CN1744821B - 使用来自胎儿细胞及组织的化合物来改善皮肤状况的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

提供组合物，其包含由胎儿组织表达的一种或是多种化合物，用以调节皮肤状况，以及提供鉴别、制造及使用此化合物之方法。

Description

使用来自胎儿细胞及组织的化合物来改善皮肤状况的方法及其应用

技术领域

本发明涉及化妆品护肤组合物，该组合物包含由胎儿细胞及组织表达的能改善皮肤状况的化合物。本发明还涉及鉴定及生产由胎儿细胞及组织表达的化合物的方法。本发明进一步涉及使用蛋白聚糖(Protegolycans)来改善皮肤状况的方法及化合物，其中，此蛋白聚糖包括纤调蛋白聚糖(fibromodulin)，或任何功能相当的化合物。 

背景技术

皮肤主要由表皮与真皮层所组成，真皮层提供表皮支持与血液供应的功能，另外，真皮层在维持皮肤的弹性及其外观上也是重要的。真皮层主要由细胞及细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)所组成，而细胞外基质的组成主要决定于成纤维细胞(Fibroblasts)。成纤维细胞可加工生产多种成分，例如胶原蛋白(collagen)、弹性蛋白(elastin)及蛋白聚糖(proteoglycan)。随着年龄的增长以及暴露在太阳及环境的污染下，支持性真皮会变薄且被破坏，此种情形会直接导致表皮的下垂而产生皱纹(参见Oikarinen A.皮肤的老化：时间老化对光老化(chronoaging versusphotoaging)，Photodermatol Photoimmunol Photomed 7：3-4，1990)。 

本发明领域为人所熟知的是胎儿皮肤与成人皮肤有根本的不同，例如，成年人的皮肤在受伤后会经由形成疤痕而修复，这个过程的特征在于使用胶原蛋白及各种细胞外基质成分的无序沉积(总称为「伤疤」)来替代受伤组织。相对之下，胎儿皮肤的修复则经由细胞组织的再生及正常皮肤的结构经由胶原蛋白及细胞外基质成分有序的沉积来产生无疤痕的修复。研究指出，无疤痕皮肤修复能力是胎儿皮肤的一种优点，并且，其不需胎儿免疫系统、胎儿血清、或是羊膜液(Bleacher JC，et al.，J Pediatr Surg 28：1312-4，1993)。例如，以分离的人类胎儿皮肤移植到无胸腺小鼠(athymic mice)内，在愈合时并不会产生典型的疤痕(Adzick NS，Lorenz HP.，Ann Sung 220：10-8.1994)。 

因此，很明显地存在于再生的胎儿皮肤中，且对皮肤的再生及增进皮肤外观具有重要性的某些特定分子或组合物，在非胎儿皮肤(如成人皮肤)中很少存在或是根本不存在。 

很多的组合物及技术在先前技术中已被描述可用于改善皮肤的状况，其中，特别是指「老化」或具有「皱纹」的肤质。典型的化合物包含利用视网膜酸(Retinoic Acid)来刺激表皮细胞的生长。另外视黄酸类(Retinoids)则被公认为是抗皱纹的活性物质，其可帮助减少老化的皮下作用，例如皱纹、皮革化、松弛、粗糙、干燥及斑点(色素沉积)等(参见美国专利字号第4,603,146及4,877,805)。已有人假设，视黄酸类通过发炎来产生作用，其会导致表皮的增厚(Acanthosis，棘皮症)，和局部的细胞间水肿，导致表皮脱落且改善皮肤的纹理及外观。另外，使用L-抗坏血酸(L-ascorbic Acid)来刺激成纤维细胞的生长及胶原蛋白增生已在先前技术中被描述(Hata R，Senoo H.J Cell Physiol138：8-16.1989)。改善皮肤状况的技术可使用包含经由化学品来刺激/伤害皮肤(例如酚脱屑(Phenol Peels))、使用机械性(例如磨皮(dermabrasion))或是热(例如激光)等成熟的方法。而伤害表皮及/或真皮层最终会导致新细胞的生长以及细胞外基质的沉积，因此，可改善皮肤的整体外观。 

另外一个常导致皮肤损害的状况为发炎。一般而言，炎性及免疫的反应可经由药物的使用来加以控制(请参见Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis OfTherapeutics eds.Hardman et al.，第九版，McGraw-Hill出版，1996)。糖皮质激素类(Glucocorticoids)及类似阿司匹林的药物(非类固醇抗炎剂(Non-SteroidalAnti-Inflammatory Agents，NASIDs))是最广泛使用的抗炎剂，其中，非类固醇抗炎剂通常被用来治疗发炎的症状(例如疼痛及发烧)。皮质类固醇(Corticosteroids)为有效的抗炎剂，虽然，皮质类固醇实际上对所有的发炎细胞具有作用，但却会显示出显著的有害效果，例如会引发库辛式症(Cushingoid)、皮肤变薄、在伤口愈合时增加被感染的敏感性、以及下视丘——脑下垂体——肾上腺轴向(hypothalamic-pituitary-adrenal axis)的抑制。目前可得到的其他抗炎药物会产生细胞毒素的结果，它是以癌症化学疗法及典型抗肿瘤药剂反应出它们刚开始的作用。此类药物可不加以区别的杀死细胞，特别是针对那些快速增生的细胞。然而，甲氨喋呤(Methotrexate)使用比治疗癌症还低的剂量(细胞减量的剂量(Cytoreductive dose))可有效的治疗类风湿性关节炎。免疫抑制剂(Immunosuppressive Agents)，例如环孢菌素A(Cyclosporin A)及他克罗司(Tacrolimus)对避免异体脏器移植物的排斥有效，但是他们使用在自体免疫疾病的治疗受限于严重的副作用，特别是肾毒性(Nephrotoxicity)方面。 

特别对于皮肤而言，局部皮质类固醇、口服皮质类固醇或抗组织胺剂是疗程中的中流砥柱。然而，皮质类固醇却有很多如以上所提及的不受欢迎的副作用，而当局部涂抹时，抗组织胺剂本身会引发过敏反应、口服时会导致嗜睡(Shai A，et al.，Inflammation，dermatitis and cosmetics.Handbook of Cosmetic Skin Care.London：Martin DunitzLtd.，pp.135-146，2001)。 

色素沉淀过多(Hyperpigmentation)为另一种常见的皮肤疾病，一旦产生便非常难以治疗。由于色素沉淀过多在身心及美观上会有明显的负面影响，因此，已投入更多的精力在色素沉淀过多的治疗上。对于色素沉淀过多的问题，当前的科技水平是提供了多种的治疗方法，但却没有一种是完全令人满意的，其主要原因在于当前的治疗方法主要为皮肤「漂白」的化合物，其对于已经产生的色素沉淀是无效的治疗，特别是对于真皮层的色素沉淀(请回顾Briganti S，et al.，Pigment Cell Res.16：101-110，2003)。许多其他种类的物质已被提出来控制或抑制皮肤的色素沉淀，几乎所有此类物质不是被用来漂白已存在的色素，就是通过抑制在黑色素生成中主要的速率限制性酶(rate-limiting enzyme)酪氨酸酶的活性，来阻止新色素的合成。美国专利字号第6123959即描述水性组合物的使用，其包含脂质体及至少一种黑色素合成酶的竞争性抑制剂，与至少一种黑色素合成酶的非竞争性抑制剂的组合。美国专利字号第6132740描述了某些雷锁辛(Recorcinol)衍生物来当作皮肤增白剂的使用。WO 99/64025A1揭露皮肤增白的组合物，其包含了由加拿大本土的双子叶植物中萃取出的酪氨酸酶抑制剂。美国专利字号第5580549描述了一种增白皮肤的外用药剂，作为酪氨酸酶抑制剂，其包含2-羟苯甲酸(2-hydroxybenzoicacid)衍生物及其盐类。WO 99/09011A1描述了一种用来抑制皮肤红斑及/或皮肤色素沉淀的药剂，其包含至少一种2-羟喹啉(carbostyril)衍生物及其盐类。美国专利字号第5214028以及5389611描述了乳纤蛋白水解物(Lactoferrin Hydrolyzates)用作一种酪氨酸酶抑制剂。另外，有报道一些化合物及植物萃取物具有对抗过多色素沉淀的活性，其中包含抗坏血酸及其衍生物、曲酸及相关的化合物、甘草萃取物以及熊葡萄萃取物。虽然这些化学物质及提取物在逆转及预防过多色素沉淀时是具有活性的，但长时间使用下他们会刺激皮肤。 

尽管提示上述所有这些物质适用于过多色素沉淀的治疗，但用来治疗过多色素沉淀的 主要产品包含对苯二酚，即一种广为人知的皮肤脱色素有效的物质(参见美国专利字号第6139854)，然而，对苯二酚在长时间使用下会产生严重的副作用，例如，使用对苯二酚可对皮肤永久的去除色素沉淀，因此，当肌肤暴露在紫外线下时，会增加皮肤的光敏感性。另外，对苯二酚会被代谢成苯醌(Benzoquinon)，苯醌为一种强力的血液毒素(Haematotoxic)、基因毒素(Genotoxic)以及致癌的化合物，其亦会引发自由基的产生而使得细胞(Predisposing Cell)容易受到氧化性损害(Do Ceu Silva M，et al.，Mutagenesis.18：491-496，2003)。因此，在某些国家，对苯二酚只允许在限定浓度内对皮肤进行去色素作用，而在其他国家，该产品则是完全被禁止使用。 

据此，需要一种新的且更有效的方法来调整皮肤的状况，例如治疗皮肤的老化、发炎及色素沉淀且会伴随较不明显显著的不受欢迎副作用 

发明内容

本发明描述一组新的美容护肤组合物，其组成包含由胎儿组织表达的化合物，用以改善皮肤的状况。将这些化合物输送(deliver)至皮肤的方法包含但不限于溶液、化妆水、药膏、乳液、凝胶或是皮肤可剥离带。 

虽然对胎儿组织表达的化合物各组成分的鉴定或纯化可能是有用的，但实际应用本发明并不要求如此的鉴定或纯化。本发明亦有关于鉴定由胎儿组织表达的化合物的方法或确认促进这些化合物表达的条件。本发明亦有关于促进由胎儿组织所表达的化合物的表达的方法，其是通过改变外部细胞环境或是藉由基因重组表达来达到。 

本发明亦有关于使用包含由胎儿组织表达的化合物的组合物来改善皮肤状况的方法。此方法一般包括对需要治疗的哺乳类动物的皮肤局部施用安全而有效量的组合物。 

进一步而言，本发明阐述了一组新的美容护肤组合物，其包含纯化的或富集萃取物的安全且有效量的纤调蛋白聚糖或功能上等效的分子。 

根据配方，含有由胎儿组织表达的化合物或纤调蛋白聚糖的组合物中，可以含有的其他组分为安全且有效量成分的透明质酸(Hyaluronic Acid)，即另外一种护肤活性成分，以及一种化妆品可接受的、皮肤可接受的或是药物可接受的载体。 

具有代表性的组合物的实施例包括但不限定于透明质酸、细胞外基质肽或是多肽、生长因子以及L-抗坏血酸。 

附图说明

图1显示了对于胎儿伤口模型的操作流程。A.为子宫的反肠系膜表面的一小部分，其是被切开且在切口附近实施一环状袋子缝合。B和C.通过切除2mm盘状的组织，在每个胚胎上形成一个最大厚度的伤口。蓝色或是绿色的活体染剂在伤口形成后立即被应用以便之后的伤口鉴别。 

图2显示了再生修复的受伤E16大鼠皮肤H&E染色的结果。A.受伤24小时之后，100倍，其有一个最小化的炎性渗透。B.受伤24小时后，400倍。蓝色活体染剂在毛囊中接近迁移的上皮边缘提示着伤口再生上皮形成的毛囊再生是同时发生(黑色空心箭头)。C.受伤后24小时，400倍。嗜中性白血球(黑色实心箭头)及淋巴细胞(黑色空心箭头)，分别是为伤口周围及中心部分的主要细胞。D.受伤后72小时，400倍。伤口以正常皮肤结构完全再生而愈合。在真皮层中正常的毛囊(黑色空心箭头)分布清晰可见。E.受伤后72小时，400倍。在较高的倍率下，以在真皮层中的蓝色活体染剂(黑色空心箭头)定义出的先前的伤口，与非伤口皮肤难以辨别。F.以共焦显微镜检视E16大鼠皮肤的伤口Fa到 Fc)。Fa.受伤后48小时630倍。注意到胶原纤维有组织的外观是具有一网状的晶格结构。Fb.受伤后72小时，630倍。伤口的位置是以正常皮肤胶原结构及毛囊再生完全的复原而被完整的上皮再生化。Fc.未受伤E19皮肤(即E16+72小时)，630倍，在受伤后72小时的E16的皮肤及E19未受伤的皮肤之间，没有可观察到不同表皮处。e：表皮，h：毛囊，d：真皮层，尺标(Scale bars)：A，D，200μm；B，C，E，50μm；Fa-Fc，32μm。G.在受伤后72小时的E16的胎儿及没有受伤的E19(E16+72小时)的胎儿的整体胶原蛋白密度(P＞0.05)，并无明显的不同。 

图3显示了没有再生修复的受伤E19大鼠皮肤H&E染色的结果。A.受伤后24小时，100倍。有一中等的发炎渗透及增加的红血球细胞。B.受伤后24小时，400倍。在受伤后24小时时，再生上皮形成亦被注意到(黑色空心箭头)。C.受伤后24小时，400倍。单核白血球(黑色空心箭头)包含了大部分的发炎细胞。D.受伤后72小时，100倍。伤口是完全地以增加的细胞结构及新生血管被再生上皮化。与没有伤口的位置(右边远处)比较，在修复的伤口位置(左边远处)没有明显观察到毛囊(黑色空心箭头)。E.受伤后72小时，400倍。在较高的倍数下，蓝色活体染剂(黑色实心箭头)在修复的伤口中是为可见的。F.以共焦显微镜检视E19大鼠的皮肤(Fa到Fc)。Fa.是为受伤后48小时，630倍。新形成的胶原纤维中的较大的空间，在真皮层中是为显而易见的。一薄层的稠密的胶原纤维，在膜的底层被发现(白色空心箭头)。Fb.受伤后72小时，630倍。具有异质尺寸胶原纤维的瓦解的胶原蛋白沉积，其在愈合的真皮疤痕组织中是为明显的，注意到并无毛囊再生。Fc.没有受伤的初生的一天(N1)的皮肤(例如E19+72小时，E21＝一期)，630倍。没有受伤的N1的皮肤显现出一个组织化的胶原沉积图样，其明显地与受伤后72小时的E19皮肤不同。e：表皮，h：毛囊，d：真皮层，尺标(Scale bars)：A，D，200μm；B，C，E，50μm；Fa-Fe，32μm。G.相对于没有受伤的N1的对照组(P＝0.00043)，在受伤后72小时的伤口E19中，其整体胶原密度明显地被提升。 

图4显示了以特定引物为基础的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)筛选转化生长因子β的配体、受体、调节体在胎儿皮肤发展期间的基因表达。RT-PCR在第14，16，17，18，19，20，及21天的胎儿的背部皮肤上(N＝10-15个胎儿/时间点)所分离出的RNA上执行。为了检测在发展期间，mRNA程度上相对的改变，在每一个时间点上，对于每一点的光密度测定值(densitometry values)是利用GAPDH表现来校正，且利用设定最高值为1来归一化。结果是以图表的平均值(A，B，C)来描述的，过渡期间是以灰色来强调，没有配对的双侧检定(two-tailed student’s test)被执行来检测胎儿皮肤的E16(刚开始转移时)及E18(转移结束时)统计学上有意义的误差。对于每一个转化生长因子-β配位基(A’)、接受子(B’)、或调节体(C’)，以具有相关P值的代表性的点在右边显示，且转移期间以灰色来强调。在基因表达中，胎儿皮肤的第16天(刚开始转移)及第18天(转移结束)间统计学上有意义的误差，是以底下画线的方式表示(A’，B’，C’)。统计学上有意义的P值(＜0.05)是以「*」被标示出。一个代表性的胎儿GAPDH PCR反应被显示出(插入)。 

图5是以图表显示了在修复期间，以基于特定引物的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)来筛选对于细胞间质蛋白水解酶(MMP)及其组织-衍生-抑制剂(TIMPS)的基因表达。一般而言，有疤痕的伤口是倾向于过量细胞外基质的沉淀，而不是退化(右边)，而无疤痕的伤口倾向于较少细胞外基质的沉淀。 

图6是以图表显示了在修复期间，以基于特定引物反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)来筛选纤维细胞生长因子及饰胶蛋白聚糖(decorin)的基因表达。总体而言，成疤的皮肤伤害似乎与纤维细胞生长因子bFGF(FGF-2)的较高表达相关(如右所示)，而不成疤的皮肤伤害具有较低的纤维细胞生长因子bFGF(FGF-2)表达。 

图7A和图7B是以图表显示了在修复期间，以基于特定引物的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)来筛选纤调蛋白聚糖及饰胶蛋白聚糖decorin的基因表达。A.FM(纤调蛋白聚糖)的转录在受伤后24小时的E16胎儿中(P＜0.0001)，以2.75倍显著地增加，其表示再生的修复，但此种现象在以非再生性方式修复的E18受伤的胎儿中不存在。B.相反地，与E16伤口比较，E18伤口的饰胶蛋白聚糖(decorin)转录相对较高，尽管E16及E18两者的伤口相对于没有受伤的老化控制组，其饰胶蛋白聚糖(decorin)水平是降低的。 

图8是显示了用胎儿皮肤的基因筛选方法得到应用和阻断化合物的检测结果，在此例子中化合物是为FM。H&E染色显示了FM(纤调蛋白聚糖)应用到通常以非再生方式愈合的晚期怀孕胎儿的伤口上，会导致完全无伤疤的再生的修复，而当抗FM(纤调蛋白聚糖)的抗体应用至早期怀孕的伤口(这类伤口会以无疤痕再生方式正常愈合)之上时，会导致非再生的修复。在200倍(左边)及400倍(右边)放大下的伤口是在控制组中72小时下得到。红色的箭头是表示永久性的染色，黑色的箭头表示毛囊。A.通常，在无永久性的染色及无肉层肌肉的断裂(蓝色箭头)的情况下，(E16)胎儿伤口会无伤疤的愈合且难以从对照组(E19)的皮肤中(插入)分辨出来，注意毛囊的再生及没有发炎反应。B.以具有抗FM抗体来治疗E16的伤口是会引诱出疤痕的产生，毛囊无再生且有发炎反应。C.具有IgG比对溶液的治疗是不会产生疤痕。注意毛囊。D.通常，E18胎儿伤口的愈合会有疤痕，在疤痕中，发炎的细胞(蓝色箭头)是存在的，但毛囊不存在。E.以外因的FM治疗E18胎儿的伤口，其抑制了疤痕的形成。这些伤口只可通过永久染色和肉层肌肉的断裂(蓝色箭头)来识别，因为少了有意义的发炎反应且含有毛囊。F.以胶原比对溶液治疗的E18的伤口，仍然形成有疤痕的愈合。注意发炎的细胞(蓝色箭头)及毛囊缺失。 

图9是显示了胎儿伤口经纤调蛋白聚糖及抗纤调蛋白聚糖抗体处理的聚焦显微镜的结果。被纤调蛋白聚糖处理的晚期怀孕(胎儿)伤口显示了一组织化胶原的结构，而被抗-纤调蛋白聚糖抗体处理的伤口显示了一个无序化的胶原结构。伤口及控制组在受伤72小时后被获得，胶原纤维已被Sirius red染色且显现出白色，红色的空心箭头表示为毛囊。A.一E19胎儿无受伤的皮肤(200倍)与E16胎儿的伤口比较。B.通常，E16胎儿的伤口会无疤痕的愈合(200倍)，真皮的胶原纤维是薄的，且在没有伤口的皮肤中，其网状的排列从组织化的胶原中无法清楚地分辨。C.相反，胶原纤维在抗纤调蛋白聚糖治疗的E16胎儿伤口中较厚且无序地排列(400倍)。D.在以IgG比对溶液(400倍)治疗的E16伤口中，胶原纤维是较薄的且有一网状的排列。E.一E21胎儿无受伤的皮肤与E18受伤皮肤比较---400(左边)倍及1000倍(右边)。F.通常，E18胎儿的伤口愈合会有疤痕。在疤痕中(400倍(左边))并不见毛囊，胶原纤维在疤痕的区域中是较厚的且以在纤维间较大的距离混乱地排列，其在较高的倍数下(1000倍(右边))看得较清楚。G.然而，将纤调蛋白聚糖加入到E18到伤口中，则会抑制伤口的产生----400倍(左边)及1000倍(右边)。此处胶原纤维是薄的，而伤口床中的组织化胶原与没有受伤的E21皮肤的结构非常相似。H.以胶原对比溶液处理的伤口有较厚、混乱排列的纤维且纤维间距离较大----400倍(左边)及1000倍(右边)。 

图10显示了第一类胶原在FM-处理(E18)的伤口中与有疤痕的伤口(E16)、无疤痕的伤口(E18)、及无受伤的皮肤(E18)比较下的相对mRNA的表现。与第五图的结果一致，在FM处理的伤口显示出较少的细胞外基质的沉积，作为第一类胶原基因表达的例子。RNA从受伤后12小时的胎儿组织中分离出且用递减循环(reduced-cycle)RT-PCR的方式处理。相对mRNA表达的平均值是以±SEM来描述。双侧检定被用来检测一配对与平均值的比较，P值小于0.05为差异显著。用星号表示对照组的伤口/皮肤与FM处理群之间有显著的不同。 

