CN1754576A - 一种肿瘤细胞疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤细胞疫苗的制备方法，旨在提供一种不仅能够增加基因载体的转导效率、增加外源基因的表达量，而且能够增加免疫分子Hsp－70、MHC－I、MHC－II、ICAM的表达量的肿瘤细胞疫苗制备方法，利用本方法制备的肿瘤细胞疫苗，不仅保证了肿瘤细胞疫苗回输人体的安全性，而且可以增加肿瘤细胞疫苗的抗原性，促进机体产生针对肿瘤细胞的特异性免疫反应，增强肿瘤细胞疫苗的疗效。本发明通过下述技术方案实现：对细胞进行转基因操作；将细胞在42～45℃加热30～120分钟。本发明的主要用途是：制备自体或异体肿瘤细胞疫苗；体外诱导制备特异性抗肿瘤CTL；制备直接参与免疫反应，或作为外源基因分泌细胞的树突细胞、成纤维细胞等其他自体或异体的非肿瘤细胞。

Description

一种肿瘤细胞疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种肿瘤细胞疫苗的制备方法，具体的讲，它涉及一种对细胞进行转基因并结合加热处理来制备肿瘤细胞疫苗的方法。

背景技术

近年来，肿瘤细胞疫苗的发展为肿瘤的治疗带来了希望。目前用来制备肿瘤细胞疫苗的细胞主要有肿瘤细胞和抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells，APC)两种，所采用的方法通常有以下几种：1.直接将死亡的全肿瘤细胞或者肿瘤细胞溶解物作为肿瘤疫苗；2.将进行了基因修饰的APC(一般是DC)作为肿瘤疫苗；3.将抗原提呈细胞尤其是树突状细胞(Dendritic cells，DC)与肿瘤细胞进行融合形成杂交细胞，以杂交细胞的提取物作为肿瘤疫苗(一种肿瘤免疫治疗及预防性疫苗的组成、制备、应用方案，申请号02153446.2)；4.将进行了基因修饰的肿瘤细胞经过处理后制成肿瘤疫苗(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)。其中，将细胞进行基因修饰的方法一般采用转基因操作，将编码肿瘤细胞缺少的蛋白质的基因、细胞因子基因(如GM-CSF)或者编码“协同刺激分子”(如B7-1)的基因转入肿瘤细胞或DC，从而增强细胞的抗原提呈能力，增加细胞的免疫原性，纠正患者的“免疫耐受状态”，激发和强化患者自身的特异性抗肿瘤免疫功能。

目前认为APC功能异常可能是导致肿瘤患者体内缺乏有效的抗肿瘤免疫反应的重要原因，从而造成肿瘤患者的低免疫原性，而不能产生免疫应答。粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)是APC分化、成熟过程中最关键的细胞因子之一，它具有免疫佐剂的作用，能够增强APC的功能，促进APC的增殖和分化，增强APC的吞噬能力而摄取足够的抗原量，增加细胞膜表面MHC分子、辅助刺激分子和粘附分子等的表达，促进细胞分泌细胞因子等。现有报道GM-CSF能显著上调人外周血单个核细胞B7-1和B7-2的表达，并促进APC通过B7分子与T细胞的CD28分子结合，使T细胞释放GM-CSF，而GM-CSF又促进APC表面表达B7分子，在APC和T细胞之间通过GM-CSF形成正反馈调节途径。小鼠黑色素瘤细胞株B16是不表达MHC-II类抗原的，因此不能递呈抗原，无免疫原性，经体内外研究它不能诱导产生针对B16细胞的细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。但在小鼠免疫接种过程中将GM-CSF注射13天，与无佐剂的免疫接种相比，主要和次要的免疫应答反应均得到增强，这说明GM-CSF通过提高APC的功能可以使机体的免疫应答得到增强，调节免疫反应。目前GM-CSF诱导抗肿瘤免疫反应主要用于以下五个方面：(1)GM-CSF基因转化的肿瘤细胞用于预防接种；(2)GM-CSF可以增强抗原激发和DC前体细胞的培养；(3)抗原-GM-CSF融合蛋白进行免疫接种；(4)GM-CSF与单抗共同注射用于单抗治疗以增强自发性网络状反应；(5)与抗原接种有关的GM-CSF的应用。经GM-CSF基因修饰的DC能够高表达B7协同刺激分子和其它粘附分子，从而能更有效地提呈抗原，诱导特异性的抗肿瘤CTL反应。有文献报道，接种GM-CSF转基因疫苗可使90％以上的NSCLC患者产生特异性抗瘤免疫反应(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)。

