CN1766102A - PVA－SbQ的合成及对乙酰胆碱酯酶的固定 - Google Patents

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Abstract

一种PVA－SbQ的合成及对乙酰胆碱酯酶的固定。解决现有技术存在乙酰胆碱酯酶的活力回收率低、活性保持期短的问题。PVA－SbQ的合成是以对苯二甲醛、γ－甲基吡啶为原料经沸水浴回流后，加酸除去剩余对苯二甲醛并将滤液调至中性收集黄色沉淀，与硫酸二甲酯反应后得到SbQ，与PVA溶液混合在微酸性条件下搅拌得PVA－SbQ。对乙酰胆碱酯酶的固定是以PVA－SbQ的磷酸缓冲液为固定液，加入乙酰胆碱酯酶粉混合均匀；吸取20μL于96孔酶标板的板孔中，紫外灯下聚合后将酶标板移入4℃冰箱中放置隔夜，待孔中缓冲液干燥后即可将酶固定住。与其它方法相比，本发明简单易行，经固定化以后的乙酰胆碱酯酶不易渗出、酶的活性保存期可被延长至半年以上，而且酶的活力回收率与其它方法相比有较大提高。

Description

PVA-SbQ的合成及对乙酰胆碱酯酶的固定
【技术领域】：本发明涉及光交联树脂PVA-SbQ的合成及对乙酰胆碱酯酶的固定化技术领域。
【背景技术】：目前已有多种技术被应用到乙酰胆碱酯酶的固定化中，主要有吸附法、包埋法、和交联法等。吸附法的最大优点是不需试剂，只需很小的活化和清洗步骤，而且对酶的损坏要比其他化学方法小。但这种方法对pH改变、温度、离子强度和底物有很大的敏感性，因此使用这种方法要求的条件比较高，而且使用此法酶容易浸出因而酶层的活性下降较快。交联法虽然可将乙酰胆碱酯酶固定的较牢固，但是由于此法需使用双功能试剂，最常用的如戊二醛，它本身可使酶变性失去活性，所以导致酶的活力回收一般都比较低。
聚乙烯醇苯乙烯吡啶(PVA-SbQ)作为一种优良的酶固定化试剂目前在国外得到较广泛的应用，尤其在检测农药残留的生物传感技术中它作为乙酰胆碱酯酶的固定化试剂倍受推崇。光交联树脂聚乙烯醇苯乙烯吡啶(PVA-SbQ)在紫外光的照射下可迅速聚合，并且聚合过程中不会对乙酰胆碱酯酶造成伤害，所以此法的酶活力回收率较高而且酶的固定牢固。但是目前国内外应用的PVA-SbQ大多是日本公司(TOYO GOSEI CO.LTD)提供的，目前国内尚未见到该产品。我们通过反复试验研究探索出一条简便、易行且产率较高的合成PVA-SbQ的方法，并把合成出的产品应用于乙酰胆碱酯酶的固定取得了良好的效果。
【发明内容】：本发明目的是合成出光交联树脂PVA-SbQ，并将其应用到乙酰胆碱酯酶的固定化中，解决现有技术存在乙酰胆碱酯酶的活力回收率低、活性保持期短的问题。提供了PVA-SbQ的合成方法和一种利用PVA-SbQ法在96孔酶标板上固定乙酰胆碱酯酶的技术。专利要求保护的内容为PVA-SbQ的合成路线，及对乙酰胆碱酯酶进行固定时PVA-SbQ的使用浓度。
本发明提供的光交联树脂PVA-SbQ的合成方法包括(以下试剂未经特殊说明均为分析纯)：
——分别取0.2～0.4M对苯二甲醛、0.1～0.2M γ-甲基吡啶、25～30mL醋酸酐、10～12mL醋酸混合均匀，沸水浴加热回流6～8小时。
——向上述溶液中加入300～400mL 1.0M HCl静置1～2小时，过滤除去沉淀物；
——滤液加热至30～40℃，用苯萃取，弃去苯溶液，用NaOH将滤液调至中性；
——过滤收集黄色沉淀即得到对甲酰苯乙烯吡啶，水洗凉干后溶于80～90℃乙酸乙酯中，不溶物过滤除去。
——加入硫酸二甲酯50mL，放置隔夜，过滤；
——收集滤渣即得到1-甲基-2-(对甲酰苯乙烯基)吡啶甲硫酸盐(SbQ)，分别用甲醇和丙酮洗涤，P2O5干燥后避光保存；
——取4～5g SbQ和6～8mL85％浓磷酸，加入聚乙烯醇(PVA)溶液中(50gPVA溶于600mL蒸馏水中配制而成)；
——室温避光搅拌24h后，缓慢倾入丙酮中，过滤收集黄色沉淀；
——甲醇洗涤，经干燥后即得PVA-SbQ。
本发明提供的PVA-SbQ法在96孔酶标板上固定乙酰胆碱酯酶技术包括：
——以pH＝8.0的0.1M磷酸缓冲液5mL为介质。
——加入300～400mg的PVA-SbQ，在60～70℃的水浴中加热溶解作为乙酰胆碱酯酶固定液。
——吸取上述固定液1mL加入0.3U的乙酰胆碱酯酶粉，缓慢混合均匀。吸取20μL于96孔酶标板的板孔中，在20瓦紫外灯下照射聚合30分钟后将酶标板移入4℃冰箱中放置隔夜待孔中缓冲液干燥后即可将酶牢固的固定住。
本发明的优点和积极效果：本法提供的PVA-SbQ合成路线简便易行不需复杂设备，而且产率较高。在乙酰胆碱酯酶的固定方面与其它方法相比，此法简单易行，经固定化以后的乙酰胆碱酯酶不易渗出、酶的活性保存期可被延长至半年以上，而且与其它方法相比酶的活力回收率有较大提高。
【具体实施方式】：
实施例1：PVA-SbQ的合成：
分别向圆底烧瓶中加入26.8g对苯二甲醛、9.3g γ-甲基吡啶、26mL醋酸酐和11.5mL醋酸，在沸水浴中加热回流6h。向圆底烧瓶中加入300mL 1.0MHCl静置1小时，过滤除去沉淀物收集滤液，将滤液加热至40℃，用苯萃取两次(40mL×2)，弃去上层苯溶液，下层滤液用NaOH调至中性，在此过程中会有黄色沉淀析出，过滤收集此沉淀并用50mL蒸馏水分3次洗涤滤渣凉干后即得到对甲酰苯乙烯吡啶。将滤渣溶于80～90℃的乙酸乙酯中，过滤除去不溶物，向滤液中加入50mL硫酸二甲酯放置隔夜，过滤，所得滤渣即为1-甲基-2-(对甲酰苯乙烯基)吡啶甲硫酸盐(SbQ)，用20mL甲醇和丙酮各洗涤2次，P2O5干燥避光保存。
称取50gPVA于600mL蒸馏水中，在水浴锅上缓慢加热至90℃保温2小时，待溶解后过28目不锈钢筛除去杂质。取4gSbQ及6mL85％浓磷酸加入上述PVA溶液中。避光搅拌24h，缓慢倾入500mL丙酮中过滤收集黄色沉淀，用50mL甲醇分3次进行洗涤即得PVA-SbQ，干燥后避光保存备用。
实施例2：乙酰胆碱酯酶的固定：
向5mL0.1MpH＝8.0的磷酸缓冲液中加入300mgPVA-SbQ，在60～70℃的水浴中加热溶解作为乙酰胆碱酯酶固定液。吸取上述PVA-SbQ溶液1mL，加入0.3U的乙酰胆碱酯酶粉，用单道移液器缓慢混合均匀。吸取此酶溶液20μL于96孔酶标板的板孔中，在20瓦紫外灯下照射聚合30分钟后将酶标板移入4℃冰箱中放置隔夜，待孔中缓冲液干燥后即可将酶牢固的固定住。

