CN1746290A - 菌体的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种菌体的培养方法,其在至少含有碳源及氮源的培养基中,使用可调控搅拌功率和通气量的通气搅拌型培养装置,培养可产生多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物中至少一种的微生物;且从培养开始到所规定的时间内,进行每单位液量搅拌功率为269(W/m3)以下的机械搅拌,在所规定时间之后,当P:搅拌所需功率(W)、V:液量(m3)、Vs:空气线速度(m/sec)时,在满足KLA(=(P/V) 0.95Vs0.67)为59以上,空气线速度参数Vs0.67为0.075以上,并且搅拌所需功率参数(P/V) 0.95为203以上的范围内调控最大通气量或最大所需搅拌功率中至少一项。

Description

菌体的培养方法
技术领域
本发明涉及一种菌体的培养方法,其在至少含有碳源及氮源的培养基中,使用可调控搅拌功率和通气量的通气搅拌型培养装置,培养可产生多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物中至少一种的微生物。
背景技术
在需氧培养中,很多情况下氧的供给左右着培养的结果(例如多不饱和脂肪酸(以下记为“PUFA(poly unsaturated fatty acid)”)的生产性能等),考虑放大时,在重视通气量、搅拌速度及通气搅拌所需功率这些因子的同时,还需重视KLa(体积氧传质系数)指标。
在考虑放大时,将KLa作为指标是指即使培养槽的形式和规模不同,如氧的传递速度相等,也可得到同样的培养结果的考虑方法(例如、参照非专利文献1和2)。
测定KLa的方法有种种提案,但操作均较繁杂,为能更简便地推断出KLa,Cooper等提出了KLa=K(P/V)0.95(Vs)0.67[K:比例常数、P:搅拌所需功率(W)、V:液量(m3)、Vs:空气线速度(m/sec)]的近似表达式(参照非专利文献3)。
[非专利文献1]村上圣等,化学工程学论文集26(4):557-562(2000)
[非专利文献2]A.E.Humphery,发酵工程学会志,42:334-345(1964)
[非专利文献3]C.M.Cooper et al.,Ind.Chem.Eng.36:504-509(1944)
发明内容
Cooper等提出的上述近似表达式虽可预测KLa,但因其是使用12片搅拌叶的Vaned disk型叶轮求出的KLa和操作条件之间的相关关系,所以严格地讲使用与其不同的培养槽时将不能得出其相关关系。
另外,Cooper等的实验是在水中进行的,对细菌、酵母等流变性低的培养来说较适用,但对流变性高的丝状真菌和放线菌的培养来说,存在很大的差异。
鉴于以上实际情况,本发明提供一种培养方法,即在放大过程中,不需实际求出KLa(体积氧传质系数),而且能确保PUFA或含有以PUFA为结构成分的化合物的良好的生产性能。
本发明第1特征的构成重点是在至少含有碳源及氮源的培养基中,使用可调控搅拌功率和通气量的通气搅拌型培养装置,培养可产生多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物中至少一种的微生物的培养方法,从培养开始到所规定的时间内,进行每单位液量搅拌功率为269(W/m3)以下的机械搅拌,在所规定时间之后,当P:搅拌所需功率(W)、V:液量(m3)、Vs:空气线速度(m/sec)时,在满足KLA(=(P/V)0.95Vs0.67)为59以上,空气线速度参数Vs0.67为0.075以上并且搅拌所需功率参数(P/V)0.95为203以上的范围内调控最大通气量或最大所需搅拌功率中至少一项。
本发明第1特征的构成为:只要是至少含有碳源及氮源的培养基即可进行培养,因使用机械搅拌,所以可配制始终为均匀混合的培养基。其结果能确保菌体的增殖及在生产性能上的重复性。
且因在通气搅拌型培养槽内培养,所以能高效地培养出产生PUFA或含有以PUFA为结构成分的化合物中至少一种(以下记为“PUFA类”)的需氧性微生物。
因上述通气搅拌型培养槽的搅拌功率和通气量均可调控,例如可随时将培养液中的溶解氧浓度调节到适合产生PUFA类的范围内。
另外,从培养开始时到所规定的时间内,由于进行每单位液量的搅拌功率为269(W/m3)以下的、搅拌剪切力较小的机械搅拌,所以能减少放线菌或丝状真菌的菌丝及球状菌体所受的物理损伤。其结果可在适合生产PUFA类的形态下培养菌体。
