CN1753895A - 螺环取代的吡咯并嘧啶化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式(I)化合物或其可药用盐或酯，其中的符号具有说明书中所定义的含义。所述化合物是组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S的抑制剂，可用于治疗与组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S有关的疾病或病症，例如包括神经病性疼痛、炎症、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、多发性硬化症和肿瘤等的各种病症。

Description

螺环取代的吡咯并嘧啶化合物
本发明涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂，具体而言，本发明涉及吡咯并嘧啶类组织蛋白酶K抑制剂或组织蛋白酶S抑制剂或具有混合活性的抑制剂，以及它们用于治疗或预防与组织蛋白K或组织蛋白S之一或两者都有关的疾病或病症的药物用途。
组织蛋白酶K和组织蛋白酶S是溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶家族的成员，该家族包含例如组织蛋白酶B、K、L和S，它们与各种病症有关，包括神经病性疼痛、炎症、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、肿瘤(特别是瘤侵袭和瘤转移)、肥胖症、冠脉疾病、动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化斑块破裂和不稳定化)、自身免疫疾病、多发性硬化症、呼吸系统疾病、感染性疾病和免疫性疾病(包括移植排斥)。因此，本发明的组织蛋白酶K和组织蛋白酶S的双重抑制剂或组织蛋白酶S或组织蛋白酶K的特异性抑制剂可以用于本文提及的疾病中。
因此，本发明提供式I化合物或其可药用盐或酯
式I
其中E是式a或式b的基团
式a
Figure A20048000547100071
式b
其中
A是CH2、CH2-CH2或C＝O；
B是CH2、C＝O或
Figure A20048000547100072
D是CH2或C＝O；
G是CH2、CH2C＝O或CH2-CH2；
J是CH2、C＝O或CH2-CH2；
L是H、OCH3、卤素或低级烷氧基；
M是CH2或NH；
Q是H、低级烷基、羟基取代的低级烷基、可选取代的芳基低级烷基、低级烷基磺酰基、碳环芳基低级烷基、低级烷氧基取代的碳环芳基低级烷基、卤素取代的碳环芳基低级烷基、N-杂环基取代的低级烷基、低级烷氧基取代的碳环芳基、氨基羰基、环烷基氨基羰基、N-杂环基取代的低级烷基羰基、卤素取代的碳环芳基低级烷基、低级烷氧基羰基或低级烷基羰基；并且
R是低级烷基、对-氯苯基乙基、环己基乙基、二甲基丁基、二氟环己基乙基、环戊基乙基或环庚基乙基。
本发明的一个优选的实施方案提供式I-(i)的化合物或其可药用盐或酯
Figure A20048000547100081
式I-(i)
其中
Q-i是H、低级烷基、羟基取代的低级烷基、N-杂环基取代的低级烷基、单或二取代的芳基低级烷基、低级烷氧基取代的碳环芳基低级烷基；并且R具有上述的定义。
本发明的另一个优选的实施方案提供式I-(ii)的化合物或其可药用盐或酯
Figure A20048000547100082
式I-(ii)
其中
Q-ii是H、低级烷基、N-杂环基取代的低级烷基、卤素取代的碳环芳基低级烷基、低级烷基羰基；并且L和R具有上述的定义。
本发明的再一个优选的实施方案提供式I-(iii)的化合物或其可药用盐或酯
式I-(iii)
其中
B-iii是CH2；
G-iii是CH2CH2；
J-iii是CH2CH2；
Q-iii是H、环烷基氨基羰基、氨基羰基、低级烷氧基取代的碳环芳基、低级烷基羰基、碳环芳基低级烷基或N-杂环基取代的低级烷基羰基；并且R具有上述的定义。
本发明的另一个优选的实施方案提供式I、式I-(i)、式I-(ii)或式I-(iii)的化合物，其中R是R1＝低级烷基。
本发明的另一个优选的实施方案提供式I、式I-(i)、式I-(ii)或式I-(iii)的化合物，其中R是R5＝2，2-二甲基-丙基。
本发明的另一个优选的实施方案提供式I、式I-(i)、式I-(ii)或式I-(iii)的化合物，其中R是R6＝3，3-二甲基-丁基。
本发明的另一个优选的实施方案提供式I、式I-(i)、式I-(ii)或式I-(iii)的化合物，其中R是R2＝对-氯苯基乙基、环己基乙基、二甲基丁基、二氟环己基乙基、环戊基乙基或环庚基乙基。
本发明的另一个优选的实施方案提供式I-(iv)的化合物或其可药用盐或酯
Figure A20048000547100091
式I-(iv)
其中
R3是(8-低级烷基-羰基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基、(8-低级烷基-磺酰基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基、(8-芳基-低级烷基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基、
Figure A20048000547100101
或
R4是对-氯苯基甲基、环己基甲基、二甲基丙基、二氟环己基甲基、环戊基甲基或环庚基甲基；并且
Q具有上述的定义。
本发明还提供式I化合物及其盐和酯的制备方法，其包括使式II化合物
式II
其中，Q、G、J、M、A、B、D具有上述的定义，
与式III化合物偶联，
Figure A20048000547100104
式III
其中，X是卤素，R具有上述的定义，和回收所形成的游离碱、可药用盐或酯形式的式I化合物的步骤。
上述偶联方法可在例如DMF溶液中、在K2CO3存在下进行，例如在室温下搅拌约12小时。适当的保护基团可在偶联过程中用来保护反应性官能团，偶联完成后再将其除去，例如如下文实施例中所述。
可根据已知方法或根据实施例对反应混合物进行处理和对这样获得的化合物进行纯化。
在本发明以上或别处的描述中，下列术语具有以下的意义。
卤素表示I、Br、Cl或F。
以上或下文中提及的分别与有机基团或化合物相关联的术语“低级”定义为含有不多于6个、包括6个碳原子的支链或直链。
“低级烷基”基团是支链或直链，含有1至6个碳原子的基团。低级烷基代表例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、叔丁基或新戊基(2，2-二甲基丙基)。
“卤代低级烷基”是由不多于6个卤素原子取代的C1-C7低级烷基，优选单、二或三取代的低级烷基。
“低级烷氧基”基团是支链或直链，含有1至6个、优选1至4个碳原子的基团。低级烷氧基代表例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丙氧基、异丁氧基或叔丁氧基。
“芳基”代表苯基或萘基。优选只含有碳和氢原子的“碳环芳基”，其可选由一个、两个或三个选自于低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤素的取代基单、二或三取代。碳环芳基优选苯基或可选取代的苯基，例如如实施例中所描述的由卤素、低级烷基或低级烷氧基单、二或三取代的苯基。
“环烷基”代表可选由低级烷基取代的、含有3至10个环碳原子的饱和环烃，优选环丙基、环戊基、环己基或可选由低级烷基取代。
“N-杂环基”代表饱和、部分不饱和或芳香的、通过氮原子连接的含有3至8个环原子的含氮杂环部分，可选另含一个O杂原子，可选由低级烷基或低级烷基羰基取代。
“低级烷基羰基”是指式-C(O)Ra的基团，其中Ra是以上定义的低级烷基，例如乙酰基、乙基羰基或正丙基羰基。
本发明化合物可以以游离形式获得，或者若存在成盐基团则以其盐形式获得。含有碱性基团的本发明化合物可转化为酸加成盐，特别是可药用盐。这些盐可与例如矿酸如硫酸、磷酸或氢卤酸等无机酸或有机羧酸例如未取代的或卤代(C1-C4)链烷羧酸如乙酸、例如饱和或不饱和二元羧酸如草酸、琥珀酸、马来酸或富马酸、例如羟基羧酸如羟乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸、例如氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸、或有机磺酸如(C1-C4)-烷基磺酸(例如甲磺酸)或未取代的或取代的(如卤代)芳基磺酸等形成。优选与盐酸、甲磺酸和马来酸形成的盐。
考虑到游离化合物与化合物的盐形式之间关系紧密，如果条件可能或合适，则凡是本文上下文中提及某个化合物时，也意指相应的盐。
化合物、包括它们的盐也可以以它们的水合物的形式获得，或含有重结晶时所用的其它溶剂。
如果式I化合物中存在一个或多个官能团如羧基、羟基、氨基或巯基处于被保护状态或需要被保护(因为它们不应该参与反应)，则这些基团通常是用于合成肽类化合物与头孢菌素类和青霉素类，以及核酸衍生物和糖类化合物的基团。
保护基团可能已经存在于前体化合物中，并且应该保护所涉及的基团使之不发生不希望的副反应，例如酰化反应、醚化反应、酯化反应、氧化反应、溶剂分解作用以及类似的反应。保护基团的特性是它们通常易于通过溶剂分解作用、还原作用、光解作用或者在例如与生理条件类似的条件下经酶的作用除去而不发生不希望的副反应，并且它们不存在于终产物中。专业人员知道或能够容易地确定哪些保护基团适合于上文及下文中提及的反应。
式II和式III的原料化合物可以通过如实施例中所述的方法制备。
本发明化合物在哺乳动物中表现了颇具价值的药理学特性，因此可用作药物。具体而言，它们可用作抑制组织蛋白酶K或抑制组织蛋白酶S或同时抑制两者的抑制剂。
本发明化合物的组织蛋白酶K抑制作用可通过在体外测量例如重组人组织蛋白酶K的抑制来证明。
