CN103841954A - 包含白细胞凝集素的美容组合物的生产方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含从鲑科（Salmonidae）孵化液获得或可以从其获得的多肽的美容品组合物、生产所述组合物的方法以及它们在皮肤的各种美容应用中的用途，尤其是用于改善哺乳动物皮肤的美容外观。

Description

包含白细胞凝集素的美容组合物的生产方法及其用途

本发明涉及可源自于鲑科（Salmonidae）孵化液的多肽在用于皮肤的各种应用中的用途。具体来说，本文中所定义的多肽和包含所述多肽的组合物可用于改变、优选地改善皮肤的美容外观。

皮肤是更易受攻击的人体器官之一。皮肤总是与外界刺激直接或间接地相互作用，并且常常暴露于环境因子并受其影响。事实上，皮肤可以被看做与外部世界接触的前线。这种持续的暴露能够引起皮肤、特别是皮肤美容外观的令人不快和/或不想要的物理和可见变化。尽管这样的变化可能不危及个体的健康，但这样的变化可能令人身体不适或看起来不舒服。事实上，由于皮肤清晰可见，因此皮肤外观的变化能够引起心理压力。因此，对维持、恢复或改善皮肤状况、特别是恢复皮肤的青春外观的有效治疗，存在着持续不断的需求。

皮肤形成人体的最大器官，占个人重量的约12-16%。它作为外部世界和我们体内受控环境之间的屏障和调节势力两者，执行许多至关重要的作用。

皮肤由3层构成，即表皮、真皮和皮下组织。表皮是皮肤最外部的上皮层。它充当物理屏障，防止从身体失水，并防止物质和有机体进入体内。它的厚度随身体部位而变。

表皮由分层的鳞状上皮构成，即它由扁平细胞层构成。皮肤、毛发和指甲是角质化的，意味着它们具有由被称为角蛋白的蛋白质构成的死亡的、硬化的疏水表面。由于表皮的与角化细胞相关的细胞外脂类的含量，使表皮不具有渗透性，尤其是在表皮的中间层（透明层）中。粘膜（例如食道、口咽腔、生殖器官等的粘膜）主要是非角质化且潮湿的。表皮具有三种主要细胞类型，即角化细胞（皮肤细胞）、黑素细胞（产色素细胞）和朗氏细胞（免疫细胞）。梅克尔细胞是第四种不占优势的表皮细胞。

角化细胞随着向外移动而成熟和分化，并伴有角蛋白的累积。它们最终脱落或擦落。它们形成四个或五个明显不同的层，从最浅表到最深处为：（i）具有无细胞核的死亡干透的坚硬细胞的角质层；（ii）具有含有嗜碱性颗粒的细胞并通过薄的透明层而与角质层向外隔开的颗粒层；（iii）刺状层（多刺、刺状或棘细胞层），其中细胞随着向上移动变得越来越扁平，以及（iv）具有柱状（长）再生细胞的基底层。

紧靠表皮下方的是基膜，其是位于表皮与真皮之间的特化结构。

真皮是皮肤的纤维结缔组织或支持层。主要纤维是交织的胶原蛋白纤维和弹性蛋白。

皮下组织是紧靠真皮和表皮下方的脂肪层。它也被称为下皮或膜。皮下组织主要由脂肪细胞、神经和血管构成。

在皮肤的下层颗粒层中产生新的上皮皮肤细胞。细胞随时间向皮肤表面迁移并变得更加酸性。在其30天的迁移期间，它们死亡并被角蛋白饱和。角蛋白和相关的脂类是重要的，因为它们保护皮肤抵御外部因素。

许多因素可能造成皮肤美容外观劣化，这些因素包括疾病、受伤、环境因素、年龄、激素水平、药物、外部施加或摄入的材料、遗传状况或这些与其他因素的组合。与衰老相关的皮肤美容外观劣化是普遍的因素，特别是光老化即皮肤日射病。这种劣化可以在皮肤中的不规则或异常处看到，其可能表现为例如皮肤干燥、皱纹、细纹、松弛加重（松垂）或色素沉着改变。

光老化是用于由长期UVA和UVB暴露引起的特征性变化的术语。生物功能和管控代谢应激的能力的降低，是所述老化过程的主要结果之一。老化是复杂的渐进性过程，其也引起皮肤的功能和美观变化。

光老化是归因于皮肤连续长期暴露于约245-290nm的紫外（UV）辐射的皮肤老化过程，所述紫外辐射可以来自于自然光或合成光。因此，光老化也被称为由UVA和UVB射线引起的皮肤老化，特别是面部、耳、颈部和手的皮肤老化。

皮肤干燥和/或脱落是老化皮肤的最常见征兆之一。尽管某些个体更易于发生皮肤干燥和/或脱落，但皮肤干燥和/或脱落现象能够影响任何人，而与年龄、性别或皮肤类型无关。

当皮肤外层（具有透明层的角质层）的水通过例如经表皮水分丢失（TEWL）而耗尽时，发生皮肤干燥。当这一层被良好保湿时，它通过皮肤的失水最小并有助于抵御刺激物、过敏原和病菌。然而，当角质层干透时，其保护功能下降。这使得失水更多，导致皮肤易于受到环境因素的影响。

理想情况下，角质层具有10%至30%的水含量。这种水使得皮肤柔软、平滑并具有柔性质地，即与皮肤的青春外观相关的特征。所述水来自大气、皮肤的下层和汗。由皮肤腺产生的油和由皮肤细胞产生的脂肪物质充当天然保湿剂，将角质层密封在水中。

身体通过蒸发从皮肤表面连续损失水（TEWL）。在正常条件下，损失速率缓慢，且水可充分更替。当失水超过水的更替且角质层的水含量降低至低于10%时，出现皮肤干燥的特征性迹象和症状。

改善或消除皮肤干燥和/或脱落，从而改善皮肤的美容外观的保湿剂，是非常合乎需要的。尽管在本领域内已知许多保湿剂，但对有效且温和的天然产品仍存在需求。

表现出不想要或过量色素沉着、即色素沉着过度的表皮细胞，例如黄褐斑，是老化皮肤的另一种常见征兆。传统上，可以使用去角质处理来除去对皮肤的美容外观不利的表皮细胞。

去角质处理移除表皮的外层以露出下面更新的皮肤细胞。去角质可以通过物理手段（例如磨皮）或通过化学手段来实现。化学去角质剂包括含有水杨酸、乙醇酸、水果酶、柠檬酸或苹果酸的磨砂剂，并且可由皮肤科医生以高浓度使用，或在非处方产品中以较低浓度应用。化学去角质可涉及使用含有α-羟基酸（AHA）或β-羟基酸（BHA）或起到使在细胞连接处将细胞保持在一起的胶状物质松散而使其渐渐松开的作用的酶的产品。这种类型的去角质被推荐用于人们治疗痤疮。

去角质处理的最大缺点是用于实现所述去角质处理的一些产品和方法的高价格。去角质在开始时将导致皮肤有些变红。在化学脱皮接近结束时，皮肤将磨砂，在皮肤表面上颜色从亮白色变为灰色。

因此，与去角质处理相比对皮肤更加温和的减少皮肤色素沉着过度的有效方法，是合乎需要的。

除了老化之外，身体损伤可能降低皮肤的美容/美学外观。例如，由例如少量刮、擦等对皮肤上部（表面）层、即表皮和/或真皮的浅表损伤，可能在皮肤上造成不想要的瑕疵。由例如创伤、切割、感染、痤疮等引起的皮肤的身体损伤可能造成疤痕。

创伤是尤其由机械、化学、热或病原性手段引起的外部或内部损伤，其造成结构性组织完整性的物理破坏。

疤痕是在损伤后代替正常皮肤的纤维组织（纤维化）区域。疤痕由皮肤和身体其他组织中创伤修复的生物过程造成。因此，疤痕形成是愈合过程的天然部分。除了非常少的病损之外，每个创伤（例如事故、疾病或手术后）产生一定程度的疤痕形成。

疤痕组织在功能和美观上次于正常的未受伤皮肤。这种次等性据信是在新组织形成期间产生的胶原蛋白束在真皮内的排列的结果。正常皮肤内的胶原蛋白束排列成复杂的三维交织排列方式（通常被称为“编篮”排列方式），其为皮肤提供高水平弹性和从损伤的回弹能力。疤痕组织内的胶原蛋白束以更平面的方式排列，其中束平行于皮肤表面取向。三维编织方式的失去及其被胶原蛋白束的平行排列的替代，据信造成了组织疤痕形成位点处美观的丧失。

疤痕形成也可能由皮肤的单个层的破坏引起。例如，拉伸痕（也称为纹）由真皮撕裂引起。拉伸痕通常是皮肤快速拉伸的结果，所述拉伸与快速生长（通常在青春期）或体重增加（例如妊娠、增肌或脂肪快速增加）或在某些情况下与皮肤上超过真皮弹性的剧烈牵拉力相关。拉伸痕也可能受到与青春期、妊娠、增肌、用于变性的激素替代疗法等相伴的激素变化的影响。这些类型的痕迹被称为萎缩纹、妊辰纹（striae vergetures）、膨胀纹、表皮膨胀纹、妊娠纹（striae gravidarum）（在由妊娠引起的情形中）、萎缩性线纹、白线纹或简单称为纹。

因此，对适合于促进皮肤美观的治疗仍存在需求。换句话说，改善皮肤美容外观的方法是合乎需要的。具体来说，对于恢复老化皮肤的青春外观和/或对抗老化皮肤的征兆的方法，存在需求。对于改善、恢复或抵抗浅表受损皮肤例如有疤痕的皮肤外观或由表皮和/或真皮的少量损伤引起的瑕疵的方法，也存在着需求。

现在已令人吃惊地发现，在鲑科孵化液中发现的某些分子、即被称为白细胞凝集素的多肽，对于改善皮肤的美容外观、特别是减少与老化皮肤相关的身体征兆和恢复浅表受损皮肤的外观来说，特别有效。

所述蛋白最初在鱼中鉴定到并从其中纯化，并描述在WO2010/049688中，其全部内容通过参考并入本文。鲑鱼蛋白具有255个氨基酸（SEQ ID NO:1）。这是所述多肽的前肽形式，其含有19个氨基酸的N-端肽，表明它定向到溶酶体进行随后的分泌（即进入卵黄周空间）。

所述多肽的氨基酸序列允许产生表位特异性抗体，其进而能够根据所分析的组织鉴定所述蛋白的许多（2-8个）可能的同种型。从鲑鱼已经分离到至少两个mRNA，其含有很少序列差异，在多肽水平上仅产生7个变化。也已从鲑鱼白细胞鉴定到所述蛋白的截短的形式（参见SEQ ID NO:2）。

所述蛋白与任何已知蛋白具有很少相似处，与任何已知蛋白显示出低于50%的相似性。在小结构域中观察到与tachylolectin的一定相似性。

已令人吃惊地发现，这些蛋白对皮肤的美容外观具有显著效果。尽管不希望受到理论限制，但实施例证实了白细胞凝集素能够抑制作为锌依赖性内切肽酶的基质金属蛋白酶（MMP）从真皮成纤维细胞的释放。这些酶能够降解皮肤的细胞外基质中存在的许多不同类型的蛋白质，例如胶原蛋白，并且据信对这些酶的释放的抑制至少部分造成了这些蛋白对皮肤的美容/酶学外观的效果。