并且因在所规定时间之后,可在满足KLA(=(P/V)0.95Vs0.67)为59以上、空气线速度参数Vs0.67[(m/sec)0.67]为0.075以上并且搅拌所需功率参数(P/V)0.95[(W/m3)0.95]为203以上的范围内调控最大通气量或最大所需搅拌功率中至少一项,所以能更有效地进行PUFA类生产菌的培养。因此能促进PUFA类生产性能的提高[P:搅拌所需功率(W)、V:液量(m3)、Vs:空气线速度(m/sec)]。即在KLA(=(P/V)0.95Vs0.67)为59以下、空气线速度参数Vs0.67[(m/sec)0.67]为0.075以下时,如图1及图2所示,PUFA类(此处为花生四烯酸)的产量少。另外,将搅拌所需功率参数(P/V)0.95[(W/m3)0.95]定为203以上是因如表4的Ex.4-2栏所示,每单位液量的搅拌功率为培养开始时的269(W/m3)以上时,即搅拌所需功率参数(P/V)0.95[(W/m3)0.95]为203以上时,应进行大于培养开始时的搅拌。并且优选为比培养开始时更强的搅拌。
更有在放大过程中,在上述数值的基础上,只要设定最大通气量及最大所需搅拌功率,即可使用最低的通气量和搅拌功率进行高生产率的培养。因其与降低运转成本有关,所以可实现生产效率非常高的放大。
本发明第2特征的构成为上述多不饱和脂肪酸为花生四烯酸。
花生四烯酸在构成血液、肝脏等重要器官的脂肪酸中约占10%左右(例如,人体血液的磷脂中脂肪酸的组成比为花生四烯酸占11%、EPA占1%、DHA占3%),其作为细胞膜的主要构成成分参与细胞膜流动性的调节并在体内代谢上表现出各种功能,同时,作为前列腺素类的直接前驱物质起着重要的作用。
特别是近来作为婴幼儿营养成份之一的花生四烯酸的作用,以作为表示神经活性作用的内源性大麻酯(Cannabinoids)(2-四氢大麻酚(Arachidonoyl)单甘油、内源性大麻酯(Anandamide))的结构脂肪酸而引人注目。
通常来说,摄取富含亚油酸的食品可转换成花生四烯酸,但由于成人病患者及其易患人群、婴儿、老年人的体内参与生物合成的酶活力低下,易导致花生四烯酸不足。因此最好是直接摄取作为油脂(甘油三酯的结构脂肪酸)的花生四烯酸。
根据本发明第2特征的构成,能高效稳定地生产特别是作为婴幼儿营养成份之一而起重要作用的花生四烯酸或以花生四烯酸为结构脂肪酸的油脂等的化合物中至少一种。并将以上物质添加入饮料食品、治疗用营养食品、饲料以及医药品中,通过制造销售,为保持和增进大众的健康做出贡献。
本发明第3特征的构成重点为PUFA类生产菌属于被孢霉属(Mortierella)被孢霉亚属(Mortierella)。
根据本发明第3特征的构成,如后详细所述,因PUFA类生产菌属于被孢霉属(Mortierella)被孢霉亚属(Mortierella),所以能高效地生产PUFA类,且此菌体容易获得。
本发明第4特征的构成重点在于培养开始后的所规定时间优选为12~24小时。
根据本发明第4特征的构成,进行每单位液量的搅拌功率为269(W/m3)以下的、搅拌剪切力较小的机械搅拌,在培养开始后12~24小时期间,培养中的菌体发生由浆状菌丝向球状菌体转变的形态变化,其形态变化的有效进行可抑制规定时间后的培养液黏度的极端上升。因此能更高效地生产PUFA类。
附图说明
图1为各培养中所得花生四烯酸的产量与KLA值的关系图。
图2为构成KLA值的2个参数(P/V)0.95值与Vs0.67值的相关关系图。
具体实施方式
本发明所使用的是对PUFA或以PUFA为结构脂肪酸的化合物(例如油脂(甘油三酯)及/或磷脂)中至少一种具有生产能力的微生物,例如,属于被孢霉属(Mortierella)、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、青霉属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉属(Mucor)、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属(Entomophthora)、刺孢囊霉属(Echinosporangium)、水霉属(Saprolegnia)的微生物。
特别是属于被孢霉属(Mortierella)被孢霉亚属(Mortierella)的微生物,如长孢被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)、高山被孢霉(Mortierella alpina)等。具体地说可为长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570,微小被孢霉(Mortierellaexigua)IFO8571,喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941,高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等的菌株。
这些菌株中任一种均可从日本大阪市发酵研究所(IFO)、美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)及荷兰的霉菌中心保藏所(Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS))中不受限制地得到。另外也可使用本发明研究小组从土壤中分离的菌株长孢被孢霉SAM0219(微工研菌寄第8703号)(微工研条寄第1239号)和高山被孢霉1S-4株。