在进行了转基因操作的肿瘤疫苗制备过程中，细胞的处理过程是十分关键的，对于细胞的处理希望达到三个目的：1.使细胞不能增殖，保证进入体内的肿瘤细胞不会发展成新的肿瘤灶；2.增加基因表达效率，在基因修饰肿瘤疫苗中，目的基因的表达效率是影响疗效的关键因素；3.促进细胞抗原相关蛋白的表达，如Hsp-70、MHC-I，这些蛋白可以促进细胞肿瘤抗原的呈递，增加肿瘤抗原性。以上这三点对于转基因肿瘤疫苗的安全性和有效性都是十分重要的，这三个方面的改进会进一步增加疗效。

传统的细胞处理方式有射线照射(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)、化疗药物等。但这些方法只能使细胞不再增殖，而对基因载体的转导效率，转入的外源基因的表达量，以及细胞抗原蛋白的表达量基本没有影响。有文献指出，对肿瘤细胞进行加热处理能够增加Hsp-70分子的表达量(Todryk，S.M.，Cancer Immunol.Immunother.2004)。而且，加热处理后的肿瘤细胞在肿瘤转移实验中只能够短暂生长，然后就失去增殖能力(Mise，K.，Cancer Res.1990)。

参考文献及专利：

文献：

1.Nemunaitis，J.

GVAX(GMCSF gene modified tumor vaccine)in advanced stage non small cell lung cancer.J.Control Release.2003 Aug 28；91(1-2)：225-31.

2.Todryk，S.M.，Eaton，J.，Birchall，L.，Greenhalgh，R.，Soars，D.，Dalgleish，A.G，Melcher, A.A.，Pandha，H.S.

Heated tumour cells of autologous and allogeneic origin elicit anti-tumour immunity.

Cancer Immunol.Immunother.2004 Apr；53(4)：323-30.Epub 2003 Nov 28.

3.Mise，K.，Kan，N.，Okino，T.，Nakanishi，M.，Satoh，K.，Teramura，Y.，Yamasaki，S.，Ohgaki，K.，Tobe，T.

Effect of heat treatment on tumor cells and antitumor effector cells.

Cancer Res.1990 Oct 1；50(19)：6199-202.

专利：

一种肿瘤免疫治疗及预防性疫苗的组成、制备、应用方案，申请号02153446.2，申请日2002.11.29。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种对细胞进行转基因操作结合加热处理来制备肿瘤细胞疫苗的方法，经过这样的处理后，基因载体的转导效率明显增加，外源基因的表达量增加，更好的实现转基因的效果；同时，有利于细胞抗原暴露的免疫分子Hsp-70、MHC-I、MHC-II、ICAM的表达量也明显增加，从而增强肿瘤疫苗激发的特异性免疫反应，增加肿瘤疫苗的疗效。

本发明是通过下述技术方案实现的：将手术切除的肿瘤组织，通过机械分离或酶消化法或直接通过100目细胞筛，制备成肿瘤细胞单细胞悬液；然后用能够表达粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组腺病毒(Ad-GM-CSF)感染这些原代细胞或培养增殖后的细胞；细胞在42～45℃加热处理30～120分钟，即可得到该种肿瘤的自体肿瘤细胞疫苗。对于难以获得肿瘤组织的情况下，也可以应用有相同肿瘤抗原的肿瘤细胞株来替代手术切除的肿瘤组织，例如前列腺癌细胞株PSA(+)、肺癌细胞株A549、黑色素瘤细胞株A375、肝癌细胞株Hep3B，或者其他异体细胞来进行上述操作，制备异体肿瘤细胞疫苗。