因此，在最广泛意义上，本发明可以被视为提供了本文中所描述的多肽，其用于促进皮肤的美观或用于促进皮肤美观的方法中。换句话说，本文所描述的多肽可用于改善皮肤的美容外观或可用于改善皮肤美容外观的方法中。在特别优选情况下，本发明可以被视为提供了本文中描述的多肽，所述多肽用于恢复老化皮肤的青春外观和/或对抗老化皮肤的征兆，或用于获得这种效果的方法中。本发明的另一个优选方面可以被视为提供了本文所描述的多肽，所述多肽用于改善、恢复或抵抗浅表受损皮肤例如有疤痕的皮肤的外观或由表皮和/或真皮的少量损伤造成的瑕疵，或用于获得这种效果的方法中。

从下面的公开内容可以明显看出，本文中描述的多肽可以提供在美容组合物中，所述组合物包含一种或多种生理上可接受或可药用赋形剂和/或稀释剂。

因此，一方面，本发明提供了：

（i）多肽，其包含在SEQ ID No.1-4任一个中所示的氨基酸序列或与所述序列有至少90%同一性的序列或任何所述序列的一部分；或

（ii）包含（i）和一种或多种生理上可接受或可药用赋形剂和/或稀释剂的美容组合物，

其用于改善哺乳动物皮肤的美容外观。

本发明还提供了用于改善哺乳动物皮肤的美容外观的方法，在所述方法中向所述动物施用如上定义的多肽或美容组合物。

本发明的另一方面是如上定义的多肽或美容组合物的用途，用于制造药物以改善哺乳动物皮肤的美容外观。

当在本文中提到时，“多肽”是具有优选地超过50、100、150、200或250个残基和/或少于500、400、300、200或100个残基或选自其中的范围的分子。当在本文中提到时，“部分”优选地包含它所源自的序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240个或更多氨基酸。所述部分可以从所述序列的中央或N-端或C-端部分获得。优选地，所述部分从多肽的N-端末端，例如从前50、100或150个残基获得。或者，部分优选地从多肽的C-端末端，例如从最后50、100或150个残基获得。特别优选的情况包括所述多肽的截短，以例如除去信号肽或在天然存在的变体中不存在的部分。优选的阶段出现在N-端末端，并且长度为1至50个，例如1至10、20、30或40个，或5至40个，例如10至35个残基。

优选地，所述序列与相比较的序列有至少95、96、97、98或99%的同一性。

序列同一性可以使用例如使用SWISS-PROT蛋白质序列库，利用FASTA pep-cmp来确定，其中使用可变的pamfactor，并将间隙产生罚分设为12.0，间隙延伸罚分设为4.0，窗口为2个氨基酸。所述比较优选地在序列的全部长度上进行，但是也可以在较小的比较窗口，例如小于200、100或50个连续氨基酸内进行。

优选地，这样的序列同一性相关的多肽在功能上等同于在叙述的序列号中示出的多肽。这样的功能上等同的多肽可以采取如下所述的衍生物的形式。同样地，可以在不影响如下所述的多肽的序列的情况下对具有序列号中列出的序列的多肽进行修饰。

此外，如本文中所述的“部分”可以是功能等同物。优选地，这些部分满足本文中提到的同一性（相对于可比区域）条件。

正如本文中所提到的，为了实现“功能等同”，所述多肽相对于母体分子（即通过例如氨基酸取代衍生出所述多肽的分子），在发挥美容功能方面可以显示出效能的一定下降，但优选地同样有效或更有效。由此，功能等同物涉及如后文中所述可有效改善皮肤的美容外观的多肽。这可以例如通过执行实施例中所指的体外分析，以定性或定量方式对衍生多肽与其起源多肽的效果进行比较来试验。在可能得到定量结果的情况中，衍生物的有效性为母体多肽的至少30、50、70或90%。或者，可以通过例如在体外细胞培养物中分析对MMP释放的抑制，来进行体外试验。

与天然存在的蛋白质有关的或其衍生的功能等同的蛋白质，可以在不破坏分子的功能条件下，通过单次或多次氨基酸替代、添加和/或删除对天然氨基酸序列进行修饰（前提是它们满足上面提到的序列同一性要求）而得到。优选地，天然序列具有少于20个替代、添加或删除，例如少于10、5、4、3、2或个这样的修饰。这样的蛋白质由“功能等同的核酸分子”编码，所述核酸分子通过一个或多个碱基的适当替代、添加和/或删除产生。

优选的功能等同物是“添加”变体，其中产生的氨基和/或羧基末端融合蛋白质或多肽包含融合到母体多肽上的另外的蛋白质或多肽。

特别优选的功能上等同的变体是天然生物变体，特别是物种内或来自于鲑（Salmonidae）科、尤其是鲑鱼（salmo)和大马哈鱼（Oncorhynchus）亚科的不同属中的等位基因变体或地理变体，以及使用已知技术制备的衍生物。鲑科的特别优选的物种包括大西洋鲑（Salmo salar）和太平洋鲑（Oncorhynchus masou）。

如上所述的多肽，包括通过例如化学修饰，包括通过去糖基化或糖基化进行修饰而不影响多肽序列的多肽。这样的多肽可以通过多肽的不影响功能性的分离后修饰，例如特定残基的某些糖基化、甲基化等来制备。

按照本发明使用或用于本发明的组合物中的多肽也可采取肽模拟物的形式，所述肽模拟物可被认为是其中多肽的功能特征得以保持，但存在于不同、例如非肽结构的背景中的衍生物。这样的肽模拟物已被成功开发并用于其他、特别是医疗应用中。

肽模拟物、尤其是非肽分子，可以通过各种过程产生，所述过程包括基于构象的药物设计、筛选、集中的文库设计和经典药物化学。不仅可以使用非天然氨基酸或其他有机结构单元的低聚物，而且可以通过本领域中已知的方法，使用糖类、杂环或大环化合物或任何有机分子，所述有机分子包含可以提供模拟所述肽的三维构象的相同性质的分子静电表面的结构元素和构象。

由此，肽模拟物与肽主链的类似性可能很低或不类似。肽模拟物可以包含完全合成的非肽形式（例如基于具有合适取代基的糖类主链），或者可以保留其所基于的肽的一种或多种要素，例如通过衍生一个或多个氨基酸或利用可替选的非肽组分代替一个或多个氨基酸。肽状模板包括假肽和环肽。对于肽功能来说被认为是冗余的结构要素可以被最少化以便仅保持支架功能，或在适当时除去。

当肽模拟物保留一个或多个肽要素、即超过一个氨基酸时，这样的氨基酸可以被其非标准的或结构类似物代替。保留在序列中的氨基酸还可以被衍生或修饰（例如标记、糖基化或甲基化），只要本发明的多肽的功能性质得以保留即可。肽模拟物被称为“衍生自”特定的多肽序列。这意味着肽模拟物参考限定的多肽序列进行设计，使其保留所述肽的功能必需的结构特征。所述结构特征可以是多肽的特殊侧链或所述结构的氢键势能。这样的特征可以由非肽组分或一个或多个氨基酸残基提供，或者可以对连接多肽的所述氨基酸残基的键进行修饰以提高多肽的某些功能如稳定性或蛋白酶抗性，同时保留多肽的功能必需的结构特征。

可使用的非标准的或结构类似的氨基酸的实例是D-氨基酸、酰胺同电子排列体（例如N-甲基酰胺、反向-翻转酰胺、硫代酰胺、硫酯、磷酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟代乙烯基、(E)-乙烯基、亚甲基氨基、亚甲基硫基或链烷）、L-N-甲基氨基酸、D-α-甲基氨基酸、D-N-甲基氨基酸。非常规的氨基酸的实例列于表1中。

表1

可使用的非标准氨基酸包括构象限制的类似物，例如Tic（用于代替F）、Aib（用于代替A）或哌啶甲酸（用于代替Pro）。

上面讨论的多肽还包括经过修饰以例如便于其在美容应用中的用途（如下所讨论）的衍生物，例如通过加入靶向或功能基团从而例如提高亲脂性、协助细胞运输、可溶性和/或稳定性。因此可以将寡糖、脂肪酸、脂肪醇、氨基酸、肽或多肽偶联到上述多肽或核酸分子。

多肽也涵盖采取“药物前体”或“前体肽”形式的衍生物，使得所添加的组分在施用后可以通过切割而去除，例如切割通过酯化添加的取代基，所述取代基可以通过酯酶的作用去除。这样的药物前体包括天然存在的蛋白质的天然前体，其通过例如蛋白水解被切割以获得目的多肽。这样的前体在前体形式下可能是无活性的，但是可以通过蛋白水解切割来激活。可以对如上所述的修饰多肽进行试验，通过确定它们是否具有相同或类似的医疗效果，来确保它们保留了与未修饰分子相关的功能活性。

在本文中所描述的本发明的组合物和用途中使用的多肽，从天然存在的来源获得或衍生。

方便地，按照实施例中描述的流程来分离所述多肽。这样的方法和这样的方法的产物形成了本发明的其他方面。

因此，另一方面，本发明提供了从鲑科孵化液（例如鲑鱼孵化液）（i）分离本文描述的多肽或（ii）制备本文描述的美容组合物的方法，所述方法至少包括下列步骤：

a）将鲑科卵悬浮在极小体积（例如等于卵的体积或更小体积）的水中；

b）诱导所述卵的同步快速孵化（优选地使对于超过95%的胚胎来说，孵化在不到2小时内完成）；

c）任选地对所述孵化的卵进行过滤以获得孵化液；以及

d）对所述孵化液进行过滤以获得所述多肽和/或组合物。

任选地，可以将从上述方法获得或可以从其获得的产物稀释或浓缩至适合的浓度，然后将其用于本发明的方法和用途。

在第一实施方式中，过滤所述孵化液的步骤可以包含多个步骤，其包括：

（i）使用孔眼尺寸为至少5μm、优选地5-15μm、特别优选地孔眼尺寸为7μm的滤器过滤所述孵化液，并收集滤液；

（ii）使用孔眼尺寸为0.30-0.60μm、优选地孔眼尺寸为0.35-0.55、特别优选地0.40-0.50μm、最优选地为0.45μm的滤器过滤来自于步骤（i）的滤液，并收集滤液；

（iii）用可药用缓冲液交换来自于步骤（ii）的滤液中的水；

（iv）使用排除尺寸为至少80kDa、优选地80-120kDa、最优选地排除尺寸为100kDa的滤器过滤来自于步骤（iii）的溶液，并收集滤液；以及

（v）使用孔眼尺寸为0.15-0.30μm、优选地孔眼尺寸为0.22μm的滤器过滤来自于步骤（iv）的滤液，并收集滤液，其中所述滤液提供包含所述多肽的组合物。通过这种方法获得的产物形成本发明的另一方面。

或者，在第二实施方式中，过滤所述孵化液的步骤可以包含多个步骤，其包括：

（i）使用孔眼尺寸为至少5μm、优选地5-15μm、特别优选地孔眼尺寸为7μm的滤器过滤所述孵化液，并收集滤液；

（ii）对来自于步骤（i）的滤液进行离子交换层析并收集洗脱液；

（iii）用可药用缓冲液交换来自于步骤（ii）的洗脱液中的水；以及

（iv）使用孔眼尺寸为0.15-0.30μm、优选地孔眼尺寸为0.22μm的滤器过滤来自于步骤（iii）的溶液，并收集滤液，其中所述滤液提供包含所述多肽或其部分的组合物。通过这种方法获得的产物形成本发明的另一方面。