为培养本发明所使用的菌株,本培养将其菌株的孢子、菌丝或预先培养所得的种子培养液或由种子培养回收的菌体接种于液体培养基中。液体培养基的碳源一般可使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、糖化淀粉等,但不仅限于此种类。氮源除可使用蛋白胨、酵母膏、麦芽汁、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、大豆蛋白、脱脂大豆、棉籽饼等的天然氮源之外,还可使用尿素等有机氮源及硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等无机氮源,特别是从大豆中得到的氮源,具体为大豆、脱脂大豆、大豆饼、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆乳、熟豆面等,尤其是脱脂大豆加热变性后的产物,更优选的是可将脱脂大豆进行70~90℃热处理,除去其乙醇可溶成分后的产物单独或复数或与上述氮源结合使用。
此外,根据需要除可使用磷酸离子、钾离子、钠离子、镁离子、钙离子以外,还可把铁、铜、锌、锰、镍、钴等的金属离子和维生素等作为微量营养源使用。只要对微生物的生长和发育无害,对这些培养基成分的浓度均无特殊要求。从实用上,一般碳源的总添加量为0.1~40%(重量百分比),优选为1~25%(重量百分比);氮源的总添加量为2~15%(重量百分比),优选为2~10%(重量百分比),更优选为初次的碳源添加量为1~5%(重量百分比),初次的氮源添加量为3~8%(重量百分比),培养过程中流加碳源及氮源,最优选的是只流加碳源进行培养。
另外,为使不饱和脂肪酸的产量增加,作为不饱和脂肪酸的前体,例如十六烷或类十六烷酸的碳氢化物;油酸或类亚油酸的脂肪酸或其盐,或是脂肪酸酯,例如乙酯、甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯;或是类橄榄油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油的油脂类均可被单独或结合使用。基质的添加量针对培养基为0.001~10%,优选在0.5~10%。并可把这些基质作为唯一的碳源用于培养。
本发明中微生物的培养温度因所使用的微生物不同而不同。例如,可为5~40℃,优选为20~30℃,亦可先在20~30℃下培养,使菌体增殖后再于5~20℃下继续培养使其生产不饱和脂肪酸。此种温度管理还可使生成脂肪酸中的多不饱和脂肪酸的比例上升。
种子培养包括通气搅拌培养、振荡培养、固体培养或静置液体培养,本培养进行的是通气搅拌培养。将本培养开始时(种子培养液接种时)的培养基的pH调至5~7,优选为5.5~6.5。本培养的培养期间通常为2~30日,优选为5~20日,更优选为5~15日。
本培养方法使用的是可调控搅拌功率和通气量的通气搅拌型培养装置,使用装有搅拌叶直径(=d)、培养槽直径(=D)的比率为d/D=0.30~0.6,优选为d/D=0.34~0.55,更优选为d/D=0.37~0.55,最优选为d/D=0.42~0.55的具备搅拌叶的培养槽进行培养。
属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物作为产生以花生四烯酸为主要结构脂肪酸的油脂(甘油三酯)的微生物而广为人知,本发明人等通过对上述菌株施以诱变处理,获得了能产生以二同型-γ-亚麻酸为主要结构脂肪酸的油脂(甘油三酯)的微生物(特开平5-91887)和能产生以ω9系列多不饱和脂肪酸为主要结构脂肪酸的油脂(甘油三酯)的微生物(特开平5-91888)。另外,还获得了对高浓度碳源具有耐性的微生物(WO98/39468)。这些微生物属于被孢霉属被孢霉亚属,且使用本发明的培养法进行培养可提高其生产能力。
将使用上述的菌体、培养基、培养装置进行本培养的培养过程概况说明如下。
首先在培养开始时,使用每单位液量的搅拌功率为269(W/m3)以下的较弱的机械搅拌的同时进行通气培养。
并且此时的通气量无特别限制。将放线菌或丝状真菌置于需氧条件下进行液体培养,从营养增殖期向生产期转移时,会有从浆状菌丝向球状菌体(别名菌丝球)转变的形态变化。
此处所述的球状菌体是指在液体培养基中培养时放线菌或丝状真菌的菌形态之一,是平均直径为0.2~数厘米的球状或纺锤状菌丝的集合体。
另外浆状菌丝是指在液体培养基中培养时放线菌或丝状真菌的典型菌形态,菌丝呈现出直线或放射状伸展的分散状态。也就是说从浆状菌丝向球状菌体的形态变化是与PUFA类的生产率密切相关的。
