CN1763029A

CN1763029A - 从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法

Info

Publication number: CN1763029A
Application number: CN 200510060645
Authority: CN
Inventors: 潘远江; 卢延斌
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-09-06
Filing date: 2005-09-06
Publication date: 2006-04-26

Abstract

本发明涉及从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法，采用的是一种连续的无需任何固体支持物的液液分配逆流色谱方法，它避免了固态支持体或载体造成的吸附、损耗和变性等问题，能保证较高的峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂，能直接分离大量冬凌草甲素粗提样品，分离得到的甲素纯度可达到97％以上。而且所用的逆流色谱仪为普通仪器，它较高效液相色谱仪远为简单便宜，所用的溶剂为正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚类或水中的两种或两种以上的混合物，经济性好。

Description

从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法

技术领域

本发明涉及从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法，特别是采用逆流色谱法从冬凌草粗品中分离制备单体冬凌草甲素的方法。

背景技术

冬凌草甲素是冬凌草中的主要二萜成分之一，其结构式如式I所示：

式I

冬凌草，学名碎米桠(Rabdosia rubescens Hera.)，是一种唇行科香茶菜属植物，产于我国山西、河南以及河北等地。我国科学家在七十年代发现了其主要成分冬凌草甲素具有显著的抗癌活性。近年来的研究也表明冬凌草甲素具有良好的抗肿瘤作用，且无明显的毒性，因此，关于冬凌草甲素的研究工作受到了科学家的广泛关注，分离制备高纯的化合物单体也成为研究的一个重要内容。然而，冬凌草甲素的化学性质极不稳定，给分离工作带来了一定的困难。而且采用传统的分离技术如薄层色谱、柱色谱时，常常因为固体载体的吸附而产生拖尾、污染、损耗，结果很难获得较高纯度的化合物单体。

发明内容

本发明的目的是提供一种低成本、高回收率、高纯度、适合于大规模从冬凌草中分离制备高纯度冬凌草甲素的方法。

本发明从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法采用的是逆流色谱方法，包括以下步骤：

1)将冬凌草药材粉末用有机溶剂反复浸提，将提取液合并、浓缩成浸膏，将所得浸膏烘干，得到浅棕色的粉末，再用正相硅胶柱层析，得到冬凌草甲素粗提物；

2)将用于逆流色谱分离用的溶剂倒入分液器中，形成互不相溶的两相溶剂；

3)将冬凌草甲素粗品溶于步骤2)中等体积的两相混合溶剂中，得到冬凌草甲素样品溶液；

4)将步骤2)两相溶剂中的一相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤3)所得的冬凌草粗品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入两相溶剂中的另一相作移动相，冬凌草甲素便在逆流色谱仪内进行连续的分配，通过紫外检测器的在线监测，收集、合并流出物，得到纯化的冬凌草甲素。

上述步骤1)所说的有机溶剂可以是脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯或醚。其中脂肪醇可以选用甲醇、乙醇或正丁醇；脂肪酮可以选用丙酮；脂肪酯可以选用乙酸乙酯；醚可以选用石油醚或乙醚。

上述步骤2)所说的用于分离的溶剂可为正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚类和水中的两种或两种以上的混合物，其中的正构烷烃可以选用正庚烷、正己烷；卤代烃可以选用氯仿、二氯甲烷或四氯化碳；脂肪醇可以选用甲醇、乙醇或正丁醇；脂肪酮可以选用丙酮；脂肪酯可以选用乙酸乙酯；醚可以选用石油醚或乙醚。这些溶剂对冬凌草甲素有较好的分配系数。

本发明采用的逆流色谱方法是一种连续的无需任何固体支持物的液液分配色谱方法，它避免了固态支持体或载体造成的吸附、损耗和变性等问题，能保证较高的峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂，能直接分离大量冬凌草甲素粗提样品，分离得到的甲素纯度一般可达到97％以上。而且所用的逆流色谱仪为普通仪器，它较高效液相色谱仪远为简单便宜，其溶剂由普通溶剂配制，价格便宜，因此是一种经济的从冬凌草提取物中分离冬凌草甲素的方法。

附图说明

图1为实施例1中冬凌草甲素粗品的高效液相分析图(图中1为冬凌草甲素)；

图2为实施例1中分离冬凌草甲素的逆流色谱图(图中1为冬凌草甲素)；

图3为实施例1中分离纯化的冬凌草甲素的高效液相分析图(图中1冬凌草甲素)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。