在某些实施方式中，使用孔眼尺寸比第一过滤步骤更小的滤器对来自于步骤（i）的滤液进行另一个过滤步骤可能是有益的。这可以帮助防止来自于孵化液的材料堵塞离子交换柱（即抑制液体流过离子交换柱）。因此，过滤所述孵化液的步骤可以包含下列任选步骤：

（i′）使用孔眼尺寸为0.30-0.60μm、优选地孔眼尺寸为0.35-0.55、特别优选地0.40-0.50μm、最优选地为0.45μm的滤器过滤来自于步骤（i）的滤液，并收集滤液。

所述任选的过滤步骤优选地发生在对来自于（i）的滤液进行离子交换层析之前。因此，进行离子交换层析的滤液可以来自于步骤（i）或步骤（i′）。

在示例性实施方式中，步骤（ii）包括：

（a）将所述滤液（来自于步骤（i）或步骤（i′））装载到离子交换柱、例如DEAE（二乙基氨基乙基）柱上；

（b）用适合的缓冲液例如包含pH8.5的20mM Tris-HCl的清洗液清洗所述柱子；

（c）使用洗脱缓冲液或溶剂，例如另外包含盐例如50mM NaCl的清洗液，从所述柱子洗脱所述多肽；以及

（d）收集来自于步骤（c）的洗脱液。

因此，过滤孵化液的通用方法可以包含来自于上述方法的步骤（i），来自于上述第一方法的使用孔眼尺寸为0.30-0.60μm的滤器的步骤（ii）和/或来自于上述第二方法的使用离子交换层析的步骤（ii），来自于上述方法的步骤（iii），任选地来自于上述第一方法的使用排除尺寸为至少80kDa的滤器的步骤（iv），以及上述第一方法的使用孔眼尺寸为0.15-0.30μm的滤器的步骤（v）（等同于上述第二方法的步骤（iv））。

尽管滤液本身可以形成美容组合物，但任选地，可以将从上述方法获得或可以从上述方法获得的产物（第一实施方式的步骤（v）或第二实施方式的步骤（iv）的滤液）稀释（或浓缩）至适合的浓度，然后将其用于本发明的方法和用途中。因此，方法可以包含另一个稀释（或浓缩）所述组合物的步骤。优选地，可以将滤液稀释（或浓缩）至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、100、1000、5000或10000倍。

任选地，可以向从或可以从上述方法获得的产物添加一种或多种可药用赋形剂和/或稀释剂。因此，方法可以包括向组合物添加一种或多种可药用赋形剂和/或稀释剂，或者将组合物与一种或多种可药用赋形剂和/或稀释剂合并的另一个步骤。可选的或附加的制备方法步骤包括改变或修改溶剂，例如pH、离子浓度等。

可以向从或可以从上述方法获得的产物添加其他可药用组分或成分。所述一种或多种其他组分可以是活性组分，即对皮肤有效果，优选地也在例如本文描述的美容适应症中起到促进皮肤的美观或改善皮肤的美容外观的作用的组分。因此，可选替地或另外，方法可以包括向组合物添加一种或多种可药用活性组分或将组合物与一种或多种可药用活性组分合并的另一个步骤。可药用活性组分可以包括矿物质、维生素、酶、蛋白质、肽、氨基酸、脂质、抗氧化剂、多糖、适合作为防晒过滤物的物质、化学去角质剂、其提取物或混合物，正如在下面更详细描述的。

从或可以从上述方法获得的分离的多肽和/或美容组合物适合用于本文中别处描述的本发明的方法中。具体来说，美容组合物被用于在哺乳动物中改善皮肤的美容外观。

对滤液进行离子交换层析的步骤可以使用任何适合的方法来进行，在所述方法产生的滤液中，本发明的多肽（包括其如上所定义的部分）相对于纯化之前（即离子交换层析之前）孵化液提取物中存在的至少一种其他多肽被富集。例如，离子交换层析可以产生洗脱液，其中本发明的多肽相对于该纯化步骤之前孵化液提取物中存在的至少一种其他多肽、优选地所有其他多肽被富集至少5%。其他多肽可以被定义为不在如上定义的本发明的方法中使用的多肽（即白细胞凝集素）的结构和/或功能定义之内的多肽。优选地，通过这一步骤，多肽被富集至少10、20、30、40或50%。特别优选地，多肽被纯化至相对于纯化前孵化液提取物中存在的至少一种其他多肽来说纯度大于50或60%，例如>70、80或90%，优选地纯度大于95或99%的程度。因此，洗脱液可以仅包含痕量的离子交换层析之前孵化液中存在的其他多肽，例如少于0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%或0.00001%w/w。

离子交换层析在本领域中是公知的，并且适合的离子交换柱是可商购的。在是示例性实施方式中，离子交换柱是DEAE（二乙基氨基乙基）柱，即已偶联于DEAE的惰性基质例如纤维素、二氧化硅、交联琼脂糖凝胶等的柱子。然而，其他离子交换柱可能适合用于上面描述的方法中。

将过滤后的孵化液装载在离子交换柱上的步骤，包括向已制备或活化以使其能够结合本发明的多肽的离子交换柱施加孵化液。制备或活化离子交换柱通常包括用缓冲液、例如下文中定义的清洗缓冲液清洗柱子。这种预清洗步骤产生处于最适条件例如pH下的离子交换柱，以便能够使多肽结合于柱子。因此，装载步骤可以被视为将本发明的多肽结合于离子交换柱的步骤。

在将过滤后的孵化液装载到离子交换柱上的步骤之后，并且根据标准流程，可以将柱子用适合的缓冲液清洗，以除去孵化液中存在的未结合于柱子的不想要的组分。清洗包含向柱子施加一定体积的清洗缓冲液，向柱子施加的清洗缓冲液的体积通常至少等于离子交换柱的体积，或者可以更大，例如柱子体积的至少1.5、2、3、4或5倍。在某些实施方式中，清洗步骤可以重复例如2、3、4、5或更多次。在本发明的方法中可以利用任何适合的清洗缓冲液。适合的清洗缓冲液是不显著破坏目标多肽与离子交换柱之间的相互作用的清洗缓冲液，例如通过每个清洗步骤从离子交换柱移除的本发明的多肽少于10%，例如少于5、4、3、2或1%。在优选实施方式中，清洗缓冲液是10-100mM、优选地10-50mM、例如20-30mM范围内的Tris-HCl溶液，并具有6-10、优选地7-9范围内，例如8.5的pH。可以收集来自于清洗步骤的通流物，以例如确定是否需要进一步的清洗步骤（例如测试代表纯化前孵化液中存在的不想要组分的多肽、多糖、盐类等的存在）和/或丢弃。

从离子交换柱洗脱多肽的步骤可以通过任何适合的手段来进行，并且通常包括向柱子施加溶剂或溶液以破坏目标多肽与离子交换柱之间的相互作用。向柱子施加的洗脱缓冲液或溶剂的体积通常至少等于离子交换柱的体积，并且可以更大，例如柱子体积的至少1.5、2、3、4或5倍。在某些实施方式中，洗脱步骤可以重复例如2、3、4、5或更多次。可以从每个洗脱步骤收集洗脱液（来自于洗脱步骤的通流物），并且可以在交换洗脱液中的水的步骤之前将一种或多种洗脱液合并。适合的洗脱缓冲液或溶剂是破坏本发明的多肽与离子交换柱之间的相互作用的洗脱缓冲液，例如通过每个洗脱步骤将至少70%、优选地至少75、80、85、90、95或99%的结合于柱子的本发明的多肽从柱子洗脱。

在优选实施方式中，洗脱缓冲液与清洗缓冲液相同，其还包含能够破坏多肽与离子交换柱之间的相互作用的物质，例如盐。因此，在某些实施方式中，洗脱缓冲液是10-100mM、优选地10-50mM、例如20-30mM范围内的Tris-HCl溶液，具有6-10、优选地7-9范围内，例如8.5的pH，还包含10-500mM、优选地20-400mM、30-300mM、40-200mM或50-100mM范围内的盐例如NaCl、KCl等，例如50mMNaCl。

交换滤液或洗脱液中的水的步骤可以使用本领域中已知的任何适合方法例如渗滤或透析来进行。在特别优选实施方式中，该步骤使用排除尺寸小于15kDa、优选地10kDa或更小，例如9、8、7、6、5、4、3kDa或更小的滤器，使用渗滤来进行。

渗滤使用超滤膜从溶液中移除例如盐类或其他不想要或不需要的微小溶质，或者作为交换溶液的溶剂例如缓冲剂的方式。小分子与溶液分离，同时较大分子保留在渗余物（不通过滤膜的材料）中。微小溶质和溶剂例如水一般容易地洗过膜。约3倍体积的渗滤溶剂通常将排除95%的微小溶质。因此，上面来自于第一方法的步骤（ii）的滤液或来自于第二方法的步骤（ii）的洗脱液首先通过渗滤进行处理，随着一定比例的溶液（其含有孵化液的可溶性杂质/不想要的级份）通过膜，这导致渗余物浓缩。然后将渗余物用可药用缓冲液例如0.5mM磷酸钠和1mM氯化钠、磷酸盐缓冲盐水等稀释。如果需要，可以对稀释的渗余物进行重复的多轮渗滤。

同步孵化可以通过本领域已知的任何适合方法来获得。例如，可以使用光操作，例如将卵从光照条件（其抑制孵化）转移到无光条件，使卵同步化。也可以使用溶液温度的操作、脱氧合作用（Oppen-Berntsen等，1990,Aquaculture,86,pp.417-430）和使用电刺激来引起同步孵化。正如上面指出的，水的极小体积可以等于卵的体积或更小，例如对于每1ml卵来说可以使用≤1、0.75、0.5、0.25ml的悬浮液体，例如0.5至1ml。

因此，本发明进一步扩展到通过上述方法制备的多肽和/或组合物的用途。

当从白细胞获得本文中所描述的多肽时，它以未修饰的形式获得。从鲑科例如鲑鱼孵化液获得的多肽是修饰的（通过糖基化和/或磷酸化），但是两种形式在本文描述的方法中同等地有效。

本文中描述的多肽优选地基本上不含源自于源材料或分离程序中或其制备中使用的材料的任何污染组分。特别优选地，化合物被纯化到当作为w/w（干重）评估时，纯度超过50或60%，例如>70、80或90%，优选地纯度超过95或99%的程度。这样的纯度水平对应于特定目标分子，但是包括其降解产物。当适合时，可以使用具有较低纯度，例如含有当作为w/w（干重）评估时超过1、2、5或10%，例如超过20、30或40%的目标分子的富集制备物。“分离”上述多肽的方法是指分离到如上所述的纯度。本文中描述的多肽可以通过例如层析（例如HPLC、孔径排阻、离子交换、亲和、疏水相互作用、反相）或毛细管电泳来纯化。