图11显示了以纤维蛋白聚糖(0.4毫克/毫升)或是磷酸盐缓冲液对比溶液处理的成人的伤口，其胶原结构及增加的真皮组织再生具有明显的改善。伤口在受伤后2周得到，且组织的部分以H&E或Sirius red染色(对于聚焦显微镜)，黑色的箭头标示了伤口床，而红色的箭头标示了永久的染色和肉层肌肉的断裂。A.以纤维蛋白聚糖处理的一成人伤口的H&E的染色---200倍(左边)及400倍(右边)放大。在较高的放大倍率下，真皮胶原纤维显示了有一平行的排列。B.一纤调蛋白聚糖处理的成人伤口的外表真皮(接近表皮-真皮边缘)的共焦显微镜下的结果---400倍(左边)及1000倍(右边)的放大倍率。白胶原纤维具有一相当均匀、线性的外观且是平行在表皮层之上。C.一以纤调蛋白聚糖处理的一成人伤口的深层真皮层的共焦显微镜下的结果---400倍(左边)及1000倍(右边)的放大倍率。另外，平行的组织化胶原纤维被观察到。D.以磷酸盐缓冲液对比溶液处理的一成人伤口以H&E染色的结果---200倍(左边)及400倍(右边)的放大。此伤口的面积比以纤调蛋白聚糖处理的伤口的面积大。E.一对照组的成人伤口的外表真皮(接近表皮一真皮边缘)的共焦显微镜下的结果，其证实了胶原纤维随意的沉积---400倍(左边)及1000倍(右边)的放大倍率。F.一控制组的成人伤口的深层真皮层的共焦显微镜下的结果---400倍(左边)及1000倍(右边)的放大倍率。在胶原形态学中，胶原沉积混乱的图样及很大的变动在此将可清楚的观察到。 

具体实施方式

接下来是本发明的详细说明，下述说明中对制程与结构的描述并不包括制作的完整流程。本发明所沿用的现有技术，在此仅做重点式的引用，以助本发明的阐述。 

I.定义 

使用的术语「局部施用(Topical Application)」在本发明中，是指施用或是涂布组合物到皮肤的表面上。 

使用的术语“皮肤可接受的(Dermatologically-Acceptable)”在本发明中，是指所描述的组合物或其成分是适合与人类的皮肤接触而没有不适当的毒性、排斥性、不稳定性及过敏反应等等。 

使用的术语「安全而有效的量(Safe and Effective Amount)」在本发明中，是指化合物或是组合物的量足以显著地引发正面的效果，更佳的是皮肤外观的正面效果或是感觉效果，其包括本发明所揭露的各个益处，但其量足够低而避免严重的副作用，此亦即提供一个合理的利益风险比，在技术人员可加以判断的范围内的化合物或组合物的量。 

使用的术语“纤调蛋白聚糖(FM)”在本发明中并不只是纤调蛋白聚糖，亦是任何有或没有基因修饰的功能等效的分子。 

使用的术语“野生型纤调蛋白聚糖(Wild-Type FM Protein)”，在本发明中，是指在组织中非基因修饰的天然存在的纤调蛋白聚糖。 

使用的术语“重组纤调蛋白聚糖cDNA(Recombinant FM cDNA)”在本发明中是指已被克隆到合适的表现载体(例如质粒、腺病毒)的纤调蛋白聚糖cDNA(有或没有基因修饰)。 

使用的术语“基因修饰(Genetically Modified)”是为修饰表达纤调蛋白聚糖的去氧核糖酸(DNA)，以增加蛋白质的某些特质，例如转录效率、纯化效率、利用提高结合效率增加蛋白质的生物活性以及蛋白质抗分解的能力等。 

使用的术语“重组表达(Recombinantly Expressed)”，在本发明中，指胎儿组织衍生出的cDNA(有或没有基因修饰)，其是已被克隆到合适的表现载体(例如质粒、腺病毒)，以达到由该cDNA得到蛋白质表达的目的。 

使用的术语“溶解产物(Lysates)”在本发明中，指藉由使用适当的洗涤剂溶解细胞并获得的组合物。 

使用的术语“萃取物(Extracts)”在本发明中，指藉由更进一步纯化或是浓缩溶解细胞物质以得到的组合物。 

使用的术语“培养基(Media)”在本发明中，指由没有修饰或是基因修饰的胎儿细胞或组织的外在环境分离出的组合物。 

使用的术语“化合物(Compounds)”在本发明中可视为与“分子(Molecules)”相同，虽然术语“分子”在描述单一的实体(Single Entity)时为更佳的解释。 

使用的术语“健康的皮肤”或是“正常的皮肤”在本发明中是指没有损伤的肌肤，例如没有视觉上明显的红斑、水肿、过多或过少或不均匀的色素沉淀、疤痕的形成、干燥、或是面疱的形成。组织学上，正常或健康的皮肤是有关于具有形态外观的皮肤组织，其包含组织完善的基体(Basal)层、刺状(Spinous)层、粒状(Granular)层，以及连续多层的角质层。另外，正常或健康的表皮层包含具有真皮皮下组织的波动连接点的末端分化的复层鳞状上皮。正常或健康的皮肤更进一步包含没有体液滞留、细胞浸润、过多或过少细胞的增生、巨细胞去颗粒作用、及不全角化作用等等的症状，且暗示对于兰格罕氏细胞(Langerhans Cells)及真皮层胶质细胞(Dermal Dendrocytes)的正常树状过程。此是出版在皮肤学的参考书中，例如Histopathology of the Skin，Lever andSchaumburg-Lever(eds.)，J.B.Lippincott Company(1991)以及Textbook ofDermatology，Champion et al.，(eds.)，5th Ed.Blackwell Scientific Publications(1992)，特别是第三章“Anatomy and Organization of Human Skin”；Physiology，Biochemistryand Molecular Biology of the Skin，Vols.I And II，Goldsmith(ed.)，OxfordPress(1991)，而参考资料中是有明确且充分的揭露，并全部结合在此引为参考。 

使用的术语“改善皮肤的状况(Promoting Skin Condition)”包括预防性改善和/或治疗性改善皮肤状况，包括改善皮肤的视觉和/或触觉间断性。如同本发明所述的，治疗性改善皮肤状况包括减轻(例如减小、最小化和/或消除皮肤的间断性)。改善皮肤的状况包含改善皮肤的外观和/或感觉。 

II.皮肤的状况 

A.皮肤的发炎 

皮肤发炎的症状在本发明中，包含非过敏性皮肤发炎状况、过敏性皮肤发炎状况、神经原性皮肤发炎状况、肿瘤坏死因子-α-媒介的(TNF-alphal-mediated)状况、紫外线辐射(UVR)引发的皮肤发炎状况、其他皮肤发炎状况。 

「非过敏性皮肤发炎状况」是一种皮肤发炎的状况，其并非唯一由特定的抗原所媒介，此状况包括刺激性接触性皮炎、牛皮癣、湿疹、皮肤搔痒、脂逸性皮炎、钱癣、扁平苔癣、青春痘、粉刺、多形核白血球(Polymorphs)、结节性痤疮(Nodulocystic Acne)、痤疮、老人斑痤疮(Senile Acne)、以及二度痤疮例如太阳性痤疮、药物性痤疮或是职业性痤疮；其他角化异常的形式，例如鱼鳞癣、鱼鳞癣状ichthyosiform conditions、Darier症、掌跖角化病palmoplantary keratodermises，leucoplasies，leucoplasiform conditions以及苔癣；其他皮肤异常例如泡疹皮肤病、胶原症；以及由于光引发或不是光引发所导致肌肉外在的老化。 

「过敏性皮肤发炎状况」是由一种或是多种的过敏原所导致的皮肤发炎的状况。「过敏原」在此是指一种物质，其会引发免疫球蛋白E抗体反应(IgEantibody responses)导致急性过敏症及迟发性过敏反应。一般而言，此类的反应需要免疫系统对过敏原的过敏作用，例如，蚊子叮咬所引发的痒(Mosquito Bite-Induced Itch)以及发炎，是被认为是免疫球蛋白E及免疫球蛋白G(IgG)对蚊子的涎管内抗原物质所介导的过敏反应。在急性过敏症中的主要对象是巨细胞，其具有高亲和力的免疫球蛋白E受体(High AffinityIgE receptors)(Ohtsuka E，et al.，Jpn J Pharmacol 86：97-105，2001)，在免疫球蛋白E-依赖性刺激作用(IgE-dependent stimulation)时，巨细胞会释放出数个引致发炎的介体(Pro-Inflammatory Mediators)，例如肿瘤坏死因子-α、库而卡M(KulkaM)以及毕福司AD(Befus AD)(Arch Immunol Ther Exp(Warsz)51：111-110，2003)。肿瘤坏死因子-α被发现预形成及被储存在巨细胞的粒子中，或是接续着巨细胞活化作用被最新合成(Iuvone T，et al.，Br J Pharmacol.128：700-704，1999)。肿瘤坏死因子-α是一种多功能的细胞因子(Cytokine)，为免疫系统及炎性反应的关键介体，且被发现预形成及被储存在巨细胞的粒子中，或是接续着巨细胞活化作用被最新合成(Gordon JR，and Galli SJ.，Nature.346：274-276，1990)。 

「神经原性皮肤过敏(Neurogenic Skin Inflammatory)状况」是有关于皮肤发炎的情况，其是与前驱性发炎神经肽释放(Proinflammatory Neuropeptide Release)有关(例如在情绪激动时或是有心理压力下)。前驱性发炎神经肽释放可能存在于伴随着皮肤过敏的状况中，或是由非过敏或过敏发炎的皮肤状况下发生。例如，压力引发的痤疮已经被提出来为一种神经原性发炎的例子。皮肤受神经支配，其由主输入感觉神经(AfferentSensory Nerves)、节后胆碱能副交感神经、节后肾上腺能以及胆碱能交感神经来支配。感觉神经是来自于背根节且是存在于全部皮肤中，其代表着输入感觉神经路径的原初体壁部分。皮肤的感觉神经系统是包含一个在皮肤中的细微C纤维(Fine C Fiber)网状系统，其神经支配多种细胞种类且在发炎反应中扮演重要的角色。表皮层是被一个带有游离分支末梢的三度空间的无髓鞘神经纤维的网状系统所神经支配，其是出现在真皮层中。感觉神经不只是扮演一个从皮肤传导刺激物到中枢神经系统的输入的系统，还扮演一种由终端刺激目标组织的输出神经分泌的方式。各式各样的刺激物，例如有毒的刺激物，可能会直接活化主要感觉神经元的周边神经末梢，其会产生神经冲动且被传送到中枢，以及经由逆行的轴突反射antidromic axonreflexes传送到周围。在从感觉神经末端释放神经肽时，重要的内藏运动发炎及食性效应会在末端组织中发生。正常的人类皮肤会直接由感觉神经元或是皮肤细胞，例如角质细胞、微血管内皮细胞或是成纤维细胞表达不同的神经肽。另外，免疫细胞或是原本就存在于皮肤中(例如巨细胞)，或是在发炎时渗透到皮肤中，其已被 报道会产生神经肽。皮肤的神经纤维可经由神经肽局部的释放来控制发炎反应，其中，神经肽局部的释放可调整急性及慢性的皮肤发炎过程，例如血管移动性、细胞运输、活化作用以及营养作用。临床上的证据支持神经肽分泌及发炎的发生间的连结关系在不同的皮肤疾病中被发现，例如特异性过敏皮炎、牛皮癣、簇状秃发、及痤疮，其通常在情绪上有压力时会容易恶化。确实地，压力已显示出会引诱物质P(Substance P，一种强力的前驱性发炎神经肽)的释放。(回顾于Toyoda M，et al.，Neuropeptides and sebaceous glands.EurJ Dermatol.12：422-427，2002)。一些研究已证实，巨细胞被发现通常与神经近距离接触，在MC及神经系统之间可能存在有功能性的交互作用。另外，最近的证据提到，物质P在亲密的神经-巨细胞交谈(Intimate Nerve-Mast Cell Cross Talk)中为一种重要的介体。这些发现启示了，经由巨细胞在内皮细胞-白血球(Endothelial-Leukocyte)交互作用的调节中，藉由皮肤神经纤维内生的释放的物质P可能是重要的。已经证实，被巨细胞去颗粒产物所诱引出的前驱性炎症效应，可通过对TNF-α的阻断性抗血清来抑制。因此，细胞事件的级联反应包含巨细胞去颗粒化及前驱性炎性细胞因子(例如肿瘤坏死因子-α)的释放，将会在相邻小静脉的内皮引诱出黏合分子(例如选择蛋白E-selection)，然后其会帮助白血球的局部集聚，以及更进一步扩大炎性反应。故肿瘤坏死因子-α亦可能控调神经原性发炎。 

「肿瘤坏死因子-α媒介的状况(TNF-alpha mediated conditions)」是有关于局部的皮肤的失调，在此肿瘤坏死因子-α是导致该失调表现的一个主要介体。肿瘤坏死因子-α(过去称为恶病质素(Cachectin))，由大量的细胞或组织所产生，例如嗜中性白血球、活性淋巴细胞、巨嗜细胞、NK细胞、LAK细胞、星细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、巨细胞、角质细胞及其他上皮细胞。这些特别的细胞因子控有不同种类的生物学活性，其包括对抗肿瘤的细胞毒效应、嗜中性白血球的活化、细胞的正常增生、炎性、免疫及抗病毒的应答。一种肿瘤坏死因子-α的膜结合(Membrane-Bound)形式是被置放于淋巴细胞或单核血球内，在此它参与细胞内的信号发生及活化。肿瘤坏死因子-α特别的过量分泌是已被知道为决定某些疾病、感染以及发炎状况的重要决定因素，所述发炎状况包括风湿性关节炎、恶病质素、内毒素休克、发炎性肠道疾病、克隆氏病(Crohn’s disease)、牛皮癣、接触性皮肤炎、成人呼吸窘迫症、感染、移植、心肌缺氧/再灌注损伤，涉及嗜酸性的疾病(例如气喘、过敏等等)、移植物抗宿主反应、骨骼溶蚀作用、发炎性肠道疾病、多发性硬化症(MS)、糖尿病、AIDS以及阿尔茨海默氏病及/或与阿尔茨海默氏病患有关的体重下降(回顾于Beutler B.，Tumor Necrosis Factors，The Molecules And TheirEmerging Role In Medicine Raven Press，1992，and European Cytokine Network，5(2)(1994)。 

「紫外光辐射媒介的皮肤炎性状况(UVR Mediated Skin Inflammatory condition)」是有关于皮肤过度曝晒在紫外光辐射下的皮肤发炎的状况。 

「各式各样皮肤发炎的状况(Miscellaneous Skin Inflammatory condition)」是有关于一种肌皮肤发炎的情况，其非专指上述累及完整(Intact)或是非完整(Non-intact)的皮肤。皮肤感染是为皮肤发炎的例子，其发生在完整或是非完整的皮肤上。伤口是皮肤发炎的例子，其是发生在非完整的皮肤上。 

如上所述，在身体中最大器官的皮肤亦可产生肿瘤坏死因子-α。因为皮肤代表着对一个敌对环境的边界，因此，它需要生物武器与某些顽强的敌人，例如化学刺激剂、细菌、 昆虫叮咬、阳光以及物理上的创伤作战。而前驱性炎性细胞因子是扮演着时刻准备着的信差的角色，在受到挑战时来通知及指挥免疫系统。 

B.皮色素沉淀 

在不同的个体及种族间，其肤色的不同是由黑色素细胞所产生的黑色素分布与量所决定。事实上，皮肤颜色的浓淡的差别不是由黑色素细胞的数目及密度所决定，这在任何种族的人类基本上都是相同的，但是却由其黑色素产生的活性的程度、黑色素小体的数量及大小、黑色素沉积到黑色素小体上的形式、以及成熟的黑色素小体贡献到周围的角质细胞所决定的。(回顾于Abdel-Malek Z.，The Pigmentary System：Physiology andPathophysiology.Eds.Nordlun JJ，et al.，pp.115-122，1998) 

皮肤色素沉淀的调节 

藉由黑色素细胞所产生的黑色素以及细胞增生是由数个因子所调节，其包括紫外线辐射、类固醇激素、炎性介体、生长因子、肽激素、黑色素细胞激素(同顾于Abdel-MalekZ，1998)。藉由表皮细胞或角质细胞曝露紫外线辐射下可刺激各种激素、细胞因子及生长因子的合成。角质细胞暴露在紫外线辐射下会产生白介素(IL)-1以及肿瘤坏死因子(TNF)-α两种主要的炎性细胞因子。更者，肿瘤坏死因子-α已被证实为形成晒斑(即凋亡)角质细胞的一个重要角色。藉由紫外线辐射的处理，角质细胞的碱性成纤维细胞生长因子的合成亦会被增加。碱性成纤维细胞生长因子对于人类的黑色素细胞是促有丝分裂的(Mitogenic)。另外，紫外线辐射亦会增加角质细胞内皮素(EI)-1、促黑激素(MSH)、以及促肾上腺皮质激素(ACTH)的合成。角质细胞内皮素-1对于黑色素细胞是一种强力的有丝分裂原及黑素原，并且是藉由白介素-1、肿瘤坏死因子-α以及紫外光辐射来调节，而促黑激素及促肾上腺皮质激素为促有丝分裂的及黑色素原的，其对紫外线辐射的melanogenic effect可起到转换器的功能。角质细胞内皮素-1亦可与基础性成纤维细胞生长因子及促黑激素协同作用，来刺激黑色素细胞的增殖。 

性类固醇激素(雄激素及雌激素)在皮肤色素沉积上的作用已被认可有很长一段时间。乳晕及生殖器色素的增加已经主要被归因于这些激素。在怀孕期间雌激素水平的改变是与皮肤变暗相关联，见于黑斑病(Abdel-Malek Z，1998)。 

发炎后高色素沉积的临床观察亦指着存在这个现象中的免疫炎性介体。炎性细胞因子，例如白介素-1及肿瘤坏死因子-α，会增加角质细胞的内皮素的产生及分泌(ManakaL，et al.，Br J Dermatol 145：895-903，2001)。环加氧酶(Cyclooxygenase)其他性介体路径的，例如前列腺素E(prostaglandin E)，已被发现会在曝晒过紫外线辐射后的皮肤中增加以及提高黑色素生成(Melangenesis)。(Abdel-Malek Z，1998) 

虽然很多分子参与了黑色素生成的调节，但从之前的部分可以很清楚的了解炎性细胞因子、肿瘤坏死因子-α在暴露于紫外线辐射下以及其他会导致或增加皮肤发炎的状况，例如受伤、痤疮、昆虫叮咬等等的皮肤色素沉淀的调节中扮演一种类似初始介体(InitialMediator)的主要角色。肿瘤坏死因子-向上调节(TNF-upiregulation)可能会引发其他分子的表达，这些分子可能更进一步增加发炎及/或黑色素生成的刺激。例如，肿瘤坏死因子-α会刺激人类滑液细胞和皮肤的成纤维细胞产生炎性介体前列腺素E2(Dayer，JM，et al.，J Exp Med.162：2163-2168，1985)以及黑色素生成介体内皮素介体-1。因此，抑制肿瘤坏死因子-α的活性，在预防能够产生不受欢迎的皮肤色素沉淀作用的整 个炎性和黑色素生成刺激的级联反应中会是有用的。 

另外，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)亦在皮肤的颜色中具有重要意义。碱性成纤维细胞生长因子是被紫外线辐射所诱生，对于黑色素细胞为促有丝分裂的(Mitogenic)亦增加干细胞因子(SCF)的产生(Sugimoto Y，et al.，J Cell Physiol.181：285-294，1999)。干细胞因子诱导黑细胞的增生同时增加黑色素细胞的数目及黑色素(Grichnik JM，et al.，J Am Acad Dermatol.33：577-583，1995)。在全身性硬化症患者的血清和皮肤中干细胞因子的过度表达是与过多色素沉淀有关联(Kihira C，et al.，J Dermatol Sci.20：72-78，1998 and Yamamoto T，et al.，Br J Dermatol.144：199-200，2001)，因此，碱性成纤维细胞生长因子的调控不只影响了碱性成纤维细胞生长因子，而且也影响了干细胞因子对黑色素细胞的增殖以及黑色素的产生的作用。 

C.真皮胶原-组织(Organization) 

真皮的成份 

真皮层提供表皮的支持及血液提供，真皮层在维持皮肤的弹性、厚度及外观上亦很重要。真皮层大部分由成纤维细胞及细胞外基质(ECM)构成。免疫细胞例如巨细胞、多核型白细胞、淋巴细胞、以及巨噬细胞亦存在于真皮中。细胞外基质的组成主要由成纤维细胞(Fibroblasts)来决定，而成纤维细胞产生了多种成分，例如胶原、弹性蛋白及其他母质蛋白(Matrix Protein)。细胞外基质对于细胞的黏合(Cell Adhesion)、增生、迁移和分化扮演一个类似支架的角色，且对组织给予机械强度及弹性(Kuwaba K，et al.，JDermatol Sci.29：185-194，2002)。细胞外基质最主要的组成为胶原，其功能将在下一个章节作详细的介绍。与皮肤的胶原最有关联的是弹性蛋白纤维，后者被发现在胶原蛋白束的周围且赋予皮肤回弹(recoil)的性质(即皮肤在拉伸之后「回缩」(Spring Back)的能力)，令人相信的是，损害弹性蛋白纤维会导致皮肤弹性的降低，其可在老化的皮肤中看见。其他母质蛋白包含糖蛋白，例如纤维结合蛋白以及腱生蛋白(Tenascin)，其会影响细胞的迁移、黏合、取向，以及糖胺聚糖(GAGs)例如透明质酸、皮肤素硫酸盐(DermatanSulfate)和肝素硫酸盐，其对于细胞的成长以及黏合、膜受体的功能以及蛋白聚糖(例如饰胶蛋白聚糖decrin)(Baumann L.Basic science of the dermis.CosmeticDermatology：Principles and Practice.Hong Kong：The McGraw Hill Companies，Inc.，pp.9-12，2002))可能是重要的。糖胺聚糖(GAGs)及蛋白聚糖已被证实为各种细胞行为的关键调节剂，且将在下述做更进一步的讨论。 