该体外分析法按下述方法进行：
该测定使用重组人组织蛋白酶K，在室温下，在96孔微量测定板中进行。组织蛋白酶K的抑制在pH7.0、含有2mM二硫苏糖醇、20mM吐温80和1mM EDTA的100mM磷酸钠缓冲液中、在恒定的酶(0.16nM)和底物浓度(54mM Z-Phe-Arg-AMCA-Peptide Institute Inc.大阪，日本)下测定。将组织蛋白酶K与抑制剂预培养30分钟，加入底物使反应开始。培养30分钟后加入E-64(2mM)停止反应，在多孔板读数器中读取荧光强度，激发和发射波长分别是360和460nm。
本发明化合物抑制人组织蛋白酶K的IC50值通常低于约100nM下至约1nM或更低，优选约5nM或更低，例如约0.2nM。实施例3-0在上述分析法中的IC50是约0.16nM。优选上述的R＝R1的化合物，例如实施例1至4中R＝R1的化合物，它们具有组织蛋白酶K抑制作用。更优选上述R＝R5的化合物，最优选实施例3-0。
本发明化合物的组织蛋白酶S抑制作用可通过体外测定例如人组织蛋白酶S的抑制来证明。
该测定使用重组人组织蛋白酶S，在室温下，在透明平底96孔微量测定板(Greiner GmbH，德国)中进行。组织蛋白酶S抑制在pH7.0、含2mMEDTA、2份1％Triton X-100、10份20mM二硫苏糖醇(DTT)和58份蒸馏水的100份0.2M磷酸钠中、在恒定的酶和不同底物浓度(底物是Z-Leu-Leu-4-甲基香豆素基-7-酰胺(Bachem(瑞士))下测定。向含有不同浓度相应底物和化合物的反应混合物中加入酶溶液(浓度比重组人组织蛋白酶S的终浓度高13倍)使反应开始。使用的底物浓度在3.4和17μM之间。使用的重组人组织蛋白酶S的终浓度为0.04nM。受试化合物浓度在该化合物对该酶IC50测定值的0.4和2倍之间。连续测定30分钟相对荧光强度，初速度从每个发展曲线获得。用迪克逊作图分析法确定抑制模式和Ki值。
本发明化合物抑制人组织蛋白酶S的IC50值通常低于约100nM下至约1nM或更低，优选约5nM或更低。优选上述R＝R2的化合物。例如实施例4-8在上述分析法中的IC50约为9nM。
具有双重抑制作用也就是在上述组织蛋白酶K和组织蛋白酶S分析法中具有抑制作用的本发明化合物抑制人组织蛋白酶K和人组织蛋白酶S的IC50通常在两个分析中均低于约100nM，下至1nM或更低，优选约5nM或更低。优选的具有双重抑制作用的化合物是如上所述的R＝R6的化合物。例如实施例4-3对人组织蛋白酶K的IC50为8nM，对人组织蛋白酶S为6nM。或者例如实施例4-9对人组织蛋白酶K的IC50为16nM，对人组织蛋白酶S为10nM。
考虑到本发明化合物作为组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S抑制剂的活性，它们特别可作为在哺乳动物中治疗和预防与组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S水平升高有关的疾病或病症。这种疾病包括与卡氏肺囊虫、克氏锥虫、布氏锥虫、crithidia fusiculata等引起的感染有关的疾病、血吸虫病和疟疾等寄生虫病、肿瘤(瘤侵袭和瘤转移)以及其它疾病例如异染脑性白质营养不良、肌肉萎缩症、肌营养不良、神经病性疼痛如慢性神经病性疼痛，其病症的实例有例如糖尿病性神经病变、带状疱疹后神经疼痛、三叉神经痛、糖尿病多发神经病变性疼痛、中风后疼痛(中枢性痛)、切断术后疼痛、脊髓病性疼痛或神经根病疼痛(例如锥管狭窄、蛛网膜炎、神经根袖套样纤维变性)、不典型面痛和灼痛样综合症(复杂性区域性疼痛综合症)、自身免疫性病症，包括但不限于青少年型糖尿病、多发性硬化症，过敏性病症，包括但不限于哮喘，以及同种型免疫反应，包括但不限于器官移植排斥。
特别地，由于组织蛋白酶K与过度骨丢失病有关，因此本发明化合物可用于治疗或预防包括骨质疏松症、各种起源的骨质疏松症(例如青少年、绝经、绝经后、创伤后、年龄老化或皮质类固醇疗法或不活动引起的)、龈疾病如龈炎和牙周炎、佩吉特病、恶性高钙血症如肿瘤诱发的高钙血症和代谢性骨病。本发明化合物还可以用于治疗或预防软骨增生性或基质退化性疾病包括骨关节炎和类风湿性关节炎以及与蛋白质水解酶高水平表达或基质退化有关的肿瘤性疾病。组织蛋白酶K抑制剂优选用于治疗骨质疏松症和骨关节炎。
特别地，组织蛋白酶S与治疗和预防神经病性疼痛例如慢性神经病性疼痛有关，其病症的实例有例如糖尿病性神经病变、带状疱疹后神经疼痛、三叉神经痛、糖尿病多发神经病变性疼痛、中风后疼痛(中枢性痛)、切断术后疼痛、脊髓病性疼痛或神经根病疼痛(例如锥管狭窄、蛛网膜炎、神经根袖套样纤维变性)、不典型面痛和灼痛样综合症(复杂性区域性疼痛综合症)、骨关节炎和类风湿性关节炎、自身免疫性病症，包括但不限于青少年型糖尿病、多发性硬化症，过敏性病症，包括但不限于哮喘，以及同种型免疫反应，包括但不限于器官移植排斥。组织蛋白酶S抑制剂优选用于治疗神经病性疼痛、多发性硬化症、骨关节炎和类风湿性关节炎。
因此双重抑制剂可以用于两种组织蛋白酶都起作用的疾病，例如神经病性疼痛、炎症、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、肿瘤(特别是瘤侵袭和瘤转移)、肥胖症、冠脉疾病、动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化斑块破裂和不稳定化)、自身免疫性疾病、多发性硬化症、呼吸系统疾病、感染性疾病和免疫性疾病(包括移植排斥)，优选神经病性疼痛、骨质疏松症、类风湿性关节炎和骨关节炎。
有益的功效可通过本领域公知的或本文举例说明的体外和体内药理学实验评价。上述性质优选通过哺乳动物如大鼠、小鼠、狗、兔、猴、或离体器官和组织以及天然或通过例如重组技术制备的哺乳动物酶制备物的体外和体内试验来证明。本发明化合物在体外可以通过溶液例如优选水溶液或混悬液的形式施用，在体内可以通过胃肠途径或非胃肠途径(优选口服)例如以混悬液或水溶液、或以固体胶囊或片剂制剂的形式施用。体外的剂量可以在约10-5摩尔浓度和10-9摩尔浓度之间的范围内。体内的剂量根据施用途径的不同可在0.1与100mg/kg之间的范围内。
本发明化合物治疗骨质疏松症的功效可使用体内动物模型“OVX短尾猴”来测定。该模型是本领域熟知的模型，也是验证骨质疏松症化合物的常见模型(参见例如Jerome CP，Peterson PE(2001)Bone；29(1)：1-6)。
本发明化合物治疗慢性炎症或神经病性疼痛的功效可通过以下体内动物模型来测定：
慢性炎性疼痛模型：
完全弗氏佐剂诱发的机械痛觉过敏可用作慢性炎性疼痛模型(Stein，C.等，Pharmacol.Biochem.Behav.(1988)31：445-451)。在这个模型中，通常向雄性Sprague-Dawley大鼠或Wistar大鼠(200-250g)一只后足跖肌内注射25μl完全弗氏佐剂。该后足会发生明显的炎症。通常在出现炎症结果24小时后，当认为机械痛觉过敏完全建立起来时，施用药物以评价其功效。
慢性神经病性疼痛模型：
可以使用两种涉及某种形式外周神经损伤的慢性神经病性疼痛模型。在Seltzer模型(Seltzer等，(1990)Pain 43：205-218)中，将大鼠麻醉后，在一侧(通常在左侧)中股上部处切一小口以暴露坐骨神经。小心清除转节旁、恰好在后二头肌半腱神经从总坐骨神经分叉点远端处的神经周围的结缔组织。用3/8反向切割微型弯针将7-0丝缝线穿入神经中紧紧结扎以使神经厚度背侧的1/3至1/2保持在结扎线内。将肌肉和皮肤用缝线和夹子缝合后向伤口上撒些抗生素粉末。在对照动物中也暴露坐骨神经但不结扎，伤口以与实验动物相同的方法缝合。
在慢性缩窄性损伤(CCI)模型(Bennett，G.J.和Xie，Y.K.Pain(1988)33：87-107)中，将大鼠麻醉后，在一侧(通常在左侧)中股上部处切一小口以暴露坐骨神经。清除神经周围的结缔组织，将四根4/0含铬的结扎线绕着神经各打个松弛的结以使结扎线仅仅束住神经表面，每根线之间间隔约1毫米。以如上所述的方法用缝线和夹子缝合伤口。在对照动物中也暴露坐骨神经但不结扎，伤口以与实验动物相同的方法缝合。
与Seltzer和CCI模型不同的是，Chung模型涉及脊神经的结扎(Kim，S.O.和Chung，J.M.Pain(1992)：50：355-363)。在该模型中，将大鼠麻醉后放置为俯卧位，在脊柱L4-S2水平的左侧切一口。深度剖开脊柱旁肌肉并将肌肉与L4-S2水平的棘突分离以暴露刚好开始分支形成L4、L5和L6脊神经的坐骨神经。用小咬骨钳小心移去L6横突以便可以看见这些脊神经。分离L5脊神经，并用7-0丝缝线紧紧结扎。肌肉缝一针(6-0丝线)再用一或两个皮肤闭合夹缝合伤口，撒些抗生素粉末。在对照动物中也暴露L5神经但不结扎，伤口以前述方法缝合。
行为指数
在慢性疼痛模型(炎性和神经病性)中，通过测量在痛觉测量仪(Analgesymeter)(Ugo-Basile，米兰)施加的渐增压力刺激下两只后足的缩足阈值对机械痛觉过敏进行评价。通过测量在向两足跖面用von Frey hairs施加的无害机械刺激下两足的缩足阈值对机械异常性疼痛进行评价。通过测量在向每只后足底侧施加的有害热刺激下的缩足潜伏期对热痛觉过敏进行测定。在全部模型中，机械痛觉过敏、异常性疼痛和热痛觉过敏均在手术后1-3天内形成并可持续50天。对于本文描述的测定法，为测定药物对痛觉过敏形成的影响，可于术前或术后施用药物，特别在术后约14天施用药物以测定药物对已经建立的痛觉过敏的逆转能力。
痛觉过敏逆转百分比的计算方法如下：
