CN1744826A - 利用虾青素的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可用于伴侣动物的方法和组合物,其中所述方法和组合物利用虾青素。所述组合物含有虾青素,可适用于伴侣动物。所述方法选自减轻炎症、增强免疫力、增加寿命,以及它们的组合,该方法包括给伴侣动物服用含有效量虾青素的组合物。在优选实施方案中,伴侣动物是家犬或猫。
Description
发明领域
本发明涉及利用虾青素来减轻炎症、增强免疫反应或延长伴侣动物寿命的方法和组合物。
发明背景
近年来,人们对抗氧化剂的保健效果兴趣日增。抗氧化剂可消除对人体有害的自由基或活性氧,所述自由基或活性氧是作为正常代谢的副产物而产生的。抗氧化剂营养物质包括多种能够消除有害自由基的化合物,并且包括某些通常已知的维生素,如维生素A、维生素C和维生素E。
类胡萝卜素是抗氧化剂的其中一大类。类胡萝卜素是天然存在的植物色素,其在不同物种中有不同程度的吸收。常见的类胡萝卜素包括,例如,β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、虾青素和角黄素。某些抗氧化剂在某些动物种类中还显示出具有抗癌性质。例如,已发现β-胡萝卜素可抑制人的神经细胞瘤细胞的增殖,而且角黄素已显示可防止小鼠中化学诱发的癌变。
对某些种类动物的免疫系统的影响也与某些类胡萝卜素有关。例如,角黄素使大鼠的淋巴细胞增殖增加,并且在仓鼠体内促进由巨噬细胞导致的肿瘤坏死因子(TNF)的产生。在细胞培养检验中,虾青素和β-胡萝卜素证明其能够增加鼠脾细胞对T依赖性抗原的体外抗体响应(Jyonouchi等人)。
尽管对于类胡萝卜素已了解很多,但要从一种已知的类胡萝卜素在一种动物体内的效果来推断确定另一种类胡萝卜素在同一动物体内的效果却是困难的。同样,根据一种胡萝卜素在不同类型动物体内的已知结论来确定它在某一动物体内的可能效果也是困难的。类胡萝卜素的吸收和代谢已确定为物种特异性的。例如,牛和马吸收β-胡萝卜素,而山羊和绵羊根本不吸收类胡萝卜素(Schweigert,F.J.,1998)。1931年的一项研究证明很大一部分的提供给猫的β-胡萝卜素未被吸收后,许多人认为猫无法利用β-胡萝卜素,直到Chew等人(2000)确定家猫容易吸收β-胡萝卜素,而且Schweigert等人(2002)证明这种吸收未伴随着β-胡萝卜素转化成维生素A,这表明β-胡萝卜素在猫体内不是通过作为维生素A前体来发挥功能的。
甚至在同一动物体内,类胡萝卜素显示具有不同的吸收方式。叶黄素和玉米黄质被发现集中在人视网膜内,而β-胡萝卜素则通常认为由于它无法通过血液视网膜屏障而不存在于视网膜组织内。
在伴侣动物营养学领域,人们期待获得对动物的免疫功能有积极效果的营养组分。鉴别那些能增强特定物种免疫功能的营养组分是一个挑战性的工作。我们需要的是能提高动物的免疫功能,从而有益于伴侣动物的营养配方和方法。
发明概述
本发明涉及可用于伴侣动物的方法和组合物,其中所述方法和组合物利用虾青素。所述组合物含有虾青素,其中所述组合物可适用于伴侣动物。所述方法选自减轻炎症、增强免疫力、增加寿命以及它们的组合,该方法包括给伴侣动物服用含有效量虾青素的组合物。在优选实施方案中,伴侣动物是家犬或猫。
附图简述
图1图示了给定每日口服剂量为0、0.1、0.5、2.5、10或40mg虾青素的狗的血浆虾青素浓度。所给值为平均值±SEM(n=8)。
图2图示了给定口服剂量为0、0.02、0.08、0.4、2、5或10mg虾青素的猫的血浆虾青素浓度。所给值为平均值±SEM(n=8)。
图3图示了给定每日口服剂量为0、0.02、0.08、0.4、2、5或10mg虾青素的狗的血浆虾青素浓度。所给值为平均值±SEM(n=8)。
图4表示喂食包含0、10、20或40mg虾青素的食物16周的狗的血浆虾青素浓度。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图5图示说明狗每日喂食0、10、20或40mg虾青素12周(图5a)或16周(图5b)后,其对皮内注射多价疫苗的迟发型超敏反应(表示为0时所测皮肤厚度的百分比)。皮肤硬化在注射后0、24、48和72小时测量。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图6图示说明每日喂食0、10、20或40mg虾青素16周的狗的CD21+B淋巴细胞的百分比(通过细胞表面标记物染色呈阳性的细胞数占淋巴细胞总数的百分比来计算)。