皮肤胶原-一般的特征 

在细胞外基质中胶原是含量最丰的蛋白质。胶原是为全部结缔组织的主要结构元素，其提供了组织的稳定性及结构完整性。已经有超过21种不同的胶原被描述。依据它们的结构及超分子组织，它们被分类为微纤维-形成胶原(Fibril-Forming Collagens(第I，II，III，V，and XI类))、基底膜胶原(basement membrane collagen(第IV类))、微纤维胶原(microfibrillar collagen(第VI类))、固定微纤维胶原(anchor fibrils(第VII类))、六角形网状构造胶原(hexagonal network-forming collagens(第VIII andX类))、原纤维-缔结胶原(fibril-associated collagens，第IX XII XIV XIX XX XXI类))、跨膜胶原(transmembrane collagens(第XIII and XVII类))、以及多重调节蛋白(multiplexins)(第XV XVI and XVIII类))。尽管它们结构上有高差 异性，但全部胶原家族的成员由具有特征性的三条α链组成的右手三股螺旋。大约全部胶原的90％为微纤维-形成胶原(回顾于Gelse K，Poschl E，and Aigner T.Collagens-structure，function，and biosynthesis.Adu Drug Del Rev 55，1531-1546，2003)。第一类胶原构成80％-85％的真皮基质且负责真皮的拉伸强度。第一类胶原在光照所导致的老化肌肤中会减少，且在真皮受伤后的皮肤(例如伤口、皮肤整平)中会增加。第三类胶原是第二丰富的真皮胶原，构成10-15％的真皮基质且对于皮肤的容量伸缩性是很重要的(Baumann L.Basic science of the dermis.Cosmetic Dermatology：Principles andPractice.Hong Kong：The McGraw Hill Companies，Inc.，pp.9-12，2002)。 

真皮胶原-组织 

由于细胞外基质的主要组成为胶原，因此细胞外基质的机械性质、生理性质以及生物学性质会被胶原的超分子(Super-Molecular)结构所影响，例如胶原分子组织为微纤维、微纤维组织为胶原束、胶原束组织为组织特异性基质，胶原的结构或是组织会深深的影响不同组织的功能或外观(Kuwaba et al.，2002)。胶原分子或参与胶原微细纤维生成的分子的先天性变异会导致胶原组织瓦解及独特的疾病，例如先天结蒂组织异常疾病(EhlersDanlos)(Ameye L，and Young MF.Mice deficient in small leucine-rich proteoglycans：novel in vivo models for osteoporosis，osteoarthritis，Ehlers-Danlos syndrome，muscular dystrophy，and corneal diseases.Glycobiology.12：107R-116R，2002)。后天的情况例如在紫外光辐射下延长曝晒也会导致正常组织结构的破坏以及由无序的胶原替代导致皮肤变薄及有皱纹。最后，后天的对于不同组织之正常胶原结构的受伤或疾病会导致无序的胶原在修复期间的产生及沉积。这个例子包括肝硬化、肺纤维化以及皮肤疤痕的形成。因此，很多不相似的过程不论皮肤有或没有受伤，都会导致胶原的瓦解并且胶原组织化的促进有可能用来治疗不同的临床状况。 

糖胺聚糖(Glycosaminoglycan) 

糖胺聚糖构成了在细胞膜以及所有哺乳动物的细胞外基质内存在的糖缀合物glycoconjugate相当大的部分。他们具有能力去结合或改变蛋白质-蛋白质间的交互作用或是酶的活性，其会使他们成为在发育、体内平衡及疾病上成为细胞应答性的(cellularresponsiveness)重要决定因素。虽然对肝素硫酸盐(Heparin Sulfate)、肝素以及透明质酸已有扩大的研究，但皮肤素硫酸盐主要的糖胺聚糖，其占了皮肤干重量的0.3％。另外，皮肤素硫酸盐也称为软骨素硫酸盐B，已被证实可提高碱性成纤维细胞生长因子以及成纤维细胞生长因子-7(FGF-7)的活性，皮肤素硫酸盐以及皮肤素硫酸盐缔合的蛋白聚糖(Dermatan Sulfate Associated Proteoglycans)例如饰胶蛋白聚糖Decorin，在受伤后会被显著地上调(Upregulated)。由伤口产生的皮肤素硫酸盐会经由ICAM-1的刺激活化内皮细胞白血球粘连。间接地，皮肤素硫酸盐蛋白聚糖例如饰胶蛋白聚糖Decorin以及双链蛋白聚糖Biglycan的产生已经被认为与增加的疤痕有关(回顾于TrowbridgeJM，and Gallo RL.Dermatan sulfate：new functions from an old GAG.Glycobiology.12：117R-125R，2002；Trowbridge JM，et al.，J Biol Chem.277：42815-42820，2002)。因此，皮肤素硫酸盐是与增加的白血球增多症有关，其会助长发炎以及助长黑色素细胞增生之碱性成纤维细胞生长因子的增加。另外，以一种将皮肤素硫酸盐作为其唯一底物的分解酶软骨素酶B(Chondroitinase B)来治疗，抑制了碱性成纤维细胞生长因子媒介的成纤维细胞增生(Denholm EM，el al.，Eur J Pharmacol.400：145-153，2000；Pojasek K， et al.，J Biol Chem.277：31179-31186，2002)。因此，糖胺聚糖水平的调节或是直接经由用酶来降解，或是间接经由它们所缔合的蛋白聚糖来调节，可能使得发炎及过多色素沉淀降低至最小。虽然不希望藉由一种特定理论来界定，但藉由软骨素酶B介导的皮肤素硫酸盐水平的降低，可以降低成纤维细胞(fibroblase)及黑色素母细胞(melanocyte)因碱性成纤维细胞生长因子所造成的增生，同时促进皮肤再生、胶原组织排列、及降低色素沉着以及减低ICAM-1介导的作用而导致对白血球增多及发炎反应的抑制。 

另外，有证据认为糖胺聚糖，例如皮肤素硫酸盐，其在修复期间大小的改变以及特殊糖胺聚糖的大小对于胶原组织具有潜在的含意。特别是，虽然小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖(Small Leucine Rich Proteoglycans，SLRPs)影响胶原微纤维的的形成，但在小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖上特殊的糖胺聚糖的大小会影响胶原纤维的间隔(即微纤维间的距离)以及胶原微纤维的直径。例如，在成年小鼠修复期间，延长的糖胺聚糖是与细的胶原微纤维的增大的微纤维间的空间联系在一起，而正常大小的糖胺聚糖与紧密堆积且厚实的胶原束结合(Kuwaba K，et al.，J Dermatol Sci.29：185-194，2002)。因此，经由不同的对特定的糖胺聚糖专一性的酶来调节糖胺聚糖的长度，可用来更进一步地促进胶原的组织化。例如，角质素硫酸盐Keratan Sulfates(另外一种形式的糖胺聚糖)可以经由使用不同的角质素硫酸盐降解酶Keratan Sulfate Defrading Enzymes来调节。(回顾于Yamagishi K，et al.，J Biol Chem.278：25766-25772，2003)。 

小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖(Small Leucine-Rich Proteoglycans) 

另一类重要的母质蛋白(Matrix Protein)为小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖，其已被证实结合于转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-Beta)且控制胶原的微纤维生成。饰胶蛋白聚糖Decorin以及双链蛋白聚糖Biglycan是为小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖家族的两个重要的成员，其已在上述讨论之。小的亮氨酸-丰富的蛋白聚糖家族很快速的成长且至少包含13种成员(回顾于Ameye L and Young MF.Mice deficient in smallleucine-rich proteoglycans：novel in vivo models for osteoporosis，osteoarthritis，Ehlers-Danlos syndrome，muscular dystrophy，and corneal diseases。Glycobiology 12：107R-116R，2002)。大多数小的亮氨酸-丰富的蛋白聚糖可被归分为三大类，饰胶蛋白聚糖(Decorin)以及双链蛋白聚糖(Biglycan)分别为第一类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖的代表，其包含一种独特的N-端半胱氨酸序列(N-terminal cysteinesequence)且分别携带一个或两个软骨素链或皮肤素硫酸盐链。不像第一类，第二类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖包含一种不同的N-端半胱氨酸序列且一般携带聚乳糖氨(polylactosamine)或是角质素硫酸盐链(keratan sulfate chains)。纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖(Lumican)，角聚糖(Keratocan)以及骨粘连蛋白(Osteoadherin)为第二类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖的例子。第三类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖是显示出一种N-端半胱氨酸序列的特征且包含硫酸化的酪氨酸(Sulfated tyrosine)残基在N-端的尾端中。 

一般而言，第一类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖倾向于比第二类成员更普遍存在，第二类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖更多组织特异性的分布。某些小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖与第I、II、V、VI、XII及XIV类胶原结合来调节胶原的微纤维生成。另外，至少有三种小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖(饰胶蛋白聚糖(decorin)、双链蛋白聚糖(biglycan)以及纤调蛋白聚糖)结合到一种多功能的细胞因子即转化生长因子-β上，其参与发炎细胞的自然凋亡(Inflammation Apoptosis)、细胞增生、细胞的分化、以及疤痕的形成。根据 这些发现，某些专利已经通过中和转化生长因子-β来减低疤痕组织或是伤口的能力提出申请，其办法为通过在饰胶蛋白聚糖(decorin)、蛋白聚糖(proteoglycan)家族中潜在转化生长因子-β调节体(TGF-betamodul ators)的应用，包括饰胶蛋白聚糖(decorin)、双链蛋白聚糖(biglycan)以及纤调蛋白聚糖。(美国专利第6509314号，美国专利第5583103号，美国专利第5958411号，美国专利第5654270号，以及美国专利第5824655号)。 

另外，因为成纤维细胞所产生的饰胶蛋白聚糖decorin似乎会随着年龄及光的损害而减少，还因为在皮肤中饰胶蛋白聚糖decorin的缺乏是与拉伸强度的减少以及皮肤脆弱性有关，现在的某些专利已特别提到饰胶蛋白聚糖decorin，但不是其他的小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖用于预防或治疗皮肤老化。例如，局部应用缀合的亚麻油酸(conjugatedlinoleic acid)、petroselinic acid、以及其他的化合物促进饰胶蛋白聚糖decorin在皮肤中的大量合成(美国专利第6,551,602号；美国专利第6,455,057号；美国专利第6,440,434号；美国专利第6,423,325号；美国专利第6,287,553号；美国专利第6,042,841号)或是在化妆品及皮肤科组合物中实际使用饰胶蛋白聚糖。(美国专利公开字号第20030124152)。 

现存的基因剔除小鼠模型证实，虽然小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖大略地属于相同的蛋白聚糖家族，但是它们具有显著的不能互换的不同作用。例如，饰胶蛋白聚糖decorin(第一类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖)缺失的小鼠表现出皮肤的脆弱性，而纤调蛋白聚糖(第一类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖)缺失的小鼠则未表现出已知的皮肤缺陷(Ameye L andYoung M，2002，Glycobiology，12(9)：107R-116R)。更者，定靶的双链蛋白聚糖biglycan(第一类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖)的瓦解导致骨质的减少但没有描述到皮肤异常，而腔蛋白聚糖Lumican(第二类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖)基因剔除的小鼠表现出了角膜混浊(Corneal Opacity)。因此，虽然饰胶蛋白聚糖decorin，双链蛋白聚糖biglycan，纤调蛋白聚糖以及lumican归类于相同的小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖家族，饰胶蛋白聚糖decorin/双链蛋白聚糖biglycan和纤调蛋白聚糖/lumican属于同类的蛋白聚糖，但每一成员具有不同的生物学功能，对胶原微纤维生成、结构、以及组织具有不可交换的作用。 

就组织分布而言，饰胶蛋白聚糖decorin和双链蛋白聚糖biglycan是普遍存在的，虽然它们在各组织中的定位非常分散，以饰胶蛋白聚糖decorin被发现更多在组织的细胞外基质内(在此它键结到第一类胶原上)(Vogel KG，et al.，Biochem J.223：587-597，1984)而双链蛋白聚糖biglycan更定位在靠近在细胞的周围(Bianco P，et al.，JHistochem Cytochem.38：1549-1563，1990)。饰胶蛋白聚糖decorin是为一种主要的皮肤素硫酸盐蛋白聚糖(Dermatan Sulfate Protoglycan)，其分布在皮肤中的胶原微纤维的表面上(Kuwaba K，et al.，J Dermatol Sci.29：185-194，2002)。纤调蛋白聚糖在软骨、腱以及巩膜(Sclera)中以高浓度更加局限地分布，而在皮肤中及矿化的骨骼中含量很低(Heinegard D，et al.，J Biol Chem.261：13866-13872，1986)。腔蛋白聚糖Lumican是主要被发现在角膜中(回顾于Ameye and Young，2002)。 

D.老化 

随着年龄的增加，成纤维细胞的增生以及合成胶原及其他细胞外基质蛋白质(例如蛋白聚糖)的能力会下降(Takeda K，et al.，J Cell Physiol.153：450-459，1992)。例如，第一类胶原以及饰胶蛋白聚糖decorin的产生在老化的皮肤中会减少(Hunzelmann N，et al.，Biochim Biophys Acta.1360：64-70，1997 and Carrino DA，et al.，J Biol Chem.278：17566-17572，2003)。另外，较老的成纤维细胞亦展现了较高的基底(basal)和诱生的间质胶原酶(interstitial collagenase)稳态信使核糖核酸(mRNA)的水平(Burke EM，et al.，Exp Gerontol.29：37-53，1994)。因此，随着年龄增长在进行性的细胞外基质的沉积(例如第一类胶原，饰胶蛋白聚糖decorin)以及退化(例如胶原酶)之间相对的平衡会倾向于总的细胞外基质的退化。这会导致支持性真皮渐渐的变薄及分裂，之后导致下垂以及表皮产生皱纹，即皱纹的形成。在微观的水平上，在老化皮肤中的胶原是以在类似绳索束中变厚的微纤维组织为特征，其与在年轻皮肤中见到的有组织的形态相比之下为混乱的(例如参见Oikarinen A.，Photodermatol Photoimmunol Photomed7：3-4，1990)。 

除了由于时间导致的老化，也可能会发生由于暴露在阳光及/或环境污染下所造成皮肤加速老化。例如，暴露的在紫外线辐射下所发生皮肤老化。暴露在紫外线辐射下会引起皮肤的炎性反应，这在很大程度上由肿瘤坏死因子-α以及其他在此所讨论的因子介导。肿瘤坏死因子-α已被证实抑制真皮成纤维细胞(dermal fibroblasts)中的胶原及纤连蛋白(fibronectin)的合成(Mauviel A，et al.，J Invest Dermatol.96：243-249，1991；Mauviel A，et al.，FEBS Lett.236：47-52，1988)以及促进胶原的退化(Dayer JM，etal.，J Exp Med.162：2163-2168，1985；Siwik DA，et al.，Circ Res.86：1259-1265，2000)-两者都会造成皮肤的老化。暴露在紫外线辐射下极大地向上调整(upgulate)某些类型的胶原降解酶。即基质金属蛋白水解酶(MMPs)(间质胶原酶亦属于此类酶)的产生。因为基质金属蛋白水解酶会降解胶原，由于紫外线辐射的暴露造成的基质金属蛋白水解酶长期提高，会导致在光老化皮肤中看见的组织瓦解以及结块的胶原(clumped collagen)。因此，基质金属蛋白水解酶可能代表了一种伴随着紫外线辐射的曝晒，而使得第一类胶原水平降低的机制(Baumann L.Photoaging.Cosmetic Dermatology：Principles andPractice.Hong Kong：The McGraw Hill Companies，Inc.，pp.13-20，2002)。紫外线辐射至某种程度时亦会导致真皮的降解。更者，紫外线辐射亦会诱生出碱性成纤维细胞生长因子，其已知可刺激血浆酶原活化蛋白(plasminogen activator)以及胶原酶的活性，其会促进细胞外基质的分解(回顾于Abraham JA and Klagsbrun M.Modulation of woundrepair of members of the fibroblast growth factor family.Ed.Clark RAF.TheMolecular And Cellular Biology Of Wound Repair.Vol.xxiii.New York：Plenum Press，pp.195-248，1996)。利用纤调蛋白聚糖来调节碱性成纤维细胞生长因子的活性亦可防止或是减少包括胶原瓦解的光老化作用。 

因此，正常的及加速的老化是与整体性的细胞外基质(例如胶原、饰胶蛋白聚糖decorin、纤连蛋白)生成的减少，以及细胞外基质退化的增加有关(例如基质金属蛋白水解酶、血浆酶原活化蛋白)，其导致细胞外基质的进行性变薄以及胶原的组织瓦解和结块。因此，在改善皮肤的状况特别是老化的皮肤方面，防止细胞外基质产生的减少或是细胞外基质退化的增加的方法(例如利用抑制肿瘤坏死因子-α及/或碱性成纤维细胞生长因子)，或是改善胶原的组织化的方法可能是有用的。 

III.改善皮肤新生的方法及组合物 

在此描述的本发明之一方面，是为一种调整皮肤状况的方法，例如促进皮肤的再生。此方法包含一个步骤，其可促进胶原的组织化、调节皮肤的炎性状况、调节皮肤的色素沉淀以及上述几种的组合。 

在一个实施例中，调节皮肤状况的方法可以藉由例如调节某种化合物的水平来达成，该化合物可为哺乳动物皮肤中的小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖、糖胺聚糖、基质金属蛋白水解酶或是上述几种的组合。小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖可以是例如纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖lumican、饰胶蛋白聚糖、双链蛋白聚糖、和它们的组合。糖胺聚糖可为例如皮肤素硫酸盐、软骨素硫酸盐、角质素硫酸盐和它们的组合。基质金属蛋白水解酶可为基质金属蛋白水解酶-1或基质金属蛋白水解酶-9，或是上述几种的组合。小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖的水平可被应用至皮肤的一种组合物来调节，该组合物包含一个或是多个有效量的小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖。皮肤可是完整的或是非完整的，有或没有真皮的受伤，或是非完整的皮肤具有表皮的受伤。皮肤素硫酸盐、软骨素硫酸盐、角质素硫酸盐keratan sulfate及其组合可以通过将包含一个或是多个酶的组合物施加到皮肤来调节，这些酶调节胶原微纤维生成以及微纤维间的空间和/或调节成纤维细胞产生的无组织的基质沉积。示范性的调节胶原微纤维生成、微纤维间的空间、及/或成纤维细胞产生的无组织的基质沉积的酶包括但不限于软骨素酶AC、软骨素酶B、内-β-半乳糖苷酶endo-beta-galactosidases、角质素酶keratanase、角质素酶keratanase II、Bc角质素酶keratanase II以及上述几种的组合。基质金属蛋白水解酶水平可通过将一种组合物施用到皮肤来调节，该组合物包含一种或多种有效量的基质金属蛋白水解酶来调节胶原的降解。 

在另一实例中，调节皮肤状况的方法可通过调节皮肤炎性状况或是调节皮肤色素沉淀来达成。皮肤炎性状况可以是，例如，非过敏性皮肤炎性状况、过敏性皮肤炎性状况、神经性皮肤炎性状况、紫外线辐射所导致的皮肤炎性况、其他皮肤炎性状况，以及上述几种的组合状况。皮肤炎状况及/或皮肤色素称沉淀，例如可通过调节可能调节的肿瘤坏死因子-α活性的纤调蛋白聚糖、lumican、饰胶蛋白聚糖decorin及/或双链蛋白聚糖biglycan的水平来调节，或是通过调节可能调节皮肤中的白血球过多的皮肤素硫酸盐来调节。皮肤色素硫酸盐的水平可通过一种或是多种酶，例如软骨素酶B来调节。皮肤色素沉淀亦可藉由调节碱性成纤维细胞生长因子活性的皮肤素硫酸盐的水平来达成。然后，碱性成纤维细胞生长因子的活性又直接地调节黑色素细胞的增生，或是间接地增加干细胞因子的产生。干细胞因子会直接调节黑色素细胞的增生以及黑色素的产生。另外，可通过加组合物施用到皮肤上来调节皮肤素硫酸盐、软骨素硫酸盐chondroitin sulfate，角质素硫酸盐keratan sulfate以及上述的种类的组合的水平来调节的皮肤色素沉淀，此组合物包含一种或多种酶例如软骨素酶AC、软骨素酶B、内-β-半乳糖苷酶endo-beta-galactosidases、角质素酶keratanase、角质素酶keratanase II、BC角质素酶keratanase II以及上述种类的组合。 

本发明的另一方面，是描述了具有促进皮肤再生能力的包含藉由胎儿组织表达的一种或多种化合物的组合物及其使用方法。特别是，本发明提供一种组合物，其可改善、减少、预防或治疗皮肤中可视的和/或可触的裂痕。此裂痕可被内部的及/或外部的因素所诱生或导致，且包括在此所描述的皮肤老化的标记。改善皮肤的状况包括了但不限于：1)改善、减少、预防以及或是治疗皮肤的状况例如明显的皱纹、下垂、不均匀色素沉淀、以及弹性或回弹性减少的治疗；2)导致更加光滑柔软的皮肤结构及外观的治疗；3)改善、减少、预防、以及或是处理皮肤发炎的治疗；4)改善、减小、预防以及或是处理与肌肤老化无关的过多色素沉淀或是不均匀色素沉淀的治疗(例如痤疮、昆虫叮咬)；5)促进细胞外基 质组织化的治疗；6)促进皮肤再生的治疗。 

本发明之又一方面，提供方法来促进利用包括纤调蛋白聚糖，lumican，饰胶蛋白聚糖decorin以及双链蛋白聚糖biglycan的小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖来改善皮肤的状况，以及利用酶来调节与蛋白聚糖有关联的糖胺聚糖。在一个实施例中，本发明包括皮肤的再生和真皮胶原的组织化，以及预防或是减少皮肤发炎或是过多色素沉淀的方法。 

本发明的再一方面，提供一种用来鉴定由胎儿组织表达的化合物的方法，此化合物可促进皮肤的再生。提供包含一种和多种已鉴定的化合物的组合物，以及使用此组合物来促进皮肤再生的方法。本方法可进一步包括分离由胎儿组织表达的化合物、鉴定此化合物、重组表达此化合物、以及将此化合物施用到哺乳动物皮肤的方法。 

在本发明的又一实施例中，促进皮肤再生的方法包括对由成人组织所表达对化合物和由胎儿组织所表达对化合物进行比较。选择出只在成人组织中表达的化合物并选择其他化合物以便阻断这些只在成人组织中被表达的化合物的表达。阻断表达的化合物，然后被施用到哺乳类动物的皮肤。 