在本文公开的实验中，上述疼痛模型中使用的是Wistar大鼠(雄性)。手术时大鼠重约120-140克。全部手术均在安氟醚/O2吸入剂的麻醉下进行。所有的情况下都是手术后缝合伤口，然后允许动物恢复。在所使用的全部模型中，除了假性手术的动物之外，几天后全部动物都出现了明显的机械和热痛觉过敏和异常性疼痛以及疼痛阈值下降、后足对碰触、压力或热刺激的反射性缩足反应增强。手术后动物还表现出受累足的特征性的变化。大多数动物受累后足的脚趾紧蜷在一起并且整个足轻微地转向一侧。有些大鼠的脚趾还卷曲在下面。已结扎大鼠的步态各不相同，但跛行并不常见。还观察到一些大鼠从笼底部抬起受累足，而且被抓起时后肢呈现异常僵直状伸展。这些大鼠对触碰非常敏感而且可能发出声音。除此之外，大鼠的一般健康状况良好。
本发明化合物还可以适用于预防或治疗冠脉疾病、动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化斑块破裂或不稳定化)(参见例如Lindstedt等的“组织蛋白酶F和S阻断HDL3-诱导的巨嗜细胞胆固醇外溢”，2003，Biochemical andBiophysical research communications 312：1019-1024)、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病和免疫性疾病(包括移植排斥)。
本发明化合物在治疗类风湿性关节炎中的抗关节炎功效可通过与佐剂诱发的关节炎大鼠模型相似的模型测定，如文献中所述(R.E.Esser等，J.Rheumatology，1993，20，1176)。
本发明化合物治疗骨关节炎的功效可通过使用家兔外侧半月板部分切除模型或与之相似的模型来测定，如前所述(Colombo等，Arth.Rheum.199326，875-886)。在该模型中化合物的功效可使用组织学计分法定量，如文献中所述(O’Byrne等，Inflamm Res 1995，44，S117-S118)。
本发明化合物治疗骨质疏松症的功效可使用动物模型例如切除卵巢的大鼠或其它相似物种如家兔或猴来测定，在该模型中，向动物施用测试化合物后，测量尿液或血清中骨再吸收作用的指标是否存在(例如Osteoporos Int(1997)7：539-543中所述)。
相应地，本发明的其它方面提供：
用作药物的本发明化合物；含有本发明化合物作为活性成分的药物组合物；治疗患有或易患与组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S有关的疾病或病症的患者的方法，该方法包括向患者施用有效量的本发明化合物；以及本发明化合物用于制备治疗或预防与组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S有关的疾病或病症的药物的用途。
本发明涉及使用本发明化合物及其可药用盐或药物组合物在哺乳动物中抑制组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S，治疗组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S依赖性病症，例如本文所述的组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S依赖性病症如炎症、神经病性疼痛、骨质疏松症、类风湿性关节炎和骨关节炎的方法。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中选择性抑制组织蛋白酶K活性的方法，该方法包括向有需要的哺乳动物施用抑制组织蛋白酶K有效量的本发明化合物。
更具体而言，这涉及治疗哺乳动物的骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨关节炎和炎症(以及其它如上所述的疾病)的方法，该方法包括向有需要的哺乳动物施用相应的有效量的本发明化合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中选择性抑制组织蛋白酶S活性的方法，该方法包括向有需要的哺乳动物施用抑制组织蛋白酶S有效量的本发明化合物。
更具体而言，这涉及治疗哺乳动物的神经病性疼痛(以及其它如上所述的疾病)的方法，该方法包括向有需要的哺乳动物施用相应的有效量的本发明化合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明涉及在哺乳动物中选择性抑制织蛋白酶K和组织蛋白酶S活性的方法，该方法包括向有需要的哺乳动物施用抑制织蛋白酶K和组织蛋白酶S有效量的本发明化合物。
更具体而言，这涉及治疗哺乳动物的神经病性疼痛、骨质疏松症、类风湿性关节炎和炎症(以及其它如上所述的疾病)的方法，该方法包括向有需要的哺乳动物施用相应的有效量的本发明化合物。
以下的实施例意为举例说明本发明而不应该被理解为限制本发明。温度均以摄氏度给出。若非另外提起，所有的蒸发均在减压优选15至100mmHg(＝20-133mbar)下进行。终产物、中间产物和起始原料的结构经标准分析方法例如微量分析和光谱特征(例如MS、IR、NMR)证实。所使用的缩略语均为本领域常规用法。
实施例
实施例1：
实施例1-0：7-(2，2-二甲基-丙基)-6-[2-(2-羟基-乙基)-1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基甲基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈的制备
A.8-苄基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮的制备
在室温下，向1-苄基-哌啶-4-酮(75.1g，0.40mol)的甲苯(400ml)溶液中加入氰基乙酸乙酯(50.6ml，0.48mol)和乙酸(18.2ml，0.32mol)。将反应混合物回流4小时，加冰水终止反应，用二乙醚萃取。合并萃取液，用H2O、盐水洗涤，用硫酸钠干燥后得到(1-苄基-哌啶-4-亚基)-氰基-乙酸乙酯，定量收率。
Rf＝0.53(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.30-1.37(m，3H)，2.58(dd，2H)，2.64(dd，2H)，2.79(dd，2H)，3.15(dd，2H)，3.55(s，2H)，4.23-4.32(m，2H)，7.21-7.36(m，5H)。
在室温下，向(1-苄基-哌啶-4-亚基)-氰基-乙酸乙酯(112.9g，0.40mol)在EtOH(500ml)和H2O(100ml)中的溶液中加入氰化钾(64.6g，0.99mol)。将反应混合物在65℃下搅拌24小时。除去EtOH、向残余物中加入H2O。用二乙醚萃取水相。合并萃取液，用H2O和盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干得到77.7g 1-苄基-4-氰基甲基-哌啶-4-甲腈。
Rf＝0.38(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.76-1.81(m，2H)，2.10-2.05(m，2H)，2.23-2.39(m，2H)，2.69(s，2H)，2.90-2.94(m，2H)，3.56(s，2H)，7.21-7.38(m，5H)。
在室温下，将乙酸(56.8ml)和硫酸(11.8ml)加至1-苄基-4-氰基甲基-哌啶-4-甲腈(27.2g，0.114mmol)中。将反应混合物在125℃下搅拌1小时，冷却至室温，加入饱和NaOH水溶液将pH调至6.0。用二氯甲烷萃取混合物。合并萃取液，用H2O和盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干得到8-苄基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮(三步收率：81.8％)。
Rf＝0.40(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.52-1.57(m，2H)，2.02-2.17(m，4H)，2.59(s，2H)，2.86-2.90(m，2H)，3.52(s，2H)，7.21-7.28(m，2H)，7.30-7.37(m，3H)，7.92(brs，1H)。
B.1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯的制备
在室温下，向2l烧瓶中的8-苄基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮(28.3g，0.11mol)和Pd(OH)2(8.5g)中加入EtOH(438ml)和乙酸(5.5ml)。将反应混合物在H2气氛、室温下搅拌15小时。过滤除去催化剂，将EtOH蒸干得到2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮，定量收率。在室温下，向2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮(4.2g，25.2mmol)在二氯甲烷(60ml)中的悬浮液中加入1N NaOH(26ml，26mmol)和二碳酸二叔丁酯(6.1g，27.7mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液。将反应混合物搅拌15小时。向反应混合物中加入10％柠檬酸调节至pH5。合并萃取液，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥后真空浓缩得到固体产物，使之与二乙醚一起过滤。
收率：51％
Rf＝0.25(正己烷∶乙酰乙酯＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.47(s，9H)，1.55-1.70(m，2H)，1.95-2.05(m，2H)，2.62(s，2H)，2.96-3.02(m，2H)，4.02-4.04(m，2H)，8.14(brs，1H)。
Figure A20048000547100221