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图7表示每日喂食0、10、20或40mg虾青素16周的狗的血浆IgM(7a)和IgG(7b)的浓度。所有狗均在13周和15周时接种多克隆疫苗。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图8表示每日喂食0、10、20或40mg虾青素16周的狗的自然杀伤细胞胞毒活性,以杀伤百分比表示。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图9图示说明每日喂食0、10、20或40mg虾青素16周的狗的血浆C反应蛋白浓度(用每毫升血浆中的纳克数表示)。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图10图示了每日喂食0、10、20或40mg虾青素16周的狗的血浆8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)的浓度。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图11表示喂食包含0、1、5或10mg虾青素的食物12周的猫的血浆虾青素浓度。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图12图示说明每日喂食0、1、5或10mg虾青素12周的猫对皮内注射多价疫苗的迟发型超敏反应水平(以在0时所测皮肤厚度的百分比来表示)。皮肤硬化在注射后0、24、48和72小时测量。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图13图示说明每日喂食0、1、5或10mg虾青素12周的猫,通过con A-(2.5μg/mL)、PHA-(1.25μg/mL)或PWM-(2.5μg/mL)诱导PBMC增殖从而掺入的[3H]-胸腺嘧啶核苷。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图14图示说明每日喂食0、1、5或10mg虾青素12周的猫的CD5+总T细胞(图14a)、CD4+Th细胞(图14b)和CD21+B淋巴细胞(图14c)的百分比(通过细胞表面标记物染色呈阳性的细胞数占淋巴细胞总数的百分比来计算)。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图15表示每日喂食0、1、5或10mg虾青素12周的猫的血浆IgG(图15a)和IgM(图15b)的浓度。所有猫均在9和10周时接种多克隆疫苗。所给值为平均值±SEM(n=14)。
图16图示了每日喂食0、1、5或10mg虾青素12周的猫的天然杀伤细胞胞毒活性。所给值为平均值±SEM(n=14)。
发明详述
贯穿本公开内容叙述了各种文献,包括例如公布和专利。所有这些文献均引入本文以供参考。任何所给文献的引用都不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
除非另外指明,所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明,所有百分比和比率均基于总组合物计算。
本文引用的是包括本发明所用各种成分的组分的商品名。本文发明者不旨在限于某一商品名称的材料。与以商品名提及的那些材料等价的材料(如以不同的名称或参考编号从不同来源得到的那些)可以被取代和用于本文的说明中。
在本发明的说明书中,公开了多种实施方案或个别特征。对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是,这些实施方案和特征的所有组合都是可能的,并可导致本发明的优选实施。
本文的组合物可包括本文所描述的任何特征或实施方案,或基本上由其组成,或由其组成。
虽然已用多种实施方案和个别特征说明和描述了本发明,但在不背离本发明精神和范围的条件下,可以对其进行各种其它改变和修改。还明显的是,前述公开中提出的实施方案和特征的所有组合是可能的,并可导致本发明的优选实施。
本发明的组合物
本文的组合物适用于伴侣动物。本文所用术语“伴侣动物”是指家畜,优选包括(例如)狗、猫、马、猪(如,大肚猪)、兔子等。家犬和猫尤其优选。在这方面,将如普通技术人员所熟知的,本文所述组合物主要用于伴侣动物,同样它们也是为此用途而配制的。