进行搅拌剪切力大的机械搅拌时,会破坏球状菌体的菌形态,妨碍向球状菌体的形态形成,同时伴随菌体的增值培养液的黏度会升高,混合效率下降,其结果使氧不能充分供给菌体,因而降低了PUFA类的生产率。
因此为促使向球状菌体的形态形成,历来均采用研究培养基的最佳组成或调整通气气体中氧分压的方法。本发明是通过从培养开始到所规定的时间内进行搅拌剪切力较小的搅拌,以促进向球状菌体的形态形成。
在通气搅拌型装置上安装溶解氧浓度监测传感器,以监测培养液中溶解氧的浓度。
因在菌体增殖的同时培养基中的溶解氧浓度(DO)开始降低,所以在即将到达不影响PUFA类生产性能的最低DO值(约50%)之前,提高搅拌功率和通气量以维持所需的DO值。
达到此最低DO值的时间大约为从培养开始的12~24小时之后。之后在满足KLA(=(P/V)0.95Vs0.67)为59以上,空气线速度参数Vs0.67[单位:(m/sec)0.67]为0.075以上并且搅拌所需功率参数(P/V)0.95[单位:(W/m3)0.95]为203以上的范围内,调控最大通气量或最大所需搅拌功率中至少一项进行培养。作为调控的具体实例,例如,可提高最大通气量或最大所需搅拌功率中的任一方,也可同时提高其双方。
此处的KLA值为本发明人等根据Cooper等提出的KLa(体积氧传质系数)=K(P/V)0.95(Vs)0.67的近似表达式重新设定的参数。并由本发明人等首次发现了KLA值和PUFA类的生产量之间有良好的正相关。
培养开始约40~48小时后,在培养基内的营养成分(特别是氮源)消耗殆尽的同时菌体浓度达到最高值,由营养增殖期向PUFA类生产期的转移的同时PUFA类在菌体内的蓄积也被促进。
之后在培养过程中随时进行葡萄糖的培养基流加,培养约5~15天。培养结束后,回收菌体并干燥,干燥菌体用正己烷萃取等以获得PUFA或含有以PUFA为结构脂肪酸的化合物(例如为甘油三酯或磷脂等)中至少一种。
实施例
实施例1(搅拌所需功率的测定)
在10kL容量的通气搅拌培养槽内加满6kL(=V)的自来水,在1vvm的通气条件下,测定用各种搅拌转数运转时的搅拌消耗功率(=A)。之后,测定在同培养槽内用同转数空转时的搅拌所需功率(=B)。空转时,为防止搅拌轴过热,加水时下部的水位不仅应没过搅拌叶,还应没过搅拌轴下部的轴承部进行运转。
测定功率需在变流器的一次侧(电源侧)安装功率计(日置电机株式会社制钳式功率计),测定有效功率。
把A值减B值所得的差值作为搅拌所需功率(=P),将P值用液量除所得值为单位液量所需搅拌功率(=P/V)。求出的实测值如下表所示。
[表1]
  搅拌转数(rpm)(=N)   满水时消耗功率(kW)(=A)   空转时消耗功率(kW)(=B)   搅拌所需功率(kW)(P=A-B)   单位液量搅拌所需功率(kW/m)(P/V)
  35   1.660   0.630   1.030   0.172
  65   6.804   1.050   5.754   0.959
  95   17.528   1.498   16.030   2.672
把实测值标在横轴为搅拌转数(=N)、纵轴为单位液量搅拌所需功率(=P/V)的图上,用最小二乘法求出近似表达式P/V=XNY的参数X及Y。使用所求出的X值、Y值及其近似表达式求出在任意搅拌转数条件下单位液量的搅拌所需功率。
停止向培养槽内通气时搅拌所需功率会增加,可用和上述同样的方法求出无通气时的X值及Y值后,再求出任意搅拌转数条件下单位液量的搅拌所需功率。
实施例2(培养液中的搅拌所需功率)
把花生四烯酸的生产菌高山被孢霉1S-4株(Mortierella alpina1S-4株)置于10kL的培养槽内培养。在培养液量6kL、1vvm的通气条件下,测定用各种搅拌转数运转时的搅拌消耗功率。其结果如下表所示。
[表2]
  搅拌转数(rpm)(=N)   注满培养液时消耗功率(kW)(=A)
  35   1.720
  65   6.700
  95   17.612
比较使用实施例1和实施例2测出的搅拌功率,在水中运转时(实施例1)与在培养液中运转时(实施例2)的搅拌功率无显著差异。由此可认为在培养液中的搅拌所需功率与同培养槽内在浸水运转时测得的搅拌所需功率十分近似。
实施例3
把M.alpina 1S-4株的孢子悬浮液0.1vol.%接种于含酵母膏1.0%、葡萄糖2.0%、pH为6.3的培养基中,往复振荡100rpm,于温度28℃条件下开始种子培养(第一阶段),培养3日。
再于容量50L的通气搅拌培养槽内配制含酵母膏1%、葡萄糖2%、大豆油0.1%、pH为6.3的培养基30L,在其中接种种子培养(第一阶段)液,在搅拌转数为200rpm、温度28℃、槽内压150kPa的条件下开始种子培养(第二阶段),培养2日。