还提供化妆品护肤组合物，其包括由胎儿组织表达的化合物。还提供其他化妆品护肤组合物，其包括蛋白聚糖如纤调蛋白聚糖、酶例如软骨素酶B，以及另一种酶例如基质金属蛋白水解酶-1(MMP-1)。 

除非有其他的指定，否则在此全部的百分比以及比例是以总组合物的重量为基础来计算且在25℃下测量。在某些例子的组合物中包含的酶，以某给定重量的或某给定体积的专一活性(specific activity)(IU)的单位来表示(例如专一活性/毫克(IU/mg))或是(例如专一活性/毫升(IU/mg))。 

本发明的组合物对于局部的应用以及改善皮肤状况是有用的。由胎儿组织表达的化合物可以各个纯化的或是部分纯化的或是直接没有纯化的细胞液、萃取物、以及培养基的形式使用。在本发明的一个实施例中，由胎儿细胞或组织表达的化合物可经由组织培养基或是细胞溶解物来直接分离并进一步浓缩及纯化。虽然由胎儿组织表达的化合物的个别的鉴定或是纯化是有用的，但是本发明并不要求对化合物个别的鉴定或是纯化。经过或未经进一步浓缩或是纯化的组织培养基或细胞裂解液，其后可被配制为化妆品护肤组合物的配方用以改善皮肤的状况。 

在一具体实施例中，组合物可包含：a)从大约0.0001重量％到大约10重量％被纯化的蛋白聚糖化合物，以及大约0.1重量％到大约80重量％的含有蛋白聚糖的细胞溶解液、萃取物、或是富集了蛋白聚糖化合物的培养基；b)从大约0.1重量％到大约10重量％的透明质；c)从大约0.000001重量％到大约10重量％的至少一种另外的皮肤护肤活性分子；以及d)一种载体，其可包含化妆品可接受的载体、皮肤科可接受的载体、药物可接受的载体、泡状传送系统、以及上述数种的组合。 

由胎儿组织表达的化合物 

早期怀孕的胎儿皮肤具有天生的能力经由真正的组织再生过程而非疤痕的形成来愈合。非巧合地，组织再生的过程的特征是发炎症状的缺乏。因此，胎儿皮肤模型的使用可被用来鉴别对早期怀孕的胎儿皮肤的天生的经由真正的组织再生过程而非疤痕的形成来愈合的能力是很重要的分子。 

在现有技术中已经证实，胎儿皮肤基本上与成人的皮肤不同。例如，受伤后，成人的 皮肤通过明显的发炎及疤痕的形成来修复，这是一个以具有胶原及不同细胞外基质组分的无序沉积来替代受伤组织的过程，其可总称为「疤痕」。相比之下，胎儿皮肤的修复是进行细胞再生以及正常皮肤结构的复原，其通过胶原以及细胞外基质的有序沉积以实现无疤痕的修复及最轻的发炎反应(Mackool，R.J.，Gittes，G.K.，and longaker，M.T.Scarlesshealing.The fetal wound.Clin Plast Surg 25：357-365，1998)。研究已证实，无疤痕皮肤修复的能力是胎儿皮肤的一种特征，且不需要胎儿免疫系统、胎儿血清、或是羊膜液(Bleacher JC，Adolph VR，Dillon PW，Krummel TM.Isolated fetal mouse limbs：gestational effects on tissue repair in an unperfused system.J Pediatr Surg 28：1312-4；discussion 1314-5.1993；Ihara S，Motobayashi Y.Wound closure in fetalrat skin.Development 114：573-82.1992)，例如，分离的人类胎儿皮肤被移植到无胸腺小鼠的疤痕上愈合时没有产生典型的疤痕组织(Adzick NS，Lorenz HP，Ann Surg 220：10-8.1994)。 

因此，在再生胎儿皮肤中的特定分子或是组合物是在非胎儿皮肤中(例如成人皮肤)很少存在或根本不存在，这些分子对于再生以及改善皮肤状况是很重要的，特别是，假设在胎儿皮肤中缺少显著的发炎，则某些此类分子或组合物亦可通过预防及减少发炎来发挥抗发炎的作用。另外，假设在胎儿皮肤中缺少无组织纤维组织的沉淀以及组织化，则某些此类分子或组合物亦可预防过量的细胞外基质的产生及/或增加细胞外基质的组织化，实现正常胶原组织的复原(Whitby DJ and Ferguson MW，Development 112：651-668，1991)。 

虽然用来鉴定对于皮肤老化及/或皮肤压力CWO 021053773 A3)以及皮肤体内平衡(homeostasis)(WO02/053774 A3)重要的基因的方法已在先前技术中被描述，但此方法与本发明所包括的方法完全不同。例如，已经证实，组织再生以及无疤痕修复的能力被限制在胎儿期间特殊的时间点(Ihara S，et al.，Development 110：671-680，1990)。只有早期怀孕的哺乳类动物具有愈合能力而不产生疤痕。后期怀孕的胎儿以及新生的动物已经失去组织再生的能力且来展现一种「成人形式」的以疤痕为特征的伤口愈合反应(Soo C，et al.，Am J of Pathol.157：423-433.2000)。因此，以分子基因筛选的看法，如同在WO 02/053773 A3中比较「老化及年轻的皮肤」所详细描述的，已无从鉴别对于组织再生所必需的基因，因为在后期怀孕的胎儿中此能力已经丧失且无疑地在「年轻的」皮肤中也一定已经丧失。这一点可通过用「年轻」皮肤修补裂唇并伴随着显著的疤痕形成，以及无疤痕裂唇修复唯一的例子是在早期怀孕的胚胎动物模型中(Longaker MT，et al.，PlastReconstr Surg 90：750-756，1992)。先前技术没有描述使用胎儿组织及伤口模型来鉴定可以改善皮肤状况的组合物，特别是化妆品组合物。另外，在先前技术WO 02/053773 A3的陈述中，并没有描述一种皮肤再生的组合物包含利用胎儿组织表达的化合物的构想。 

a)在胎儿模型中胎儿组织的获取方法(Methods for preparation of Fetal Tisue ina Fetal Model) 

大约300gm的雌大鼠(SD)被配对。以阴道栓塞检测作为怀孕的证据来证实0.5天怀孕期(一期＝21.5)。为了制造胎儿的伤口，麻醉16天及18.5天及19天的怀孕大鼠。胎儿大鼠皮肤从无疤痕胎儿类型修复(scaarless fetal-type repair)到疤痕成人类型修复(adult-type repair with scar)过渡是在16天(E16)的怀孕期至18天(E18)的怀孕期(一期＝21.5天)，E19的胎儿大老鼠被选择来避免E16到E18过渡期的潜在重复性。麻醉药剂由剂量为10-20毫克/公斤的1％氯胺酮(Ketamine)和剂量为0.3毫克/公 斤的0.1％塞拉嗪(Xylazine)构成。怀孕的动物被刮毛且从中线剖腹。每一个子宫的切片都被具体化且一条7-0尼龙环状袋子缝合(purse-string structure)被放置在非胎盘表面上的每一层子宫壁。子宫肌壁及羊膜囊之后在环状袋子缝合内以显微外科剪刀切开。接着，利用显微外科镊子抓伤皮肤以及剪刀刺激皮肤的方式，在胎儿的背部上制造一个2-毫米的切口。为了以后的伤口鉴定，蓝色或是绿色的活体染剂(vital stain)被施用在切片的位置上。温的无菌正常生理食盐水之后经由子宫切开来施加并且闭合环状袋子缝合(第一图)。母体的筋膜及皮肤之后使用人造可吸收性缝合线封闭为两层。 

在组织学上，E16以及E19胎儿的伤口在12、24、36、48以及72小时手术后获得。从每一个时间点上收集没有伤口的皮肤用作对照组(例如E17对照组的皮肤是为E16+24小时的伤口)。对于每一个时间点，总计四个动物从两族怀孕的动物中分离出，全部的组织样本是被固定于4％的三聚甲醛中、用无水等级的乙醇脱水、埋置在石蜡中，并切成5微米(μm)切片用于常规染色(Hematoxylin and Eosin(H&E)staining andimmunohistochemistry)，或是切成7微米切片用于激光扫描共轭焦(CLSM)显微镜。 

对于RNA的分析，E16以及E19的胎儿伤口在受伤后24及72小时被获得，从每一个伤口获得的时间点取得非伤口皮肤被使用为对照组(例如E19对照组皮肤是为E16+72小时的伤口)，对于每个时间点共有20个伤口被使用，分离的组织立即用液氮冷冻且储存在-70℃下直至萃取RNA。 

b)在胎儿模型中组织再生的确定的方法 

是利用常规染色来鉴定整体伤口的外观以及利用CLSM来分析胶原结构及微纤维的排列(第二图及第三图)。CLSM的技术是如先前所描述的那样进行(Beanes SR，et al.，PlastReconstr Surg.109：160-170.，2002)。 

对于在受伤后的72小时的E16(n＝10)以及E19(n＝8)的伤口，每一个愈合伤口位置的总胶原密度使用Image Pro

Plus来计算，将总胶原表面面积除以总伤口表面面积(Media Cybernetic，Silver Spring，MD)。为了比较，从年龄配对的对照组中(例如E19(E16+72小时)和初生的第一天(E19+72hours)动物)非受伤皮肤的总胶原密度亦被测定。计算平均值和标准偏差并进行没有配对的双侧检定(two-tailed student’stest)来检测总胶原密度的统计学上显著的差别。P值＜0.05被认为是显著的。 

如第2A-E图所示，E16伤口在CLSM上证实了以减小的皮肤发炎及皮肤细胞结构组织及组织的胶原结构，在H&E证实了形成再生无疤痕的修复，其与正常、无伤口的皮肤为可比较(第2F图)。数字影像分析证实受伤后72小时的E16伤口以及没受伤的E19的皮肤在胶原密度上并未显示显著的不同(p＞0.05)(第二G图)。相对之下，E19伤口证实了有疤痕的非再生修复及无毛滤泡再生以及增加及延长的发炎反应和增加的直皮的细胞结构(第三A-E图)。CLSM揭示了一个致密的异种胶原微纤维，在完全愈合伤口中的无序集合(第三F图)。数字影像分析证实了在受伤72小时后，在E19伤口中胶原密度相对于非受伤的新生的第一天的皮肤(E19+72小时)(p＝0.00043)有了显著的增加(第三G图)。这些研究指出，早期怀孕的E16伤口显现出无疤痕再生修复的能力，其在后期怀孕的E19伤口是缺乏的。人类胎儿皮肤从15周到22周(第二个三个月)亦显现出无疤痕再生修复的能力。(回顾于Dang C，et al.，Clin Plast Surg.30：13-23，2003)。 

c)从人类组织培养系统直接获得化合物的方法 

如上文所述，在15到22周之间的人类胎儿的皮肤具有皮肤无疤痕修复以及组织再生的能力。因此，可以从胎儿皮肤器官培养物、二维或三维胎儿细胞培养物、以及来自培养的胎儿细胞/组织的培养基获得由胎儿组织表达的非基因修饰的化合物。这些化合物可以是溶解物(lysates)、萃取物及培养基的形式。细胞和组织培养方法，以及获得细胞溶解物或萃取物的方法是本领域所公知的(参见Pollard JW，Walker JM(1997)Basic cellculture protocols，2nd ed.Humana Press，Totowa，N.J for more specific detailson cell culture)。人类胎儿细胞培养基可以被分离且处理所得到的上清液。细胞培养物上清液的处理是本领域技术人员公知的可以包括但不限于上清液的浓缩，从上清液纯化特殊的化合物，和上清液的杀菌。细胞培养物上清液处理方法应该确保由胎儿组织表达的化合物的生物活性的最佳保留。无菌处理及其他的努力来改善杀菌也是期望及需要的。下面的实施例是为了阐明而不是限制本发明的范围。 

人类胎儿细胞培养 

将胎儿皮肤的小条(真皮面朝下)放置到细胞培养板上，可将胎儿皮肤的成纤维细胞从胎儿皮肤样品中分离出。胎儿皮肤成纤维细胞从一片皮肤迁移并附着到培养板上。在成纤维细胞附着于培养板上后，丢弃此片皮肤。让此胎儿皮肤成纤维细胞生长至期望的密度并且根据标准技术分离。 

人类胎儿细胞培养基的制备 

从胎儿组织或是培养基倒出或是吸出液体可以获得胎儿细胞培养基(或上清液)。取出之后，可以进一步处理得到上清液。这种处理的例子包括但不限于通过水流动吸滤装置或是渗滤(defiltration)浓缩(关于进一步处理的更多的资讯参见下面「从胎儿细胞培养基或溶解产物纯化蛋白质的实施例」的章节)。 

人类胎儿细胞溶解物的制备 

细胞培养板中胎儿皮肤成纤维细胞成长至70％-80％密度之后，以下列方法进行细胞溶解物的制备：1)为了去除血清，在磷酸盐缓冲的溶液(PBS)中充分洗涤含有胎儿成纤维细胞的培养基板；2)之后，胎儿成纤维细胞用水解酶例如胰蛋白酶培养大约3分钟，以有利于从培养板上分离；3)之后，分离的细胞经由离心沉淀而成小丸状，之后利用洗涤剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)进行细胞溶解。然后将上清液透析以去除残留的SDS。 

胞内产物亦经由化学的(例如有机溶剂)、酶促的(例如溶菌酶以及EDTA)、机械的、或是物理细胞破碎方法(例如菌化作用、超音波振荡、高压均化、摩擦搅动)。分离胞内产物亦包括机械和非机械方法的组合。 

从人类胎儿细胞培养基或是溶解物纯化蛋白质

细胞外(细胞培养基)或是细胞内(溶解物)产物的纯化可用多种方法进行，以有利于产物纯化或是去除非需要的污染物。一种方法为固-液相分离(例如离心/沉淀、萃取、过滤)。另一种方法是浓缩(例如蒸发、超滤、吸附、沉淀)。再一种方法为色层分析法(例如尺寸排斥分析法、离子交换色层分析法、色层聚集法、疏水交互层析法、亲和层析法、固定化金属离子亲和层析法共价层析法。本领域技术人员容易实施这些技术。若有需要，也可以应用杀菌技术，例如过滤或加热或照射(有关蛋白质纯化的更多资讯请参见RatledgeC，Kristiansen B(2001)Basic biotechnology，2nd ed.Cambridge UniversityPress，Cambridge，U.K.)。 

d)通过基因重组技术从胎儿伤口模型中间接获得化合物的方法

本发明的另一实施例中，鉴定了在哺乳类的皮肤中(人类或是非人类)，由胎儿组织表达的化合物或是促进这些化合物表达的条件。胎儿组织与细胞表现出与成年细胞截然不同的基因表达模式。就蛋白质水平而言，这可能导致不同的细胞外基质成分、生长因子、细胞因子以及酶的产生(Sullivan KM，Lorenz HP，Meuli M，Lin RY，Adzick NS.A modelof scarless human fetal wound repair is deficient in transforming growth factorbeta.J Pediatr Surg 30：198-202；discussion 202-3，1995)。例如，胎儿皮肤成纤维细胞产生较高的第三类与第一类胶原的比例以及不同的蛋白聚糖曲线，以及更多的透明质酸(Mast BA，Diegelmann RF，Krummel TM，Cohen IK.Scarless wound healing in themammalian fetus.Surg Gynecol Obstet 174：441-51.1992)。另外，蛋白聚糖是带有一个或是多个糖胺聚糖侧键的核心蛋白，在细胞外基质的装配、细胞交互作用、以及生长因子储存中起关键作用(Ruoslahti E.Proteoglycans in cell regulation.J Biol Chem264：13369-72，1989)。 

通过标准分子生物学技术可以鉴定胎儿和成人组织间的基因表达差异。例如，可应用Northern印迹、减数杂化术(subtractive hybridiaztin)、PCR的差异显示、微阵列、以及实时PCR来鉴定基因表达的差异(下面是对各种技术中的一些样品参考：DD-PCR-LiangL，Arthur BP.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of thepolymerase chain reaction.Science 257：967-971，1992；Microarrray-zhang X，et al.，Craniosynostosis in transgenic mice overexpressing Nell-1.J Clin Invest 110：861-70.2002；Subtractive hybridization-Diatchenko L，et al.，Suppressionsubtractive hybridization：a method for generating differentially regulated ortissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl Acad Sci USA 93：6025-30.1996)。使用各种不同的基因表达鉴定技术，能阐明胎儿皮肤再生中特定时间的分子「蓝印」(blue print)，并且特异分子鉴定为在胎儿再生修复期间是被上调或下调。请参阅第四图至第七图候选基因筛选的特殊引物(primer)PCR基础技术的例子。 

一旦鉴定后，早期怀孕中的(但不是晚期胎儿或是成年组织或细胞中的)上调分子可被分离出且进行鉴定以用于后来的产品研发。这些上调分子可以「回加」以使得成年皮肤更具有「类似胎儿」的特性。相反地，成年组织或是晚期怀孕中的上调分子(但不是早期胎儿组织)也可以进行鉴定以用来此后的产品研发。可以「阻断或抑制」成年组织中鉴定的上调分子以赋予成年皮肤更具有「类似胎儿」的特性。 

下面是为了阐明而不是限制本发明的范围。要「回加」的分子可以直接由胎儿组织、胎儿细胞培养基、溶解物、或萃取物得到(参见前面的章节，supra)。或者，要「回加」的分子为了提高其表达的目的，可在基因工程细胞中「重组表达」(有或无事先的基因修饰)。之后，可以单独或联合在皮肤组合物中使用胎儿细胞或组织中的上调分子。相反地，用反义RNA(antisense RNA)分子或是已知的抑制剂或是调节体(例如以软骨素酶B来调节皮肤素硫酸盐)可用于锁定成人而非胎儿组织中的上调分子(即「阻断或抑制」的分子)。之后，反义RNA分子或是已知的抑制剂可以在皮肤保养组合物中使用。 

筛选正常的大鼠胎儿组织作为怀孕的功能(Screening Normal Rat Fetal Tissue asa Function of Gestation) 

没有受伤的胎儿皮肤的基因表达筛选作为一种怀孕的功能，可允许对无受伤的胎儿皮肤的恒定作用具有重要性的分子进行鉴定。第四图描述随着妊娠年纪的增加以及再生愈合的丧失纤调蛋白聚糖下调及饰胶蛋白聚糖(decorin)上调，与先前技术中所期望的不同，其显示出上调饰胶蛋白聚糖(decorin)暂时与晚期怀孕胎儿中非再生修复结合。其他利用此研究方法(即TFT-β配基和接体以及潜在的转化生长因子-β键结蛋白-1(LTBP-1))来筛选的分子，被包括在使用以PCR为基础的特定引物来筛选的例子。 

筛选受伤大鼠的胎儿组织

相对于E19的胎儿皮肤的受伤的E16的基因表达筛选，允许对于皮肤再生是为关键的分子的可能鉴定。第五图描述了对于MMP-9表达及相对低的TIMP-1作为特征。此是证明了相对于过量的细胞外基质沉积，其细胞外基质退化相当程度的增加对于无疤痕修复是重要的。由于过量的细胞外基质累积构成了疤痕必要的组分，因此可用来防止过量细胞外基质沉积以及促进细胞外基质退化(例如MMPs)的化合物，对于在受伤后以疤痕的产生为特征的皮肤再生而言是有用的。第六图描述了对于FGFs以PCR为基础来筛选的结果。相对于结疤的伤口，无疤痕伤口是以减少的FGF在受伤后初始的48小时被诱生出为特征。特别是，FGF-2(此是为碱性成纤维细胞生长因子)在无疤痕胎儿伤口中被相当程度的减少。此暗示碱性成纤维细胞生长因子的调节对于皮肤的再生可能是有用的。第七图为以PCR为基础对饰胶蛋白聚糖decorin以及纤调蛋白聚糖作筛选的结构。此证实了并非饰胶蛋白聚糖decorin而是纤调蛋白聚糖在E16再生伤口中被上调，其表明不是饰胶蛋白聚糖decorin的调节而是纤调蛋白聚糖的调节，可用来促进皮肤再生。 

独立的基因克隆

基因克隆的技术在本领域是熟知的(更多的资料请参阅Wu W.Methods in GeneBiotechnology.Boca Raton：CRC Press，1997)。简单的说，对编码序列(coding sequence)已知的基因，特定的引物PCR为基础的技术可用于基因的克隆。从这些序列，PCR引物可被涉及为位在编码序列的两侧。在放大后，对于细菌、酵母、或是哺乳类动物的细胞，其PCR的产物可被连接成各式各样的质粒(Plasmid)。对于编码序列未知的基因这对于使用差异表现方式来鉴定的基因序列的情况，这里常有的，如先前技术中所述的(Soo C，et al.，J Cell Biochem.74：1-10，1999)利用迅速扩大cDNA端(RACE)的方法可完成全长cDNA克隆的分离。例如，对于人类纤调蛋白聚糖，可经由基因库(GenBank)并利用下列的登陆号码(accession number)：NM_002023，BC035281，或是X75546，即可得到完整的cDNA序列。对于人类纤调蛋白聚糖的cDNA全长编码，其经由反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从人类成纤维细胞的总RNA被放大。用于该PCR的特定引物的设计以基因库的登陆号码为NM_002023，已发表的人类纤调蛋白聚糖cDNA的序列为基础，其1.1kb PCR片段利用全长测序来确定。 

对于纤调蛋白聚糖的哺乳动物表达质粒的构建及表达(Mammalian ExpressionPlasmid Constuction and Expression for FM)

对于哺乳动物系统，选择p2xFLAG-CMV-14(Sigma)表达载体是由于其对于接续的蛋白质纯化具有方便的优点。3xFLAG序列与人类纤调蛋白聚糖cDNA的C-端尾部连接，以产生C-端的棋标-标签重组蛋白质。人类纤调蛋白聚糖表达质体最后的结构为p3FLAG-CMV-HFM，更进一步以选择性限制消化作用以及DNA的测序来证实。 