所述加热处理的温度最好是42℃，所述加热处理时间最好为60分钟。

本发明所述的方法中，在对细胞进行转基因操作和加热处理时，可以先进行转基因操作再进行加热处理，也可以先进行加热处理再进行转基因操作，也可以将转基因操作与加热处理同时进行。

除了肿瘤细胞以外，本发明也可以处理树突细胞、成纤维细胞等其他自体或异体的非肿瘤细胞，这些细胞在处理后可以直接参与免疫反应，或作为外源基因的分泌细胞，实现外源基因表达产物在局部的高浓度。本发明也可用于肿瘤疫苗制备以外需要使细胞不再增殖，同时增加外源基因的转染效率或免疫相关分子的表达增高的其他情况。

本发明中进行转基因操作时应用的转基因载体可以是腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体，也可以是质粒DNA载体。

本发明中应用的腺病毒载体是Ad5F35腺病毒载体，它属于B组腺病毒。与通常使用的腺病毒通过CAR受体来感染细胞不同，B组腺病毒用CD46细胞受体作为吸附受体。CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白，几乎在所有的人类体细胞表面都存在。所以应用Ad5F35作为载体来进行转基因操作转染造血干细胞、树突状细胞和恶性肿瘤细胞等靶细胞时，可以克服应用一般腺病毒作为载体进行转染时感染效率低的缺点。

应用本发明处理细胞时，外源基因表达效率的提高不是由转导的基因种类引起的，因此多种基因都可以用于转染，以适应不同的设计需要，例如IL-2、Hsp70、IL-7、B7-1等各种免疫分子的基因，或CEA、PSA等各种抗原基因，以及其他治疗用具有免疫活性的目的基因或报告基因。

本发明中加热处理的方法可以有多种，例如气浴、水浴、金属加热等方法。只要42～45℃的温度持续30～120分钟，就能够达到使处理后的细胞丧失增殖能力，进入凋亡状态，同时保持细胞的蛋白表达能力的效果。

与现有技术相比，加热处理转基因操作的细胞，能够使细胞受到创伤并丧失增殖能力，与传统的采取射线照射方法处理细胞效果相同。另外，加热处理后，外源基因转染细胞的效率明显增高，外源基因的表达也明显增强。而且由于细胞在受到热激处理后的反应，细胞的免疫分子如Hsp-70、MHC-I、MHC-II以及ICAM的表达增加。因此，经过本发明处理所制备的肿瘤疫苗在保证了经加热处理的细胞回输人体的安全性的同时，可以增加肿瘤疫苗的抗原性，促进机体产生针对肿瘤细胞的免疫反应，增强疫苗的疗效。

附图说明

图1.加热处理和照射处理对外源基因转染效率的影响

图中绿色荧光显示转染外源基因后细胞中表达的GFP。细胞经过不同处理，表达GFP的外源基因转染效率为：未处理组＜照射处理组＜加热处理组。

图2.加热处理和照射处理对外源基因表达量的影响

感染了Ad-GM-CSF的细胞，经过不同处理后，未处理组及照射处理组GM-CSF的表达量基本相同，而加热处理组的表达量明显增加。

图3.加热处理和照射处理对免疫相关分子MHC-I、MHC-II、ICAM表达量的影响

A图中显示的是照射处理的细胞进行流式细胞仪检测的结果；B图中显示的是加热处理的细胞进行流式细胞仪检测的结果。结果表明：经加热处理的A549细胞表面的MHC-I、MHC-II、ICAM的表达量增加。

图4.加热处理和照射处理对免疫相关分子Hsp-70表达量的影响

1.加热处理的细胞中Hsp-70的表达量；2.照射处理的细胞中Hsp-70的表达量；3.未经处理的细胞中Hsp-70的表达量。结果表明：经加热处理的A549细胞中Hsp-70的表达增加，明显多于照射处理组和对照组。