1，3-二氧代-2-[2-(四氢-吡喃-2-基氧基)-乙基]-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯的制备
在室温下，向1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯(1.0g，3.7mmol)在DMF(12ml)中的悬浮液中加入2-(2-溴乙氧基)-四氢-2H-吡喃(0.62ml，4.1mmol)和碳酸钾(O.62g，4.5mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。向反应混合物中加入水终止反应，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥后过滤。蒸干溶剂得到1.6g粗品1，3-二氧代-2-[2-(四氢-吡喃-2-基氧基)-乙基]-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯。
2-(2-羟基-乙基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮盐酸盐的制备
在室温下，向粗品1，3-二氧代-2-[2-(四氢-吡喃-2-基氧基)-乙基]-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯(1.6g)在乙酸乙酯(1ml)中的溶液中加入EtOH(1.0ml)和4N HCl/乙酸乙酯(4ml)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。蒸发除去溶剂得到1.06g粗品2-(2-羟基-乙基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮盐酸盐。
7-(2，2-二甲基-丙基)-6-[2-(2-羟基-乙基)-1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基甲基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈的制备
将6-溴甲基-7-(2，2-二甲基-丙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈(1.3g，4.25mmol)和粗品2-(2-羟基-乙基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮盐酸盐(1.1g，4.25mmol)溶于DMF(14ml)中并向溶液中加入碳酸钾(1.8g，12.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12小时，加水终止反应后，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥后蒸干。粗产物经反相HPLC纯化，收集级份并蒸干。加入饱和碳酸氢钠溶液中和，用乙酸乙酯萃取水相。合并萃取液，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥后蒸干得到0.5g所需产物，收率为27％。
Rf＝0.10(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.01(s，9H)，1.52-1.60(m，2H)，2.08-2.14(m，4H)，2.60(s，2H)，2.84-2.88(m，2H)，3.71-3.78(m，4H)，3.81(s，2H)，4.34(s，2H)，6.58(s，1H)，8.89(s，1H)。
使用合适的起始原料和条件，通过重复上述方法可获得下面表1中列出的式I-(i)化合物。
式I-(i)
表1
  实施例   Rx   产量(％)   Rf(溶剂)   NMR(400MHz，δ)
1-1   H   43   0.48(EtOAc)   (CDCl3)：1.03(s，9H)，1.50-1.57(m，2H)，2.10-2.25(m，4H)，2.62(s，2H)，2.84-2.95(m，2H)，3.83(s，2H)，4.36(s，2H)，6.60(s，1H)，7.74(brs，1H)，8.91(s，1H)
Figure A20048000547100241
实施例2：
实施例2-0：7-(2，2-二甲基-丙基)-6-(5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-1’H-螺[吲哚-3，4’-哌啶]-1-基甲基)-7-吡咯并[2，3d]嘧啶-2-甲腈的制备
A.2-氟-4-甲氧基-1-硝基-苯的制备
Figure A20048000547100262
在室温下，向3-氟-4-硝基-苯酚(25.3g，0.16mol)在丙酮(160ml)中的溶液中加入碳酸钾(41.7g，0.30mol)和碘甲烷(20.0ml，0.32mol)。将反应混合物在40℃下搅拌3小时。冷却至室温后，加入二氯甲烷，过滤反应混合物并蒸发。向残余物中加入二氯甲烷后，将有机相用H2O和盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干得到2-氟-4-甲氧基-1-硝基-苯，收率为98％。
Rf＝0.5(正己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：3.90(s，3H)，6.72-6.79(m，2H)，8.06-8.13(m，1H)。
B.5-甲氧基-1，3-二氢-吲哚-2-酮的制备
Figure A20048000547100263
标题化合物根据专利(WO0206228)中报道的方法制备。
在室温下，向2-氟-4-甲氧基-1-硝基-苯(84.1g，0.49mol)和丙二酸二甲酯(129.9g，0.98mol)在DMF(490ml)中的溶液中加入碳酸钾(135.9g，0.98mol)。将反应混合物在70℃下搅拌12小时。将反应混合物加至甲苯(393ml)和12N HCl(123ml)中，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用H2O和盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干得到2-(5-甲氧基-2-硝基-苯基)-丙二酸二甲酯。
Rf＝0.8(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：3.80(s，6H)，3.89(s，3H)，5.45(s，1H)，6.94-6.96(m，2H)，8.15-8.20(m，1H)。
在室温下，向1l烧瓶中的2-(5-甲氧基-2-硝基-苯基)-丙二酸二甲酯和5％Pd-C(7.0g)中加入MeOH(490ml)。将反应混合物在H2气氛、室温下搅拌15小时。过滤除去催化剂，蒸干甲醇得到粗品5-甲氧基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-3-甲酸甲酯。
Rf＝0.10(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)。
在室温下，向粗品5-甲氧基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-3-甲酸甲酯在MeOH(320ml)中的溶液中加入6N HCl(255ml，1.92mol)。将反应混合物在70℃下搅拌3小时。冷却至室温后，向反应混合物中加入8N KOH (269ml，1.82mol)。将反应混合物在40℃下搅拌30分钟后加入12N HCl(41ml)。蒸干MeOH，滤出白色粉末。
收率：59％(三步)。
Rf＝0.25(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：3.51(s，2H)，3.78(s，3H)，6.72-6.85(m，3H)，7.60(brs，1H)。
C.1′-苄基-5-甲氧基螺[吲哚-3，4′-哌啶]-2(1H)-酮的制备
Figure A20048000547100271
在-78℃下，向NaHMDS溶液(1M THF溶液)(800ml，0.8mol)中加入5-甲氧基-1，3-二氢-吲哚-2-酮(26.1g，0.16mol)在THF(160ml)中的溶液和苄基-二-(2-氯-乙基)-胺(47.3g，0.18mol)在THF(176ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，加入饱和氯化铵溶液和冰水终止反应，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干。残余物中加入乙醚得到粉末状物，滤出。
收率：39％
Rf＝0.25(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.81-1.99(m，2H)，2.00-2.04(m，2H)，2.66-2.72(m，2H)，2.90-2.96(m，2H)，3.67(s，2H)，3.77(s，3H)，6.71-6.81(m，2H)，7.00(s，1H)，7.25-7.40(m，5H)，8.32(brs，1H)。
D.5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-1′H-螺[吲哚-3，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯的制备
Figure A20048000547100281