CHO-K1细胞株(cell line)(ATCC，Manassas，VA)被使用来产生重组人类纤调蛋白聚糖(recombinant human FM，rhFM)。稳定的被传染的transfected细胞株以G418在培养基中的深度选择，且利用对重组蛋白质表达的anti-Flag抗体的免疫荧光细胞化学的方法来构建。重组人类纤调蛋白聚糖经由anti-flag琼脂糖柱的亲和层析法来纯化用3xFLAG竞争性洗脱，以维持重组人类纤调蛋白聚糖的天然形式。被纯化的蛋白质包含天然的KS侧链，其经由Western印迹以分子的大小来确认。重组人类纤调蛋白聚糖键结到转化生长因子-β1以及碱性成纤维细胞生长因子的能力利用ELISA结合分析方法来确认。若是需要，重组人类纤调蛋白聚糖的亲水性标志肽可容易利用肠激酶消化作用除去。 

纤调蛋白聚糖细菌表达质粒的构建及表达(Bacterial Expression PlasmidConstruction and Expression for FM)

E.coli系统的pFLAG-MAC(Sigma)表达载体会被使用，是由于其从细菌细胞质容易纯化重组蛋白质。在这个氨端flag(标志的)-tagged载体中，人类纤调蛋白聚糖cDNA插入物被tac启动子所驱动且假若需要，在融合蛋白中的flagtag(标志物)可以利用肠动酶来除去。与在哺乳动物系统中的相同，用于构成物纤调蛋白聚糖调全长编码cDNA的片段通过从人类成纤维细胞的总RNA RT-PCR放大。纤调蛋白聚糖表达质粒的最后构成物为pFLAG-MAC-H FM，更进一步通过选择性限制消化作用以及DNA的测序来证实。 

E.coli菌株BL21被用来产生重组人类纤调蛋白聚糖。阳性菌落(positive colony)的变形及选择在标准的方案下进行。具有大约2.0的OD600的大规模细菌培养物利用在5000xg下离心10分钟收获。细菌细胞以CelLytic B溶菌(lysis)以5微克/毫升DnaseI补充的缓冲液来细胞溶解。重组人类纤调蛋白聚糖经由用3XFLAG竞争洗脱的anti-flag琼脂糖珠的亲和层析法来纯化。重组人类纤调蛋白聚糖的纯度以及分子量由Western印迹来确认。重组人类纤调蛋白聚糖键结到转化生长因子-β以及碱性成纤维细胞生长因子的能力利用ELISA结合分析方法来确认。若是需要，重组人类纤调蛋白聚糖的亲水性flag肽容易利用肠激酶以消化作用除去。 

原核细胞(prokaryotic cell)中单个基因的重组表达

构建包含感兴趣的基因的载体用于晚期插入到原核细胞中，可以使用启动子(例如T7)或Lac启动子来引发高转录效率。将有潜在亲和性结合序列例如组氨酸亲和性标记插入到具有蛋白酶裂解位置的N-端。可以插入额外的序列例如麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein)来提高溶解(Hidebrand A，Romaris M，Rasmussen LM，Heinegard D，TwardzikDR，Border WA，Ruoslahti E.Interaction of the small interstitial proteoglycansbiglycan，decorin and FM with transforming growth factor beta.Biochem J 302(Pt2)：527-34，1994)。 

真核细胞(eukaryoti cell)中单个基因的重组表达

真核系统例如酵母、杆状病毒(baculovirus)、以及哺乳类系统都可以进行基因产物的翻译后修饰。在酵母中可以使用强大的启动子例如AOXI，或是在哺乳类动物细胞中可以使用巨细胞病毒(CMV)启动子来引诱高转录效率，在翻译产物的N或C端可以插入亲和性标记。也可以在N-端插入分泌序列来提高所需的重组分子分泌到细胞培养基中的分泌作用。 

通过已注册的商业公司使用生物工程植物系统也可以进行重组蛋白质的大规模表达 (例如www.VentriaBio.com)。 

flag-tagged人类纤调蛋白聚糖(HFM)以及人类饰胶蛋白聚糖(HDC)的结合试验(Binding assay of flag-tagged human(HFM)and decorin(HDC))

平底多孔组织培养盘用用人类重组转化成长因子β(Sigma)或是人类重组碱性成纤维细胞生长因子(Sigma)涂覆缓冲液(0.5mM碳酸钠缓冲液，PH9.3)中稀释到0.5微克/毫升且在4℃下静置隔夜。之后，倍涂覆的孔洞被倒空且200微升的结合缓冲液(50mMTris/HCI，PH7.4，150mM NaCl，2％BSA and 0.05％Tween20)被加入每一涂覆的孔洞中，在37℃下保温(incubation)2小时，以阻断非一特定异性的结合位置。孔洞被清空且以清洗缓冲液(磷酸盐缓冲液(PBS)，0.1％Tween20)整个填入的方式清洗三次，之后，向下轻弹且倒过来拍打内含物三次在一纸巾上。从质粒转染的CHO-K1细胞得到的亲和性纯化的flag-tagged人类纤调蛋白聚糖及饰胶蛋白聚糖(decorin)被加入在每一孔洞具有100微升的结合缓冲液中且在37℃保温1小时后在4℃下隔夜静置。孔洞与之前相同的方式被清空及清洗，且利用每孔洞100微升的anti-flag biotinylated M2 mAb(Sigma)保温，其中anti-flag biotinylated M2 mAb(Sigma)是在室温下以1微克/毫升稀释于TBS-Ca缓冲液(50mM Tris/HCI，pH7.4，150mM NaCl，and 1mM CaCl2)中1.5小时。孔洞又依照之前的方式清洗及清空，且100微升/孔洞检测的抗生蛋白链菌素Streptavidin-HRP(Dako Corp.)在室温下被保温另一个1.5小时。孔洞被清洗四次且被完全清空然后加入100微升/孔洞的显色缓冲液(developing buffer)(100μg/ml四甲基联苯胺，H2O2浓度为0.003％的乙酸钠缓冲液，pH6.0)。显色15-30分钟生成后加入100微升的1当量浓度的盐酸溶液于每一个孔洞停止反应。纯化的人类纤调蛋白聚糖以及饰胶蛋白聚糖(decorin)键结到表面一固定化的(surface-immobilized)hrTGF-betal或是hrbFGF上的能力，藉由使用ELISA分析仪(Fisher)在450nm的吸收值下检测。全部的试验一式三份进行。从原本的CHO-K1细胞得到的旗帜一标志细菌碱性磷酸酶(flag-tagged bacterialalkaline phosphatase)(BAP-Flag)(Sigma)以及纯化的溶解产物(lysate)被作为阴性对照。 

转化生长因子-β结合能力在450nm下的读数(分成三组) 

Blank(空白)    0.121，0.111，0.113 

ConL(对照)     0.151，0.163，0.164 

BAP            0.120，0.137，0.130 

HDC            0.205，0.207，0.206 

HFM            0.787，0.722，0.741 

碱性成纤维细胞生长因子结合能力在450nm下的读数(分成三祖) 

Blank(空白)    0.123，0.107，0.123 

ConL(对照)     0.207，0.242，0.198 

BAP            0.138，0.120，0.122 

HDC            0.233，0.282，0.244 

HFM            0.796，0.729，0.763 

HSM结合到转化生长因子-β上在先前技术中已被详细描述，但在先前技术中不知道人 类纤调蛋白聚糖同样能够结合到碱性成纤维细胞生长因子上。HSM结合到碱性成纤维细胞生长因子的这种能力有被特别的注意，因为碱性成纤维细胞生长因子与角质素(keratan)硫酸盐(sulfate)小亮氨酸一丰富的蛋白聚糖例如纤调蛋白聚糖间的交互作用还未被讨论过。直至今日，唯一已知的在小亮氨酸一丰富的蛋白聚糖与碱性成纤维细胞生长因子间的交互作用是与存在于饰胶蛋白聚糖上的皮肤素硫酸盐部分的交互作用(dermatansulfate moieties)，而不是与decorin核心蛋白质本身(Zamifir A，et al.，Glycobiology.13：733-742，2003)。由于碱性成纤维细胞生长因子对于成纤维细胞亦为一种强力的有丝分裂原(mitogen)，因此纤调蛋白聚糖结合到碱性成纤维细胞生长因子的能力可被特别的使用在治疗过多成纤维细胞增生如疤痕的状况的方法，或是治疗过多黑色素细胞增生或活性(如在色素沉淀中)。更者，由于紫外线辐射导致碱性成纤维细胞生长因子的产生，且碱性成纤维细胞生长素已被知道可以刺激胞浆素原活化剂和促进细胞外基质的分解的胶原酶活性(回顾于Abraham JA and Klagsbrun M.Modulation of wound repair of membersof the fibroblast growth factor family.Ed.Clark RAF.The Molecular And CellularBiology Of Wound Repair.Vol.Xxiii.New York：Plenum Press，pp.195-248，1996)，因此，由纤调蛋白聚糖调节碱性成纤维细胞生长因子的活性也可以预防或减少光老化作用，包含胶原的瓦解。 

在重组表达前的基因修饰

在确定的基因序列的非编码区或非必需区(例如启动子区、非翻译3’区)以及确定的基因序列的编码或必需区中都可以建立变异或基因修饰。所谓「必需」的意思是对于实施其预期的功能的基因是为关键基因的部分。一般进行非编码区中的基因修饰来提高基因的总体转录或翻译效率及提高最终蛋白质产物纯化的容易度-这些变化一般不影响基因的功能特征。相反地，编码区基因的修饰通常被用来作为修饰翻译的产物以增强或减弱基因的期望功能的目的(例如对于目标分子改变亲和性、改变肌肤渗透特性、改变翻译后加工、改变分子的半衰期)。对于非编码区或编码区的修饰这两方面的技术在本领域已有详细描述。 

B.小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖 

小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖(SLRPs)为具有不同功能的一类化合物，其可用来增加皮肤的再生。虽然纤调蛋白聚糖已被提到可用来减少皮肤的结疤和伤口的收缩，但是由定义可知道这些状况是会由于皮肤的受伤发生的。有很多例子叙述纤调蛋白聚糖或等效物的应用可期望改善皮肤的状况，其并不涉及减少皮肤的结疤或是伤口收缩的要求。 

a)对于完整的老化皮肤的治疗来改善皮肤的再生

在先前技术中已知道饰胶蛋白聚糖(decorin)可以改善老化皮肤的外观。但是就如同前述所提及的，饰胶蛋白聚糖decorin及纤调蛋白聚糖是具有不同功能的不同类的小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖。另外，无纤调蛋白聚糖小鼠并没有很明显的皮肤缺陷且在非胎儿的皮肤中有最小的纤调蛋白聚糖表达。因此，纤调蛋白聚糖在胶原组织化及皮肤的再生中具有这样的中心角色是完全意外的新的发现。 

虽然在先前技术中已经叙述，藉由缀合的亚麻酸(conjugated linoleic acid)、petroselinic acid，以及其他化合物(美国专利第51,602号；美国专利第6,455,057号；美国专利第6,440,434号；美国专利第6,423,325号；美国专利第6,287,553号；美国专 利第6,042,841号)局部的应用，或是饰胶蛋白聚糖decorin在化妆品或皮肤科组合物中的实际使用引起饰胶蛋白聚糖decorin在皮肤中的大量合成，但其中并未提及纤调蛋白聚糖的使用。目前的先前技术是注重在饰胶蛋白聚糖decorin，因为由成纤维细胞所产生的decorin显现出随着年龄增加及光照而减少，还因为decorin在皮肤中的缺少是与皮肤拉伸强度的减少及皮肤脆性有关(Takeda K，et al.，J Cell Physiol.153：450-459，1992；Carrino DA，et al.，Arch Biochem Biophys.373：91-101，2000)。因此当前的几篇专利有特别提到饰胶蛋白聚糖decorin(而不是其他小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖例如纤调蛋白聚糖)来预防或是治疗皮肤的老化。 

从现有的先前技术中可以看到使用纤调蛋白聚糖来改善皮肽的状况是不明显的。例如，如从饰胶蛋白聚糖decorin及肌皮间亲密的关系所预计的，饰胶蛋白聚糖decorin基因剔除的小鼠证实了皮肤明显的脆弱性。同时，纤调蛋白聚糖基因剔除的小鼠如所预期的那样并没有任何可看得见的皮肤反常，且在成人皮肤中只能检测到非常少的纤调蛋白聚糖。更者，在受伤的成人皮肤中，饰胶蛋白聚糖decorin而非纤调蛋白聚糖发生上调，表明饰胶蛋白聚糖decorin的表达与成人非再生修复反应之间相关系是很紧密的。另外，属于不同类小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖的纤调蛋白聚糖和饰胶蛋白聚糖decorin分别结合至胶原分子中不同的区域。 

因此，在早期怀孕胎儿皮肤中再生修复期间，是纤调蛋白聚糖而非饰胶蛋白聚糖decorin的上调可作为有组织的胶原沉积的一个证据(参见图4及图7)，而在晚期怀孕的胎儿皮肤中伴随着瓦解的胶原排列的非再生修复并没有伴随着纤调蛋白聚糖的上调，更令人惊讶的是，通过用纤调蛋白聚糖抗体来单独去除纤调蛋白聚糖已足够阻止有序胶原在正常地显现无疤修复的早期怀孕沉积，而单独加入纤调蛋白聚糖已足够促进在正常显示有疤痕的修复的晚期怀孕胎儿动物中有序胶原的沉淀(图8和图9)。就如同先前的数据所显示的，在无疤痕胎儿伤口中缺少过多的基质累积，第一类胶原mRNA表达在晚期怀孕的伤口中在纤调蛋白聚糖的治疗后减少(图10)。纤调蛋白聚糖应用在成人伤口亦显著增加整体的皮肤结构以及胶原的组织化(图11)。此证实了本发明使用从胎儿组织中得到的化合物来改进皮肤的状况的方法，或是经由胎儿组织来鉴定此化合物的方法，可应用到成人的皮肤上。 

b)有表皮伤口的非完整皮肤的治疗 

饰胶蛋白聚糖decorin或是等效化合物例如纤调蛋白聚糖的使用，用来预防皮肤的结疤或是伤口的收缩已经在先前技术中有详细描述。疤痕为纤维状的或是结缔组织的沉积，按照定义它只在皮肤受伤之后发生。皮肤受伤启动了伤口愈合的级联反应，其包括止血、发炎、增生、以及重建(recomdeling)。正常皮肤伤口的修复以成纤维细胞的结缔组织的沉积以及肌原成纤维细胞(myofibroblasts)的伤口收缩为特征，其最后会导致疤痕的产生(Mast BA.The skin.In wound Healing：Biochemical and Clinical Aspects.Eds.Cohen KI，Diegelmann RF，lindblad WJ.Philadelphia：WB Saunders Company，P.344-355，1992)。例如，在美国专利第6509314号中提到了“肌肤的结疤是一个各种皮肤损伤之后的过程，其会导致过量的纤维组织包含胶原、织连蛋白(fibronectin)、以及蛋白聚糖的累积。纤维基质累积的诱发是血小板及发炎细胞在伤口的位置释放生长因子的结果。诱发纤维疤痕组织沉积的主要生长因子为转化生长因子-β，饰胶蛋白聚糖Decorins会结合并和不同的TFG-β的生物功能，包含诱发细胞外基质”。 

相反地，单独的表皮伤口并不会留下疤痕或是导致伤口的收缩。部分具有厚度的伤口例如擦伤或是表面的烫伤并不会穿过真皮，因此既不是纤维组织或过量的结缔组织沉积(例如疤痕)，亦不是伤口的收缩在上皮痊愈中扮演一个角色(Mast BA.The skin.In WoundHealing：Biochemical and Clinical Aspects.Eds.Cohen KI，Diegelmann RP，LindbladWJ.Philadelphia：WB Saunders Company，p.344-355，1992)。因此，正常伤口级联反应的止血、发炎、再生、以及重建的确会发生，因为首先，在表皮中没有血管可以受伤。然而，表皮的受伤或是刺激可以开始发炎的反应，其会影响在上皮层中所包含的黑色素细胞及蓝格罕式细胞。黑色素细胞的刺激及/或受伤会刺激或是中断由黑色细胞产生色素的过程，黑色素细胞产生色素的过度刺激会导致表皮或是真皮的过多色素沉淀，而伤害黑色素细胞会导致过少色素沉淀。过多色素沉淀及过少色素沉淀的过程，直接与黑色素细胞产生色素有关，且分别与由成纤维细胞产生胶原及其他细胞外基质成分及肌原成纤维细胞介导的疤痕的形成及伤口的收缩的过程完全不同。由于与色素问题有关的疤痕的形成或是伤口收缩是为完全不同的机制，因此使得用纤维蛋白聚糖来治疗与表皮发炎或是受伤相关的潜在并发症在先前技术中并不明显。 

c)促进胶原的有序化的治疗

在特别强调完整的皮肤时，胶原组织化的促进可能被使用来治疗无序胶原形成的状况，例如由时间老化或是由光老化。在特别强调非完整的皮肤时，胶原组织化的促进可能被使用来治疗无序胶原形成的状况，例如真皮的结疤。 

就如同之前所提及的，使用饰胶蛋白聚糖decorin或是等效分子例如纤调蛋白聚糖，可防止真皮的结疤(美国专利第5,654,270号；美国专利第6,509,314号)或是伤口的收缩，如同在先前技术中所描述的(美国专利第5,510,328号；美国专利第5,851,994号)。 

因此，先前技术教示了过量第纤维基质累积是疤痕的主要成分，其基本上由转化生长因子-β所介导。更者，先前技术教示了由饰胶蛋白聚糖decorin或是相关的分子来改善疤痕，基本上与调节转化生长因子-β活性的能力有关。因此，先前技术教示了饰胶蛋白聚糖decorin或是相关的分子会调节细胞外基质累积的量。这个细胞外基质累积量的减少，将会帮主以过多纤维沉积作为特征，例如血管球性肾炎(glomerulonephritis)及真皮的疤痕，作为病理学上特殊疾病的治疗。然而，单单减少细胞外基质量，甚或单单抑制转化生长因子-β活性并不足够完全地消除疤痕。这是由于虽然转化生长因子-β已被知道对细胞外基质的产生具有直接的影响，但并不知道它对细胞外基质的组织化有什么作用。 

转化生长因子-β是一类多功能的细胞因子，其对于细胞成长和分化、胚胎发生、免疫调节、发炎及伤口的愈合尚有广泛的作用(Border WA，et al.，Kidney International.Supplement.49：S59-61，1995)。就皮肤的修复而言，转化生长因子-β1及转化生长因子-β2已知可以促进疤痕的的形成，但TFG-β3可减少疤痕(LinRY，et al.，Ann Surg.222：146-154，1995；Shah M，et al.，J Cell Sci.108(Pt 3)：985-1002，1995)。转化生长因子-β已认为与个体发生的从具有最小发炎反应的胎儿型态的无疤痕修复向具有显著增加的发炎反应的成形态的非再生性的修复的转移有关。具有疤痕的成人型修复是以过多量及低质的基质沉积来作为特征。许多策略被设计来中和转化生长因子-β1，包括抗转化生长因子-β1及转化生长因子-β2抗体，反意转化生长因子-β1寡脱氧苷酸(oligodeoxynucleotides)及病毒性基因疗法，其已被证实可减少但不是完全消除在成年动物中形成的疤痕(Choi BM，et al.，Immunol Cell Biol.74：144-150，1996；Shah M，et al.，Lancet.339：213-214，1992；Shah M，et al.，J Cell Sci.107(Pt5)：1137-1157，1994；Isaka Y，et al.，Nat Med.2：418-423.，1996；Elepfandt P，et al.，Neurosci Lett.322：107-110.2002)。这表示了在细胞外基质中单独抑制转化生长因子-β的活性伴随与之相关的ECM量的减少，并不足以完全消除疤痕。 

已经证实，对于无疤痕胎儿修复，以不足的转化生长因子-β1表的来作为一个单一机制是过分的简单化。此亦证实了即使是无疤痕E16伤口也显示了在受伤后初始时的转化生长因子-β1及转化生长因子-β2的上调(Soo C，et al.，Am J Pathol.In press)。更者，虽然转化成长因子-β被广泛的认为是一种可增加细胞外基质数量的促纤维化的肽，但是，没有数据可以指出转化生长因子-β可以直接的影响细胞外基质的品质或组织化作用。这提示着直接参与细胞外基质结构及组织化作用的其他因子，亦可能对于再生的胎儿细胞修复是重要的。 

然而，有一些并不一定与皮肤受伤相关的其他状况，其亦导致纤维性结缔组织的沉积。一个例子是全身性硬化症(systemic sclerosis)，这是一个主要由于第一类及第三类胶原过量地沉积引起的一种结缔组织的疾病，是以皮肤皮下组织及内部的器官的纤维样变性来作为特征(Kuroda K，and Shinkai H.，Arch Dermatol Res.289：481-485，1997。) 

因此，先天或是后天的畸形胶原结构或是组织，会导致各种组织的功能障碍。例如在导致畸形胶原结构的胶原分子本身的突变，会发生各种天生疾病综合症，例如群软骨错生，骨骼发育不完整、先天结缔组织异常疾病、或是表皮分解性水泡症(epidermolysisbullosa)(回顾于(Gelse K，et al.，Adv Drug Deliv Rev.55：1531-1546，2003)，而调节胶原细纤维生成的小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖的变异，会发生各种畸形的发生，例如骨关节炎(这是一种Danlos样的表型(danlos-like phenotype))、肌肉失养症、以及角膜的疾病(Ameye Lound Young MF，Glycobiology，12：10FR-116R，2002)。同时，受伤或疾病会导致得到后天的胶原结构的降解，之后，则会产生更多的疾病。在这些例子中，无序化的胶原即可被总称为-「疤痕」。疤痕的生成对很多人类疾病，包含肝硬化、肺纤维化、及贫血性心脏疾病的发生(pathogenesis)是关键性的。 

有两种不同的过程会导致疤痕的产生，其中一个是基质的累积，没有基质的累积基本上不会有物质可以形成疤痕。只要过量的基质沉积就会有疤痕的形成，甚至于不需要引起受伤。例如，在肾脏中的血管球性肾炎的一个转化生长因子-β的模型是以过量的细胞外基质累积作为基础，其破坏了基质沉积以及退化之间的平衡。另一个例子是全身性硬化症，它是以皮肤、皮下组织和各种内部器官的纤维样变性为特征的一种结缔组织疾病，其原因主要是由于第一类及第三类胶原的过量沉积。其他会导致疤痕的过程是为基质组织化的缺少。 