本文中描述的多肽或组合物可以在体外，例如在细胞或器官培养物中使用，以影响所述细胞的性质，例如抑制MMP的释放，以便改变细胞外基质的蛋白质的结构和/或组成。

然而，正如本文中讨论的，所述多肽和组合物优选地用于体内应用。

“可药用的”或“生理上可接受的”是指成分必须适用于美容应用和组合物。成分还必须与组合物中的其他成分相容，并且对于接受者来说是生理上可接受的。

用于施用的活性成分可以被适合地修饰以用于美容组合物中。例如，通过使用如上所述的衍生物可以使按照本发明使用的化合物稳定以抵抗降解。

例如，通过例如使用适合的添加剂例如盐类或非电解质、乙酸盐、SDS、EDTA、柠檬酸或乙酸缓冲液、甘露糖醇、甘氨酸、HSA或聚山梨醇酯，也可以使组合物中的活性成分稳定。

本文描述的多肽或组合物可以作为单一活性成分存在于所述组合物中，或者可以与其他成分、特别是其他活性成分组合，以增强美容效果（如上所述）或使组合物对消费者更具吸引力。

如上所述，本文中描述的多肽和组合物表现出可用于改善皮肤的美容外观的性质，所述皮肤特别是老化皮肤例如光老化的皮肤，或有疤痕的皮肤，例如作为皮肤的至少一层受损、例如创伤的结果，或由表皮和/或真皮的少量损伤造成的瑕疵或磨损。

包含本文中描述的一种或多种多肽的组合物，在例如从天然来源制备所述一种或多种本发明的多肽之后，可能还包含杂质。在包含本文中描述的所述一种或多种多肽的组合物中，每种所述多肽可以0.0001至50%w/w的范围存在于按照上述方法制备的美容组合物中。优选地，所述多肽以0.01-40%w/w的范围存在于按照上述方法制备的或者如后文中所述例如在进一步稀释后的美容组合物中。例如，多肽可以0.0001至5%、0.0001至3%、0.0001至2%、0.0001至1%、0.0001至0.5%、0.0001至0.1%w/w的范围存在于美容组合物中。

美容组合物中存在的多肽或多肽部分的比例，可以相对于组合物中的其他溶质（例如盐类），即不包括溶剂例如水来定义。因此，所述多肽或多肽部分可以以组合物的干物质的10-100%w/w的范围存在。在某些实施方式中，多肽或多肽部分合起来可以以组合物的干物质的10-90%w/w的范围存在，例如组合物的干物质的10-80%、15-70%、20-60%、30-50%w/w。在其他实施方式中，多肽或多肽部分合起来可以以组合物的干物质的10-40%、20-39%、25-38%、30-37%w/w等的范围存在。正如本文中描述的，组合物可以被稀释用于本发明的用途。

尽管本发明涉及用于改善皮肤的美容外观的方法，这可以包括障碍、异常或病症的治疗，但在所有情形中所述治疗在本质上是美容的。

当在本文中提到时，“美容”打算是指不治愈、治疗或预防疾病或障碍，而是起到皮肤护理产品的作用或修改或改善皮肤的外观，例如皮肤的颜色、质地或水分含量的治疗。

本文描述的治疗的基础是本文中公开的多肽的皮肤抗老化、减少疤痕和抗瑕疵/抗磨损效果。这些效果在本文提供的实施例中示出。

因此，设想了基于本文描述的多肽的抗老化、抗瑕疵/抗磨损和减少疤痕性质的治疗

因此，本发明提供了用于改善哺乳动物皮肤的外观的美容方法，在所述方法中向所述动物施用上文中描述的多肽或美容组合物。

在特别优选的实施方式中，皮肤是老化、有瑕疵或有疤痕的皮肤。

“老化皮肤”是指显示出老化的一种或多种征兆或症状，即皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛（松垂）、皮肤干燥、脱落或经表皮水分丢失（TEWL）的表象的皮肤。具体来说，“老化的皮肤”相对于正常的最适皮肤，即健康、水合、正常色素沉着和未老化的皮肤来确定。就此而言，老化的皮肤不一定与对象的年龄相关，并且可能例如由于长期暴露于日光而过早老化（光损伤）。因此，“正常最适皮肤”的相对参数可以被确定为从与所讨论的对象相同或类似年纪的大量对象、即未接受长期日光暴露的对象获得的上述老化征兆的平均测量值。或者，“正常最适皮肤”的相对参数可以取为从比所讨论的对象更年轻的对象获得的测量值。换句话说，本文描述的多肽、用途和组合物可用于相对于较早年龄时对象的皮肤，恢复皮肤的青春外观。

因此，本发明提供用于在哺乳动物中治疗皮肤日射病的美容方法，在所述方法中向所述动物施用上文中描述的多肽或美容组合物，其中所述多肽或组合物优选地表面施用。

从另一个角度来看，本发明提供了用于在哺乳动物中治疗皮肤日射病的上文中描述的多肽或美容组合物，其中所述多肽或美容组合物优选地施用到所述动物的皮肤。在特定实施方式中，所述多肽或组合物用于表面施用。

在特别优选的实施方式中，改善皮肤的美容外观（例如老化或光损伤的皮肤）包括减少或防止皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛、皮肤干燥、脱落和/或经表皮水分丢失的美容外观或普遍程度。可以改善这些参数中的一种或多种。优选地，减少细纹和/或皱纹。

减少或防止例如老化的皮肤或皮肤日射病的征兆或症状的美容外观或普遍程度，可以意味着所述征兆或症状的数量和/或严重性的降低。例如，可以减少细纹和皱纹的数量，和/或可以减小或最小化皱纹或细纹的尺寸例如深度。此外，减少或防止可以包括停止或降低新征兆或症状出现的速率。

当在本文中提到时，“皮肤干燥”是指表皮缺乏水分或皮脂，其通常以细纹图案、脱落和瘙痒和/或灼烧感为特征。皮肤干燥可以作为皮肤状况本身而发生（例如由于老化），或者可以是皮肤障碍或病症例如晒伤的症状。

就此而言，通过上述多肽和组合物的保湿效果，可以实现皮肤干燥、脱落、细纹或经表皮水分丢失的减少。

因此，本发明可以被视为提供了一种对哺乳动物皮肤进行保湿的美容或非美容方法，在所述方法中向所述动物施用本文中定义的多肽或美容组合物。

换句话说，本发明提供了本文中描述的用于对哺乳动物皮肤进行保湿的多肽或美容组合物。（所述化合物或组合物也可用于制备用于此目的的美容性药物）。

当在本文中提到时，“保湿”涵盖防止水从皮肤流失（例如TEWL）的保湿剂以及当施用于皮肤时吸引并持留水的保湿剂（润湿剂）和润肤剂（其改善缺陷性脱皮）。

正如上面提到的，这样的保湿形式对于改善皮肤的美容外观是有利的。在特别优选实施方式中，皮肤是面部、耳、颈部、手的皮肤或头皮。

“皱纹”是皮肤中的折叠、隆起或皱褶。皮肤皱纹通常作为老化过程的结果而出现。就此而言，真皮包含皮肤的许多结构元件，其包括为皮肤提供强度的胶原蛋白、为皮肤提供膨压的糖胺聚糖和为皮肤提供弹力或弹性的弹性蛋白纤维。

当皮肤老化时，真皮层变得越来越薄，并且皮肤也产生更少的胶原蛋白。此外，提供弹性的弹性蛋白耗尽。这些皮肤支架的变化导致皮肤出现皱纹和松垂。真皮-表皮接合处的表皮突变平，使皮肤更脆并且使皮肤更容易剪切。这一过程还通过减少与真皮接触的表面积并干扰皮肤的正常修复过程，减少可用于表皮的营养物质的量。

在皮下层中，随着衰老脂肪细胞变得更小。这引起更加明显的皱纹和松垂（松弛），因为脂肪细胞不能“填充到”来自于其他层的损伤中。

暴露于UVA和UVB辐射即日光，引起与仅仅时光衰老相比，胶原蛋白以更高速率分解。日光损坏胶原蛋白纤维，并引起异常弹性蛋白的积累。当这种日光诱导的弹性蛋白积累时，基质金属蛋白酶（MMP）大量产生。正常情况下，金属蛋白酶通过制造和重新形成胶原蛋白来重塑日光损伤的皮肤。然而，这一过程不总是良好工作，并且某些金属蛋白酶事实上分解胶原蛋白。这导致被称为黄褐斑的组织混乱的胶原蛋白纤维的形成。这种不完美的重建/再生过程的重复，引起皱纹发生和皮肤松弛。

然而，正如上面提到的，已显示本文所描述的多肽抑制MMP的释放，因此本发明的多肽和组合物在减少或防止皱纹形成和皮肤松弛中是有利的。

在另一种优选情况下，待美容性治疗或预防的皮肤状况是色素沉着状况、障碍或异常。

皮肤的色素沉着障碍或异常，即色素沉着过度，可以作为老化的结果发生，或者可以由例如日光损伤造成的过早老化引起。色素沉着改变可能由黑素细胞的局部过量或黑素细胞活性的增加或两者引起。色素沉着障碍包括黄褐斑、晒斑或老年斑（日光性着色斑）和其他斑点例如雀斑。

“有疤痕的皮肤”是在功能和美观上次于正常的未受伤皮肤的皮肤。正如上面提到的，疤痕形成被认为是由愈合皮肤中形成的胶原蛋白束的不同排列方式引起的。

因此，本发明的一个方面是提供在哺乳动物中减少或最少化疤痕组织或改善疤痕的美容外观的方法，在所述方法中向所述动物使用前文中描述的多肽或美容组合物，其中优选地向疤痕组织表面施用所述多肽或组合物。

从另一方面来看，本发明提供了上文中所描述的多肽或美容组合物，其用于在哺乳动物中减少或最少化疤痕组织或改善疤痕的美容外观，其中优选地向所述动物的疤痕组织施用所述多肽或组合物。在特别优选实施方式中，多肽或组合物用于表面施用。所述美容组合物也可用于治疗浅表受损的皮肤。

在例如引起疤痕或疤痕组织的伤口的皮肤愈合中存在各种不同阶段（描述在WO2007/059584中，其通过参考并入本文）。对于皮肤的浅表损伤，即由例如刮或划引起的表皮和/或真皮的少量损伤来说，皮肤愈合的较晚阶段是尤为重要的。

第一阶段是“炎性”阶段（0-6天），其紧接在伤口例如皮肤伤口的施加之后。这被称为止血，由此引发由血纤维蛋白和血小板介导的血管收缩和凝血，以控制流血。凝块进一步起到成纤维细胞和炎性细胞进入到伤口的临时基质和细胞因子和生长因子的储库的作用。

在止血后，炎性细胞进入伤口并维持炎性过程（表现为红斑、发热、肿胀和疼痛）。这其中首先是多形核细胞（PMN），其被生长因子和细胞因子例如血小板衍生生长因子（PDGF）和IL-8吸引。IL-8是PMN的主要化学吸引剂，它的快速和瞬时表达对于炎性过程来说是关键的。PMN通过除去细胞碎片、外来粒子和细菌开始清理伤口，并在伤口中驻留相对短的时间段（1-2天）。到受伤后约3天止，PMN被单核细胞代替，所述单核细胞转化成也起到伤口清理剂作用的巨噬细胞。纤维细胞在炎性过程中发挥重要重用，并且具体来说参与胶原蛋白和细胞因子生产。