在室温下，向500ml烧瓶中的1′-苄基-5-甲氧基螺[吲哚-3，4′-哌啶]-2(1H)-酮(20.0g，62mmol)和Pd/C(2.0g)中加入EtOH(120ml)和乙酸(5.5ml)。将反应混合物在H2气氛、室温下搅拌15小时。过滤除去催化剂，蒸干EtOH。Rf＝0.20(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
在室温下，向5-甲氧基螺[吲哚-3，4′-哌啶]-2(1H)-酮(9.9g，45.2mmol)在二氯甲烷(50ml)中的悬浮液中，加入1N NaOH(45.2ml，45.2mmol)和二碳酸二叔丁酯(9.3g，45.2mmol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液。将反应混合物搅拌1小时后，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥后真空浓缩。经硅胶色谱法(洗脱剂：正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1和1∶1)纯化后得到10.6g所需产物。
收率：68％(两步)
Rf＝0.50(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.51(s，9H)，1.76-1.89(m，4H)，3.70-3.90(m，7H)，6.74-6.76(m，1H)，6.83-6.88(m，2H)，8.83(brs，1H)。
E.1-[2-氰基-7-(2，2-二甲基-丙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-1’H-螺[吲哚-3，4’-哌啶]-1’-甲酸叔丁酯
Figure A20048000547100291
在室温下，向5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-1′H-螺[吲哚-3，4′-哌啶]-1′-甲酸叔丁酯(10.6g，31.9mmol)在DMF(70ml)中的溶液中，加入NaH(1.4g，35.1mmol)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。在0℃下加入6-溴甲基-7-(2，2-二甲基-丙基)-7.H.-吡咯并[2，3-.d.]嘧啶-2-甲腈(9.5g，31.9mmol)，在室温下将反应混合物搅拌4小时。用冰水终止反应，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥。经硅胶色谱法(洗脱剂：正己烷∶乙酸乙酯＝10∶1和1∶1)纯化后得到12.1g标题产物。
收率：68％
Rf＝0.60(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.09(s，9H)，1.50(s，9H)，1.83-1.86(m，4H)，3.78-3.84(m，7H)，4.22(s，2H)，5.13(s，2H)，6.37(s，1H)，6.62-6.65(m，1H)，6.72-6.75(m，1H)，7.26(s，1H)，8.84(s，1H)。
F.7-(2，2-二甲基-丙基)-6-(5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-1’H-螺[吲哚-3，4’-哌啶]-1-基甲基)-7-吡咯并[2，3d]嘧啶-2-甲腈的制备
在0℃下，向1-[2-氰基-7-(2，2-二甲基-丙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-1’H-螺[吲哚-3，4’-哌啶]-1’-甲酸叔丁酯(12.1g，21.6mmol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中，加入TFA(5ml)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，除去溶剂后，向残余物中加入饱和碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取混合物。合并萃取液，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥后真空浓缩。向残余物中加入乙醚，过滤后得到淡黄色产物7-(2，2-二甲基-丙基)-6-(5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-1’H-螺[吲哚-3，4’-哌啶]-1-基甲基)-7-吡咯并[2，3d]嘧啶-2-甲腈。
收率：91％。
Rf＝0.15(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.09(s，9H)，1.90-1.94(m，2H)，2.52-2.61(m，2H)，3.44-3.50(m，2H)，3.80(s，3H)，3.87-3.94(m，2H)，4.24(s，2H)，5.12(s，2H)，6.37(s，1H)，6.67(d，1H)6.77-6.80(m，1H)，7.03(s，1H)，8.86(s，1H)。
使用合适的起始原料和条件，通过重复上述方法可获得下面表2中列出的式I-(ii)化合物。
式I-(ii)
表2
  实施例   R1   R2   收率(％)  Rf(溶剂)   1H-NMR(400MHz，δ)
2-1   H   H   80  0.25(MeOH∶CH2Cl2＝1∶4)   (CDCl3)：1.10(s，9H)，1.84-1.89(m，4H)，3.07-3.13(m，2H)，3.38-3.44(m，2H)，4.24(s，2H)，5.15(s，2H)，6.36(s，1H)，6.73(d，1H)，7.10(t，1H)，7.22(t，1H)，7.47(d，1H)，8.84(s，1H)
Figure A20048000547100321
Figure A20048000547100331
实施例3：
实施例3-0：7-(2，2-二甲基-丙基)-6-(1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈的制备
A.8-苄基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮的制备
Figure A20048000547100342
在室温下，向1-苄基-哌啶-4-酮(75.1g，0.40mol)在甲苯(400ml)中的溶液中加入氰基-乙酸乙酯(50.6ml，0.48mol)和乙酸(18.2ml，0.32mol)。将反应混合物回流4小时，用冰水终止反应，用二乙醚萃取。合并萃取液，用H2O洗涤，用硫酸钠干燥后得到(1-苄基-哌啶-4-亚基)-氰基-乙酸乙酯，定量收率。
Rf＝0.53(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.30-1.37(m，3H)，2.58(dd，2H)，2.64(dd，2H)，2.79(dd，2H)，3.15(dd，2H)，3.55(s，2H)，4.23-4.32(m，2H)，7.21-7.36(m，5H)。
在室温下，向(1-苄基-哌啶-4-亚基)-氰基-乙酸乙酯(112.9g，0.40mol)在EtOH(500ml)和H2O(100ml)中的溶液中加入氰化钾(64.6g，0.99mol)。将反应混合物在65℃下搅拌24小时。除去EtOH后，将H2O加至残余物中。用二乙醚萃取水相。合并萃取液，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干得到77.7g 1-苄基-4-氰基甲基-哌啶-4-甲腈。
Rf＝0.38(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.76-1.81(m，2H)，2.10-2.05(m，2H)，2.23-2.39(m，2H)，2.69(s，2H)，2.90-2.94(m，2H)，3.56(s，2H)，7.21-7.38(m，5H)。
在室温下，将乙酸(56.8ml)和硫酸(11.8ml)加至1-苄基-4-氰基甲基-哌啶-4-甲腈(27.2g，0.114mmol)中。将反应混合物在125℃下搅拌1小时。冷却至室温后加入饱和NaOH水溶液将pH调至6.0。用二氯甲烷萃取混合物。合并萃取液，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干得到8-苄基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮(三步收率：81.8％)。
Rf＝0.40(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.52-1.57(m，2H)，2.02-2.17(m，4H)，2.59(s，2H)，2.86-2.90(m，2H)，3.52(s，2H)，7.21-7.28(m，2H)，7.30-7.37(m，3H)，7.92(brs，1H)。
B.1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯的制备
Figure A20048000547100351
在室温下，向2l烧瓶中的8-苄基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮(28.3g，0.11mol)和Pd(OH)2(8.5g)中加入EtOH(438ml)和乙酸(5.5ml)。将反应混合物在H2气氛、室温下搅拌15小时。过滤除去催化剂，蒸干EtOH得到2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮，定量收率。