虾青素(3,3’-二羟基-β,β-胡萝卜素-4,4’-二酮),一种含氧胡萝卜素或α-羟基-酮类胡萝卜素,是一种有效的抗氧化剂(Martin等人,1999)。在水产业和家禽业中,主要因为它的红色素而通常用作饲料添加剂。已观察到虾青素对某些活性氧的抗氧化活性高于β-胡萝卜素、叶黄素、黄体素、α-生育酚、tunaxanthin、和玉米黄质(Naguib,2000;Miki,1991)。喂食富含虾青素的酵母的虹鳟鱼已证明能减少氧化油诱导的氧化作用(Nakano等人,1999),并降低血清类脂过氧化物的含量和转氨酶的活性(Nakano等人,1995和Nakano等人,1996)。无论是直接或是间接与它的抗氧化活性有关,虾青素增强了体液(Jyonouchi等人,1995)和细胞调节(Chew等人,1999b)的免疫反应,并且抑制了啮齿动物的乳房(Chew等人,1999a)和膀胱(Tanaka等人,1994)肿瘤生长。它也显示可增强小鼠的促细胞分裂剂诱导的脾细胞增殖(Chew等人,1999)。在喂食富含虾青素的藻类提取物的幽门螺杆菌感染鼠体内,细菌负荷和胃的炎症减少,这显然是由于T-淋巴细胞从由IFN-γ控制的Th1反应转变成IFN-γ和IL-4的混合Th1/Th2反应的缘故(Bennedsen等人,1999)。
然而迄今为止,还不知道伴侣动物(如狗和猫)是否可吸收和利用有效药理学剂量的虾青素,也未能确定在猫或狗体内任何这种吸收的效果。在本发明者进行的研究中,喂食虾青素的家犬和猫显示出由血液和由血液白细胞的所有亚细胞器的显著摄入。因此本发明提供了组合物和可用于给伴侣动物服用组合物的方法,所述组合物包含虾青素作为成分或食品添加剂,虾青素的量足以提供例如每日约0.001mg至约40mg的虾青素。这种食物提供足够的虾青素以被动物吸收和供给动物的血液,如,血浆、血液白细胞。
本发明者已发现家犬和家猫都能够吸收饮食中的虾青素。
此外,本发明者还发现循环的虾青素被血液白细胞显著吸收,并与这些动物体内的高密度脂蛋白(HDL)有关。他们也已发现虾青素还分布在各种亚细胞器中。将虾青素摄入白细胞的各种细胞器的这种吸收据信将(1)保护这些细胞免受氧自由基的攻击和/或(2)直接调节细胞核活动。因此,给伴侣动物如狗和猫喂食含有效量虾青素的组合物提供了动物机体组织内重要细胞位置处的虾青素,引起这些动物体内免疫功能上调,并改善动物的健康状态。
虾青素可以游离虾青素或以虾青素二酯的形式提供。天然形成的虾青素可得自真菌、甲壳类动物和藻类如红球藻属物种(如,美国专利5,744,502所述)。虾青素也可由野生型和遗传工程的Pfaffia酵母生产,并市售自Archer Daniels Midland Co.、Aquasearch Inc.、AstaCarotene AB、Cyanotech Corporation和Micro Gaia,Inc。合成生产的虾青素也可从Hoffman-LaRoche,Ltd购买。服用虾青素的形式可选择能提供更多生物利用性的产品,例如,微型胶囊、油树脂或类似的形式。
在一个优选的实施方案中,本文所用的组合物是宠物食品组合物。本文所用术语“宠物食品组合物”是指旨在由伴侣动物摄入的组合物。这些组合物将有利地包括旨在供给必需的饮食需求的食品,以及犒赏食物(如,狗饼干)或其它食品增补剂。任选地,本文的组合物可以是宠物食品组合物,如干组合物(例如,粗磨食物)、半干组合物、湿组合物或任何它们的任何混合物。组合物还可选择或是额外作为增补剂,如肉汤、饮用水、酸奶酪、粉末、悬浮液、咀嚼物、犒赏食物(如,饼干)或任何其它递送形式。作为一个实施例,虾青素可以与组合物的其它组分混合以提供需要的有益量,或者可以在提供给动物之前加入组合物中,例如,使用可撒布的粉末。
作为一个实施例,在一个实施方案中所述组合物是营养平衡的。本文所用的关于伴侣动物组合物的术语“营养平衡”是指该组合物以适当量和比例包含已知维持生命所必需的营养物质,所述量和比例基于伴侣动物营养学领域公认权威人士的建议。营养平衡的组合物在本领域普遍知晓并广泛使用。
本文所用的组合物可任选包含一种或多种其它组分。虽然其它组分包含在本文所用的组合物中是有益的,但对本发明而言是任选的。在一个实施方案中,所述食品组合物基于干物质可包含按所述食品组合物的重量计约20%至约50%的粗蛋白,也可选择约20%至约40%的粗蛋白,也可选择约20%至约35%的粗蛋白。粗蛋白物质可包含植物蛋白如大豆、棉籽和花生,或动物蛋白如酪蛋白、白蛋白和肉蛋白。可用于本发明的肉蛋白的非限制性实施例包括选自牛肉、猪肉、羊肉、家禽、鱼、蔬菜以及它们的混合物的蛋白质源。
所述组合物基于干物质可包含按所述食品组合物的重量计约5%至约40%的脂肪,也可选择约10%至约35%的脂肪。
本发明的组合物还可包含碳水化合物。例如谷物或谷类如大米、玉米、蜀黍、高粱、大麦、小麦等。
