ved autopsi viste noen av lesjonene seg som meget iøynefallende og tumorlignende, rødlige, forhøyde og fra 1 til 15 mm i diameter. Mens andre lesjoner var mindre forhøyde og hadde farge som slimhinnen. Noen dyr hadde mer enn én tumor, ofte fra 2 til 3. Andre lesjoner ble bare iakttatt da tarmen ble undersøkt under stereomikroskop fortelling av ACF. Tumorer ble også iakttatt i tynntarmen hos ett dyr i gruppe 1, 5, 7 og 8. I Gruppe 2 hadde to dyr tumorer i sin tynntarm (ikke histologisk undersøkt). Det høyeste antall tumorbærende dyr og totalt antall tumorer ble iakttatt i gruppe 3 og 4. Gruppe 8, som mottok det laveste kalsiumnivå i kombinasjon med ASA og la,25 (OH)2D3hadde den laveste tumorbør, fulgt av Gruppe 1. Ved sammenligning av antallet tumorbærende dyr i gruppe 2 og 8 (som begge mottok kalsium på det laveste nivå) viser resultatene en beskyttende effekt av kombinasjonen ASA og la,25 (OH)2D3. En lignende, men mindre uttalt tendens ses ved sammenligning av gruppe 3 og 6 (som begge mottok det høyeste kalsiumnivå).

Tumordata indikerer at kombinasjonen av la,25 (OH)2D3og ASA gitt til dyr foret enten med høyt eller lavt nivå av kalsium (gruppe 6 og 8) tenderte til å minske antallet tumorbærende dyr og det totale antallet tumorer sammenlignet med den relevante kontrollgruppe som mottok samme kalsiumnivå. Selv om minskningen er ikke-statistisk signifikant indikerer dette beskyttelse mot utvikling av ACF til adenom. Særlig på det lave kalsiumnivå hvor det høyeste antall ACF ble registrert, men det laveste antall tumorbærende dyr.

a: Gruppe 1, kontrolldiett (5000 ppm Ca); Gruppe 2, 2500 ppm Ca i dietten, Gruppe 3, 7500 ppm Ca i dietten; Gruppe 4, 0,02 ug la,25(OH)2D3i dietten; Gruppe 5, 300 ppm acetylsalisylsyre og 7500 ppm Ca i dietten; Gruppe 6, 0,02 ug la,25(OH)2D3, 300 ppm acetylsalisylsyre og 7500 ppm Ca i dietten; Gruppe 7, 0,02 Mg la,25 (OH)2D3, 300 ppm acetylsalisylsyre og 5000 ppm Ca i dietten; Gruppe 8, 0,02M9la,25 (OH)2D3, 300 ppm acetylsalisylsyre og 2500 ppm Ca i dietten.

b: Inklusivt slimhinne-adenokarsinom og signet-ringkarsinom.

Eksempel 2

Undersøkelse in vivo av effekten på hindring ac CRC i AOM (azoksymetan)-induserte rotter.

Rottene ble indusert subkutant 1 gang pr. uke i 2 uker med en AOM-løsning.

Effekten av den spesifikke behandling ble evaluert pga. antallet aberrante krypt-foki (ACF) i tarmen/endetarmen i AOM-induserte rotter. Det aberrante krypt score ble evaluert ved stereomikroskopi (40 X) etter farging med Giemsa-løsning (6 ml konsentrert Giemsa i 50 ml PBS, pH 7,1). Krypt-størrelsen ble kategorisert som liten, middels, stor og ekstra stor. Antallet dyr var 80 med 16 i hver gruppe. Medikamentene ble administrert sammen med foret. Seksjonen var 18 uker fra den første dose. Ca i foret var 5000/10000 ppm, og 1,24DHC var 2,5 ug/kg. Data for vekt, for og vann ble registrert og analysert.

Behandling:

«Liten» i tredje spalte er summen av liten og middels i den første spalte.

«Stor» i den tredje spalte er summen stor og ekstra stor i den andre spalte.

Risikoen for malign utvikling (APC og ras-mutasjoner) er korrelert til store og ekstra store krypter.

Aspirindosen som generelt anses for å være preventiv er 400-500 ppm i AOM-induserte F344-rotter.