第二阶段是“增殖”阶段（其发生在皮肤损伤后3天至几周）。迁移的成纤维细胞产生永久的基于胶原蛋白的细胞外基质（ECM），巨噬细胞产生各种生长因子和细胞因子，所述细胞因子进而刺激生长因子的生产。基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶在受伤后的细胞迁移和ECM重塑中发挥重要作用，并且已证实，ECM的重新组织化的降低与成纤维细胞MMP生产和激活的减少相关联。

上皮再形成是皮肤愈合过程中的下一个关键事件，并且主要由迁移的角化细胞引发。上皮再形成通过生长因子和细胞因子刺激的角化细胞的增殖来实现，所述角化细胞通过肉芽组织迁移。这些细胞在迁移期间显得经历大量表型变化，表达与分化的细胞表型相关的蛋白质。随着迁移的进行，角化细胞获得产生丝氨酸蛋白酶和MMP的蛋白水解表型。角化细胞继续迁移到伤口空间中直至完成，此时有丝分裂活性的角化细胞经历另一种表型改变，导致发生上皮的分化和分层以及基底膜的重新形成，以完成上皮再形成过程。

细胞ECM粘附、ECM被蛋白酶的降解以及这些过程受细胞因子和生长因子的总体调控，是皮肤重塑和愈合的其他关键特点，它们通过细胞整合蛋白-EMC相互作用协调细胞功能，例如细胞迁移和伤口收缩。这样的相互作用调节细胞骨架重新组织化和新的整合蛋白-EMC相互作用，同时蛋白酶移除现有的整合蛋白相互作用，允许后部脱粘附和细胞迁移。在不存在后部脱粘附的情况下的细胞收缩性引起真皮重新组织，正如通过胶原蛋白晶格重新组织/收缩在实验上定量的。

皮肤愈合（以及因此疤痕形成）的最后阶段是成熟（其在损伤发生后4天至数周或数月之间发生）。成熟（或重塑）可能花费少至数天或数周时间，特别是对于浅层皮肤损伤来说，但是完整的过程可能持续长达几年。在这一阶段中，观察到皮肤的收缩、发红减少、厚度减小、硬结减少和强度增加。皮肤或疤痕组织在成肌纤维细胞的影响下收缩，肉芽组织中胶原蛋白的生产减少，并且血管减少。然后通过进一步的上皮再形成完成皮肤愈合。

因此，从上面可以先让看出，本文描述的多肽或组合物当在皮肤愈合过程中、特别是在增殖或成熟阶段施用时，可能具有减少或最少化疤痕组织或改善疤痕的美容外观的效果。因此，可以将上面描述的产品施用到浅层皮肤损伤或疤痕区域，其中疤痕可以被视为部分或完全愈合的皮肤。在优选实施方式中，本文中描述的多肽或组合物用于在成熟阶段时施用。

在特别优选实施方式中，疤痕组织是痤疮的结果。

在另一种优选实施方式中，疤痕组织是拉伸的痕迹或纹。所述纹优选地选自萎缩纹、妊娠纹、膨胀纹、表皮膨胀纹、妊娠纹、萎缩性线纹或白线纹中的任一种。

当在本文中提到时，“改善”皮肤的美容外观相对于正常的最适皮肤，即健康、水合、正常色素沉着和非老化的皮肤来确定。因此，对于老化的皮肤来说，可以按照实施例中所述测量老化的一种或多种征兆或症状，并与时间或生理上更年轻的皮肤的相同征兆进行比较，优选地当改善是老化的一种或多种征兆或症状的减轻时。

对于有疤痕或有瑕疵的皮肤来说，减少或最少化疤痕组织或改善疤痕或瑕疵的美容外观，意味着疤痕或瑕疵区域可以在否则可能与皮肤愈合过程相伴的疤痕形成、发红、皮肤痕迹或色素沉着（色素沉着过度或色素沉着过低）的水平和程度上显示出降低，其中这些属性是与正常的无疤痕的皮肤相比。也可以在愈合的皮肤或疤痕位点处或其附近测量皮肤的抗张强度，其中抗张强度的增加表明皮肤美容外观的改善或疤痕组织的减少。

在优选情况下，美容用途通过向皮肤表面施用来实现。

当在本文中使用时，“治疗”是指相对于在所述个体的皮肤没有罹患所述美容状况或障碍且没有进行所述治疗的不同身体部位上或者在没有进行所述治疗的相应的正常个体中所存在的症状或影响，所述状况或障碍的一种或多种美容症状或影响降低、减轻或消除、优选地到正常水平，所述症状或影响如皮肤干燥的存在或程度、色素沉着或疤痕形成的程度或面积等。

“防止”或“减少”是指绝对防止、或者降低或减轻症状或影响发作的程度或时间（例如延迟）。例如，通过在以干燥、色素沉着异常、有皱纹或由疤痕的皮肤为特征的状况出现之前定期施用本文描述的组合物，可以预防这样的状况。

优选地，所述治疗使用本文中描述的多肽来实现。包含所述多肽的美容组合物是特别优选的。

本发明的美容性治疗或预防方法可以有利地与一种或多种活性成分的施用相组合，所述活性成分能够有效治疗或预防所述障碍或状况和/或实现保湿。因此，本文描述的美容组合物可以另外含有一种或多种这样的活性成分。

根据本发明的另一方面，我们提供了本文中所定义的含有一种或多种多肽的产品和任选的一种或多种其他活性成分作为联合制剂，用于在本文所述的人类或哺乳动物疗法中同时、分别或顺序使用。

本发明的组合物，可以按照本领域公知的技术，使用易于获得的成分，以常规方式，使用一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂来配制。

因此，可以将活性成分、任选地与作为联合制剂的其他活性物质一起，与一种或多种常规载体、稀释剂和/或赋形剂合并，以制备常规的盖伦制剂如粉剂、袋剂、扁囊剂、酏剂、悬液（作为输注液）、乳液、溶液、糖浆、气溶胶（作为固体或在液体基质中）、软膏、无菌包装粉剂等。可以通过使用冷冻干燥、过冷或Permazyme，使组合物稳定。

适合的赋形剂、载体或稀释剂是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、碳酸钙、乳酸钙、玉米淀粉、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或者脂肪物质例如固体脂肪，或其合适的混合物。还可以使用用于获得持续释放配方的试剂，如羧基聚亚甲基、羧甲基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素或聚乙酸乙烯酯。

组合物可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、增粘剂、成粒剂、崩解剂、粘合剂、渗透活性剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、吸附增强剂（例如表面渗透剂如胆盐、卵磷脂、表面活性剂、脂肪酸、螯合剂）、棕色着色剂、有机溶剂、抗氧化剂、稳定剂、软化剂、硅酮、α-羟基酸、缓和剂、消泡剂、保湿剂、维生素、香精、离子型或非离子型增稠剂、表面活性剂、填充剂、离子型或非离子型增稠剂、多价螯合剂、聚合物、推进剂、碱化剂或酸化剂、乳浊剂、着色剂和脂肪化合物等。这些组分中的一些在下面更详细描述。

美容组合物中的其他活性成分或组分可以选自矿物质、维生素、酶、蛋白质、肽、氨基酸、脂质、多糖、适合作为防晒过滤物的物质、化学去角质剂、提取物、皮肤调理剂、抗氧化剂中的任一种或多种及其混合物。

可以与本发明的组合物合并的蛋白质的实例包括胶原蛋白和/或其衍生物（例如其如上定义的部分）、能够促进细胞生长的蛋白质或肽、糖蛋白1、糖蛋白2和层粘连蛋白。

本发明的组合物可以与酶合并，所述酶包括但不限于任一种或多种水果酶（例如菠萝蛋白酶）、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、透明质酸酶和粘多糖酶。

肽可以选自但不限于D,L-肌肽、D-肌肽、L-肌肽,鹅肌肽和Matrixyl（五肽衍生物）中的任一种或多种。

氨基酸可以选自但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸及其衍生物，包括表1中所定义的非天然存在的按结算中的任一种或多种。作为抗氧化剂的特别优选的氨基酸可以选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸中的任一种或多种。

美容组合物可以包含一种或多种脂质，其包括脂肪、油类、蜡等。适合的极性油类是例如卵磷脂类和脂肪酸甘油三酯类，即饱和和/或不饱和的、支链和/或直链的具有8至24、特别是12至18个碳原子的链长的烷羧酸的三甘油酯。脂肪酸甘油三酯可以有利地选自例如合成、半合成和天然油类，例如橄榄油、葵花油、大豆油、花生油、菜籽油、杏仁油、棕榈油、椰子油、蓖麻油、小麦胚芽油、葡萄籽油、蓟油、月见草油、澳洲坚果油等。

可选替地或另外地，油可以选自挥发性油类、非挥发性油类或其混合物。非挥发性油类包括满足至少一个下列定义的油类：（a）所述油在25℃和一个大气压下表现出不超过0.2mm Hg的蒸气压；（b）所述油在一个大气压下具有至少300℃的沸点。挥发性油包括不是如上所定义的“非挥发性”的材料。

非挥发性油可以选自非挥发性硅油、非挥发性烃类油及其混合物。适合的非挥发性硅油包括直链聚甲基硅氧烷，并且优选地，非挥发性硅油是高分子量二甲聚硅氧烷。可商购的直链聚甲基硅氧烷的实例包括来自于Dow Corning Corporation的DC 200 Fluid 20Cst、DC 200 Fluid100Cst、DC 200 Fluid 350Cst。

适合的非挥发性烃类油包括双甘油或三甘油的支链酯类或1,2,3,4-丁三醇或赤藓糖醇、二赤藓糖醇或三赤藓糖醇的酯类。优选地，非挥发性烃类油包含赤藓糖醇三乙基己酸酯（可以作为Salacos E-38从Nisshin Oilio获得）和聚甘油基-2三异硬脂酸酯（可以作为Cosmol 43V从Nisshin Oilio获得）、二乙基己基碳酸酯（可以作为Tegosoft DEC从Degussa获得）、二辛基醚（可以作为Cetiol OE从Cognis AG获得）、二辛基碳酸酯（可以作为Cetiol CC从Cognis AG获得）、异壬酸异壬基酯（可以作为Lanol 99从Seppic获得）、新戊酸三癸基酯（作为Ceraphyl 55由International Speciality Products供应）或其混合物。

挥发性油可以选自官能化和未官能化的挥发性硅油、挥发性烃类油及其混合物。可以在本发明中使用的挥发性油可以是饱和或不饱和的，具有直链或支链或环状结构，或具有任一个或多个所述特点的组合。

挥发性烃类油的实例包括聚癸烷例如异十二烷和异癸烷（例如可以从Presperse Inc.获得的Permethyl-99A）和C7-C15异链烷烃（例如可以从Exxon Chemicals获得的Isopar系列）。

挥发性硅油可以选自环戊硅氧烷、环己硅氧烷或其混合物。可商购的挥发性环状硅油的实例包括来自于Dow Corning Corp.的DC 244、DC 245、DC 344和DC 345，来自于Momentive Performance Materials的SF-1204和SF-1202硅酮流体，来自于General Electric Co.的GE 7207和7158，来自于SWS Silicones Corp.的SWS-03314。