之后在10kL容量的通气搅拌槽(培养槽内直径为1.8m)内配制本培养的培养基。培养基的配制法为首先将4500L培养基(培养基A:大豆粉336kg、KH2PO4 16.8kg、MgCl2·6H2O 2.8kg、CaCl2·2H2O 2.8kg、大豆油5.6kg)的pH调整为4.5,在121℃、20分钟条件下在本培养槽内进行灭菌。另一培养基为把1000L培养基(培养基B:含水葡萄糖112kg)于121℃、20分钟的条件下在其他培养槽内灭菌后,将其保持无菌状态加入到本培养槽的培养基A中(添加后的培养基为培养基C)。在培养基C中保持无菌状态添加灭菌氢氧化钠水溶液,将pH调整为6.1后,把容量28L的种子培养液(第二阶段)通过无菌操作进行接种,制成合计为5600L液量的初期培养液(培养槽容积为10kL)。在温度26℃、内压200kPa、通气量49m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.00535m/sec)、单位培养液量的所需搅拌功率(=P/V)为112W/m3的条件下开始培养。如下式求出培养开始时的各参数值。
[数式1]
(P/V)0.95:89[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.03 [(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):2.67[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
在培养第15小时时将搅拌功率(=P/V)变更为880W/m3后,到培养第40小时之间逐渐加大通气量和搅拌转数,直到提高通气量到437m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.0477m/sec),搅拌功率(=P/V)到3250W/m3为止。在提高了通气搅拌的状态下如下式求出各参数值。
[数式2]
(P/V)0.95:2169[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.130[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):282[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
培养过程中如下表所示进行培养基流加,本培养共进行了306小时。培养结束时,由于培养基受流加时培养液增加及蒸发时培养液减少的影响,培养液的总量变为7750L。
[表3]
本培养时间            流加培养基
19小时后            含水葡萄糖280kg/460L
43小时后            含水葡萄糖280kg/450L
67小时后            含水葡萄糖252kg/390L
91小时后            含水葡萄糖252kg/410L
120小时后           含水葡萄糖224kg/370L
140小时后           含水葡萄糖168kg/280L
163小时后           含水葡萄糖168kg/270L
培养结束后,在120℃、20分钟条件下灭菌,之后用连续式脱水机回收湿菌体,用振动流动层干燥机进行热风干燥(热风温度120℃),将水分含量干燥到2wt%。把干燥后的菌体置于流动层内供给室温空气,冷却到40℃后,再用空气输送机将干燥菌体输送到充填场所。将得到的干燥菌体与氮气同时充填到容量约1m3的铝制大包装袋内,将袋口热封后,置于10℃以下的冷藏室保藏。
从大包装袋内取出干燥菌体进行正己烷萃取,过滤正己烷萃取液除去所含的固形成分后,减压加热除去正己烷,可获得以花生四烯酸为结构脂肪酸的粗制油。
实施例4(培养开始时搅拌所需功率的影响)
与实施例3同法进行种子培养,配制本培养的培养基。除把培养开始时的搅拌条件如下表所示各种条件设定外,本培养均与实施例3同条件进行。
培养结果显示培养开始时的P/V值对花生四烯酸的生产有很大影响。
[表4]
  实验No.   培养开始时的条件   培养结果
  培养开始时单位液量所需搅拌功率P/V(W/m3)   参数(P/V)0.95[(W/m3)0.95]   单位培养液量中花生四烯酸的产量(※)(g/L)
  Ex.4-1   41   34   22.4
  Ex.4-2   269   203   22.40
  Ex.4-3   810   579   17.0
  Ex.4-4   3250   2169   14.1
  Ex.3(实施例3)   112   89   22.8
(※)由于各培养中蒸发和葡萄糖添加使培养液液量发生变动,所以如下式求校正值。
[数式3]
花生四烯酸的产量(校正值)
=培养结束时单位培养液中花生四烯酸的产量×培养结束时的液量/培养开始时的液量
实施例5(培养开始时通气量的影响)
与实施例3同法进行种子培养,配制本培养的培养基。除将培养开始时的通气条件如下表所示各种条件设定外,本培养均与实施例3同条件进行。因在实验No.Ex.5-1及5-2的任意一项中均设定了比培养开始时高的通气量,所以,在培养开始后20小时之内,与Ex.3相比具有极高的起泡性。因此,为消除泡沫,采用了间歇式停止通气法。