Resultatene viser at det ikke er mulig å sette ned aspirindosen til 200 ppm idet denne dose er uten effekt (Gruppe 2). Men tilsetningen av Ca og 1,25DHC resulterer i en signifikant minskning i store ACF (Gruppe 4). Resultatene i gruppe 3 og 4 og spesielle, idet det synes som om nærværet av aspirin er en ugunstig effekt. Det skal imidlertid bemerkes at rottene led av hyperkalsemi.

Referanser:

1. MATrujillo, HS Garewal, RE Sampliner. Non-steroidal anti-inflammatory agents in chemoprevention of colorectal cancer. At what cost?

Dig Dis Sei, vol 39, 1994, s. 2260-6.

2. LS Caplan, M Hutton, DS M Muller et al., Secondary prevention of cancer. Curr. Opin. Oncol. Vol 8, 1996, s. 441-6. 3. IH Clemmesen, H Storm, Kræft i Danmark. En oppslagsbok. Kræftens Bekæmpelse 1993. 4. JAK Key, M Thorogood, PN Appleby et al., Dietary habits and mortality in 11000 vegetarians and health conscious people: results of av 17 year follow up. BMJ vol 313, 1996, s. 7060. 5. H Raskov. Adjuverende systemisk kemoterapi ved cancer coli. Ugeskrift for Læger, bind 158, 1996, s. 1222-7. 6. CF Garland, E Barrett-Connor, AH Ressof et al., Dietary vitamin D and calcium and risk of colorectal cancer: a 19-year prospective study in men. Lancet, 1985, s. 307-9. 7. CF Garland, FC Garland, EK Shaw et al., Serum 1,25 hydroxyvitamin D and colon cancer: eight-year prospective study. Lancet 18. Nov. 1989, s. 1176-8. 8. CF Garland, FC Garland, ED Gorham. Can colon cancer incidence and death rates be reduced with calcium and vitamin D? Am. J. Clin. Nutr. Vol 48, 1991, s. 193S-201S. 9. GA Kune, S Kune, LF Watson. Colorectal cancer risk, chronic illnesses, operations and medications: case control results from the Melbourne Colorectal Cancer Study. Cancer Res. Vol 48, 1988, s. 4399-404. 10. O Suh, C Mettlin, NJ Petrelli. Aspirin use, cancer and polyps of the large bowel. Cancer, vol 72, 1993, s. 1171-7. 11. MJ Thun, MM Namboodiri, Health CW Jr. Aspirin use and reduced risk of fatal colon cancer. N. Engl. J. Med. Vol 325, 1991, p 1593-6. 12. JE Buring, IM Lee, CH Hennekens. Non-steroidal inflammatory drugs and colorectal cancer. Cancer, vol 74, 1994, s. 1837-9. 13. CW Health, MJ Thun, ER Greenberg et al., NSAID and human cancer. Cancer, vol 74, 1994, s. 2885-8. 14. BC Pence. Role of calcium in colon cancer prevention:experimental and clinical studies. Mut. Res. Vol 290, 1993, s. 87-95. 15. I Duris, D Hruby, B Pekarkova, M Huorka, E Cernakova, T Bezayova et al., Calcium chemoprevention in colorectal cancer. Hepatograstroeterol. Vol 43, 1996, s. 152-4. 16. M Buset, MLS Winaver, S Swaroop, E Friedmann. Inhibition of human colonic epithelial cell proliferation in vivo and in vitro by calcium. Cancer Res. vol 46, 1986, s. 5426-30. 17. MJ Wargovich, PH Lointier. Calcium and vitamin D modulate mouse colon epithelial proliferation and growth characteristics of a human colon tumor cell line. Can. J. Physiol. Pharmacol. Vol 65, 1987, s. 472-7. 18. IARC Handbooks of Cancer Prevention, vol 1. Non-steroidal anti-inflammatory drugs. Lyons: International Agency for Research on Cancer. In Press. 19. S Dorudi, AM Hanby, R Poulson, J Northover, IR Hart. Levels of expression of E-cadherin m-RNA in colorectal cancer correlates with clinical outcome. Br. J. Cancer, vol 71, 1995, s. 614-6. 20. HL Newmark, M Lipkin. Calcium, vitamin D and colon cancer. Cancer Research vol 52, 1992, s. 2067S-70S. 21. H Rasmussen. The calcium messenger system. N. Engl. J. Med. vol 314, 1986, s. 1094-1101. 22. X Llor, RF Jacoby, BB Teng, NO Davidson, MD Sitrin, TA Brasitus. K-ras mutations in 1,2 dimetylhydrazine includede colonic tumors, effects of supplemental dietary calcium and vitamin D deficiency. Cancer Res. vol 51, 1991, s. 4305-9. 23. R Reshef, P Rozen, Z Fereman, N Fine, M Barzilai, SM Sasha, T Shkolnik. Effect of av calcium enriched diet on the colonic epithelium hyperproliferation induced by Nmetyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine in rats on a low calcium and fat diet. Cancer Res. vol 50, 1990, s. 1764-7. 24. KF Kane, NP Mitchell, MJS Langmann et al., Functional vitamin D3receptors are present in human colorectal neoplasms. Gastroenterology vol 108, 1995, s. A487.