在室温下，向2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-1，3-二酮(4.2g，25.2mmol)在二氯甲烷(60ml)的悬浮液中加入1N NaOH(26ml，26mmol)和二碳酸二叔丁酯(6.1g，27.7mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液。将反应混合物搅拌15小时。向反应混合物中加入10％柠檬酸将混合物的pH调至5。合并萃取液，用盐水洗涤，用硫酸镁干燥后真空浓缩得到固体产物，使之与二乙醚一起过滤。收率：51％
Rf＝0.25(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.47(s，9H)，1.55-1.70(m，2H)，1.95-2.05(m，2H)，2.62(s，2H)，2.96-3.02(m，2H)，4.02-4.04(m，2H)，8.14(brs，1H)。
C.2-[2-氰基-7-(2，2-二甲基-丙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯的制备
将6-溴甲基-7-(2，2-二甲基-丙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈(1.0g，3.25mmol)和1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯(0.82g，3.42mmol)溶于DMF(15ml)中并向该溶液中加入碳酸钾(0.58g，4.23mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15小时，用饱和氯化铵溶液终止反应后，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用水、盐水洗涤，用硫酸镁干燥。经硅胶色谱法(洗脱剂：正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化后得到1.56g所需的2-[2-氰基-7-(2，2-二甲基-丙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯，收率97％。
Rf＝0.30(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.99(s，9H)，1.40(s，9H)，1.66-1.68(m，4H)，2.89-2.93(m，2H)，3.85-3.88(m，2H)，4.25(s，2H)，4.90(s，2H)，6.62(s，1H)，9.06(s，1H)。
D.7-(2，2-二甲基-丙基)-6-(1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈的制备
Figure A20048000547100362
在0℃下，向2-[2-氰基-7-(2，2-二甲基-丙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯(1.5g，3.1mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中加入TFA(5ml)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。除去溶剂后，向残余物中加入饱和碳酸氢钠溶液并用二氯甲烷萃取混合物。合并萃取液，用水、盐水洗涤，用硫酸镁干燥后真空浓缩得到所需产物7-(2，2-二甲基-丙基)-6-(1，3-二氧代-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈。
收率：91％。
Rf＝0.15(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.03(s，9H)，1.44-1.51(m，2H)，1.69(brs，1H)，1.95-2.02(m，2H)，2.66(s，2H)，2.69-2.72(m，2H)，3.11-3.17(m，2H)，4.34(s，2H)，4.91(s，2H)，6.59(s，1H)，8.90(s，1H)。
使用合适的起始原料和条件，通过重复上述方法可获得下面表3中列出的式I-(iii)化合物。
Figure A20048000547100371
式I-(iii)
表3
Figure A20048000547100372
Figure A20048000547100381
实施例4：
实施例4-0：6-(8-乙酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基)-7-(3，3-二甲基-丁基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈的制备
Figure A20048000547100392
8-甲磺酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷盐酸盐
Figure A20048000547100393
在0℃下，向2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯(1.12g，4.66mol)在CH2Cl2(10ml)中的溶液中，加入三乙胺(3.88ml)和甲磺酰氯(1.08ml，14mmol)。将反应混合物搅拌过夜，用冰水终止反应，用二氯甲烷萃取。合并萃取液，用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥后得到粗品8-甲磺酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯(1.32g)。
Rf＝0.7(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.46(s，9H)，1.66-1.76(m，6H)，2.76-2.80(m，2H)，3.00(s，3H)，3.15-3.25(m，2H)，3.36-3.45(m，4H)。
向8-甲磺酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯(1.32g)在乙酸乙酯(10ml)中的溶液中加入1M HCl的乙酸乙酯溶液(20ml)。在室温下搅拌2小时后，蒸干溶剂得到8-甲磺酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷盐酸盐，为固体。
Rf＝0.05(乙酸乙酯)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.62-1.68(m，4H)，1.78-1.82(m，2H)，2.87(s，3H)，2.98-3.12(m，6H)，3.20-3.23(m，2H)，9.49(brs，1H)，9.59(brs，1H)。
1-(2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基)-乙酮盐酸盐
Figure A20048000547100401
在0℃下，向2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯(1.12g，4.66mol)在二氯甲烷(10ml)中的溶液中加入三乙胺(3.88ml)和乙酸酐(1.32ml，14mmol)。将反应混合物搅拌过夜，用冰水终止反应，用二氯甲烷萃取。合并萃取液，用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥后得到粗品8-乙酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯(1.34g)。
Rf＝0.6(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.46(s，9H)，1.50-1.56(m，4H)，1.72-1.76(m，2H)，2.03(s，2H)，2.22(s，3H)，3.16-3.49(m，6H)。
向8-乙酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯(1.34g)在乙酸乙酯(10ml)中的溶液中加入1M HCl的乙酸乙酯溶液(20ml)。在室温下搅拌2小时后，蒸干反应混合物得到1-(2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基)-乙酮盐酸盐，为固体。
Rf＝0.05(乙酸乙酯)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.44-1.59(m，4H)，1.76-1.83(m，2H)，2.07(s，3H)，2.96-3.06(m，2H)，3.16-3.24(m，4H)，3.38-3.56(m，2H)，9.55(brs，1H)，9.67(brs，1H)。
中间产物I
Figure A20048000547100411
在-78℃下，向5-甲氧基-1，3-二氢-吲哚-2-酮(1.5g，10mmol)在THF(160ml)中的溶液中加入NaHMDS(1M THF溶液)(50ml，50mmol)。在-78℃下搅拌30分钟后，加入乙基-二-(2-氯-乙基)-胺(47.3g，0.18mol)在THF(176ml)中的溶液，将反应混合物在室温下搅拌15小时，用饱和NH4Cl水溶液和冰水终止反应，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干。向残余物中加入乙醚，过滤得到粉末状物。