通气时会产生泡沫,泡沫高度开始上升。如泡沫的高度上升到槽内顶层附近(排气管附近)时,立即停止液中通气。停止通气后,泡沫高度开始下降,培养液中的溶解氧浓度(DO)也同时开始降低。在即将到达不影响花生四烯酸生产性能的最低DO值之前再次开始通气。反复进行此操作直到控制住起泡性为止。本实施例中的空气线速度Vs是指通气状态下的空气线速度,不是考虑到间歇通气法时通气量的积算平均值。另外,不影响花生四烯酸生产性能的最低DO值是指停止通气时引起的DO的减少对经过的时间失去直线关系时的DO浓度(临界DO浓度)。临界DO浓度是预先在同等条件下培养时,根据动态测定法(《发酵工程学基础》,1988,学会出版中心,石崎文彬译)测得的。
培养结果显示培养开始时的Vs值对花生四烯酸的生产基本无影响。
[表5]
  实验No.   培养开始时的条件   培养结果
  培养开始时的空气线速度Vs(m/sec)   参数Vs0.67[(m/sec)0.67]   单位培养液量中花生四烯酸的产量(※)(g/L)
  Ex.5-1   0.0196   0.0719   22.3
  Ex.5-2   0.0477   0.130   22.6
  Ex.3(实施例3)   0.00535   0.0301   22.8
(※)由于各培养中蒸发和葡萄糖添加使培养液液量发生变动,所以如下式求校正值。
[数式4]
花生四烯酸的产量(校正值)
=培养结束时单位培养液中花生四烯酸的产量×培养结束时的液量/培养开始时的液量
实施例6(最高KLA值的影响)
与实施例3同法进行种子培养,配制本培养的培养基。与实施例3相同,在温度26℃、内压200kPa、通气量49m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.00535m/sec)、单位培养液量的所需搅拌功率(=P/V)为112W/m3的条件下开始培养。如下式求出培养开始时的各参数值。
[数式5]
(P/V)0.95:89[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.03[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):2.67[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
在培养第18小时时将搅拌所需功率(=P/V)变更为380W/m3后,到培养第48小时之间逐渐加大通气量和搅拌转数,在各种最大通气量及最大搅拌功率条件下进行培养。在图1中,将在各培养中所得的花生四烯酸的产量和培养中最大KLA(=(P/V)0.95Vs0.67)值的关系进行制图。由此可看出,KLA值与花生四烯酸的产量之间表现出良好的正相关关系。另外在图1中,即使把KLA值增加到100以上,花生四烯酸的产量有时也只为15~16g/L左右(例如,图1中用A所示的范围内的图形),也可看出KLA值与花生四烯酸的产量之间有时会偏离相关关系。为调查此原因,又绘制了构成KLA值的2个参数(P/V)0.95值和Vs0.67值之间的相关关系图(图2)。在此,图2中A’所示范围内的图与图1中A所示范围内的图相对应。从结果可知,即使提高KLA值,如Vs0.67值未达到0.075以上时,也不能得出由提高KLA值而使花生四烯酸的产量增大的结果。
实施例7
与实施例3同法进行种子培养。将与实施例3相同浓度组成的本培养培养基1300L置于2kL容积的培养槽内配制,在温度26℃、内压200kPa、空气线速度0.0087(m/sec)、单位培养液量的所需搅拌功率(=P/V)为264W/m3的条件下开始培养。如下式求出培养开始时的各参数值。
[数式6]
(P/V)0.95:199[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.042[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):8.28[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
在培养第24小时时将搅拌功率(=P/V)变更为890W/m3后,到培养第48小时之间逐渐加大通气量和搅拌转数,直到提高空气线速度Vs到0.084(m/sec),搅拌功率P/V到1493W/m3为止。在提高了通气搅拌的状态下如下式求出各参数值。
[数式7]
(P/V)0.95:1036[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.191[(m/s ec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):198[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