25. Anticancer Res. vol 16, 1996, s. 2333-8.

26. JA Eisman, DH Barkla, PJM Tutton. Suppression of in vivo growth of human cancer solid xenografts by l,25dihydroksyvitamin D3. 27. HL Newmark, M Lipkin. Calcium. Vitamin D and Colon Cancer. Cancer Res. vol 52s, 1992, s. 2067-70. 28. HL Newmark, M Lipkin. Calcium. Vitamin D and Colon Cancer. Cancer Res. vol 52s, 1992, s. 2067s-70s. 29. G Ternent, XZ Ding, T Adrian. Lipoxygenase blocade inhibits growth factor-induced colonic cancer cell proliferation. Abstract, ASCRS Årsmøte 1999, Washington DC. 30. AJ Marcus. Aspirin as prophylaxis against colorectal cancer. N. Engl. Med. vol 333, 1995, s. 656-8. 31. JC Frolich. A classification of NSAIDs according to the relative inhibition of cyclooxygenase enzymes. TIPS vol 18, 1997, s. 30-4. 32. AP Hanif, Y Feng, M Koutsos et al., NSAIDs inhibit the growth of colon cancer cell lines by a prostaglandin independent pathway. Gastroenterology, vol 108, 1995, s. A478. 33. D Ahnen, G Piazza, D Alberts et al. Sulindac sulfide and sulfone both inhibit the growth of colon cancer cell lines by inducing apoptosis. Gastroenterology, vol 108, 1995, s. A443. 34. DS Alberts, U Hixson, D Ahnen, C Bogert, J Einspahr, N Paranka et al. Do NSAIDs exert their colon cancer chemoprevention activities through the inhibition of mucusal prostaglanding synthetase? J. Cell Biochem. Vol 22, 1995, s. 18-23. 35. M Kahlenberg, D Stoler, C Volpe, N Petrelli, G Anderson. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) recluse genomic instability in colorectal tumor celles. Abstract. Surgical Oncology Societies 51 årlige kreft-symposium 1998. 36. G Levy. Prostaglandin H synthases, nonsteroidal anti-inflammatory drugs and colon cancer. FASEB J, vol 11, 1997, s. 234-47. 37. U Hixson, DS Alberts, M Krutzsch, J Einspahr, K Brendel, PH Gross et al. Antiproliferative effect of non-steroidal anti-inflammatory drugs against human colon cancer cells. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. Vol 3, 1994, s. 433-8. 38. RN Dobois, FM Giardello, WE Smalley. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, eicosanoids and colorectal cancer prevention. Gastroenterol. Clin. N. Am. Vol 25, 1996, s. 773-91. 39. AJ Watson. Chemopreventive effects of NSAIDs against colorectal cancer: regulation of apoptosis and mitosis by COX-1 and COX-2. Histol. Histopathol. Vol 13, 1998, s. 591-7. 40. Steering Committee of the Physicians' Health Study Research Group. Final report on the aspirin component of the ongoing Physician Health Study. N. Eng. 3. Med. vol 321, 1989, s. 129-35. 41. JE Muscat, SD Stellman, EL Wynder. NSAID and colorectal cancer, Cancer, vol 74, 1994, s. 1847-54. 42. E Giovannucci, KM Egan, DJ Hunter et al. Aspirin and the risk of colorectal cancer. N. Engl. J. Med. vol 333, 1995, s. 609-14. 43. E Giovannucci, EB Rimm, MJ Stampfer et al. Aspirin use and the risk of colorectal cancer and adenoma in male healthProfessionals. Ann. Int. Med. vol 121, 1994, s. 241-6. 44. M Pollard, PH Luckert. Effect of indomethacin on intestinal tumors induced in rats by the acetate derivative of dimethylnitrosamine. Science, vol 214, 1981, s. 558-9. 45. T Narisawa, M Sato, M Tani et al. Inhibition of development of methylnitrosurea induced rat colon tumors by intomethacin treatment. Cancer Res. vol 41, 1981, s. 1954-7. 46. BS Reddy, H Maruyama, G Kelloff. Dose-related inhibition of colon carcinogenesis by dietary prioxicam, a nonsteroidal anti-inflammatory drug, during different stages of rat colon tumor development. 47. T Kudo, T Narisawa, S Abo. Antitumor activity of indomethacin on methylazoxymethanol-induced large bowel tumors in rats. Gann, vol 71, s. 260-4. 48. CAPRIE Steering Committee. A randomised, blinded, trial of clopidogrel versus aspirin in patients at risk of aschaemic events (CAPRIE). Lancet, vol 348, 1996, s. 1329-39. 49. MA Duffy (ed.), Physicians' Desk Reference. Montvale, NJ. Medical Economics Data, s. 780, 1993. 50. GK McEvoy, GM McQuarrie. Aspirin. In: Drug Information 86, Bethesda, MD: American Society of Hospital Pharmacists, vol 841, 1986, s. 841-8. 51. E Kristiansen, I Thorup and 0 Meyer: Influence of different diets on development of DMH-induced aberrant crypt foci and colon tumor incidence in Wistar rats. Nutr. Cancer, vol 23, 1995, s. 151-159. 52. Dario Diaz et al. : Apoptosis is induced by the active metabolite of vitamin D3and its analogue EB1089 in colorectal adenoma and carcinoma cells: possible implications for prevention and therapy. Cancer Res. vol 60, 2000, s. 2304-2312.