直链挥发性硅油可以是直链聚甲基硅氧烷。可商购直链聚甲基硅氧烷的实例包括来自于Dow Corning Corp.的DC 200Fluid,5Cst。

本发明的美容组合物还可以包含一种或多种多糖，其选自但不限于任一种或多种阴离子型多糖（例如藻酸、果胶、黄原胶、透明质酸、硫酸软骨素、阿拉伯树胶、加拉亚胶、黄耆树胶、羧甲基几丁质、纤维素胶、糖胺聚糖）、阳离子型多糖（例如壳聚糖、乙酰化壳聚糖、阳离子型瓜尔胶、阳离子型羟乙基纤维素（HEC））、非离子型多糖（例如淀粉、糊精、瓜尔胶、纤维素醚例如羟乙基纤维素、甲基纤维素和硝酸纤维素）、两性多糖（例如羧甲基壳聚糖、N-羟基-二羧基乙基-壳聚糖、改性的马铃薯淀粉）和疏水性多糖（例如鲸蜡基羟乙基纤维素、聚季铵盐24）。

美容组合物还可以包含适合作为防晒过滤物的物质，例如有机防晒剂例如肉桂酸衍生物。有机防晒活性物质可以选自亲水有机防晒剂、疏水有机防晒剂或其混合物。防晒剂的适合实例可以在《CTFA国际美容成分字典和手册》（CTFA International Cosmetic IngredientDictionary and Handbook，第7版第2卷，pp.1672，由Wenning和McEwen主编）（The Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.,Washington,D.C.1997）中找到。

有机防晒剂可以选自β,β-二苯基丙烯酸烷基酯衍生物、α-氰基-β,β-二苯基丙烯酸酯衍生物、邻氨基苯甲酸衍生物、二苯甲酮衍生物、樟脑衍生物、二苯甲酰基甲烷衍生物、对氨基苯甲酸衍生物、水杨酸衍生物、三嗪衍生物或其混合物。例如，疏水性有机防晒剂可以选自4-(1,1-二甲基乙基)-4′-甲氧基二苯甲酰基甲烷、4-异丙基二苯甲酰基甲烷、4-(1,1-二甲基乙基)-4′-甲氧基二苯甲酰基甲烷、2-乙基己基-2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸酯或其混合物。

可商购的4-(1,1-二甲基乙基)-4′-甲氧基二苯甲酰基甲烷、也称为丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷或阿伏苯宗的实例，包括来自于GivaudanRoure S.A.的Parsol TM 1789和来自于Merck&Co.,Inc.的Eusolex TM9020。可商购的4-异丙基二苯甲酰基甲烷、也称为异丙基二苯甲酰基己烷的实例，包括来自于Merck&Co.,Inc.的Eusolex TM 8020。可商购的2-乙基己基-2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸酯、也称为Octocrylene的实例，包括来自于BASF的Uvinul N539SG和来自于Rona/Merck的Eusolex OCR。

在某些实施方式中，亲水性有机防晒剂可以是2-苯基苯并咪唑-5-磺酸。可商购的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸、也称为PBSA的实例，包括来自于Rona/Merck的Eusolex232。

肉桂酸衍生物防晒剂的适合实例可以在《CTFA国际美容成分字典和手册》（CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary andHandbook，第7版第2卷，pp.1672，由Wenning和Mc Ewen主编）（TheCosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.,Washington,D.C.1997）中找到。肉桂酸衍生物可以选自2-乙基己基-对甲氧基肉桂酸酯、二乙醇胺甲氧基肉桂酸酯、2-乙氧基乙基-对甲氧基肉桂酸酯或其混合物。例如，肉桂酸衍生物可以是2-乙基己基-对甲氧基肉桂酸酯。

美容组合物可以与化学去角质剂组合，所述去角质剂选自但不限于α-羟基酸（AHA）、β-羟基酸（BHA）或多羟基酸例如水杨酸、乙醇酸、柠檬酸和苹果酸中的任一种或多种。

可以掺入到美容组合物中的提取物包括但不限于植物提取物，其可以包含酚类化合物例如类黄酮（例如糖基芦丁、阿魏酸、咖啡酸）、呋喃亚甲基葡萄糖醇、丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、去甲二氢愈创木树脂酸、去甲二氢愈创木酸、三羟基丁酰苯及其衍生物。在本发明的组合物中使用的具体植物提取物包括芦荟提取物、人参提取物和问荆提取物。

人参提取物可以通过用亲水性溶剂（具体来说水、乙醇、乙二醇或其任何混合物）提取人参的根来获得。所述提取物含有皂角苷类、甾类、糖类、果胶、维生素、矿物质和脂质。

问荆提取物可以通过用亲水性溶剂（例如水、乙醇、乙二醇或其任何混合物）提取问荆（Equisetum arvense）的整株药草来获得。所述提取物含有硅酸盐、类黄酮、皂草苷、咖啡酸和阿魏酸。

美容组合物还可以包含皮肤调理剂。皮肤调理剂可以选自保湿剂、去角质剂、润肤剂或其混合物。保湿剂包括多元醇类例如甘油、丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、羟丙基山梨糖醇、己二醇、1,3-丁二醇、1,2,6-己三醇、乙氧基甘油、丙氧基甘油或其混合物。

可以与本发明的组合物合并的抗氧化剂的实例包括但不限于氨基酸、维生素、矿物质、类胡罗卜素、肽、硫醇、亚砜亚胺化合物、螯合剂、不饱和脂肪酸、酚类化合物、植物提取物、芪类、尿酸、甘露糖醇、氯原酸、咪唑类（例如尿刊酸）、呋喃亚甲基山梨糖醇、泛醌、泛醇、质体醌、植物甾醇类及其衍生物（例如盐类、酯类、醚类、糖类、核苷酸类、核苷类、肽类和/或脂类衍生物），其中一些在上面已描述。

维生素可以选自但不限于下列任一种或多种：维生素A及其衍生物（例如类视黄醛或视黄醇或其衍生物例如棕榈酸视黄酯或丙酸视黄酯），生物素，叶酸，泛酸钙，烟酰胺，盐酸吡哆醇，盐酸吡哆醛，核黄素，盐酸硫胺素，胸苷，维生素B12，维生素B3（例如烟酰胺），维生素B5（例如泛酰醇），维生素C及其衍生物（例如抗坏血酸棕榈酸酯，抗坏血酸磷酸镁，抗坏血酸乙酸酯），生育酚类及其衍生物（例如维生素E乙酸酯）。

矿物质可以选自但不限于钼（例如(NH₄)OMo₇O₂₄）、铝（例如AlCl₃）、钙（例如CaCl₂）、钴（例如CoCl₂）、铬（例如CrK(SO₄)）、铜（例如CuSO₄）、铁（例如Fe(NO₃)₃，FeSO₄）、钾（例如KCl）、镁（例如MgCl₂）、锰（例如MnCl₂，MnSO₄）、磷酸盐（例如Na₂HPO₄，NaH₂PO₄）、碳酸盐（例如NaHCO₃）、硅酸盐（例如Na₂SiO₃）、钠（例如NaCl）、钒（例如NH₄VO₃）、镍（例如NiCl₂）、锡（例如SnCl₂）、锌（例如ZnO、ZnSO₄）、硒（例如硒代甲硫氨酸、依布硒啉、H₂SeO₃、Na₂SeO₃）、硫酸盐和硝酸盐的任一种或多种盐类。

类胡罗卜素可以选自但不限于任一种或多种胡萝卜素，例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、ψ-番茄红素、八氢番茄红素等及其衍生物。

硫醇类可以选自但不限于下列任一种或多种：硫代葡萄糖金，丙基硫尿嘧啶，硫氧还蛋白，硫辛酸，谷胱甘肽，半胱氨酸，胱氨酸，胱胺以及它们的糖基、N-乙酰基、甲基、乙基、丙基、戊基、丁基和月桂基、棕榈酰基、油烯基、γ-亚油烯基、胆固醇基和甘油基酯及其盐，硫代二丙酸二月桂基酯，硫代二丙酸二硬脂基酯，硫代二丙酸及其衍生物。

亚砜亚胺化合物可以选自但不限于高半胱氨酸亚砜亚胺、丁硫氨酸砜类、戊、己、庚硫氨酸亚砜亚胺中的任一种或多种，其可以包含在组合物中以使它们以非常低的剂量（例如pmol至μmol/kg）提供。

螯合剂可以选自但不限于下列任一种或多种：脱辅基铁蛋白，desferral，乳铁蛋白，α-羟基脂肪酸，棕榈酸，植酸，α-羟基酸（例如柠檬酸、乳酸、苹果酸），腐殖酸，胆汁酸，胆汁提取物，胆红素，胆绿素，EDTA，EGTA及其衍生物。

不饱和脂肪酸可以选自但不限于γ-亚麻酸、亚油酸、油酸及其衍生物中任一种或多种。

芪及其衍生物包括例如芪氧化物和反式芪氧化物。

可以将各种其他任选活性成分掺入到本发明的美容组合物中。这些其他成分的非限制性实例包括其他皮肤护理活性物质，例如法呢醇、没药醇、植三醇、尿素、胍（例如氨基胍），己脒化合物、其盐或衍生物，糖胺，自晒黑剂（例如脱羟基丙酮），结构化剂，亲水胶凝剂，抗痤疮药物（间苯二酚、水杨酸等），皮肤抚慰和康复剂例如尿囊素等，以及适用于美容目的的试剂例如精油、芳香剂、皮肤增感剂、遮光剂、芳族化合物（如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油和丁子香酚）。

通过使用本领域公知的技术，本文描述的组合物可以被配制成在施用到身体后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。

组合物可以采取允许递送或靶向特定细胞或组织的任何适合的剂型，例如作为乳液或活性成分可以吸附、吸收、掺入或结合在其上的脂质体、类脂囊泡、微球、纳米粒子等。这可以将产物有效地转变成不溶形式。这些颗粒形式可以克服稳定性（例如降解）和递送两种问题。

溶液、悬液、凝胶和乳液的使用是优选的，例如，活性成分可以装载在水、气体、水基液体、油、凝胶、乳液、水包油或油包水乳液、分散系或其混合物中。

乳化剂可以选自非离子型乳化剂、阴离子型乳化剂、阳离子型乳化剂、两性离子乳化剂、两性乳化剂或其混合物。乳化剂在本领域中是已知的。参见例如McCutcheon的《去污剂和乳化剂》（Detergents andEmulsifiers，北美版（1986），Allured Publishing Corporation出版）。

当美容中可接受的载体是硅酮包水乳液时，乳化剂优选地选自聚氧化烯共聚物、聚甘油基共聚物或其混合物。聚氧化烯共聚物也称为硅酮聚醚，详细描述在US4,268,499中。可商购的聚氧化烯共聚物的实例包括来自于Dow Corning Corp.的DC5225C或DC2-5185C（可以作为与环戊硅氧烷的掺混物获得的PEG/PPG-18/18二甲聚硅氧烷），i及来自于Shin-Etsu Inc.的KF6017或KF6028（PEG-9二甲聚硅氧烷）。可商购的聚甘油基乳化剂的实例包括来自于Shin-Etsu Inc.的KF6100和KF6104。

组合物优选地用于表面施用（即施用到皮肤）。

表面组合物包括凝胶、霜剂、软膏、喷剂、洗剂、油膏、口红、肥皂、粉剂、薄膜、气溶胶、滴剂、泡沫剂、溶液、乳液、悬液、分散系例如非离子性囊泡分散系、乳剂和本领域任何其他常规的美容形式。