培养过程中添加与实施例3同组成浓度的葡萄糖,本培养进行了306小时。其结果,获得20.0g/L的花生四烯酸的产量(作为校正值)。
实施例8
使用作为花生四烯酸生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)CBS754.68株进行培养。从保存菌株开始用与实施例3同样的方法进行种子培养,配制本培养的培养基。在温度26℃、内压200kPa、通气量49m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.00535m/s ec)、单位培养液量的所需搅拌功率(=P/V)为112W/m3的条件下开始培养。如下式求出培养开始时的各参数值。
[数式8]
(P/V)0.95:89[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.03[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):2.67[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
在此条件下开始培养,将最初的搅拌转数的变更时间作多种设定进行复数次培养(实验No.Ex.6-1~6-4)。最初的搅拌转数变更时,将搅拌功率(=P/V)变更为380W/m3,之后到培养第48小时之间逐渐加大通气量和搅拌转数,直到提高最大通气量到437m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.0477m/sec),最大搅拌功率(=P/V)到3250W/m3为止。在提高了通气搅拌的状态下如下式求出各参数值。
[数式9]
(P/V)0.95:2169[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.130[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):282[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
培养过程中添加与实施例3相同的葡萄糖,本培养进行了288小时。
培养结果显示培养开始后的最初的搅拌功率变更时间对花生四烯酸的生产有很大影响。
[表6]
  实验No.   最初的搅拌功率变更时间(从种子培养接种开始本培养后所经过的时间)   培养结果※单位培养液量中花生四烯酸的产量(g/L)
  Ex.6-1   6hr   10.1
  Ex.6-2   12hr   18.5
  Ex.6-3   24hr   18.7
  Ex.6-4   30hr   9.5
(※)由于各培养中蒸发和葡萄糖添加使培养液液量发生变动,所以如下式求校正值。
[数式10]
花生四烯酸的产量(校正值)
=培养结束时单位培养液中花生四烯酸的产量×培养结束时的液量/培养开始时的液量
实施例9(DGLA生产)
使用高山被孢霉(Mortierella alpina)SAM1860株作为二同型(dihomo)-γ-亚麻酸的生产菌。把保藏菌株接种在配制有含酵母膏1%、葡萄糖2%、pH为6.3的培养基的烧瓶内,在100rpm、28℃条件下开始种子培养(第一阶段),培养3日。之后,把含酵母膏1%、葡萄糖2%、大豆油0.1%、pH为6.3的培养基30L于50L容量的通气搅拌培养槽内配制,在其中接种上述的种子培养(第一阶段)的培养液,在搅拌转数200rpm、温度28℃、槽内压150kPa的条件下进行种子培养(第二阶段),培养2日。
之后在含脱脂大豆粉4%、葡萄糖1.8%、KH2PO40.3%、Na2SO40.1%、MgCl2·6H2O 0.05%、CaCl2·2H2O 0.05%、大豆油0.1%、pH为6.1的培养基中接种0.5%的种子培养液(第二阶段),在4000L液量中开始本培养。
在温度26℃、内压200kPa、通气量52m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.0057m/sec)、单位培养液量中所需搅拌功率(=P/V)为30W/m3的条件下开始培养。如下式求出培养开始时的各参数值。
[数式11]
(P/V)0.95:25[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.0313[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):0.782[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