实施例1

1.将5kg干的冬凌草药材粉末用95％乙醇10L加热回流3次，每次2小时，抽滤出溶剂，在滤渣中再加入10L的95％乙醇，重复以上操作三次，将提取液合并用真空旋转蒸发器减压浓缩成浸膏，浓缩温度为40℃，烘干后得200g冬凌草粗品。将所得粗品进行正相硅胶柱层析，层析柱尺寸为：150cm×8cm，用石油醚与丙酮以8∶1，6∶1，4∶1，2∶1，1∶1的体积比连续洗脱，流速为10-15ml/min，得到冬凌草甲素粗品，其高效液相分析如图1所示，冬凌草甲素的含量为65.8％。

2.用逆流色谱仪分离冬凌草甲素提取物。用正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，按体积比为1∶2∶1∶2配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将冬凌草粗品500mg溶于10ml上相和10ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径4mm，柱体积为1600ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为400转，以4ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长238nm，收集、合并流出物，得到冬凌草甲素，其纯度为98.4％，见图2和图3。冬凌草甲素的一维核磁共振波谱及质谱数据如下：¹H NMR(500MHz，C₅D₅N)：δppm：1.138(3H，s，-CH₃)，1.299(3H，s，-CH₃)，3.644(1H，t，J＝8Hz，H-1)，4.276(1H，q，J＝10.0，7.0Hz，H-6α)，4.414(1H，d，J＝10.0Hz，H-20)，4.792(1H，d，J＝10.0Hz，H-20)，5.336(1H，s，H-14)，5.506(1H，s，H-17)，5.945(1H，br s，-OH)，6.282(1H，s，H-17)，6.935(1H，d，J＝10.0Hz，-OH-6)；¹³C NMR(125MHz，C₅D₅N)：δppm：20.803(C-11)，22.615(C-19)，30.955(C-2)，31.334(C-12)，33.764(C-18)，34.479(C-4)，39.797(C-3)，42.193(C-10)，44.383(C-13)，54.620(C-9)，61.014(C-5)，63.413(C-8)，64.433(C-20)，73.559(C-14)，73.948(C-6)，75.252(C-1)，98.873(C-7)，119.523(C-17)，153.826(C-16)，209.704(C-15)；ESI-MS：[M+H]⁺：365，[M+Na]⁺：387，[2M+Na]⁺：751.

实施例2：

冬凌草甲素粗品制备方式同实施例1，用逆流色谱仪分离冬凌草甲素提取物。用石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水，按体积比为1.5∶2.5∶1.5∶2.5配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将冬凌草甲素粗品300mg溶于8ml上相和8ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径2.6mm，柱体积为850ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为500转，以3ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长238nm，收集、合并流出物，得到冬凌草甲素，其纯度为97.9％。

实施例3：

冬凌草甲素粗品制备方式同实施例1，用逆流色谱仪分离冬凌草甲素提取物。用氯仿、甲醇和水，按体积比为4∶3∶2配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将冬凌草甲素粗品150mg溶于5ml上相和5ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径1.6mm，柱体积为320ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为800转，以1.5ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长238nm，收集、合并流出物，得到冬凌草甲素，其纯度为98.6％。

Claims

1.从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法，其特征包括以下步骤：

4)将步骤2)两相溶剂中的一相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤3)所得的冬凌草甲素粗品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入两相溶剂中的另一相作移动相，冬凌草甲素便在逆流色谱仪内进行连续的分配，通过紫外检测器的在线监测，收集、合并流出物，得到纯化的冬凌草甲素。

2.根据权利要求1所述的从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法，其特征是步骤1)所说的有机溶剂是脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯或醚。

3.根据权利要求2所述的从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法，其特征是所说的脂肪醇选用甲醇、乙醇或正丁醇；脂肪酮选用丙酮；脂肪酯选用乙酸乙酯；醚选用石油醚或乙醚。

4.根据权利要求1所述的从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法，其特征是步骤2)所说的逆流色谱分离用的溶剂为正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚类和水中的两种或两种以上的混合物。

5.根据权利要求4所述的从冬凌草中分离冬凌草甲素的方法，其特征是所说的正构烷烃选用正庚烷或正己烷；卤代烃选用氯仿、二氯甲烷或四氯化碳；脂肪醇选用甲醇、乙醇或正丁醇；脂肪酮选用丙酮；脂肪酯选用乙酸乙酯；醚选用石油醚或乙醚。