软膏、凝胶和霜剂可以例如用水性或油性基料并添加适合的增稠剂和/或胶凝剂来配制。洗剂可以使用水性或油性基料来配制，并且一般还含有一种或多种乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。粉剂可以在任何适合的粉剂基料协助下形成。滴剂和溶液可以用水性或非水性基料来配制，并且还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。气溶胶喷剂方便地使用适合的推进剂从加压包装物中递送。

在某些实施方式中，本文描述的多肽和美容组合物可以通过已施加、浸渍或化学键合有多肽或组合物的产品、装置或材料，表面施用到皮肤。为此，可以将绷带、膏药（例如粘附性贴片）、纱布、手术胶带、棉拭子或其他吸附性材料例如粉扑、绒布或海绵或支持基质用本文所描述的多肽或组合物涂布、浸渍或化学键合。例如，许多组合物可以使用皮肤贴片施用到皮肤，所述皮肤贴片在本领域中已很好地描述，例如US2008/0038300、US2009/0043236、WO2005/067499和WO2009/085302，其通过参考并入本文。在某些实施方式中，包含本文所描述的多肽或组合物的材料可以采取装置的形式，所述装置可以例如由待治疗的对象佩戴。例如，本文描述的多肽或组合物可以施用、浸渍或化学键合到形成尿布、手套、袜子等的全部或一部分的材料或支持基质上。

美容组合物可以与使用说明书一起包含在容器、包装物或配药器中。

因此，本发明的另一方面包括提供用本文描述的多肽或组合物涂布、浸渍或化学键合的产品、材料或装置。本发明还扩展到用于本文描述的用途的这样的产品、材料或装置。优选地，所述产品是绷带、膏药（例如粘附性贴片）、纱布、手术胶带或棉拭子，或者所述装置是尿布、手套或袜子。

本发明的组合物中活性成分的浓度取决于施用方式、治疗过程、患者的年龄和体重、美容适应症、待治疗的身体或身体区域，并且可以根据选择进行改变或调整。然而，一般来说，本文中描述的化合物的浓度范围为按照本发明的方法制备的上述组合物的0.0001、0.0005、0.001或0.01至50%，例如0.0005-40%，例如0.01至25%，例如0.1或0.5至5，例如1-5%（用于施用、特别是用于表面施用的最终制剂的w/w或v/v），例如1%溶液。

当存在超过一种化合物例如本文中所描述的其他保湿剂时，每种化合物可以以如上所述的量存在。所述浓度参考化合物本身的量来确定，因此，应该留有适当余地以将组合物的纯度考虑在内。当作为单一药剂表面施用时，取决于待治疗的哺乳动物，多肽的有效的单一剂量可以在0.001-100mg/cm2/天，例如0.1-100mg/cm2/天，优选地0.001-10mg/cm2/天，例如0.1-10mg/cm2/天的范围内。

优选地将液体溶液、霜剂或悬液用于本文描述的多肽或组合物的表面施用。

可以施加或施用组合物的动物限于哺乳动物。哺乳动物优选地是灵长动物、驯养动物、牲畜和实验室动物。因此，优选的哺乳动物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猫、狗、猴、猪、奶牛、山羊、绵羊和马。特别优选地，组合物施加或施用到人类。

提供下面的实施例仅仅是出于说明的目的，其中提到的图如下所述：

图1示出了用包含本发明的多肽的组合物治疗的对象在治疗前（基线）、治疗2周后和治疗12周后的照片。在2周和12周后两种情况下，老化皮肤的各种征兆的减轻是明显的。提供的值指示了35位参加者的平均变化。

图2示出了图1中对象的特写照片，强调了在用包含本发明的多肽的组合物治疗2和12周后看到的细纹和皱纹的减少。

图3示出了用包含本发明的多肽的组合物治疗的对象在治疗前（基线）和治疗12周后的特写照片。圆圈区域示出了在治疗12周后皱纹的明显减少。

图4示出了条形图，其示出了根据面部两侧上的触觉/视觉临床分级，被认为在衰老的各种征兆方面获得改善的对象的百分数。

图5示出了条形图，其示出了在用包含本发明多肽的组合物进行每日两次共三周的治疗后，与未治疗的情况相比，基于4位对象的皮肤水合平均增加约23%。

图6示出了条形图，其示出了在用包含本发明多肽的组合物进行每日两次共三周的治疗后，与未治疗的情况相比，基于4位对象的经表皮水分丢失平均减少约14.5%（皮肤屏障功能提高）。

图7示出了条形图，其示出了在用包含本发明多肽的组合物进行每日两次共三周的治疗后，与未治疗的情况相比，基于4位对象的眼部皱纹体积平均减少约23%。

图8示出了条形图，其示出了在用包含本发明多肽的组合物进行每日两次共三周的治疗后，与未治疗的情况相比，基于4位对象的黑色素含量平均减少约10%。

实施例1：白细胞凝集素的分离和包含白细胞凝集素的制备物

白细胞凝集素蛋白（在下文中示出）及其制备方法已详细描述在WO2010/049688中，其全部内容通过参考并入本文。然而，为了完整性起见，用于制备包含白细胞凝集素的组合物的优选方法在下面进行描述，并示例了上面描述的方法。

可用作起始原料用来分离本发明的多肽的部分纯化的zonase的制备方法提供在WO99/29836中，其通过参考并入本文（特别是所描述方法的实施例1，但是任选地不含尿素步骤）。

白细胞凝集素从鲑鱼孵化液纯化。为了提高孵化液的蛋白质浓度，在孵化前将鲑鱼卵转移到极小体积水中。可以通过高温（室温）或通过脱氧合作用来诱导高度同步的孵化（Oppen-Berntsen等，1990,Aquaculture,86,pp.417-430），这产生小体积高度浓缩的粗品白细胞凝集素和相关蛋白的制备物。对于超过95%的胚胎来说，孵化应该在2小时内完成。

使用具有7μm孔眼尺寸的标准滤器过滤孵化液，以除去可能在随后的过滤步骤中堵塞滤器的材料。该滤液、即处理过的孵化液，可以被冷冻数年而不显著降解，然后融化并用于进一步的蛋白质纯化。这一事实极大简化了用于纯化鲑鱼白细胞凝集素的起始原料的生产。

使用孔眼尺寸为0.45μm的滤器对处理过的孵化液进行过滤，并收集滤液。然后使用排除尺寸为8kDa的滤器对滤液进行渗滤，用缓冲液交换孵化液的水。在这种情形中，缓冲液含有0.5mM磷酸盐和1mMNaCl，尽管其他缓冲液同样适合。例如，pH在中性附近或微碱性（pH7.5-8.5），含有5mM NaCl的磷酸盐缓冲盐水或含有毫摩尔Tris（例如10mM）的缓冲液，是适合的。从渗滤步骤收集渗余物，并通过添加缓冲液进行稀释。

使用排阻尺寸为100kDa的超滤膜对渗滤液进行超滤，并收集包含白细胞凝集素的滤液。最后，通过孔眼尺寸为0.22μm的滤器对滤液进行过滤，并收集最终滤液。该滤液是白细胞凝集素的富集制备物。

实施例2：白细胞凝集素对成纤维细胞的体外活性

材料和方法

将按照实施例1中的方法制备的组合物施用到衰老的成纤维细胞（人类真皮成纤维细胞，Hayflick老化模型的复制品，Hayflick,L.和Moorhead,P.S.（1961）.人类二倍体细胞株的连续培养（The serialcultivation of human diploid cell strains.），Exp Cell Res25:585-621）。就此而言，衰老的成纤维细胞与年轻成纤维细胞相比释放更大量的MMP，并且正如上面讨论的，MMP活性与老化和疤痕形成两者的征兆和症状相关。特别是被称为间质胶原酶或成纤维细胞胶原酶的MMP-1，由于它切开I、II和II型间质胶原蛋白，因此参与细胞外基质的分解。

向衰老的成纤维细胞施用三种不同浓度的白细胞凝集素组合物，0.015%、0.050%和0.150%[v/v]。所述组合物是白细胞凝集素的富集制备物，并且v/v是指每单位体积的富集制备物的总体积（包括非白细胞凝集素组分）。MMP-1的浓度通过ELISA来测量。同时进行两个对照实验。第一个对照包括使用从青少年包皮的真皮或来自于不同位置例如面部的成年皮肤分离的正常人类真皮成纤维细胞（NHDF），并由此证实MMP-1的正常的“非老化”水平（P7-NHDF）。第二个对照包含与TGF-β（10ng/ml）而不是白细胞凝集素相接触的衰老细胞。TGF-β（转化生长因子β）是一种多功能细胞因子，其调控细胞增殖和分化、组织塑造和修复。已知它抑制MMP-1的释放。结果示出在表2中，从所述结果可以看出，浓度为0.050%和0.150%的白细胞凝集素组合物导致几乎完全抑制MMP-1从衰老成纤维细胞的释放，使得水平甚至低于青少年成纤维细胞的水平。这些结果表明，预期白细胞凝集素可用于改善皮肤、特别是显示出高水平MMP和/或异常的MMP活性的老化和有疤痕的皮肤的美容外观。事实上，示出了包含白细胞凝集素的组合物的效果的下列结果证实了这样的组合物对老化皮肤的效果。

表中的符号如下所述：

^（1）：用于统计学显著性的阈值

ns：>0.05，不显著

^*：0.01至0.05，显著

^**：0.001至0.01，非常显著

^***：<0.001，极端显著

<或>：低于或高于检测极限

实施例3：白细胞凝集素对老化皮肤的体内效果

如实施例1中所述制备包含白细胞凝集素的组合物，但是省略通过排除尺寸为100kDa的滤器进行超滤的倒数第二个步骤。将组合物制备成1%和3%润肤液[v/v]（酶单位体积润肤液的组合物总体积），在试验中使用两种活性物质润肤液，并与不含活性组分、即孵化液组合物的对照润肤液进行比较。所述润肤液是水包油（O/W）乳液。油相占总组合物的9%，并用氢化卵磷脂乳化。

进行双盲安慰剂对照的临床试验，在具有轻度至中度光损伤、即老化面部皮肤的女性中评估表面皮肤治疗的有效性和耐受性。该试验的持续时间为12周，在基线、第2周、第6周和第12周时随访。使用目测分级、仪器测量、数字化VISIA CR照片和对象自我评估调查问卷来评估效能。

对象数量

一百零一位（101）女性对象完成本研究（对于三种处理，即一种安慰剂和两种包含不同浓度的活性组分即白细胞凝集素的组合物来说，N>30）。

对象群体和识别

对象是年龄为40至65水的健康女性并被指派三位数字的编号，其在与临床研究编号联合使用时，独一无二地识别研究中的每位对象。在整个研究中该编号一直伴随着所述对象，以维持实验的匿名性。

合格判据

包含判据

1.女性，年龄为40至65岁并包括40和65岁，其通过健康和合格性调查问卷确定为健康总体良好。

2.愿意合作并参加，在研究持续时间内遵从研究要求并立即报告任何不利症状。

3.在面部具有临床确定的轻度至中度光损伤（细纹、皱纹、色素沉着过度、松弛和粗糙），对应于改良Griffith分级量表的3-7的分值。

4.没有可能损害试验位点的评估或通过参与研究而增加对象健康风险的任何疾病状态或面部皮肤身体状况（例如特应性皮炎、湿疹、银屑病、脂溢性皮炎）。

5.愿意在研究持续时间内避免长期日光暴露和所有日光浴床的使用。应该特别小心以穿戴防护衣包括太阳镜，并避免10AM至4PM的日光暴露。

6.愿意在研究持续时间内继续使用所有常规品牌的有色美容品、清洁剂、化妆水（如果适用）和卸妆水。个体必须克制使用指派的试验材料之外的任何抗老化产品或皮肤亮白产品。

7.愿意在每次计划的诊所随访之前至少20分钟卸除所有化妆。在研究随访完成之前不向面部或眼部区域施用其他表面产品。如果对象到达时尚未卸除所有化妆，要求她在诊所卸除残余化妆并在程序之前等待至少20分钟。