在此条件下开始培养,在培养开始后第19小时时变更搅拌功率,到培养第48小时之间逐渐加大通气量和搅拌转数,直到提高最大通气量到240m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.0262m/sec),最大搅拌功率(=P/V)到1251W/m3为止。在提高了通气搅拌的状态下如下式求出各参数值。
[数式12]
(P/V)0.95:875.9[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.0871[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):76.3[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
培养过程中添加葡萄糖,本培养进行了160小时。培养结束时二同型γ亚麻酸的生成浓度为7.0g/L。
实施例10(M酸生产)
使用高山被孢霉(Mortierella alpina)SAM2086株作为M酸的生产菌。把保藏菌株接种在配制有含酵母膏1%、葡萄糖2%、pH为6.3的培养基的烧瓶内,在100rpm、28℃条件下开始种子培养(第一阶段),培养3日。之后,把含酵母膏1%、葡萄糖2%、橄榄油0.1%、pH为6.3的培养基30L于50L容量的通气搅拌培养槽内配制,在其中接种上述的种子培养(第一阶段)的培养液,在搅拌转数200rpm、温度28℃、槽内压150kPa的条件下进行种子培养(第二阶段),培养2日。
之后在含脱脂大豆粉4%、葡萄糖1.8%、KH2PO40.3%、Na2SO40.1%、MgCl2·6H2O 0.05%、CaCl2·2H2O 0.05%、橄榄油0.1%、pH为6.1的培养基中接种0.5%的种子培养液(第二阶段),在4000L液量中开始本培养。
在温度24℃、内压200kPa、通气量52m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.0057m/sec),单位培养液量中所需搅拌功率(=P/V)为30W/m3条件下开始培养。如下式求出培养开始时的各参数值。
[数式13]
(P/V)0.95:25[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.0313[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):0.782[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
在此条件下开始培养,在培养开始第22小时时变更搅拌功率,到培养第48小时之间逐渐加大通气量和搅拌转数,直到提高最大通气量到240m3/hr(空气线速度(=Vs)为0.0262m/sec),最大搅拌功率(=P/V)到1098W/m3为止。在提高了通气搅拌的状态下如下式求出各参数值。
[数式14]
(P/V)0.95:773.8[(W/m3)0.95]
Vs0.67:0.0871[(m/sec)0.67]
KLA(=(P/V)0.95Vs0.67):67.4[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
培养过程中添加葡萄糖,本培养进行了376小时。培养结束时M酸的生成浓度为6.0g/L。
因能高效稳定地生产特别是作为婴幼儿营养成份之一而起重要作用的花生四烯酸或以花生四烯酸为结构脂肪酸的油脂等的化合物中至少一种,所以可将以上物质添加入饮料食品、治疗用营养食品、饲料以及医药品等的制造中使用。

Claims (4)

1.一种菌体的培养方法,其在至少含有碳源及氮源的培养基中,使用搅拌功率和通气量可调控的通气搅拌型培养装置,培养可产生多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物中至少一种的微生物;
从培养开始到所规定的时间内,进行每单位液量搅拌功率为269(W/m3)以下的机械搅拌,在所规定时间之后,当P:搅拌所需功率(W)、V:液量(m3)、Vs:空气线速度(m/sec)时,在满足KLA(=(P/V)0.95Vs0.67)为59以上,空气线速度参数Vs0.67为0.075以上,并且搅拌所需功率参数(P/V)0.95为203以上的范围内调控最大通气量或最大所需搅拌功率中至少一项。
2.根据权利要求1所述的菌体培养方法,其特征为上述多不饱和脂肪酸为花生四烯酸。
3.根据权利要求1所述的菌体培养方法,其特征为上述微生物属于被孢霉属(Mortierella)被孢霉亚属(Mortierella)。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的菌体培养方法,其特征为上述所规定的时间优选为12~24小时。
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