所述组合物还可包含其它物质如干乳清和其它饮食副产物。
所述组合物还可包含至少一种纤维源以改善胃肠健康。这些纤维源可包含,例如,至少一种适度可发酵纤维。适度可发酵纤维原先已被叙述为对伴侣动物的免疫系统有益。适度可发酵纤维或其它本领域技术人员已知的组合物(其提供益生菌组合物以促进肠内前生命期微生物的生长)也可掺入所述组合物中有助于增强由本发明为动物的免疫系统所提供的有益效果。另外,例如前生命期微生物如乳酸菌或双岐杆菌类可加入所述组合物中。
基于本发明的公开内容,同时考虑组合物的类型(如,营养平衡的宠物食品组合物对增补剂)、不同动物对具体种类的组合物的平均消耗量和制备食品的生产条件等因素,本领域的技术人员能确定虾青素的适宜用量。作为一个实施例,所述组合物在某些实施方案中可包含按所述组合物的重量计小于约3%的虾青素。在一个更进一步的实施方案中,所述组合物可包含约0.0001%至约2%、或约0.001%至约1%、或约0.001%至约0.5%的虾青素,所有百分比均按所述组合物的重量计。
本发明的方法
本发明的方法包括给伴侣动物且最优选家犬或猫,口服(即,咽下本发明的组合物以减轻炎症、增强免疫反应、增加寿命或它们的效果综合。
本发明还提供一种通过提供足够有效的虾青素剂量来增强狗或猫免疫反应的方法,其中所述虾青素与高密度脂蛋白(HDL)有关。该方法还在动物的食物中提供足够量的虾青素使得虾青素被动物的白细胞吸收。
本发明的方法提供有效含量的虾青素以增加狗或猫的细胞调节免疫反应。该方法还提供有效含量的虾青素以增强伴侣动物的体液免疫反应以及IgG和IgM的体内产生。
通过改善动物的免疫功能,本发明也提供了延长伴侣动物寿命的方法,所述方法包括以下步骤:给动物喂食含有效量虾青素的食物一段时间,它足以使虾青素增强动物引发免疫反应的能力。
本发明的组合物被伴侣动物摄入,可满足伴侣动物减轻炎症、增强免疫反应、提供美味的食物源和满足饥饿或营养的需要。所述组合物也用于正常营养需要量的补充。
本文所用的关于伴侣动物的术语“口服”是指动物摄入或人在指导下喂或喂给动物一种或多种本文的组合物。优选地,所述组合物是如本文已描述的宠物食品组合物或增补剂。其中人在指导下喂食所述组合物时,该指导可以指示和/或告知人使用该组合物可以和/或将提供所提及的有益效果,例如减轻炎症或增强免疫反应。例如,这种指示可为口头指示(如,通过例如来自医师、兽医、或其它保健专业人员、或广播或电视媒体(即,广告)的口头指示),或书面指导(例如,通过来自医师、兽医、或其它保健专业人员(如,处方)、销售专业人员或组织(如,通过例如销售宣传册、小册子、或其它说明性附件)、书面媒体(如,因特网、电子邮件、或其它与计算机有关的媒体)、和/或与组合物有关的包装(如,盛装所述组合物的容器上的标签)。本文所用,“书面的”是指通过文字、图片、符号和/或其它可视的说明符。这些信息不需要使用本发明所用的实际文字,例如“减轻”、“炎症”、“增强”、“免疫”、“反应”等,而宁可说是使用传达相同或相似意思的文字、图片、符号等被设想在本发明的范围之内。
本文所述的组合物可用作对正常营养需要量的增补剂,或者可用作伴侣动物的主要食物(并且同样地,该增补剂或食物可以是营养平衡的)。用法可以根据要求或根据需要,例如,每月一次、每周一次或每日一次(包括每日多次)。当用作对正常营养需要量的增补剂时,所述组合物可直接给哺乳动物服用,或换句话讲与每日的饲料或食物接触或混合。当用作每日的饲料或食物时,用法对普通技术人员来说将是熟知的。
利用的组合物的量可取决于多种因素,包括伴侣动物的状态和/或年龄、宠物食品组合物或增补剂(若可用)的质量、以及伴侣动物的大小或品种(若可用)。作为指导,伴侣动物每日可服用约0.001mg至约40mg虾青素。作为另一个实施例,猫每日可服用约0.02mg至约10mg虾青素。作为另一个实施例,狗每日可服用约1mg至约40mg虾青素。
此外,服用该组合物后猫的虾青素血浆浓度可增至约20nmol/L至约0.14μmol/L。服用该组合物后狗的虾青素血浆浓度可增至约0.01μmol/L至约0.14μmol/L。
本发明将由下列非限制性实施例来举例说明。
实施例1
狗的虾青素增补效果
材料和方法