Claims (2)

1、一种光交联树脂PVA-SbQ的合成方法，其特征是该方法包括：
——分别取0.2～0.4M对苯二甲醛、0.1～0.2M γ-甲基吡啶、25～30mL醋酸酐、10～12mL冰醋酸混合均匀，沸水浴加热回流6～8小时；
——向上述溶液中加入300mL 1.0M HCl静置1～2小时，过滤除去沉淀物；
——滤液加热至30～40℃，用苯萃取，弃去苯溶液，用NaOH将滤液调至中性；
——过滤收集黄色沉淀，水洗凉干即得到对甲酰苯乙烯吡啶，滤渣溶于80～90℃乙酸乙酯中，不溶物过滤除去。
——加入硫酸二甲酯50mL，放置隔夜，过滤；
——收集滤渣即得1-甲基-2-(对甲酰苯乙烯基)吡啶甲硫酸盐(SbQ)，分别用甲醇和丙酮洗涤，P2O5干燥后避光保存；
——取4～5g SbQ和6～8mL85％磷酸，加入聚乙烯醇(PVA)溶液中(50gPVA溶于600mL蒸馏水中配制而成)；
——室温避光搅拌24h后，缓慢倾入丙酮中，过滤收集黄色沉淀；
——甲醇洗涤，经干燥后即得PVA-SbQ。
2、一种PVA-SbQ法在96孔酶标板上固定乙酰胆碱酯酶技术，其特征是该法包括：
——以pH＝8.0的0.1M磷酸缓冲液为介质；
——每5mL磷酸缓冲液加入300～400mg的PVA-SbQ，在60～70℃的水浴中加热溶解作为乙酰胆碱酯酶固定液；
——吸取上述固定液1mL加入0.3U的乙酰胆碱酯酶粉缓慢混合均匀；吸取20μL于96孔酶标板的板孔中，在20瓦紫外灯下照射聚合30分钟后将酶标板移入4℃冰箱中放置隔夜，待孔中缓冲液干燥后即可将酶牢固的固定住。
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