Rf＝0.10(CH2Cl2∶MeOH＝30∶1)1H-NMR 400MHz，CDCl3)δ：1.17(t，3H)，1.87-2.02(m，4H)，2.60(q，2H)，2.69-2.74(m，2H)，2.90-2.96(m，2H)，6.78-6.82(m，1H)，6.88-6.93(m，1H)，7.08-7.11(m，1H)，8.04(brs，1H)。
中间产物L
Figure A20048000547100412
在-78℃下，向5-甲氧基-1，3-二氢-吲哚-2-酮(1.06g，6.49mmol)在THF(13ml)中的溶液中加入NaHMDS(1M THF溶液)(32.5ml，32.5mmol)。在-78℃下搅拌30分钟后，加入甲基-二-(2-氯-乙基)-胺盐酸盐(1.37g，7.14mol)，在室温下将反应混合物搅拌13.5小时后，用饱和NH4Cl水溶液和冰水终止反应，用乙酸乙酯萃取。有机萃取液用盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干。向残余物中加入乙醚，过滤后得到粉末状物。
Rf＝0.10(CH2Cl2∶MeOH＝30∶1)1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.66-1.78(m，4H)，2.28(s，3H)，2.44-2.47(m，2H)，2.71-2.77(m，2H)，3.70(s，3H)，6.74(s，2H)，7.01(s，1H)，10.15(brs，1H)。
中间产物
在0℃下，向中间产物(422mg，1.76mol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加入三乙胺(1.2ml)和乙酸酐(0.33ml，3.53mmol)。将反应混合物搅拌2小时，用冰水终止反应，用二氯甲烷萃取。合并有机层，用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥后真空浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(正己烷∶AcOEt＝5∶1)纯化后得到产物。
Rf＝0.6(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.79-1.95(m，4H)，2.20(s，3H)，3.68-3.74(m，1H)，3.80-3.87(m，1H)，3.98-4.22(m，2H)，6.90-6.92(m，1H)，7.03-7.07(m，1H)，7.22-7.26(m，2H)，8.06(brs，1H)。
6-(8-乙酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基)-7-(3，3-二甲基-丁基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈
Figure A20048000547100422
向6-溴甲基-7-(3，3-二甲基-丁基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈(440mg，1.37mmol)在DMF(5ml)中的溶液中加入1-(2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基)-乙酮盐酸盐(300mg，1.37mmol)和K2CO3(568mg，4.11mmol)及三乙胺(5ml)。将混合物在氮气气氛、室温下搅拌11小时。用水稀释反应混合物，用AcOEt萃取(两次)。合并有机层，用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥后真空浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(正己烷∶AcOEt＝1∶1)纯化后得到产物。
Rf＝0.30(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.05(s，9H)，1.53-1.72(m，8H)，2.07(s，3H)，2.40-2.48(m，2H)，2.60-2.69(m，2H)，3.35-3.45(m，2H)，3.60-3.67(m，1H)，3.74-3.82(m，2H)，4.40-4.44(m，2H)，6.49(s，1H)，8.87(s，1H)。
使用合适的起始原料和条件，通过重复上述方法可获得下面表4中列出的式I-iv化合物。
式I-iv
表4
Figure A20048000547100432
Figure A20048000547100441
Figure A20048000547100451
Figure A20048000547100461
实施例4-13：3-[2-氰基-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯的制备
4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯
在室温下，向1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸烷-4-酮(1.0g，4.32mmol)在二氯甲烷(10ml)中的悬浮液中加入饱和碳酸氢钠溶液(10ml)和二碳酸二叔丁酯(1.04g，4.76mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液。将反应混合物搅拌1小时，用水终止反应，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥后蒸干得到4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯。收率：100％
Rf＝0.90(CH2Cl2∶MeOH＝20∶1)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.51(s，9H)，1.63-1.71(m，2H)，2.50-2.65(m，2H)，3.50-3.65(m，2H)，3.97-4.10(m，2H)，4.75(s，2H)，6.74-6.76(m，2H)，6.84-6.88(m，1H)，7.01(brs，1H)，7.23-7.27(m，2H)。
3-[2-氰基-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯
Figure A20048000547100472
向6-氯甲基-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈(600mg，1.98mmol)在DMF(7ml)中的溶液中加入4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯(657mg，1.98mmol)和氢化钠(101mg，2.53mmol)。将混合物在氮气气氛、室温下搅拌14小时。用水稀释反应混合物，用AcOEt萃取(两次)。合并有机层，用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥后真空浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(正己烷∶AcOEt＝1∶1)纯化后得到产物，收率为29％。
Rf＝0.25(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.97-1.49(m，7H)，1.50(s，9H)，1.56-1.82(m，8H)，2.45-2.60(m，2H)，3.50-3.65(m，2H)，4.09-4.14(m，2H)，4.33-4.36(m，2H)，4.64(s，2H)，4.87(s，2H)，6.72-6.74(m，2H)，6.86-6.90(m，1H)，7.20-7.24(m，2H)，8.94(s，1H)。
实施例4-14：7-(2-环己基-乙基)-6-(4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸-3-基甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈三氟乙酸盐
向3-[2-氰基-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸烷-8-甲酸叔丁酯(340mg，0.56mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加入三氟乙酸(5ml)。在室温下搅拌1小时后，蒸干溶剂得到7-(2-环己基-乙基)-6-(4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸-3-基甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈三氟乙酸盐，定量收率。
Rf＝0.10(CH2Cl2∶MeOH＝20∶1)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.98-1.38(m，5H)，1.65-1.83(m，8H)，1.98-2.09(m，2H)，2.71-2.80(m，2H)，3.53-3.56(m，2H)，3.94-4.02(m，2H)，4.38-4.42(m，2H)，4.73(s，2H)，4.91(s，2H)，6.71(s，1H)，6.88-6.90(m，2H)，7.01-7.04(m，1H)，7.28-7.32(m，2H)，7.85(brs，1H)，8.25(brs，1H)，9.08(s，1H)。
实施例4-15：6-(8-乙酰基-4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸-3-基甲基)-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈
Figure A20048000547100491
在0℃下，向7-(2-环己基-乙基)-6-(4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸-3-基甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈三氟乙酸盐(142mg，0.28mol)在二氯甲烷(2ml)中的溶液中加入三乙基胺(395μl)和乙酸酐(54μl，0.57mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用冰水终止反应，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥。经硅胶色谱法纯化后得到90mg 6-(8-乙酰基-4-氧代-1-苯基-1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸-3-基甲基)-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈，收率为58％。
Rf＝0.30(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.97-1.40(m，6H)，1.64-1.82(m，9H)，2.14(s，3H)，2.37-2.44(m，2H)，3.40-3.48(m，1H)，3.74-3.79(m，1H)，3.93-4.01(m，1H)，4.34-4.38(m，2H)，4.56-4.66(m，3H)，4.87(s，2H)，6.61(s，1H)，6.74-6.76(m，2H)，6.91-6.95(m，1H)，7.23-7.25(m，2H)，8.94(s，1H)。
实施例4-16：6-(2-乙酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基甲基)-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈
Figure A20048000547100492
向6-溴甲基-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈(290mg，0.84mmol)在DMF(1.7ml)中的溶液中加入2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯(201mg，0.84mmol)和碳酸钾(138mg，1.0mmol)。将混合物在氮气气氛、室温下搅拌14小时。用水稀释反应混合物，用AcOEt萃取(两次)。合并有机层，用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥后真空蒸发。残余物经硅胶柱色谱法(正己烷∶AcOEt＝1∶1)纯化后得到8-[2-氰基-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯，收率为71％。Rf＝0.45(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。
向8-[2-氰基-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基甲基]-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸烷-2-甲酸叔丁酯(300mg，0.59mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加入三氟乙酸(3ml)。在室温下搅拌1.5小时后，蒸干溶剂得到7-(2-环己基-乙基)-6-(2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈三氟乙酸盐，定量收率。
Rf＝0.10(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)
在0C下，向7-(2-环己基-乙基)-6-(2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-甲腈三氟乙酸盐在吡啶(5ml)中的溶液中，加入乙酸酐(0.28ml，2.90mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用冰水终止反应，用乙酸乙酯萃取。合并萃取液，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥。经硅胶色谱法纯化后得到79mg 6-(2-乙酰基-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-8-基甲基)-7-(2-环己基-乙基)-7H-吡咯并[2，3]嘧啶-2-甲腈，收率为30％(3步)。
Rf＝0.30(正己烷∶AcOEt＝1∶1)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.00-1.84(m，17H)，2.04(s，3H)，2.33-2.56(m，4H)，3.25-3.35(m，2H)，3.47-3.53(m，2H)，3.66-3.69(m，2H)，4.38-4.43(m，2H)，6.49(s，1H)，8.87(s，1H)。

Claims (15)

1.式I化合物或其可药用盐或酯：
Figure A2004800054710002C1
式I
其中E是式a或式b的基团
Figure A2004800054710002C2
式a
Figure A2004800054710002C3
式b
其中
A是CH2、CH2-CH2或C＝O；
B是CH2、C＝O或
Figure A2004800054710002C4
D是CH2或C＝O；
G是CH2、CH2C＝O或CH2-CH2；
J是CH2、C＝O或CH2-CH2；
L是H、OCH3、卤素或低级烷氧基；
M是CH2或NH；
Q是H、低级烷基、羟基取代的低级烷基、可选取代的芳基低级烷基、低级烷基磺酰基、碳环芳基低级烷基、低级烷氧基取代的碳环芳基低级烷基、卤素取代的碳环芳基低级烷基、N-杂环基取代的低级烷基、低级烷氧基取代的碳环芳基、氨基羰基、环烷基氨基羰基、N-杂环基取代的低级烷基羰基、卤素取代的碳环芳基低级烷基、低级烷氧基羰基或低级烷基羰基；并且
R是低级烷基、对-氯苯基乙基、环己基乙基、二甲基丁基、二氟环己基乙基、环戊基乙基或环庚基乙基。
2.式I-(i)化合物或其可药用盐或酯
式I-(i)
其中
Q-i是H、低级烷基、羟基取代的低级烷基、N-杂环基取代的低级烷基、单或二取代的芳基低级烷基、低级烷氧基取代的碳环芳基低级烷基；并且R如权利要求1所定义。
3.式I-(ii)化合物或其可药用盐或酯
Figure A2004800054710003C2
式I-(ii)
其中
Q-ii是H、低级烷基、N-杂环基取代的低级烷基、卤素取代的碳环芳基低级烷基、低级烷基羰基；并且L和R如权利要求1所定义。
4.式I-(iii)化合物或其可药用盐或酯
Figure A2004800054710004C1
式I-(iii)
其中
B-iii是CH2；
G-iii是CH2CH2；
J-iii是CH2CH2；
Q-iii是H、环烷基氨基羰基、氨基羰基、低级烷氧基取代的碳环芳基、低级烷基羰基、碳环芳基低级烷基或N-杂环基取代的低级烷基羰基；并且R如权利要求1所定义。
5.权利要求1、2或3的化合物，其中R是R1＝低级烷基。
6.权利要求1、2或3的化合物，其中R是R2＝对-氯苯基乙基、环己基乙基、二甲基丁基、二氟环己基乙基、环戊基乙基或环庚基乙基。
7.权利要求1、2或3的化合物，其中R是R5＝2，2-二甲基-丙基。
8.权利要求1、2或3的化合物，其中R是R6＝3，3-二甲基-丁基。
9.式I-(iv)化合物或其可药用盐或酯
Figure A2004800054710004C2
式I-(iv)
其中
R3是(8-低级烷基-羰基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基、(8-低级烷基-磺酰基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基、(8-芳基-低级烷基)-2，8-二氮杂-螺[4.5]癸-2-基甲基、
Figure A2004800054710005C1
或
Figure A2004800054710005C2
R4是对-氯苯基甲基、环己基甲基、二甲基丙基、二氟环己基甲基、环戊基甲基或环庚基甲基；并且Q如权利要求1所定义。
10.选自于实施例1至4的任一个的化合物或其可药用盐或酯。
11.用作药物的权利要求1-8任一项所述的化合物。
12.含有权利要求1-8任一项所述的化合物作为活性成分的药物组合物。
13.治疗患有或易患与组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S有关的疾病或病症的患者的方法，该方法包括向患者施用有效量的权利要求1-8任一项所述的化合物。
14.权利要求1-8任一项所述的化合物用于制备治疗或预防与组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶S有关的疾病或病症的药物的用途。
15.权利要求1所述的化合物的制备方法，其包括使式II化合物
式II
其中，Q具有权利要求1中的定义，
与式III化合物偶联，
Figure A2004800054710005C4
式III
其中，X是卤素，R具有权利要求1中的定义，
并回收所形成的游离碱、可药用盐或酯形式的化合物。
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