雌性Beagle(毕尔格)犬(9至10个月大;8.2±0.2kg体重;Covance Research Products Inc.,Kalamazoo,MI)被随机分配(n=14/疗法)成每日喂食0、10、20或40mg虾青素(109g虾青素/kg油树脂浓缩物,购自Haematococcus pluvialis,astraZanthinTM,La HayeLaboratories,Redmond,WA)16周。虾青素被掺入市售的基础食物(The Iams Co.,Lewisburg,OH)中,并每日喂食两次(200g食物/每日)。所述食物组成如下(g/kg):85.3水分、275.8蛋白质、60.7灰分、115.0脂肪、9.9钙、9.3磷、21.3粗纤维、和18,914kJ/kg总能量;n-6∶n-3脂肪酸比率为7.9。狗圈养在温度(20℃至22℃)和光(14小时有光)控制实验室中的2×3m围圈内(2只狗/圈)。在0、4、8和16周记录体重。在0、6和12周采集血液以评价免疫功能。所有狗都在12和14周接种疫苗(Vanguard 5TM,SmithklineBeacham,West Chester,PA)两次,并且在16周再次采血评价接种疫苗后的免疫反应。
迟发型超敏性。在12周(接种前)和16周(接种后),所有狗都皮内注射100微升(1)盐水(8.5g/L;阴性对照)、(2)稀释的多价疫苗,包含犬瘟热病毒、腺病毒2型、副流感病毒和细小病毒(未稀释;Vanguard 5TM,Smithkline Beacham,West Chester,PA)、和(3)前述的植物血凝集素(PHA,0.5g/L)(Chew等人,2000)来评价皮肤的迟发型超敏性(DTH)。皮肤硬化在注射后0、24、48和72小时测量。
血液学。在血液分析仪(Vet ABC-Hematology Analyzer,Heska,Fort Collins,CO)上使用EDTA处理的血液进行全血细胞计数(白细胞、红细胞(RBC)和血小板计数,淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分类计数,血细胞比容、血红蛋白和平均红细胞体积,血红蛋白和血红蛋白浓度,及血小板体积)。
淋巴细胞增殖。外周血单核细胞(PBMC)对PHA(2和10mg/L最终浓度)、伴刀豆球蛋白A(Con A;1和5mg/L)以及美洲商陆有丝分裂原(PWM;0.25和1.25mg/L)的增殖反应在0、6、12和16周使用全血培养物进行评价(Chew等人,2000)。培养全血以便模仿体内环境。
白细胞亚群。用流式细胞仪在0、6、12和16周测量CD3(总T)、CD4(Th)、CD8(Tc)、MHC II(活化淋巴细胞)和CD21(成熟B细胞)亚群的数量(Chew等人,2000)。
IgG和IgM。血浆中的IgG(绵羊抗狗IgG;灵敏度=16微克/L)和IgM(山羊抗狗IgM;灵敏度=31微克/L)浓度用ELISA法使用商品试剂盒(Bethyl Lab.,Inc.,Montgomery,Tx)进行分析。
自然杀伤细胞的胞毒活性。犬甲状腺腺癌细胞(靶细胞)在Dulbecco的改良Eagles培养基(Sigma,St.Louis,MO)中重新悬浮至2×105个细胞/mL,所述培养基包含100mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素和100g/L硫酸链霉素。Ficol-分离的PBMC(效应细胞)重新悬浮至1×106和2×106个细胞/mL,然后将100微升加入96孔平底盘内的靶细胞中以使效应细胞∶靶细胞的比率为5∶1和10∶1。培养8小时后,将20微升(5g/L)MTT加入然后培养4小时。移除上清液,然后甲产物重新悬浮在100微升异丙醇中。在550nm处测量光密度,然后如下计算特异性细胞毒性的百分比:
%特异性细胞毒性=1-(OD效应细胞+靶细胞-OD效应细胞)/OD靶细胞×100
C-反应蛋白。血浆中急性期蛋白的变化通过在固相三明治免疫分析法(Tri Delta Diagnostics,Morris Plains,NJ)中使用辣根过氧化物酶-标记的抗犬CRP测量C-反应蛋白(CRP)浓度来评价。
DNA的氧化性损害。在血浆ELISA(BIOXYTECHTM 8-OHhdG-EIA Kit,OxisResearch,Portland,OR;灵敏度=0.5微克/L)中测定8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHdG)。
结果
在整个研究中饮食未显著影响体重。体重在0和16周时分别平均为8.18±0.16和8.57±0.11kg。研究中增补之前的所有狗和未增补的狗的血浆中未检测到虾青素。然而,虾青素在整个16周中以剂量依赖性的方式增加(图5)。在所有增补的狗中,最大的血液浓度于6周时观察到。