图5.采用加热处理与照射处理制备的肿瘤疫苗对小鼠肿瘤动物模型的治疗效果

图a显示：接种了黑色素瘤细胞的小鼠，分别注射加热处理与照射处理制备的肿瘤疫苗后，肿瘤平均瘤块体积：对照组＞照射处理组＞加热处理组；

图b显示：接种了黑色素瘤细胞的小鼠，分别注射加热处理与照射处理制备的肿瘤疫苗后，存活率：对照组＜照射处理组＜加热处理组；

图c显示：接种了黑色素瘤细胞的小鼠，分别注射加热处理与照射处理制备的肿瘤疫苗后，无瘤生存率：对照组＜照射处理组＜加热处理组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的描述。

实施例1：自体肿瘤疫苗的制备

所述操作均在无菌条件下进行

1.肿瘤细胞悬液的制备，

1.1将手术取得的肿瘤组织置于无血清培养基中，冰浴条件下送至细胞治疗中心，可于4℃保存，但不应超过24小时。

1.2将肿瘤标本在标本浸泡液(Hanks液或1640培养基配制，含青霉素500～1000单位/mL、链霉素500单位/mL、两性霉素2ug/mL)中浸泡15～30分钟。

1.3取出标本置于平皿中，用眼科剪将标本切成1mm³小块；可选酶消化法：按1∶2(v/v)加入消化液(Hanks液或1640培养基配制，含0.25％胰蛋白酶、0.1～0.3ug/mL胶原酶)，置于37℃摇床消化或每15分钟震荡一次至液体明显混浊；或者可以直接通过100目细胞筛，以注射器针芯轻柔碾压使细胞通过细胞筛。

1.4以无血清培养基收集细胞，PBS清洗两遍。800～1000g离心10分钟后，少量无血清培养基重悬细胞，计数，以含5％人AB型血清培养基反复吹打细胞，制成单细胞悬液(以下列条件培养：细胞密度10⁶cell/mL；无血清培养基+5％人AB型血清；37℃；5％CO₂)

2.转基因操作

上述细胞培养2～3小时后，以MOI＝10的剂量加入Ad-GM-CSF，感染12～16小时。

3.加热处理

用胰蛋白酶消化收集上述经Ad-GM-CSF感染的细胞，用培养液重悬于离心管中，每管3～8mL，置于42℃水浴1小时。

4.制备好的自体肿瘤细胞疫苗保存在低温环境下备用。

实施例2：同种异体肿瘤细胞疫苗的制备

前列腺癌细胞株PSA(+)、肺癌细胞株A549、黑色素瘤细胞株A375、肝癌细胞株Hep3B可分别用于制备相应的肿瘤疫苗，本实施例以A549为例进行说明。

所述操作均在无菌条件下进行

1.将冻存的A549细胞复苏

2.细胞培养扩增至2×10⁸个细胞时，以MOI＝10的剂量加入Ad-GM-CSF，感染12～16小时。

3.用胰蛋白酶消化收集上述经Ad-GM-CSF感染的细胞，用培养液重悬于离心管中，每管3～8mL，置于42℃水浴1小时。

4.制备好的同种异体肿瘤细胞疫苗保存在低温环境下备用。

实施例3：利用特异性抗肿瘤细胞疫苗诱导制备特异性抗肿瘤CTL

1.树突细胞的培养和成熟

1.1无菌操作取患者外周血，以肝素或EDTA抗凝后，缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，分层后离心弃上清，吸取中间的白色细胞层.