据此，有两种方法来治疗疤痕，其中之一为减少基质的累积，另一为增加基质的组织化。然而，疤痕形成的减少是不只包含基质累积的减少。因此，可以认为是累积基质的有序化模式比基质数量本身还要重要。此可以试验的证据来支持，即利用抗转化生长因子-β抗体单独中和转化生长因子-β是为伤口但不足以消除疤痕。因此，与转化生长因子-β介导基质的累积无关的其他机制在无疤痕修复中是重要的。 

其他蛋白聚糖的饰胶蛋白聚糖decorin家族已知的功能包括对胶原微纤维形成的体外(invitro)效应。然而，即使是体外的，其有很多明显不同的作用。例如饰胶蛋白聚糖 decorin及纤调蛋白聚糖以不同的位置在胶原分子上互相作用。同时在体内，小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖基因剔除的动物证实了不同的形态学，表示了在体内小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖不同功能及组织分布。例如，纤调蛋白聚糖基因剔除的小鼠皮有可察觉的皮肤异常，且在皮肤中仅检测到极少量的纤调蛋白聚糖。与饰胶蛋白聚糖(decorin)相反，FM在非再生型态的修复期间并未被提高。 

因此，此令人惊讶及新的方面是在胎儿的再生修复期间的令人惊讶的纤调蛋白聚糖上调，及以有疤痕的非再生修复期间的纤调蛋白聚糖的缺乏。更令人惊讶的甚至是在成人及晚期怀孕期动物中随着非再生修复的饰胶蛋白聚糖decorin上调。更者，更令人惊讶的是，单独去除纤调蛋白聚糖已足够在胎儿动物中阻止组织化胶原的沉积，单独的加入纤调蛋白聚糖已足够促进组织化胶原的沉积。 

完整或是非完整皮肤的治疗以减少发炎反应

本发明的一新颖之处是为迄今为止未被认识的事件序列，即饰胶蛋白聚糖decorin及双链蛋白聚糖biglycan的调节可调节肿瘤坏死因子TNF-α(其为一种参与多种炎性皮肤状况的主要炎性细胞因子)，以及在饰胶蛋白聚糖decroin或是双链蛋白聚糖biglycan上的皮肤素硫酸盐部分的调节可调节白血球增多(白血球增多是炎性反应的主要组成)。因此，饰胶蛋白聚糖decorin、双链蛋白聚糖biglycan、及/或相关的肤素硫磺盐部分的调节，会影响与完整或非完整皮肤有关的大量的发炎状况。例如，中度的暴露在紫外线辐射下(例如晒伤)及皮肤的摩擦或是搔痒是导致完整性表皮(完整皮肤的定义)没有破坏情况下的皮肤发炎的例子。可能伴随着完整或是非完整皮肤的其他炎性皮肤状况的例子包括但不限于非过敏性皮肤发炎的状况、过敏性皮肤发炎的状况、紫外线辐射导致地皮肤发炎的状况、神经性皮肤发炎的状况、或是其他皮肤发炎的状况。因此包含一种或多种小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖及/或酶用来调节糖胺聚糖(例如皮肤硫酸盐)的组合物，可被用于治疗皮肤炎性状况。本发明的较佳实施例包括饰胶蛋白聚糖decorin及/或软骨素酶B。 

完整或是非完整皮肤的治疗用来减少过多色素沉淀

本发明的一个新颖之处为迄今为止未被认知的事件序列，即饰胶蛋白聚糖decorin及纤调蛋白聚糖的调节可调节碱性成纤维细胞生长因子(其为一种强力的黑色素细胞有丝分裂原)并调节肿瘤坏死因子TNF-α(其为一种主要的炎性细胞因子)。本发明的另一新颖之处为迄今为止未被认知的事件序列，即饰胶蛋白聚糖decorin或是双链蛋白聚糖biglycan之上的相应的肤素硫酸盐部分的调节可调节白血球增多(一种炎性反应的主要成分)以及调节碱性成纤维细胞生长因子的活性。 

虽然本发明并不希望受限于任何特定的理论，但碱性成纤维细胞生长因子活性的调节可藉由通过使用酶如软骨素酶B来调节饰胶蛋白聚糖decorin或纤调蛋白聚糖水平或皮肤素硫酸盐水平，这会直接影响碱性成纤维细胞生长因子介导的黑色素细胞增生。另外，碱性成纤维细胞生长因子的活性的调节亦会调节干细胞因子的活性，干细胞因子对于黑色素细胞的增生及黑色素的产生是一个强力的诱导剂。更者，表皮的伤害或是刺激会引发炎性反应，其也可能刺激黑色素细胞并导致过多的黑色素沉淀，或伤害黑色细胞并导致黑色素细胞的死亡以及过少的色素沉淀的情形。通过调整肿瘤坏死因子-a来减少发炎的能力，可能会减少对黑色素标的刺激或是伤害，并相关的减少可能的过多色素沉淀或过少色素沉淀。 

虽然某些小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖，例如饰胶蛋白聚糖decorin、双链蛋白聚糖biglycan、以及纤调蛋白聚糖键结到转化生长因子-β的能力已经在先前技术中的在肾脏中减少细胞外基质堆积的文章中有清楚的描述，但转化生长因子-β并未被暗示与过多色素化的问题有关。事实上，TFG-β1会强烈的抑制正常黑色素细胞的增生及DNA的体外合成(Krasagakis K，et al.，Anticancer Res.14：2565-2571，1994)。另外，过多色素沉淀为一种与疤痕形成完全不同的过程。疤痕的产生涉及藉由成纤维细胞所制造的纤维组织的过量累积，且会伴随表皮层的受伤而发生。相反地，过多色素沉淀涉及由黑色素细胞产生并沉积过多的黑色素，且有或没有伴随着皮肤实际上的受伤。假使与皮肤的受伤有关，通常会伴随着炎性成分。假使对于完整性皮肤并没有实际上的伤害，则可能存在或不可能存在炎性成分，这与暴晒在紫外光辐射下的程度有关。因此，疤痕的形成是以真皮的受伤为前提，而过多色素沉淀则可能有关或无关于皮肤的发炎或是皮肤的受伤。 

本发明的一个实施例是使用于痤疮的伤口及昆虫的叮咬，其会在一些特定的种族，例如亚洲人、拉丁人、黑人中起显著的高色素沉积。本发明的另一个实施例可应用在皮肤炎性状况而产生的可能的过多的色素沉淀，其包括但不限于非过敏性皮肤炎性状况、过敏性皮肤炎性状况、神经性皮肤炎性状况、紫外线辐射导致的皮肤炎性状况、或其他皮肤炎性状况。 

C.纤调蛋白聚糖(FM) 

本发明的一方面是一种组合物，其包含纤调蛋白聚糖且可用来促进皮肤的再生。纤调蛋白聚糖为胎儿组织所表达的几个组分中的一个，是一种小亮氨酸-丰富的蛋白聚糖，其明显地改善皮肤中真皮层胶原的组织化，且无皮肤刺激的情形发生。当局部地应用纯化的纤调蛋白聚糖或是纤调蛋白聚糖富集的细胞萃取物(FM enriched cellular extracts)时，皮肤的状况会在不受刺激下得到改善。事实上，纤调蛋白聚糖的应用会导致皮肤发炎症状以及发炎的细胞因子表达的明显减少。虽然，纤调蛋白聚糖被使用来作为减轻严重的皮肤受伤有关的真皮疤痕的产生在先前技术已有描述(参见美国专利第5,654,270号及第5,510,328号)，但时目前的技术对于在新的化妆品上、或是药学上使用纤调蛋白聚糖或是等效的化合物改善非发炎的皮肤状况并未加以叙述。此外，先前技术也没有叙述FM或等效分子的新的化妆品或药物用来减少皮肤发炎和高色素沉淀的应用。 

在本发明的一个代表性实施例中，由胎儿组织所表达的特定的化合物，例如纤调蛋白聚糖可从天然的组织(野生型)中，或由一适当的表达媒介例如细菌或是酵母(有或没有编码区修饰的重组形式)分离出来，之后，配置成改善皮肤状况的化妆品组合物。有关具体组织组合物的更详细说明描述请参见在此提供的实施例。下面的描述在于说明，但不限制本发明的范围。 

使用纤调蛋白聚糖来促进皮肤的再生的可以是野生型或是重组型纤调蛋白聚糖。纯化的野生型纤调蛋白聚糖蛋白质可由商业化的来源购得(Sigma-Aldrich Corp.，StLouis，M0)。重组型FM是由将纤调蛋白聚糖cDNA(最佳是为人类的)克隆到一个适当的表达载体(例如质粒、线病毒)而获得。人类纤调蛋白聚糖cDNA在本领域是为公知的(基因库的登陆号码X75546)。 

在本发明的一实施例中，在重组表达之前也可以利用在本领域公知的技术对重组纤调蛋白聚糖cDNA的编码序列进行基因修饰以增强特异性的特征。定位突变(site-sepecific mutagenesis)可藉由使用寡聚核苷酸(oligonucleotide)引物(primer)，来增加蛋白质对其受体的结合亲和力。另外，可以加入亲水性及分泌序列(secretory sequence)例如Ig Kappa-链或组氨酸及GST标记序列来提高纯化效率。亦可利用本领域中公知的技术重组纤调蛋白聚糖cDNA的非编码区进行基因修饰以增强特异性的特征。例如，天然哺乳动物启动子不足以有效地产生大量地的蛋白质。在此种情况下，可以将CMV和SV40启动子插入到哺乳动物体系中来提高转录效率。另外，可以在3’一端加入SV40或β一珠蛋白聚A序列来提高稳定性和蛋白质产生效率。 

本发明的另一实施例中，可从非基因修饰细胞或基因修饰细胞分离纤调蛋白聚糖。细胞和组织培养的方法，以及获得细胞溶解产物或萃取物的方法在现有技术中已有详细描述，且本领域的技术人员可实施(更多咨询请参阅Pollard JW，Walker JM.Basic CellCulture protocols，2nd ed.Humana Press，Totowa，N.J，1997)。富集了纤调蛋白聚糖的细胞培养基可以被分离且经加工得到上清液。这里的加工对于本领域的技术人员是显而易见的，包括(但不限于)上清夜的浓缩，从上清液中纯化特定化合物和上清液的灭菌。这些方法应该保证由胎儿组织所表达的化合物的最理想的生物活性的保存。此外，防腐及其他促进灭菌的努力亦是令人满意的。 

本发明的代表性实施例亦可能包含，但不限定透明质、细胞外基质肽或是多肽、生长因子、L-抗坏血酸、或是碳水化合物部分例如乳糖-1-磷酸(lactose-1-phosphate)、麦芽糖-1-磷酸(maltose-1-phosphate)、甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosphate)及乳糖-6-磷酸(lactose-6-phosphate)。要明白，术语透明质酸包括其衍生物且广义的指由葡萄糖醛酸(glucuronic)和N-乙酰-D-葡萄糖胺残基所构成的天然存在的、微生物产生的、及合成衍生物的各种分子量的酸性多糖。透明质酸已经被描述为使用在保养皮肤组合物中的一种皮肤调节剂(参见美国专利的6,444,647号)。亦相信透明的酸在胎儿组织再生中有着重要的作用(Burd DA，Greco RM，Regauer S，Longaker MT，Siebert JW，GargHG.Hyaluronan and wound healing：a new perspective.Br J Plast 44：579-84，1991)。单糖碳水化合物部分例如乳糖-1-磷酸、麦芽糖-1-磷酸、甘露糖-6-磷酸、及乳糖-6-磷酸已经被描述为在预防或减少发炎的反应是有用的。(DiCorleto PE，and de la Motte CA.，J Immunol.143：3666-3672，1989；Crestani B，et al.，Am J Physiol.264：L391-400，1993；Bartlett MR，et al.，Immunol Cell Biol.72：367-374，1994；Davis RH，et al.，J Am Podiatr Med Assoc.84：77-81，1994)。 

在本发明的一个实施例中，透明质和由胎儿组织所表达的化合物一起用于皮肤保养的目的且加强包含胎儿组织表达的化合物的化妆品护肤组合物的作用。一个具有代表性的护肤组合物可能包含，例如，从大约0.1％(重量)到10％(重量)的透明质酸。 

D.剂量 

被包含在此所描述的组合物中的由胎儿组织所表达的化合物的量，随着哺乳类动物皮肤状况而有所变化。一般而言，组合物及重量的范围是依据某些因素来决定，包括：化合物的分子重量、化合物的纯度、化合物的生物活性及化合物的降解曲线。例如，酶、生长因子及细胞因子为相对小的分子。因此，对于已知的重量其会显现出相对高的生物活性，然而，生长因子及细胞因子在任何缺乏保护的传送传播媒介中亦容易被降解。因此，在缺乏输送介质的环境中为了其生物学功效，必须以较高的重量剂量来提供。相反地，其他分子例如可能具有细胞外基质结构功能的胶原或是蛋白聚糖，其一般是以对于已知分子可能 有较少的生物活性而比较大，且对于降解有更大的抵抗力。因此，其他的化学物例如胶原或是蛋白聚糖，其可能以较高或较低的重量的剂量来提供，依据在上述所提的因素来决定。在一个实施例中，组合物可能包含纯化的蛋白聚糖大约0.0001％(重量)至大约10％(重量)，及细胞溶解产物、萃取物、或是具有富集的蛋白聚糖化合物的培养基大约0.1％(重量)到大约80％(重量)。在另一个实施例中，组合物可能包含纯化的酶或生长因子化合物大约0.0001％(重量)到大约10％(重量)，或是纯化的酶或生长因子化合物大约0.000000001％(重量)到大约0.0001％(重量)，以及细胞溶解产物、萃取物、或是具有富集的酶或生长因子的培养基大约0.1％(重量)到大约80％(重量)。在另一个实施例中，组合物可能包含大约0.001IU/毫升到大约1IU/毫升的纯化的酶化合物，或是大约IU/毫升到大约1000IU/毫升的纯化的酶化合物。 

E.附加的护肤活性物质

本发明的组合物可以含有安全而有效量的一种或多种附加的护肤活性成分，选自但不限于脱皮活性成分(desquamatory actiyes)、抗粉刺性活性成分、视黄酸类物质、羟基酸、肽、多肽、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、自由基清除剂、螯合剂、抗炎剂、局部麻醉剂、晒褐活性物质、皮肤增白剂、抗蜂窝织炎剂、黄酮类物质、抗微生物活性物质、润肤剂，皮肤修补剂、抗真菌活性物质。防晒活性物质、调理剂、结构剂、增稠剂及其混合物。所述附加的护肤活性物质的量可随着要加以调节的具体的皮肤状况而改变。在一个实施例中，组合物可包含0.000001％(重量)——10％(重量)的至少一种附加的护肤活性物质。 

本发明的一个代表性实施例中，组合物要接触人类角质组织，附加成分应该适合角质组织施用，亦即当混入到组合物中时，它们适合接触到人类的角质组织但在合理医药判断范围内不具有过度的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等等。CTFA化妆品成分手册第二版(1992年)描述了很多种非限制性护肤常使用的化妆品成分和医药成分，其适合在本发明的组合物中使用。这些成分的类别包括，例如研磨剂、吸收剂、美感成分例如香味剂、颜料、着色剂/色料、精油、皮肤感觉物质、收敛剂等(例如丁子香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、子丁香酸、乳酸薄荷脂、榛树蒸馏产物)、抗粉刺物质、抗结剂(anti-cakingagents)、消泡剂、抗微生物剂(例如丁基氨基甲酸碘代丙酯(iodopropylbutylcarbamate))、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、化妆品收敛剂、化妆品杀虫剂、变性剂、药物收敛剂、外部止痛剂、有助于组合物的成膜性质和实质性(例如二十碳烯和乙烯基比咯烷酮的共聚物)的成膜剂或材料(例如聚合物)、不透明剂、PH调节剂、推进剂、还原剂、多价螯合剂、皮肤漂白剂和光亮剂(例如氢琨、曲酸、抗坏血酸、磷酸抗坏血酸镁、抗坏血酸葡糖胺)、皮肤调理剂(例如包括各种各样和闭塞的湿润剂)、润肤剂/或恢复剂(例如泛醇(panthenol)及其衍生物(例如乙基泛醇)、芦荟、泛酸及其衍生物、尿囊素、没药醇(bisabolol)，及甘草酸二钾)、皮肤治疗剂、增稠剂、和维生素及其衍生物。 

然而，在本发明的任一实施例中，籍由它们所提供的利益或是藉由它们假设的作用模式，能将此有用的活性成分分类。但是，要明白在此有用的活性成分在某些状况下能提供一个以上的优点或是藉由一个以上的作用模式作用。因此，在此的分类只是为了方便起见，并非要将活性物质限制到特定的应用或是所列出的应用上。 

脱屑活性成分

可以向本发明的组合物中加入安全而有效量的脱屑活性成分，较佳者大约0.1％至大约10％，更佳者为大约0.2至大约5％，另一更佳者为大约0.5％至大约4％，其是以组合物的重量来计算。 

将脱屑活性成分提高是受益于本发明的皮肤外观，例如，脱屑活性成分是为了改善皮肤的纹理(例如光滑感)。一种适合在本发明中使用的脱屑系统，是含有基化合物和两性离子表面活性剂，并且描述于Bissett的美国专利第5681852号中，其用于此是作为参考。另一种适合在本发明中使用的脱屑体系含有水杨酸和两性离子表面活性剂，并且描述于Bissett的美国专利第5652228号中，其用于此是作为参考。在此所描述的两性离子表面活性剂，亦可在本发明中以特别挑选的鲸腊基甜菜碱(cetyl betaine)作为脱屑剂。 

抗痤疮活性成分

本发明的组合物可以含有安全且有效量的一种或是多种抗痤疮活性成分，有用的抗痤疮活性成分包括间苯二酚、硫磺、水杨酸、过氧化苯甲酰、红霉素(erythromycin)、锌等。适合的抗痤疮活性成分的例子进一步详细描述在McAtee等在1997年3月4日公开的美国专利第5607980号中。 

抗皱纹活性成分/抗萎缩活性成分

本发明的组合物可进一步含有安全且有效量的一种或多种抗皱纹活性成分或是抗萎缩活性成分。适合在本发明的组合物中使用的抗皱纹活性成分或是抗萎缩活性成分的例子包括含硫的D和L氨基酸及其衍生物以及盐类，特别是N-乙酰衍生物，其具有代表性的例子是为N-乙基-L-半胱氨酸、硫醇(例如乙硫醇)、羟基酸(例如α-羟基酸、例如乳酸和乙醇酸或β-羟基酸、例如水杨酸和水杨酸衍生物例如辛酰(octanoyl)衍生物)、植酸、硫辛酸、溶血磷脂酸、脱皮剂(例如苯酚等)、以及可增加在本发明的角质组织外观受益，特别是强调角质组织状况的视黄素类。 

在此所使用的「视黄素类」包括所有天然的及/或合成的维生素A类似物或是在肌肤中具有维生素A的生物活性的类似视黄醇类化合物，以及此类物质的立体异构体与几何异构体。 

视黄素类较佳者为视黄醇、视黄醇脂(例如视黄醇C2-C22烷基酯，包括棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯)、视黄醛，及/或视黄酸(包括全反式-视黄酸及/或13-顺式视黄酸)，更佳者为除了视黄酸之外的视黄素类。此些化合物在本领域中是为公知的且可购买到(例如Sigma Chemical Company(St.Louis，Mo.)，及Boerhinger Mannheim(Indianapolis，Ind.))。在此有用的视黄素类是在以下的文献中描述的：Parish等人的美国专利第4,677,120号；Parish等人的美国专利第4,885,311号，Purcell等人的美国专利第5,049,584 to号；Purcell等人的美国专利第5,124,356；and Purcell等人的美国专利再公开第34,075号。其他适合的视黄素类是为维生素E视黄酸酯[视黄酸(反式或顺式)的维生素E酯、阿达帕林{6-[3-(1-金刚烷基)-4-甲氧基苯基]-2-茶酸}，及他佐罗丁(乙基6-[2-(4，4-二甲基硫代苯并二氢吡喃-6-基)-乙炔基]烟酸酯)](adapalene){6-[3-(1-adamantyl)]-4-methoxypheny}-2-naphthoic acid}，及tazarotene(ethyl)6-[2-(4，4-dimethylthiochroman-6-yl)-ethynyl]nicotinate)]。代表性的视黄素类是视黄醇、棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯、视黄醛及其组合。 

较佳的组合物中包含从大约0.005％到大约2％，更佳者大约0.01％到大约2％的视黄 素类。视黄醇使用的量较佳者大约为0.01％至大约0.15％：视黄醇酯使用的量较佳者大约为0.01％-2％(如约1％)；视黄酸的用量为约0.01％至大约0.25；维生素E视黄酸酯、adapalene、tazarotene使用的量较佳者大约为0.01％至大约2％。 

肽/多肽

在此所使用的多于三个但等于或少于34个氨基酸的天然存在的、酶消化的、或合成的氨基酸序列，是称作「肽」。而「多肽」是指多于34各氨基酸的天然存在的、酶消化的、或合成的氨基酸序列。 

本发明的组合物中可含有安全且有效量的肽，包括但不限于二肽、三肽、四肽、五肽及其衍生物，以及细胞外基质的成分例如胶原、弹性蛋白的酶裂解片段。天然存在及在商业上可购得的含有肽的组合物，在此亦也是为有用的。 

当包含于本发明的组合物时，较佳者是以大约1×10^-6％到大约10％，更佳者是以大约1×10^-6％到大约0.1％，最佳者是以大约1×10^-5％到大约0.01％的量含有肽，其是以组合物的重量来计算。在所有含的肽为CARNOSINE的某些组合物中，组合物较佳者包含以组合物重量计算的大约0.1％至大约5％的肽。 

生长因子/细胞因子

虽然藉由胎儿组织所表达的化合物可包括生长因子及细胞因子，但本发明的较佳的实施例中，可包含有安全且有效量，但不一定为由胎儿组织所表达的附加的生长因子及细胞因子。在此所描述的刺激细胞生长的化合物及因子，为对特定细胞株的建立和生长有刺激作用的天然或外生的化合物。这些包括合成代谢生长激素，例如人类生长激素和甲状腺刺激激素，或者作用于特定细胞株例如粒细胞、血小板或红细胞。具体而言，有关于促进表皮生长例如皮肤组织的修复或是伤口的愈合，多种定义为生长因子的因素包括但不限制于：表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、及类似胰岛素生长因子(IGF)。 