迟发型超敏性。0和8周时饮食未显著影响对盐水、PHA和疫苗的皮肤硬化反应。然而,12周时喂食10、20和40mg虾青素的狗在用疫苗皮内激发后在48和72小时具有较高的DTH反应(图5)。当狗在12和14周接种疫苗后于16周更早地观察到此反应(在24和48小时的时候)。未观察到PHA具有类似反应。
血液学。在整个研究中血液学通常显示无饮食影响。
淋巴细胞增殖。12周时喂食20mg虾青素的狗比未增补的狗具有更高的con A-诱导的PBMC增殖。然而,在所有时间间隔内虾青素都不影响PHA-或PWM-刺激的PBMC增殖的变化。
白细胞亚群。饮食虾青素在6和12周通常以剂量依赖性的方式使B细胞数量增加(图6)。接种后16周时,喂食20mg虾青素的狗显示出最大的反应(图6)。在研究的任何时间间隔内虾青素都不影响CD4、CD8和MHC II类数量的变化。然而,喂食40mg虾青素的狗显示出CD3数量的瞬时减少。
免疫球蛋白的产生。喂食20mg虾青素的狗12周时血浆IgG浓度较高,并且在接种后16周时又较高(图7)。更多的(40mg)饮食虾青素对IgG的产生不产生同样的刺激作用。接种前血浆IgM浓度不受饮食虾青素的影响(0至12周)(图7)。12和14周的接种通常使所有狗的血浆IgM浓度增加大约300%。喂食20mg虾青素的狗在16周显示出显著较高的IgM浓度。在研究开始时,IgG和IgM的浓度在治疗组中是相似的。
自然杀伤细胞的胞毒活性。饮食虾青素在6周时产生剂量依赖性增加的NK细胞活性;喂食40mg虾青素的狗显著高于对照组(图8)。12周时,喂食20mg虾青素的狗而不是喂食40mg虾青素的那些具有比对照组更高的NK细胞胞毒活性。这种相同的趋势在整个16周中持续。0周时未观察到疗法的差异。
C-反应蛋白。血浆CRP的浓度在本研究的整个12周内类似(平均4.48mg/L)。然而,接种后16周时饮食虾青素使血浆C-反应蛋白的浓度减小。
DNA氧化性损害。12周时对8-OHdG的浓度无饮食的影响(图10)。同C-反应蛋白一样,饮食虾青素抑制了增补后狗的血浆中8-OHdG的产生。喂食40mg虾青素狗的血浆8-OHdG浓度没有进一步减少。
饮食虾青素同时增强了狗的细胞调节和体液免疫反应。喂食12周时每日剂量10至40mg虾青素增强了对特异性抗原(疫苗)的迟发型超敏性(DTH)反应,但未增强对PHA(一种非特异性抗原)的迟发型超敏性反应。接种后,DTH反应同样地被饮食虾青素增强。然而,总皮肤硬化反应在接种后(皮内激发后24小时观察)比接种前(皮内激发后48小时)更迅速。也观察到狗喂食虾青素所引起的增强的DTH反应强于原先研究的类胡萝卜素,包括β-胡萝卜素(Chew等人2000)和叶黄素(Kim等人2000),所述DTH反应由皮肤反应来测定,该反应通常认为是一种可靠的评价狗体内T细胞功能的临床方法(Miyamoto等人1995)。
增强的DTH反应与对con A(一种T细胞促细胞分裂剂)的较高淋巴细胞增殖反应一致。在20mg虾青素的研究中观察到最多的芽生反应。自然杀伤(NK)细胞充当对肿瘤的免疫监测系统,并且也证实饮食虾青素具有提高NK细胞活性的能力。
饮食虾青素还刺激体液免疫,接种后比未增补的对照组增加IgG和IgM的产生,在这些研究中20mg/天的虾青素增补量观察到了最佳反应。在本研究中,增强的抗体反应平行于B细胞亚群的增加。实际上,在16周时,喂食20mg的狗既具有最多的B细胞亚群,又具有最高的IgG和IgM浓度。这与原先对喂食20mgβ-胡萝卜素(Chew等人,2000)和20mg叶黄素(Kim等人,2000)的狗所做的研究一致,在这些研究中那些狗也显示具有比未增补动物更高的血浆IgG浓度。
虾青素增补的犬在接种疫苗激发后还显示具有较低的循环CRP浓度。血液CRP浓度随感染、炎症和其它涉及组织坏死的病状而增加,所有这些均为高氧化应激反应的指示。
实施例2
猫的虾青素增补效果
材料和方法
雌性短毛家猫(8到9个月大;3.2±0.04kg体重;LibertyFarms,Waverly,NY)被随机分配(n=14/食物)成每日(基于90g食物/日的平均摄入量)喂食0、1、5或10mg虾青素(109g虾青素/kg油树脂浓缩物,购自Haematococcus pluvialis,astraZanthinTM,LaHaye Laboratories,Redmond,WA)12周。虾青素被掺入市售的基础饮食(The Iams Co.,Lewisburg,OH)中,并随意喂食。所述饮食组分如下(g/kg):63.1水分、350.6蛋白质、62.7灰分、213.6脂肪、10.0钙、7.6磷、7.1粗纤维、和21,707kJ/kg总能量;n-6∶n-3脂肪酸比率为9.9。猫被圈养在温度(20℃至22℃)和光(14小时有光)控制实验室中,并且于0、4、8和12周测量体重。0和8周采集血液以评价免疫功能。为了评价虾青素对抗原激发后的免疫反应的饮食效果,所有猫均接种疫苗(FelocellTM,Pfizer,New York)两次(8和10周),并且于12周采血以评价相同的免疫参数。