Claims (10)

1. Farmasøytisk medikament,karakterisert vedat det omfatter en kombinasjon av acetylsalisylsyre (ASA), 1,25 dihydroksykolekalsiferol (1,25DHC) og kalsium i en kombinasjonsdosering sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

2. Farmasøytisk medikament ifølge krav 1,karakterisert vedat kombinasjonsdoseringen omfatter 1,25DHC i et område fra 0,1 ug til 2 ug.

3. Farmasøytisk medikament ifølge krav 1 eller 2,karakterisertv e d at kombinasjonsdoseringen omfatter kalsium i området 200 mg til 3000 mg.

4. Farmasøytisk medikament ifølge et av kravene 1-3,karakterisertv e d at kombinasjonsdoseringen omfatter ASA i området 50 mg til 500 mg.

5. Farmasøytisk medikament ifølge et av kravene 1-4,karakterisertv e d at kombinasjonsdoseringen omfatter 50 til 75 mg ASA, 500 til 1000 mg kalsium, og 0,5 ug til 1 ug 1,25DHC.

6. Anvendelse av acetylsalisylsyre (ASA), vitamin D3-metabolitten 1,25 dihydroksykolekalsiferol (1,25DHC) og kalsium sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer for fremstilling av et medikament for å hindre initiering og/eller progresjon av colorektal kreft i et menneske.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor acetylsalisylsyren (ASA) er i området 50 mg til 500 mg.

8. Anvendelse ifølge krav 6 eller 7, hvor kalsium er i området 200 mg til 3000 mg.

9. Anvendelse ifølge et av kravene 6-8, hvor 1,25DHC foreligger i en mengde fra 0,1 Mg til 2 Mg-

10. Anvendelse ifølge et av kravene 6-9, hvor kombinasjonen er i form av en kombinasjonsdosering omfattende ASA, 1,25DHC og kalsium.