1.2以5倍体积的PBS或Hank’s液清洗细胞。

1.3以含有10％FCS的RPMI1640重悬细胞，稀释至2×10⁶个细胞/mL，加入六孔板中，每孔3mL，37℃孵育3小时。

1.4以培养基洗涤一次贴壁的细胞，加入含15％FCS的RPMI1640(含青链霉素，GM-CSF 800u/mL，IL-4500u/mL)培养。

1.5培养7天后，收集树突细胞备用。

2.肿瘤细胞疫苗在体外刺激树突细胞

将制备好的肿瘤细胞疫苗加入成熟的树突细胞中，37℃孵育24小时，清洗细胞，作为致敏的抗原呈递细胞。

3.特异性抗肿瘤CTL的诱导制备方法

3.12×10⁶个细胞/mL的自体淋巴细胞与1×10⁵个细胞/mL的致敏树突细胞等体积混合，加入96孔板中，100μL/孔，37℃孵育。

3.2三天后加入IL-2至终浓度为25u/mL，诱导抗原特异性CTL的活化和扩增。此特异性

抗肿瘤CTL细胞可直接应用于临床治疗。

实施例4：加热处理与照射处理对肿瘤细胞增殖的影响

1.MTT试验检测加热处理与照射处理对肿瘤细胞增殖的影响

A549细胞消化后制成细胞悬液，分装于3个离心管，其中1号管用放射源以10,000rad照射，2号管置于42℃水浴中1小时，3号管作为阳性对照。然后将3管细胞分别接种于96孔培养板中，另设空白孔和对照孔。加入RPMI-1640完全培养液，补足体积为200μL。混匀后放入CO₂孵箱中培养。5天后取出细胞，弃去上清液，加培养液100μL，MTT液10μL，混匀后放入CO₂孵箱中培养4小时。然后弃上清液，加二甲亚砜100μL/孔，混匀后测600nm的Dλ值，计算每组细胞存活率，存活率％＝D实验/D对照×100％。

经过加热处理或照射处理后的肿瘤细胞，五天后存活率均＜1％。

2.³H-TdR掺入法检测加热处理与照射处理对肿瘤细胞增殖的影响

A549细胞消化后制成细胞悬液，分装于3个离心管，其中1号管用放射源以10,000rad照射，2号管置于42℃水浴中1小时，3号管作为阳性对照。然后将3管细胞分别接种于96孔培养板中，另设空白孔和对照孔。加入RPMI-1640完全培养液，补足体积至200μL。混匀后放入CO₂孵箱中培养。5天后，加入³H-TdR振荡混匀，继续培养24小时，弃去上清液，加胰酶消化后制成细胞悬液，用多头细胞收集仪将细胞抽滤于49型纤维滤膜上，37℃烘干，加入固相闪烁液，脉冲计数仪测定Bq，计算细胞DNA合成率(％)＝Bq实验/Bq对照×100％。

经过加热处理或照射处理后的肿瘤细胞DNA合成率均＜1％。

3.细胞计数法检测加热处理与照射处理对细胞增殖的影响

A549细胞消化后制成细胞悬液，分装于3个离心管，其中1号管用放射源以10,000rad照射，2号管置于42℃水浴中1小时，3号管作为阳性对照。在培养瓶中加1×10⁵个/mL细胞悬液2mL/瓶，并加培养液至总体4mL。四天中每天取出一瓶细胞，胰酶消化制成细胞悬液，计数细胞，每种条件计数3次，取平均结果。

经过加热处理或照射处理后的肿瘤细胞经1～4天，细胞总数均逐渐减少。

4.裸鼠成瘤试验检测加热处理与照射处理对细胞增殖的影响

3×10⁸个A549细胞消化后制成细胞悬液，分成3管，其中1号管用放射源以10,000rad照射，2号管置于42℃水浴中1小时，3号管作为阳性对照。每组细胞分别接种裸鼠10只，每只接种1×10⁷个细胞，30天内观察成瘤情况，计算成瘤率＝成瘤只数/10×100％。

加热处理和照射处理的肿瘤细胞的成瘤率为0％。未经处理的肿瘤细胞的成瘤率为100％。加热处理和照射处理的肿瘤细胞均不会形成新的肿瘤灶。

实施例5：加热处理与照射处理对基因载体转染效率的影响

1.转染Ad-GFP

A549细胞消化后制成细胞悬液，分装于3个离心管，其中1号管用放射源以10,000rad照射，2号管置于42℃水浴中1小时，3号管作为阳性对照。之后分别接种于24孔板中，细胞贴壁后以MOI＝10加入Ad-GFP，感染过夜后观察荧光。