迟发型超敏性。皮肤迟发型超敏性(DTH)反应于0、8周(接种前)和12周(接种后)进行评价,如Kim等人(2000b)所述。猫皮内注射100μl(1)盐水(8.5g/L;阴性对照),或(2)稀释的多价疫苗,包含猫疱疹病毒-1、杯状病毒、细小病毒和鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)(FelocellTM,Pfizer,NY,NY)以测定特异性免疫,和(3)伴刀豆球蛋白A(con A,0.5g/L)。皮肤硬化在注射后0、24、48和72小时测量。
血液学。使用血液分析仪(Vet ABC-Hematology Analyzer,Heska,Fort Collins,CO)测量血液学参数(白细胞、红细胞(RBC)和血小板计数,淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分类计数,血细胞比容、血红蛋白和平均红细胞比容体积,血红蛋白和血红蛋白浓度,及血小板体积)。
淋巴细胞增殖。促细胞分裂剂诱导的外周血单核细胞(PBMC)增殖通过存在PHA(0.25和1.25mg/L的最终浓度)、Con A(0.5和2.5mg/L)和美洲商陆有丝分裂原(PWM;0.025和0.125mg/L)的情况下培养全血来评价,如以前所述(Chew等人,2000)。使用全血以便模拟体内环境。结果以刺激指数(促细胞分裂剂刺激的cpm÷未刺激的培养物的cpm)来报告。
白细胞亚群。0、8和12周采集的血液如前所述(Chew等人,2000)通过流式细胞仪(FACSCalibur,Becton Dickenson,San Jose,CA)显型以得到CD3(总T)、CD4(Th)、CD8(Tc)、MHC II(活化淋巴细胞)和CD21(成熟B细胞)的数量。
IgG和IgM。IgG(绵羊抗IgG;灵敏度=16∝g/L)和IgM(山羊抗IgM;灵敏度=31∝g/L)血浆浓度用ELISA使用商品试剂盒(BethylLab.,Inc.,Montgomery,Tx)进行分析。
自然杀伤细胞的胞毒活性。Crandell猫肾成纤维细胞(CrFK,ATCCCRL-9761;Crandell等人,1973)的培养物在Dulbecco的改良Eagles培养基(Sigma,St.Louis,MO.)中生长,所述培养基含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100g/L硫酸链霉素。当70%-90%融合时,细胞被胰蛋白酶化、洗涤并调节至2×105个细胞/mL。将一百微升细胞悬浮液吸移至96孔平底盘(Nunclon,Denmark)的每个孔中,然后于37℃培养8小时。Ficoll-分离的PBMC被调节至1×106/mL或2×106个细胞/mL,然后将100∝L该细胞悬浮液加入CrFK靶细胞中以使效应细胞∶靶细胞的比率为5∶1和10∶1。培养8小时后,加入20∝L MTT(5g/L)然后培养该混合物4小时。移除上清液,然后甲产物重新悬浮在100μL异丙醇中。光密度在550nm处测量,然后如下计算特异性细胞毒性的百分比:
%特异性细胞毒性=1-(OD效应细胞+靶细胞-OD效应细胞)/OD靶细胞×100
结果
体重在0和12周时分别为平均3.23±0.04和3.22±0.06kg,并且各疗法之间无显著差异。未增补的猫血浆中未检测到虾青素,同时虾青素浓度通常存在剂量依赖性增加(图7)。第8周血浆虾青素浓度迅速开始增加后,血浆虾青素在整个12周内虽然增加较缓和,但持续增加。
迟发型超敏性。第8周饮食虾青素刺激了对特异性(疫苗)或非特异性(con A)抗原激发(图8)的DTH反应,但未刺激对盐水的反应(未示出)。喂食10mg虾青素的猫在注射后72小时观察到对疫苗的最大皮肤硬化反应和显著的增强。喂食5或10mg虾青素的猫在皮内激发后24和48小时具有对con A的较大DTH反应(图8)。12周饮食虾青素的DTH反应在接种疫苗后稍有减小。喂食10mg虾青素的猫仍显示出对疫苗增强的DTH反应,仅在注射后24小时(图8)。对con A的反应仅在1mg虾青素时显著。