抗氧化剂/自由基清除剂

本发明的组合物可以含有安全且有效量的抗氧化剂/自由基清除剂。抗氧化剂/自由基清除剂特别用于提供保护对抗会导致角质曾脱落及纹理变化的紫外线辐射，以及对抗会导致皮肤损伤的其他环境物质的保护作用。可以在本发明的组合物中加入安全而有效量的抗氧化剂/自由基清除剂，较佳者为占组合物的大约0.1％至大约10％，更佳者为大约1％至大约5％。 

抗氧化剂/自由基清除剂可以使用例如抗坏血酸(维生素C)及其盐类、脂肪酸的抗坏血酸酯、抗坏血酸衍生物(例如磷酸抗坏血酸酯镁、磷酸抗坏血酸酯钠、山梨酸抗坏血酸酯)、生育素(维生素E)、山梨酸生育素酯、乙酸生育素酯、生育素的其他酯类、丁基化的羟基苯甲酸及其盐类、6-羟基-2，5，7，8-四甲基可罗满-2-羧酸(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)(可以由商品的TROLOX购得)、没食子酸(gallic acid)及其烷基酯、特别是没食子酸丙酯、尿酸及其盐类和烷基酯、山梨酸及其盐类、硫辛酸、胺类(例如N，N-二乙基羟基胺、氨基-胍(amino-guanidine))、硫氢基化合物(例如谷胱甘肽(glutathione))、二羟基-富马二酸及其盐类、甜菜碱氧脯胺酸盐(lycine pidolate)、精氨酸氧脯氨酸盐、去甲二氢愈创酸、生物类黄酮、薑黄素、赖氨酸(lysine)、甲硫氨酸、脯氨酸、超氧化物歧化脢、水飞蓟素(silymarin)、茶叶萃 取物、葡萄皮/籽萃取物、黑色素、及迷迭香萃取物。更具代表性的抗氧化剂/自由基清除剂选自山梨酸生育素酯、及生育素的其他酯类。更具代表性的是为山梨酸生育素酯。例如，在局部组合物中使用山梨酸生育素酯以及应用苯发明的描述于Donald L.Bissett，RodneyD.Bush and Ranjit Chatterjee的美国专利第4,847,071号。 

螯合剂

本发明的组合物亦可含有安全且有效量的熬合试剂。「螯合剂」或「螯合试剂」意思是藉由形成复合物能从系统中去除金属离子，以使得金属离子不能容易地参与或是催化化学反应的活性试剂。螯合剂的加入特别用于提供保护对抗过度脱落及肌肤纹理变化的紫外线辐射，以及对抗其他环境物质的保护作用。 

安全且有效量的螯合剂可加入在本发明的组合物中，较佳者为组合物的大约0.1％至大约10％，更佳者大约为组合物1％至大约5％。在此示范的有用的螯合剂是描述于Bissett等人的美国专利第5,487,884号；Bush等人的PCT公开号第WO91/16035号；及Bush等人的PCT公开号第WO91/16034号。本发明组合物中使用的代表性的螯合剂为糠偶酰二肟(furildioxime)、糠偶酰单肟(furilmonoxime)，及其衍生物。 

类黄酮

本发明的组合物可以随意选择类黄酮化合物。美国专利第5686082及5686367号清楚地揭露了类黄酮且被用在此作为参考。在此所使用的类黄酮化合物是由许多来源购得，例如Indofine Chemical Company，Inc.(Somervill，N.J.)、Steraloids，Inc.(Wilton，N.H.)，及Aldrich Chemical Company，Inc.(Milwaukee，Wis).类黄酮化合物的混合物亦可被使用。 

在此所描述的类黄酮化合物本发明中的浓度是大约为0.01％到大约20％，较佳者为大约0.1％到大约10％，更佳者为大约0.5％到大约5％。 

抗炎剂

本发明的组合物中可以加入安全且有效量的抗炎剂，较佳是大约为组合物的0.1％至大约10％，更佳者大约为组合物的0.5％至大约5％，此抗炎剂增强本发明的皮肤外观的益处，例如使皮肤色调更为均匀美观。由于抗炎剂在效力上有很大的不同，因此，组合物中使用的抗炎剂精确的量取决于所使用的特定的抗炎剂。 

抗炎剂的例子包括但不限于类固醇抗炎剂及非类固醇抗炎剂。这些化合物是本领域技术人员所公知的，例如，可以参照抗发炎剂标准教科书，包括Rainsford KD(1985)抗发炎及抗风湿病的药物。CRC Press，Boca Raton，Florida，and Scherrer RA，WhitehouseMW(1974)抗发炎药剂；化学及药学，Acadamic Press，New York。 

另外，当作化妆品时，转化生长因子β，或其他主要炎症生长因子的天然的或合成的调节剂也可将发炎症状最小化。(Logan A Frautschy SA，Gonzalez AM，Sporn MB，BairdA.Enhanced expression of transforming growthfactor beta 1 in the rat brain aftera localized cerebral injury.Brain Res 587：216-25，1992；Border WA，Noble NA，Yamamoto T，Harper JR，Yamaguchi Y，Pierschbacher MD，Ruoslahti E.Naturalinhibitor of transforming growth factor-beta protects against scarring scarringin experimental kidney disease.Nature 360：361-4，1992)。 

在一个实施例中，称为「天然的」抗炎剂可用在本发明的方法中。此药剂可从天然的 来源(例如植物、真菌、微生物的副产品)或是经由合成获得，其是经由适当的物理及/或化学的分离以作为萃取物。例如，可以使用小烛树腊(candelilla wax)、没药醇(bisabolol)(例如α没药醇)、芦荟、植物类固醇类(例如植物类固醇)、Manjistha(从Rubia属中的植物，特别是Rubia Cordifolia中萃取)及Guggal(从commiphora属中的植物，特别是commiphora Mukul中萃取)、可药树萃取物、红三叶草(red clover)萃取物、及海鞭萃取物。 

抗蜂窝织炎剂

本发明的组合物亦可含有安全且有效的抗蜂窝织炎剂，适合的药剂包括但不限于黄嘌呤化合物(例如咖啡因、茶碱、可可碱、及胺茶碱)。 

局部麻醉剂

本发明的组合物亦可含有安全且有效量的局部麻醉剂。局部麻醉剂的例子包括苯佐卡因、利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)、氯普鲁卡因(chlorprocaine)、辛可卡因(dibucaine)、依替卡因(etidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、丁卡因(tetracaine)、达克罗宁(dyelonine)、海克卡因(hexylcaine)、普鲁卡因(procaine)、可卡因(cocaine)、氯胺酮(ketamine)、普莫卡因(pramoxine)、苯酚，及药学上可以接受的盐类。 

晒褐活性成分

本发明的组合物可含有晒褐活性成分。当存在时，较佳为含有组合物重量的大约0.1％至大约20％，更佳为大约2％至大约7％，亦更佳为大约3％至大约6％的二羟基丙酮为人造晒褐活性成分。 

二羟基丙酮，也称为DHA或1，3-二羟基-2-丙酮，是白色至灰白色结晶粉末。 

此化合物可以单体和二聚体的混合物存在，固体结晶态中二聚体占优势。加热或融化时，二聚体裂解产生单体。在水溶液中也发生二聚体向单体的转化作用。另外，二羟基丙酮在酸性PH值下更稳定(参见Windholz M，Merck&Co(1983)The Merck index：anencyclopedia of chemicals，drugs，and biologicals，10th ed.Merck，Rahway，N.J，entry 3167，p.463 and“Dihydroxyacetone for Cosmetics”，E.Merck TechnicalBulletin，03-304 110，319 897，180 588)。 

皮肤增白剂

本发明的组合物可以含有皮肤增白剂。当存在时，组合物较佳为含有组合物重量的大约0.1％至大约10％，更佳为大约0.2％至大约5％，最佳为大约0.5％至大约2％的皮肤增白剂。适合的皮肤增白剂，包括本领域所公知的，包括曲酸、熊果素(arbutin)、抗坏血酸、及其衍生物((例如磷酸抗坏血酸镁、磷酸抗坏血酸钠)、及萃取物(例如桑树萃取物、胎盘萃取物))。在此适合使用的皮肤增白剂还包括Hillebrand在PCT所公开的No.WO95/34280，其是于1995年6月12日申请的PCT申请No.U.S.WO95/07432、及Kvalnes，Mitchell A.Delong，Barton J.Bradbury，Curtis B.Motley的美国专利第6,068,834号、及John D.Carter，在PCT申请的No.WO95/23780。 

皮肤舒缓及皮肤愈合活性成分

本发明的组合物可以含有皮肤舒缓或皮肤愈合活性成分。适合在此使用的皮肤舒缓或 皮肤愈合活性成分包括泛酸衍生物(panthenoic acid)(包括泛醇、D-泛酸、乙基泛醇)、芦荟、尿囊素、没药醇(bisabolol、及甘草酸二钾。可在本发明的组合物中加入安全且有效量的皮肤舒缓或皮肤愈合活性成分，较佳为大约为形成组合物重量的0.1％至大约30％，更佳为大约0.05％至大约2％。 

抗微生物和抗真菌活性成分

本发明的组合物中可含有抗微生物或抗真菌活性成分，在此的活性成分可破坏微生物，抑制微生物的生长或防止微生物的病理作用。可以在本发明的组合物中加入有效量的抗微生物或抗真菌的活性成分，较佳为大约为0.001％至大约10％，更佳为大约0.01％至大约5％，最佳为大约0.05％至大约2％。 

抗微生物和抗真菌的例子包括B-内酰胺药物、喹诺酮(quinolone)药物，环丙沙星(ciprofloxacin)，诺氟沙星(norfloxacin)，四环素(tetracycline)，红霉素(erythromycin)，阿米卡星(amikacin)，2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯基醚(2，4，4’-trichloro-2’-hydroxy diphenyl ether)，3，4，4’-trichlorobanilide，苯氧乙醇(phenoxyethanol)，苯氧丙醇(phenoxy propanol)，苯氧异丙醇(phenoxyisopropan)，多西环素(doxycycline)，卷曲霉素(capreomycin)，氯己定(chlorhexidine)，金霉素(chlortetracyclineO，土霉素(oxytetracycline)，克林霉素(clindamycin)，乙胺丁醇(ethambutol)，乙脒定(hexamidine)，羟乙磺酸盐(isethionate)，甲硝唑(metronidazole)，喷他脒(pentamidine)，庆大霉素(gentamicin)，卡那霉素(kanamycin)，lineomycin，美他环素(methacyclie)，乌洛托品(methenamine)，米诺环素(minocycline)，新霉素(neomycin)，奈替米星(netilmicin)，巴龙霉素(paromomycin)，链霉素(streptomycin)，妥布霉素(tobramycin)，咪康唑(miconazole)，盐酸四环素(tetracycline)，hydrochloride，红霉素(erythromycin)，红霉素锌(zincerythromycin)，依托红霉素(erythromycin estolate)，硬脂酸红霉素(erythromycinstearate)，葡糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate)，盐酸氯己定(chlorhexidinehydrochloride)，硫酸卷曲霉素(capreomycin sulfate)，硫酸阿米星(amikacin sulfate)，盐酸多西环素(doxycycline hydrochloride)，硫酸卷曲霉素(capreomycin sulfate)，葡糖酸氯己定(chlorhexidine glucinate)，盐酸氯己定(chlorhexidine hydrochloride)，盐酸金霉素(chlortetracycine hydrochloride)，盐酸土霉素(oxytetracyclinehydrochloride)，盐酸克林霉素(clindamycin hydrochloride)，盐酸乙胺丁醇(ethambutolhydrochloride)，盐酸甲硝唑(metronidazole hydrochloride)，盐酸喷他咪(pentamidinehydrochloride)，硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)，硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate)，盐酸(lineomycin hydrochloride)，盐酸美他环素(methacyclinehydrochloride)，马尿酸乌洛托品(methenamine hippurate)，扁桃酸乌洛托品(methenamine mandelate)，盐酸米诺环素(minocycline hydrochloride)，硫酸新霉素(neomycin sulfate)硫酸奈替米星(netilmicin sulfate)，硫酸巴龙霉素(paromomycinsulfate)，硫酸链霉素(streptomycin sulfate)，硫酸妥布霉素(tobramycin sulfate)，盐酸咪康唑(miconazole hydrochloride)，酮康唑(ketaconazole)，amanfadinehydrochloride，amanfadine sulfate，羟甲辛吡酮(octopirox)，对氯间二苯酚(parachlorometa xylenol)，制霉素(nystatin)，托萘酶(tolnaftate)，吡硫翁锌(zincpyrithion and clotrimazole)。 

在此有用的活性成分代表的例子包括选自水杨酸、过氧化苯甲酰(benzoyl peroxide)，3-羟基苯甲酸(3-hydroxy benzoic acid)，乙醇酸(glycolic acid)，乳酸(lactic acid)，4-羟基苯甲酸(4-hydroxy benzoic acid)，乙酰水杨酸(acetyl salicylic acid)，2-羟基丁酸(2-hydroxybutanoic acid)，2-羟基戊酸(2-hydroxypentanoic acid)，2-羟基己酸(2-hydroxyhexan acid)，顺式视黄酸(cis-retinoic acid)，反式视黄酸(trans-retinoic acid)，视黄醇(retinol)，植酸(phytic acid)，N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)，硫辛酸(lipolic acid)，壬二酸(azelaic acid)，花生四烯酸(arachidonic acid)，过氧化苯甲酰(benzoylperoxide)，四环素(tetracycline)，布洛芬(ibuprofen)，奈普生(naproxen)，氢可的松(hydrocortisone)，对乙酰氢基酚(acetominophen)，间苯二酚(resorcinol)，苯氧乙醇(phenoxyethanol)，苯氧丙醇(phenoxypropanol)，苯氧异丙醇(phenoxyisopropanol)，2，4，4’-三氯(trichloro)-2’-羟基(hydroxy)二苯基(diphenyl)醚(ether)，3，4，4’-trichlorocarbanilide，羟甲辛吡酮(octopirox)，盐酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)，克雷唑(clotrimazole)，咪康唑(miconazole)，酮康唑(ketoconazole)，neocycin sulfate，及其混合物。 

防晒活性成分

暴露于紫外线辐射下会导致过度脱皮及角质层纹理变化，因此，本发明组合物可以任选含有防晒的活性成分。如在此所使用的，「防晒活性成分」包括防晒剂和物理防晒油。适合的防晒活性成分可以是有机物和无机物。 

在此有用的无机防晒物质包括下面的金属氧化物。平均初级粒度大约为15nm至大约100nm的二氧化钛、平均初级粒度大约为15nm至大约150nm的氧化锌、平均初级粒度大约为15nm至大约150nm的氧化锆、平均初级粒度大约为15nm至大约500nm的氧化铁，及其混合物。当在此使用时，无机防晒物存在的量是组合物重量的大约0.1至大约20％，更佳为大约0.5％至大约10％，最佳为大约1％至大约5％。 

有很多种常规的有机防晒活性成分适合本发明使用。Balsam MS，Sagarin E(1972)化妆品、科学与技术，第二版。Wiley-Interscience，New York，揭露了很多适合的活性成分。 

本发明中有用的组合物使用了代表性的有机防晒活性成分是为2-乙基己基-p-甲氧基肉桂酸酯(ethylhexyl-p-methoxycinnamate)，丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(butylmethoxydibenzoyl-methane)，2-羟基-4-甲氧基二苯酮(2-hydroxy-4-methoxybenzo-phenone)，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(2-phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid)，辛基二甲基-p-氨基苯甲酸(octyldimethyl-p-aminobenzoic acid)，octocrylene，及其混合物。 

组合物特别有用的防晒活性成分，是如在下列文献中揭露的；Sabatelli的美国专利第4937370号，及Sabatelli&Spirnak的美国专利第4999186号。在此揭露的防晒剂在单一分子中具有两个不同的发色团部分，其表现出不同的紫外线辐射吸收光谱。发色团部分之一主要在UVB照射范围内吸收，其他在UVA照射范围内吸收。 

这类防晒剂具代表性的成员为2，4-二羟基二苯酮(2，4-dihydroxybenzophenone)的4-N，N-(2-乙基己基)甲基-氨基苯甲酸酸酯(4-N，N-(2-ethylhexyl)methyl-aminobenzoic acid ester)；N，N-di-(2-乙基己基)-4-氨基苯 甲酸酯(N，N-di-(2-ethylhexyl)-4-aminobenzoc acid ester)与4-羟基二苯甲酰甲烷的酯(4-hydroxydibenzoylmethane)；4-N，N-(2-乙基己基)甲基氨基苯甲酸与4-羟基二苯甲酰甲烷的酯4-N，N-(2-ethylhexyl)methyl-aminobenzoic acid ester with 4-hydroxydibenzoylmethane；2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)二苯酸的4-N，N-(2-乙基己基)甲基氨基苯甲酸酯4-N，N-(2-ethylhexyl)methy-aminobenzoic acid ester of2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)benzophenone；2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)二苯酮的4-(2-羟基乙氧基)苯甲酰甲烷的4-N，N-(2-乙基己基)甲基氨基苯甲酸酯4-N，N-(2-ethylhexyl)-methylaminobenzoic acid ester of 4-(2-hydroxyethoxy)dibenzoylmethane；N，N-di-(2-ethylhexyl)-4-aminobenzoic acid ester of 2-羟基-4-(2-hydroxyethox)benzophenone，及4-(2-羟基乙氧基)二苯甲酰甲烷的N，N-di-(2-乙基己基)-4-氨基苯甲酸酯N，N-di-(2-ethylhexyl)-4-aminobenzoic acid ester of 4-(2-hydroxyethoxy)dibenzoylmethane及其混合物。 

特别具有代表性的防晒活性成分包括4，4’-t-叔丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(4，4’-t-butylmethoxydibenzoylmethane)，2-乙基己基-p-甲氧基肉桂酸酯(2-ethylhexyl-p-methoxycinnamate)，苯基苯并咪唑磺酸(phenyl benzimidazole sulfonicacid)，及octocrylene。 

使用安全且有效量的有机防晒成分，一般是组合物重量的大约1％至大约20％，更典型是大约2％至大约10％。精确的量将随着所选择的一种或是多种防晒剂及期望的太阳防晒系数(SPF)而有所不同。 

粒状材料

本发明组合物可以含有粒状材料，特别是金属氧化物。在此粒子可以是被包覆的或是没有被包覆的、带电荷的或是未带电荷的。带电荷的粒子材料揭露于Ha等人的美国专利第5997887号中，并在此做为参考。在此有用的颗粒材料包括氯氧化铋、氧化铁、云母、硫酸钡处理过的云母及二氧化钛、二氧化硅、尼龙、聚乙烯、滑石、苯乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯酸共聚物、绢云母、二氧化钛、氯氧化铋、氧化铁、氧化铝、硅酮树脂、硫酸钡、碳酸钙、乙酸纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯、及其混合物。 

无机颗粒材料(例如二氧化钛、氧化锌或二氧化锆)是由很多来源所购得。适合的颗粒材料之一离子包含以U.S.Cosmetics获得的材料(TRONOX TiO2系列，SAT-TCR837，一种二氧化钛)。较佳地，组合物中存在的颗粒材料的含量是组合物重量的大约0.01％至大约2％，更佳地，大约为0.05％至大约1.5％，最佳地是为大约0.1％至大约1％。 

调节剂

本发明的组合物可以含有选自湿润剂、润肤剂或护肤剂的调节剂。可使用各式各样的此种材料，每一种存在的含量是组合物量的大约0.01％至大约20％，较佳大约为0.1％至大约10％，更佳为大约0.5％至大约7％。此些材料包括但不限于胍(guanidine)、尿素、乙醇酸及乙醇酸盐(例如铵及四烷基铵)、水杨酸、乳酸及乳酸盐类(例如铵及四烷基铵)、各种形式的芦荟(例如芦荟凝胶)、多羟基醇(例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、丙三醇、己三醇、丁三醇、丙二醇、丁二醇、己二醇等)、聚乙二醇、糖(例如蜜二糖)及淀粉、糖及淀粉衍生物(例如烷氧化的葡萄糖、海藻糖、葡糖胺)、透明质酸、乳酰胺-乙醇胺、乙酰胺-乙醇胺、泛醇、尿囊素、及其混合物。在此有用的是Orr等人的 美国专利等4976953号所揭露的丙氧基化的甘油。 

另外，亦有用的是为糖的各种C1-C30单酯和多元酯及其相关物质。此些酯类材料由糖或多元醇部分和一个或多个羧酸部分衍生。此类酯类材料进一步描述于美国专利第2,831,854号，Jandacek的美国专利第4,005,196号、Jandacek的美国专利第4,005,195号、Letton等人的美国专利第5,306,516号、Letton等人的美国专利第306.515号、Letton等人的美国专利5,305,514号、Jandacek等人的美国专利第4,797,300号、Rizzi等人的美国专利第3,963,699号、Volpenhein的美国专利等4,518,772号、及Volpenhein的美国专利第4,517,360号。 

结构剂

在一个实施例中，本发明的组合物，特别是基乳状液中可以含有结构剂。在本发明中结构剂特别的代表是为水包油型乳液。不受原理的限制，相信结构剂有助于对组合物提供流变特性(rheologic characteristicg)，以带给组合物稳定性。例如，结构剂倾向于有助于形成液晶凝胶网状结构。结构剂还可作为乳化剂或表面活性剂以发挥功能。本发明较佳为组合物含有大约0.1％至大约20％，更佳大约为0.1％至10％，最佳大约0.5％至大约9％的一种或是多种结构剂。 