结果如图1所示，加热处理组细胞中表达的GFP荧光亮度明显高于照射处理的细胞和空白对照细胞。

2.转染Ad-GM-CSF

A549细胞消化后制成细胞悬液，分装于3个离心管，其中1号管用放射源以10,000rad照射，2号管置于42℃水浴中1小时，3号管作为阳性对照。之后接种于24孔板中，细胞贴壁后以MOI＝10加入Ad-GM-CSF，感染后1～7天每天吸取细胞上清冻存于-20℃，然后全部换液，7天后应用ELISA试剂盒检测每天所取样品中的GM-CSF含量。

结果如图2所示，加热处理组的细胞中，GM-CSF的表达量明显高于照射处理组和空白对照组。

实施例6：加热处理与照射处理对免疫相关分子的表达量的影响

1.加热处理与照射处理对MHC-I、MHC-II、ICAM表达量的影响

A549细胞消化后制成细胞悬液，分装于2个离心管，其中1号管用放射源以10,000rad照射，2号管置于42℃水浴中1小时。每种细胞分装于2只管中，加入PE标记的抗人MHC-I抗体后，分别加入FITC标记抗人MHC-II抗体和抗人ICAM抗体，用流氏细胞仪进行检测。

结果如图3所示，与照射处理相比，加热处理的A549细胞表面的MHC-I、MCH-II、ICAM的表达量均增加。

2.加热处理与照射处理对Hsp-70表达量的影响

A549细胞消化后制成细胞悬液，分装于3个离心管，其中1号管用放射源以10,000rad照射，2号管置于42℃水浴中1小时，3号管作为阳性对照。分别加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，蛋白变性后取上清20μL做Western blot，检测三组细胞中Hsp-70的表达量。结果如图4所示，经加热处理的A549细胞Hsp-70的表达量增加，明显多于照射处理组和对照组。

实施例7：采用加热处理与照射处理制备的肿瘤疫苗在小鼠肿瘤动物模型中的治疗效果

1.小鼠肿瘤动物模型的建立

4～6周雌性C57小鼠，每只于右侧腋下接种1×10⁵个小鼠黑色素瘤细胞B16F10。

2.GM-CSF转基因肿瘤疫苗的制备

B16F10细胞，以MOI＝10感染Ad-GM-CSF，过夜后，消化细胞，重悬分装于2支离心管中，一支用放射源以10,000rad照射，另一支置于42℃水浴中1小时。冻存备用。

3.GM-CSF转基因肿瘤疫苗治疗小鼠肿瘤动物模型

接种肿瘤细胞5天后的小鼠肿瘤模型动物，分为三组，第一组皮下注射经加热处理的转基因肿瘤疫苗，第二组皮下注射经照射处理的转基因肿瘤疫苗，第三组注射PBS作为对照。观察成瘤率、抑瘤率。

结果如图5所示，三组动物的平均瘤块体积大小依次为：对照组＞照射处理组＞加热处理组。三组动物的肿瘤发生率高低依次为：对照组＞照射处理组＞加热处理组。

Claims (9)

1.一种制备肿瘤疫苗的方法，包括以下步骤：a)对细胞进行转基因操作；b)将细胞在42～45℃加热30～120分钟。

2.根据权利要求1所述制备肿瘤细胞疫苗的方法，其特征在于，在制备肿瘤细胞疫苗的过程中，对细胞进行转基因并结合加热处理。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的细胞是肿瘤细胞、成纤维细胞、树突细胞。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞的来源可以是原代、传代、自体、异体细胞。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热处理的方法可以采用水浴、气浴、金属浴。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热处理的温度范围在42～45℃之间。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热处理的时间范围在30～120分钟之间。

8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述转基因操作的转导基因是治疗用具有免疫活性的基因及抗原基因，包括GM-CSF、IL-2、Hsp70、IL-7、B7-1、CEA、PSA。

9.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述转基因操作应用了基因载体，包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体、质粒DNA载体。

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