血液学。饮食虾青素通常不影响血液学参数(白细胞、红细胞(RBC)和血小板计数,淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分类计数,血细胞比容、血红蛋白和平均红细胞比容体积,血红蛋白和血红蛋白浓度,及血小板体积),所有值均在正常范围内。
淋巴细胞增殖。即使到第8周饮食虾青素不影响促细胞分裂剂诱导的PBMC增殖,但12周时喂食1mg虾青素的猫而不是喂食更大量虾青素的那些猫接种疫苗后显示出对ConA、PHA和PWM更大的增殖反应(图9)。
白细胞亚群。到8和12周饮食虾青素增加了CD5+总T细胞和CD4+辅助T(Th)细胞的数量(图10)。增加通常是剂量依赖性的。相反,虾青素减少了B细胞的数量。饮食未影响CD8+T细胞毒素(Tc)细胞(平均4.7±0.4)和MHC II型(平均94.1±1.0)种群的分布。
免疫球蛋白的产生。喂食10mg虾青素的猫于8周时血浆IgG和IgM的浓度较高(图11)。12周时接种疫苗的这些猫的IgG和IgM的平均浓度在数值上仍较高,只有喂食5mg虾青素的那些显著。
自然杀伤细胞的胞毒活性。8周时NK细胞的胞毒活性无饮食治疗的差异。然而,效应细胞∶靶细胞的比率为5∶1(5和10mg虾青素)或10∶1(1、5和10mg虾青素)时12周时虾青素刺激了NK细胞的胞毒活性(图12)。
喂食虾青素的猫显示出对疫苗和con A增强的DTH反应。狗显示出对疫苗显著的DTH反应。喂食虾青素的猫的增强DTH反应伴随着总T和Th淋巴细胞数量的增加,尽管狗没有看到类似的反应。
促细胞分裂剂诱导的PBMC增殖通常在喂食虾青素的猫和狗体内增加。另外,NK细胞的胞毒活性在喂食包含虾青素的饮食组合物的猫和狗体内增强。
饮食中的虾青素还刺激了猫和狗的体液免疫,同时虾青素增补剂在接种疫苗之前和之后都使IgG和IgM的产生增加。另外在通过接种疫苗的抗原接触后抗体的产生通常也升高。与狗相反,虾青素增补的猫与未增补的猫相比时增强的抗体产生伴随着B细胞数量的减少。然而,喂食虾青素的猫的总T和Th细胞数量较高。这可能是猫体内通过刺激T细胞功能虾青素增加抗体产生,这与原先对啮齿动物的研究结果一致,所述原先的研究证实了利用虾青素增补剂增强T细胞调节的抗体产生(Jyonouchi等人,1994)。
由虾青素产生的猫的免疫功能增强可能归因于虾青素的抗氧化性质,因为本发明者的确证实虾青素还原了狗体内类脂的过氧化反应。总之,给猫喂食虾青素导致血浆虾青素的剂量依赖性增加。同时,饮食中的虾青素增强了如对特异性和非特异性抗原增强的DTH反应、PBMC增殖、NK细胞胞毒活性、以及总T和Th细胞数量的增加所示的细胞调节的免疫反应。
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Claims (17)
1.一种包含虾青素的组合物,其中所述组合物适合用于伴侣动物。
2.如权利要求1所述的组合物,所述组合物包含按所述组合物的重量计小于约3%的虾青素。
3.如权利要求2所述的组合物,其中所述组合物是营养平衡的宠物食品组合物。
4.如权利要求3所述的组合物,所述组合物包含按所述组合物的重量计约0.0001%至约2%的虾青素。
5.如权利要求4所述的组合物,所述组合物选自狗食品组合物、猫食品组合物以及它们的组合。
6.如权利要求5所述的组合物,所述组合物包含按所述组合物的重量计约0.001%至约1%的虾青素。
7.如权利要求6所述的组合物,所述组合物包含按所述组合物的重量计约0.001%至约0.5%的虾青素。
8.如权利要求2所述的组合物,其中所述组合物为增补剂。
9.如权利要求8所述的组合物,所述组合物包含按所述组合物的重量计约0.0001%至约2%的虾青素。
10.一种选自减轻炎症、增强免疫力、增加寿命以及它们的组合的方法,所述方法包括给伴侣动物服用包含有效量的虾青素的组合物。
11.如权利要求10所述的方法,所述方法包括给所述伴侣动物每日服用约0.001mg至约40mg虾青素。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述免疫反应是细胞调节的免疫反应。
13.如权利要求11所述的方法,其中所述免疫反应是体液免疫反应。
14.如权利要求11所述的方法,其中所述伴侣动物是家犬。
15.如权利要求14所述的方法,其中给所述家犬每日服用约1mg至约40mg虾青素。
16.如权利要求11所述的方法,其中所述伴侣动物是家猫。
17.如权利要求16所述的方法,其中给所述家猫每日服用约0.001mg至约10mg虾青素。
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