代表性的结构剂是具有大约1至大约8的HLB且具有至少大约45℃的熔点。适合的结构剂选自饱和C14-C30脂肪醇、含有大约1至大约5摩耳环氧乙烷的饱和C16-C30脂肪醇、饱和C16-C20二醇、饱和C16-C30单甘油醚、饱和C16-C30羟基脂肪酸、C14-C30羟基化的及非羟基化的饱和脂肪酸、C14-C30饱和的乙酸基化的脂肪酸、含有大约1至大约5摩耳环氧乙烷二醇的胺和醇、单甘油酯含量至少40％的饱和C14-C30甘油单酯、具有大约1至大约3个烷基和大约2至大约3个饱和甘油单元的饱和C14-C30多甘油酯、C14-C30甘油单醚、C14-C30脱水山梨糖醇一/二酯、含有1至大约5摩耳环氧气乙烷的C14-C30饱和的乙氧基化的脱水山梨糖一/二酯、C14-C30饱和甲基葡糖甘酯、C14-C30饱和蔗糖一/二酯、含有1至大约5摩耳环氧乙烷的C14-C30饱和乙基化的甲基葡糖苷酯、具有平均1-2个葡萄糖单元及其混合物的、具有至少大约45℃熔点的C14-C30饱和聚葡糖苷。 

本发明某些具有代表性的结构剂选自硬酯酸、棕榈酸、十八烷基醇、十六烷基醇、二十二烷基醇、硬酯酸、棕榈酸、平均具有大约1至大约5个环氧乙烷单元的十八烷醇的聚乙二醇醚、平均具有大约1至大约5个环氧乙烷单元的十六烷醇的聚乙二醇醚、及其混合物。本发明更具代表性的结构剂是选自十八烷基醇、十六烷基醇、二十二烷基醇、平均具有大约2个环氧乙烷单元的十八烷醇的聚乙二醇醚(Steareth-2)、平均具有大约2个环氧乙烷单元的十六烷醇的聚二醇醚、及其混合物。最佳代表性的结构剂是选自硬脂酸、棕榈酸、十八烷基醇、十六烷基醇、二十二烷基醇、steareth-2、及其混合物。 

增稠剂(包括增稠剂和凝胶化剂)

本发明组合物可以含有一种或是多种的增稠剂，较佳者是组合物重量的大约0.1％至大约5％，更佳者为大约0.1％至大约4％，更佳者为大约0.25％至大约3％。 

非限制性增稠剂种类包含选自下列：羧酸聚合物、交联聚丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、多糖、及凝胶化剂树脂。 

羧酸聚合物是含有一种或是多种从丙烯酸、取代的丙烯酸及这些丙烯酸其取代的丙烯酸的盐类和酯类衍生物单体的交联化合物，其中交联剂含有两个或是多个碳-碳双键，并 且从多羟基醇衍生出。本发明中有用的聚合物更详细描述于Haffey等人的美国专利第5,087,445号、Huang等人的美国专利第4,509,949号、Brown的美围专利第2,798,053号，及在Wenninger JA，McEwen GN，Cosmetic Toiletry和Fragrance Association(1993)国际化妆品成分字典，第五版，Cosmetic Toiletry and Fragrance Association，Washington，D.C.。 

交联的聚丙烯酸酯聚合物作为增稠剂或凝胶化剂，包括阳离子及非离子聚合物、而阳离子聚合物一般是具有代表性的。有用的交联非离子聚丙烯酸酯聚合物和交联的阳离子聚丙稀酯聚合物是在下例的文献中揭露的：Hawe等人的美国专利第5,100,660号；Heard的美国专利第4,849,484号；Farrar等人的美国专利第4,835,206号；Glover等人的美国专利第4,628,078号；Flesher等人的美国专利第4,599,379号；及Farrar等人的美国专利第EP 228,868号。 

聚丙烯酰胺聚合物，特别是非离子聚丙烯酰胺聚合物包括取代的支化(branch)或未支化的聚合物。这些聚丙稀酰胺聚合物中较具代表性的是由Seppic Corporation(Fairfield，N.J.)以商品名Sepige1305所购得的CTFA命名的聚丙烯酰胺、isoparaffin及laureth-7的非离子聚合物。在此有用的其他聚丙烯酰胺聚合物包括丙烯酰胺和取代的丙烯酰胺与丙烯酸和取代的丙烯酸的多嵌段(multi-block)共聚物。这些多团共聚物可由包括Hypan SR150H，SS500V，SS500W，及从Lipo Chemical，Inc.，(Patterson，N.J.)的SSSA100H购得。 

「多糖」是含有重复糖(即碳水化合物)单元主链的凝胶化剂。多糖凝胶化剂的非限制性例子包括那些选自纤维素、羧甲基羟基乙基纤维素(carboxymethylhydroxyethyellulose)、乙酸丙酸纤维素(cellulose acetate propionate carboxylate)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose)、羟乙基乙基纤维素(hydroxyethylethylcellulose)、羟丙基纤维素(hydroxypropylceulose)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropl methylcellulose)、甲基羟乙基纤维素(methyl hydroxyethylcellulose)、微晶纤维素(microcrystalline cellulose)、硫酸纤维素钠(sodium cellulose sulfate)、及其衍生物。在此有用的是烷基取代的纤维素，在这些聚合物中，纤维素聚合物的羟基是羟基化的(特别是羟乙基化或羟丙基化)，形成羟烷基化纤维素，之后，更进一步经由醚键修饰有C10-C30直链或支链烷基。一般而言，这些聚合物是C10-C30直链或支链醇与羟烷基化纤维素的醚类。在此有用的烷基的例子包括自十八烷基、异十八烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、异十六烷基、椰油基(即椰油醇衍生的烷基)、棕榈基、油基、亚油基(linoleyl)、亚麻油基(linolenyl)、蓖麻油基ricinoleyl、二十二烷基、及其混合物。烷基羟烷基纤维素醚中具代表性的是以CTFA命名的十六烷基羟乙基纤维素材料，其为十六烷醇及羟乙基纤维素的醚。此材料由从Aqualon Corporation(Wilmington，Del.)以NATROSOLCS Plus出售。其他有用的多糖包括核葡聚糖(seleroglucans)，其为每三个单元(1-3)连接的葡萄糖单元与(1-6)连接的葡萄糖的线性链，在商业上可购得的例子是从Michel Mercier Products Inc.(Mountainside，N.J.)的CLEARGELCS11。 

在此还有用的其他增稠剂和凝胶化剂包括最初自然来源的材料，这些凝胶化剂树脂的非限制性例子包括阿拉伯胶、洋菜、褐藻素、褐藻酸、褐藻酸铵、淀粉果胶、淀粉红藻胶、肉生佥、红藻胶、糊精、明胶、结冷胶(gellan)树脂、瓜儿胶、羟丙基三甲基铵(guarhydroxypropyltrimonium chloride)、水辉石、hyaluroinic acid、水合二氧化硅 (hydrated silica)、羟丙基聚葡萄胺糖、刺梧桐胶、海藻、刺槐豆胶、纳豆胶、褐藻酸钾、红藻胶钾、丙烯基乙二醇褐藻酸酯、菌核胶、羟甲基葡聚糖钠(sodium carboyxmethyldextran)、红藻胶钠、山羊刺树胶、三仙胶、及其混合物。 

附加的活性成分

本发明组合物可含有附加的皮肤活性成分，不包括特定的种类，包括但不限于安全且有效的金合欢醇(Farnesol)及phytantrriol。 

金合欢醇为一种天然存在的物质，相信其在角鲨烯及类固醇特别是胆固醇的生物合成作用中作为母体及/或中间体。蛋白质修饰和调节中(例如蛋白质的金合欢醇化作用)也涉及金合欢醇，且有一种对金合欢醇敏感的细胞核受体。 

化学上，金合欢醇是3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯-1-醇(3，7，11-trimethyl-2，6，10-dodecatrien-l-ol)，在此所使用的「金合欢醇」包括异构物及互变变构体。金合欢醇在商业可购得，例如商品名为金合欢醇(一由Dragoco，10 GordonDrive，Totowa，N.J.异构物的混合物)及反式-反式-金合欢醇(Sigma Chemical Company，P.O.Box 14508，St.Louis，Mo.)。 

当在本发明组合物中存在时，组合物较佳为含有组合物重量的大约0.001％至大约50％，更佳为大约0.01％至大约20％，最佳为大约0.1％至大约15％，另一最佳为大约0.1％至大约10％，再一最佳为大约0.5％至大约5％，又一最佳为大约1％至大约5％的金合欢醇。 

在本发明组合物中，phytantrriol较佳的量是组合物重量的大约0.001％至大约50％，更佳为大约0.01％至大约20％，最佳为大约0.1％至大约15％，另一更佳为大约0.2％至大约10％，再一更佳为大约0.5％至大约10％，又一更佳为大约1至大约5％。 

F.化妆品上、皮肤科上或是药学上可接受的载体 

本发明的局部组合物亦含有皮肤可接受的载体。安全有效且有效量的载体是组合物的大约50％至大约99.99％，更佳为大约80％至大约99.9％，最佳为大约90％至大约98％，另一更佳为大约90％至大约95％。 

载体可是各式各样的形式，例如，乳状液载体，包括但不限于水包油、油包水、水包油包水及油包水包硅酮树脂乳状液，其是在此使有用的。 

本发明的乳液状一般含有如上所述溶液和脂质或是油脂。脂质和油脂可来自动物、植物和石油，并且可以是天然的或是合成的(例如人造的)。代表性的乳状液含有湿润剂例如甘油。代表性的乳状液更进一步含有载体重量的大约0.01至大约10％，更佳为大约0.1％至大约5％，乳化剂可以是非离子、阳离子、或阴离子。适合的乳化剂揭露于Dicker等人的美国专利第3,755,560号、Dixon等人的美国专利第4,421,769号、及McCutcheon的去污剂及乳化剂(Detergents and Emulsifiers)、北美版(North American Edition)、第317-324页(1986)。 

乳状液更进一步可含有消泡剂、在对角质组织施用时可使泡沫最小化。消泡剂包括高分子量硅酮树脂及本领域中公知于此用途的其他材料。 

适合的乳状液可以有宽广的粘度范围，其取决于所需的产品形式。较佳为具有大约50厘沲(centistokes)或是更少的粘度，更佳为大约10厘沲或是更小，最佳为大约5厘沲 或是更小的低粘度乳状物。 

G.小泡状的传送系统 

局部药物传送的主要障碍是为药物穿越角质层的扩散速率太慢。皮肤天生的功能是为保护身体免于有害环境的传染。皮肤主要的屏障是位于皮肤最外层的角质层，由于在角质层中的脂质区域会形成不间断的结构，因此当物质应用在皮肤上时，必须通过此区域。为了要增加转移至皮肤的机会，各式各样的小泡状传送系统例如凝胶状、液状、及弹性小泡已经被揭露于下列的文献(回顾于Verma DD，et al.，Eur J Pharm Biopharm.55：271-277，2003；Verma DD，et al.，Int J Pharm.258：141-151，2003；Miyazaki S，et al.，J PharmPharm Sci.6：238-245，2003；Takahashi A，et al.，Int J Pharm.246：179-186，2002；Barry BW.，Adv Drug Deliv Rev.54 Suppl 1：S31-40，2002；Barry BW.，Eur J PharmSci.14：101-114，2001；Jain S，et all.，Drug Dev Ind Pharm.29：1013-1026，2003)。 

IV.使用组合物来调节皮肤状况的方法 

本发明的组合物可用于改善哺乳动物皮肤的状况。此类的角质组织状况的调节可以包括预防性和治疗性的调节，例如此类的调节方法针对增厚的角质组织(例如建立皮肤的表皮及/或真皮层即应用到指甲及毛根的角质层的状况)，以及防止及/或延迟哺乳类动物皮肤的萎缩、防止及/或延迟哺乳类动物皮肤的蜘蛛血管及/或红斑外观、防止及/或延迟哺乳类动物眼下黑眼圈的外观、防止及/或延迟哺乳类动物皮肤的土黄色、防止及/或延迟哺乳类动物的皮肤下垂、使哺乳类动物的嘴唇、毛发及指甲柔软及/或平滑、防止及/或减轻哺乳类动物皮肤的搔痒、调节皮肤纹理且改善皮肤的颜色(例如红润、雀斑)。 

调节角质组织的状况包括对角质组织局部应用安全且有效量的本发明的组合物。所应用的组合物的量、应用频率及使用时间的长短，是根据胎儿化合物、皮肤活性成分及/或已知组合物的其他成分和期望的调节水平(例如着眼于存在的角质组织损伤程度或预期发生的情况)而有所不同。 

在一个具体实施例中，是对于皮肤长期使用组合物。所谓「长期局部应用」的意思为在目标物的生命期期间，连续地局部应用组合物超过一段时间，较佳者为至少大约一个月，更佳者为至少大约六个月，最佳者为至少大约一年。当在不同的最长的应用时间(例如5、10、或20年)后即刻获得好处时，其具有代表性的为长期的使用持续了整个目标物的生命期。一般情况之下，在此持续时间大约为每天一次使用，但是应用的比例大约可以每周一次至大约每天三次或是更多。 

本发明的组合物的量可在很大的范围使用以提供皮肤外观及/或感觉的好处。一般每次使用的本发明组合物的量在组合物的毫克/平方厘米(mg/cm²)中，是为大约是0.1mg/cm² 至10mg/cm²，特别有用的应用量是为大约1mg/cm²至大约2mg/cm²。 

较佳之角质组织状况的调节，是可经由下列形式的组合物：皮肤的化妆水、乳液、凝胶、泡沫剂、乳膏剂、糊状物、乳状液、喷雾剂、调理剂、化妆品、唇膏、指甲油、刮胡后的泡沫剂，或是为了在皮肤或是其他角质结构上打算留下一些美感、预防性、治疗性或其他好处的类似的形式(例如一「留在上面」的组合物)。对皮肤使用组合物后，较佳者为在皮肤上至少大约15分钟，更佳者为至少大约30分钟，最佳者为至少大约1小时，另一最佳者为至少大约数小时，例如直至大约12小时。任何脸部、毛发、及/或指甲以外的部分可被治疗，例如脸部、嘴唇、眼部下面、头皮、颈部、躯干、手臂、手、腿、脚、手 指甲、脚趾甲、头发、睫毛、眉毛等。可以手指或使用工具或装置(例如垫、棉花球、笔状涂抹器、喷雾器及其类似物)应用此组合物。 

保证皮肤与至少最小量的胎儿化合物和护肤活性成分连续接触的另一种方法，是为藉由使用贴片应用此化合物。此方法特别用于需要更强力的处理方法的问题皮肤的部分(例如面爪纹部分、眉线、眼下部分等)。贴片可以是闭合的、半闭合的或者不闭合的，且可以是粘合的或是不粘合的。贴片可以含有组合物或是在应用贴片之前将组合物应用到皮肤上。贴片也可以含有另外的活性成分，例如对于放热反应的化学启动剂(initiators)，其是如在Wu等人的美国专利第5,821,250，5,981,547，及5,972,957号所揭露的。贴片较佳是为在皮肤上停留大约5分钟，更佳为大约15分钟，最佳为至少大约30分钟，另一最佳为大约1小时，再一最佳是一种在晚上的夜晚治疗的形式。 

实施例 

下列的实施例进一步描述和证明在本发明范围内的实施例。特定的实施例只是为了详细说明本发明的目的，但并非限制本发明的说明。不脱离本发明的精神及其他多种的变化是为可能的。 

在本发明的一个实施例中，藉由胎儿细胞或组织所表达的化合物，其是藉由组织培养基及溶解产物直接分离且进一步浓缩及纯化。虽然藉由胎儿组织表达的化合物的各自的鉴定或是纯化是有用的，但本发明的化合物的应用不需要求化合物各自的鉴定或纯化，之后，将有或无进一步浓缩或纯化的组织培养基或溶解产物依据下列的实施例，配置改善皮肤状况的化妆品的组合物。 

在本发明的另一个实施例中，鉴定了藉由胎儿组织表达的化合物或改善此化合物表达的条件。一旦鉴定后，从天然组织中(野生型)或者从适合的表达载体例如细菌或酵母(有或无编码区修饰作用的重组形式)分离出胎儿化合物，并且根据下列的实施例配置成改善肌肤状况的化妆品组成物。 

下表中列出的成分「胎儿组织化合物」不需限定于胎儿组织培养基、溶解产物、及萃取物，其可是有或没有进行各种成分的事先的鉴定。「胎儿组织化合物」亦可指从胎儿组织直接产生的化合物，或者藉由有或无事先的基因修饰作用的重组方法来获得化合物。 

表一、使用胎儿组织化合物的护肤组合物的例子 

组成部分	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
							A相：
水U.S.P.	qs to 100	qs to 100	qs to 100	qs to 100	qs to 100	Qs to 100
							二钠EDTA	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
对羟苯甲  酸甲酯	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
							尿囊素	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
甘油	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
							B相：
十六烷醇	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30

 

十八烷醇	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
							二十二烷醇	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40
对羟苯甲酸丙酯	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
							金合欢醇	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
植烷三醇	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
							C相：
Sepigel 305	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
							D相：
二氧化钛						0.5
							E相：
苄醇	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
							硅灵  (Dimethicone /  Dimethiconol)	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
F相：
							透明质酸钠	0.15	0.30	0.30	0.60	0.60	0.60
抗坏血酸	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
							G相：
胎儿组织化合物	5.0	10.0	20.0	30.0	45.0	60.0

为了获得适合的皮肤组合物，上表中列出了A相成分与适合的组合物(例如Tekmarmodel RW20DZM)混合的。将组分加热，搅拌下升至70-80℃的温度且搅拌下保持此温度。在B相组分中渗入适当的化合物，加热到70-75℃并保持此温度且同时搅拌。为了乳化，充分搅拌下在A相组分中加入B相组分。当乳状液大约60℃时，连续在混合乳状液中加入C相组分，搅拌下使乳状液冷却至大约40℃，在大约50℃时，在乳状液中加入D和E相组分并连续混合之。在大约40℃时，连续向混合乳状液加入F组分，搅拌下使乳状液冷却到大约30℃，并加入G相组分。之后，使用适合的混合基(TekmarT-25)混合乳状液大约5分钟得到均匀产物。 

在本发明的另一实施例中，从天然组织(野生型)或从适合的表达载体例如细菌、酵母或是哺乳动物细胞(有或无编码区修饰作用的重组形式)分离胎儿组织表达的特定化合物，之后，并根据下表及步骤配置成为改善肌肤状况的化妆品组合物。例如，野生型或重组纤维蛋白聚糖可以为纯化或是部分纯化或无纯化的形式。纯化的可理解的意义是为存在主要纤维蛋白聚糖的蛋白质。部分或无纯化形式的纤维蛋白聚糖可以含有其他改善皮肤状况的胎儿化合物，其形式不拘于培养基、溶解产物或是萃取物。 

在使用纯化的纤调蛋白及下列成分之一组合物，其是与制造修复乳霜相同。 

表二、使用纯化的纤调蛋白的皮肤护肤组合物的例子 

组成部分

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

实施例5

实施例6

 

A相
							水U.S.P.	qs to 100	qs to 100	qs to 100	qs to 100	qs to 100	Qs to 100
二钠EDTA	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
							对羟苯甲酸甲酯	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
尿囊素	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
							甘油	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
B相：
							十六烷醇	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30
十八烷醇	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
							二十二烷醇	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40
对羟苯甲酸丙酯	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10

 

金合欢醇	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
							植烷三醇	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
C相：
							Sepigel 305	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
D相：
							二氧化钛						0.5
E相：
							苄醇	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
硅灵  (Dimethicone/  Dimethiconol)	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
							F相：
透明质酸钠	0.15	0.30	0.30	0.60	0.60	0.60
							抗坏血酸	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
G相：
							纯化的纤调蛋白  聚糖	0.001	0.01	0.1	1	5	10

A相成分是以一适当的混合物混合(例如Tekmar model RW20DZM)，A相成分是被加热于温度70-80℃下搅拌时。个别地，相成分是与一适当的混合物，其加热到70-75℃且保持此温度并继续搅拌，B相成分是被加入到A相成分中均匀混合以便乳化。当乳状液在近乎60℃时，C相成分被加入当持续混合乳状液。当搅拌时，乳状液被允许冷却至近乎40℃，在近乎50℃下，D相成分及E相成分被加入至乳状液中且持续混合之，在近乎40℃下，F相成分被加入且持续混合之，当搅拌时此乳状液被允许冷却至近乎30℃，且之后G相成分被加入。然后，此乳状液使用一适当的磨粉机被研磨大约5分钟，并形成一均匀 产物。 

或者，使用下列的组成部分及之前所描述的相同步骤，在制作修复乳霜中使用具有丰富的溶解产物、萃取物、或是培养基的部分纯化或是非纯化的纤调蛋白及下列成分的组合物。 

表三、使用部分纯化或是非纯化的纤调蛋白聚糖的皮肤护肤合成物的例子 

组成部分	Ex.1	Ex.2	Ex.3	Ex.4	Ex.5	Ex.6
							A相：
水U.S.P.	qs to 100	qs to 100	qs to 100	qs to 100	qs to 100	Qs to 100
							二钠EDTA	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
对羟苯甲  酸甲酯	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
							尿囊素	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
甘油	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	2.5
							B相：
十六烷醇	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30
							十八烷醇	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
二十二烷醇	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40	0.40
							对羟苯甲酸丙酯	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
金合欢醇	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	2.5
							植烷三醇	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	2.5
C相：
								2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
D相：
							二氧化钛						0.5
E相：
							苄醇	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
硅灵  (Dimethicone/  Dimethiconol)	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
							F相：
透明质酸钠	0.15	0.30	0.30	0.60	0.60	0.60
							抗坏血酸	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	-
G相：

 

富集的溶解产  物、萃取物、或  是培养基的部分  纯化或是非纯化  的纤调蛋白聚糖

0.1

1

10

20

40

80

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的专利申请权；同时以上的描述对于熟知本技术领域的专门人士应可明了及实施，因此其他未脱离本发明所描述的精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在所述的权利要求书中。 

Claims (1)

1.一种包含由胎儿组织表达的化合物以及皮肤科类或是药学上可接受的载体的化妆品类的、药物的、皮肤科的护肤组合物在制备用于改善无真皮损伤的皮肤状况、调节皮肤发炎状况或调节皮肤色素沉淀的药物中的用途，其中该由胎儿组织表达的化合物是纤调蛋白聚糖。

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