8.使用激素替代疗法或服用激素避孕的个体，在研究开始之前至少一个月内必须使用稳定的用药方式，并且愿意在研究持续时间内继续且不改变这种药物治疗。在研究开始时未使用HRT或激素的个体，必须愿意在研究持续时间内不开始使用它们。

9.愿意合作并参加，遵从研究要求并立即报告任何不利症状。

排除判据

1.对任何个人护理产品具有不耐受或过敏史的个体。

2.在进入研究之前30天内使用过任何处方或OTC皮肤亮白产品的个体。

3.具有检查研究人员视为不适合参加的皮肤状况和/或疾病的个体。

4.在研究期间正在哺乳、妊娠或计划妊娠的个体。

5.在进入研究之前30天内日常使用任何抗衰老、抗皱纹表面抗氧化剂的个体。

6.在研究开始的6个月内使用酶法面部皮肤治疗的个体。

7.在研究开始的3个月内使用Retin-A

Retin-A Micro

Renova

AvitaTazorac

Avage

或Differin

或其他表面类视黄醇，或在过去6个月内口服类视黄醇。

8.在研究开始的30天内在面部上日常使用含有α-、β-、γ-羟基酸（包括水杨酸和Lachydrin）、视黄醇或视黄醇衍生物的产品或其他“抗老化”产品。

9.在3个月的治疗内或研究期间接受面部皮肤磨削术或化学去死皮治疗的个体。

10.在6个月的治疗内或研究期间，在被治疗区域内接受使用光RF或其他装置的治疗的个体。

11.在9个月的治疗内或研究期间，在被治疗的区域内接受Botox、胶原蛋白、脂肪注射或使用注入或植入材料进行增大的方法的个体。

12.在本试验开始之前12个月内经历表面重修手术、面部提升或眼或眼睑手术的个体。

13.在面部上具有预先存在的和/或潜伏皮肤病症（例如白癫风、特应性皮炎、银屑病、红斑痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、严重表皮脱落等）或据调查人员来看可能干扰研究结果的医学状况/疾病的个体。

14.具有免疫抑制/免疫缺陷障碍（包括HIV感染或AIDS）病史或目前使用免疫抑制药物的个体。

15.正参加任何其他临床使用研究的个体（贴片研究可以接受）。

16.患有不受控制的疾病例如糖尿病、高血压、甲状腺机能亢进或甲状腺机能减退的个体。一些具有多种健康状况的个体被排除在参加之外，即使可以通过饮食、药物等控制所述状况。

17.在包含在本研究中之前28天内参加任何临床试验的个体。

在调查人员或其指定者根据医疗史和研究前面试和检查的发现做出慎重判断后，允许个体加入本研究。

研究设计

进行双盲安慰剂对照的临床试验，在具有轻度至中度光损伤、即老化面部皮肤的女性中评估表面皮肤治疗的有效性。该试验的持续时间为12周，在基线、第2周、第6周和第12周时按计划随访。使用目测分级、仪器测量、数字化VISIA CR照片和对象自我评估调查问卷来评估效能。

每组N>30的三个组完成本研究。对象在12周内接受向面部施加的活性物质皮肤处理、即上面描述的白细胞凝集素组合物，或介质对照（水）。按照预先确定的随机化方案将对象随机分配到3个组中。

效能和耐受性评估

由专业临床分级人员对面部右侧和左侧的下面示出的参数进行评估。使用改良的Griffith量表，其中0=无，1-3=轻度，4-6=中度，7-9=重度。当需要更好地描述皮肤状况时使用半个点。

·细纹

·皱纹

·色素沉着过度

·松弛

·暗淡/无光（透明感）

·触觉粗糙度

由专业临床分级人员对面部右侧和左侧的下面示出的参数进行评估。使用4个点的量表，其中0=无，2=轻度，3=中度，4=重度。当需要更好地描述皮肤状况时使用半个点。

·红斑

·干燥/脱落

·烧灼/叮刺感

·瘙痒

·紧绷/干燥感觉

数字VISIA CR摄影

获取面部右侧和左侧的VISIA-CR成像。对象在成像时将头发拉后，除去首饰，闭上眼睛，使对象在取景框内居中并采取中性面部表情。

经表皮水分丢失（TEWL）

在仪器测量之前，使对象平衡到诊所的环境条件至少20分钟。在研究随访期间每小时记录环境条件。在此期间，将对象分级、完成调查问卷和/或进行VISIA CR成像。

在所有随访时使用皮肤水分流失测试仪获取经表皮水分丢失（TEWL）测量值。测量值在右侧和左侧面颊上，在从眼角向下延伸的线与水平横过鼻子下部的线的交点处获取。

皮肤水分流失测试仪利用开放仓室系统测量TEWL。置于皮肤表面上的手持式探针对表面上的两个点处的相对湿度进行取样，允许从测量到的湿度梯度计算水分流失速率。

皮肤弹性测量仪MPA580

在所有随访时对所有对象获取皮肤弹性测量仪测量值。使用皮肤弹性测量仪来评估皮肤的粘弹性性质（即可延伸性和弹性）。所述仪器向小面积皮肤施加真空，并通过光学技术测量皮肤的弹性响应（皮肤进出孔隙的运动）。

对于本研究来说，使用2mm探针，施加300mbar的真空，并进行两个吸吮和释放的循环。循环时间是打开5秒和关闭10秒。

测量值在右侧和左侧面颊上，在从眼角向下延伸的线与水平横过鼻子下部的线的交点处，或者在靠近下颌的可选替位置处获取。

皮肤评估和自我评估调查问卷

对象完成皮肤自我评估调查问卷，所述问卷含有描述对象对其面部右侧和左侧上的面部皮肤外观和状况的感觉的问题。

结果

细纹

在第2周时，用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象，与安慰剂（4.58%）相比显示出细纹减少（例如5.59%（1%溶液）和5.65%（3%溶液）的百分率变化）。细纹的减少在第6周（例如14.34%（1%溶液），14.86%（3%溶液）和8.98%（安慰剂））和第12周时（例如23.43%（1%溶液），25.99%（3%溶液）和14.68%（安慰剂））继续。图1和2示出了细纹减少28%的对象。

皱纹

在第2周时，用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象，与安慰剂（0.70%）相比显示出皱纹减少（例如2.15%（1%溶液）和1.75%（3%溶液）的百分率变化）。皱纹的减少在第6周（例如6.13%（1%溶液），7.32%（3%溶液）和3.70%（安慰剂））和第12周是（例如14.72%（1%溶液），15.15%（3%溶液）和9.57%（安慰剂））继续。图1示出了皱纹减少12.5%的对象。图3示出了皱纹减少26.32%的对象。

色素沉着过度

在第2周时，用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象，与安慰剂（0.40%）相比显示出色素沉着过度的减少（例如2.11%（1%溶液）和2.68%（3%溶液）的百分率变化）。色素沉着过度的减少在第6周（例如5.61%（1%溶液），7.91%（3%溶液）和3.16%（安慰剂））和第12周时（例如10.53%（1%溶液），15.35%（3%溶液）和5.73%（安慰剂））继续减少。图1示出了12周后老年斑的色素沉积减少15%的对象。

松弛

在第2周时，用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象，与安慰剂（0.87%）相比显示出松弛的减少（例如2.64%（1%溶液）和1.62%（3%溶液）的百分率变化）。松弛的减少在第6周（例如6.33%（1%溶液）和6.61%（3%溶液），2.51%（安慰剂））和第12周时（例如10.55%（1%溶液）和11.33%（3%溶液），5.18%（安慰剂））继续减少。图1示出了在12周后松弛（松垂）减少7.69%的对象。

暗淡/无光（透明感）

在第2周时，用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象，与安慰剂（10.67%）相比显示出皮肤透明感的改善（例如12.95%（1%溶液）和16.00%（3%溶液）的百分率变化）。这种改善在第6周（例如29.26%（1%溶液），28.50%（3%溶液）和19.07%（安慰剂））和第12周时（例如37.17%（1%溶液），39.18%（3%溶液）和26.72%（安慰剂））继续。图1示出了暗淡度减少33.33%的对象。

触觉粗糙度

在第2周时，用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象，与安慰剂（13.38%）相比显示出皮肤触觉粗糙度的降低（例如16.51%（1%溶液）和20.24%（3%溶液）的百分率变化）。这种改善在第6周时继续（例如24.77%（1%溶液），26.65%（3%溶液）和16.79%（安慰剂）），但是在第12周时没有进一步降低（例如26.61%（1%溶液），29.19%（3%溶液）和15.79%（安慰剂））。图1示出了触觉粗糙度降低12.5%的对象。

干燥/脱落

在第2周时，用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象，与安慰剂（64.71%）相比显示出皮肤干燥/脱落的减少（例如72.09%（1%溶液）和100.00%（3%溶液）的百分率变化）。然而，与安慰剂相比，在第6周（例如86.05%（1%溶液）、84.62%（3%溶液）和100.00%（安慰剂））和第12周时（例如90.70%（1%溶液）、100.00%（3%溶液）和89.47%（安慰剂））没有进一步减少。

TEWL

尽管用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象在第2周时显示出TEWL的减少，但这与安慰剂（17.26%）相比没有明显差别（例如15.35%（1%溶液）和14.53%（3%溶液）的百分率变化）。然而，与安慰剂相比，在第6周（例如29.46%（1%溶液）、26.66%（3%溶液）和22.96%（安慰剂））和第12周时（例如37.46%（1%溶液）、40.04%（3%溶液）和34.21%（安慰剂））存在进一步更大的减少。

可延展性

尽管用包含一种活性物质组合物的润肤液治疗的对象在第2周时显示出皮肤可延展性的改善，但这与安慰剂（10.82%）相比仅略微不同（例如16.18%（1%溶液）和17.21%（3%溶液）的百分率变化）。在第6周时在三种治疗之间没有显著差异（例如18.04%（1%溶液）、17.18%（3%溶液）和19.90%（安慰剂）），但是在第12周时使用包含活性组分的组合物进行的皮肤治疗与安慰剂相比具有更高的进一步改善（例如31.84%（1%溶液）、33.57%（3%溶液）和16.48%（安慰剂））。

在研究开始时和治疗12周后面部两侧上触觉/视觉临床分级的比较显示，所有对象在用包含本发明的多肽组合物治疗后在她们皮肤的暗淡度和粗糙性方面显示出改善，并且大部分对象在细纹（97%的对象）、皱纹（91%的对象）、色素沉着过度（87%的对象）和松垂（80%的对象）方面显示出改善（图4）。

调查问卷揭示，从使用6周起，在安慰剂与包含本发明的多肽的美容组合物之间，对关于总体外观、总体感觉、光滑度、柔软度、透明感和弹性的陈述的平均分值，发现统计学显著的差异。

因此，从上述结果明显看出，包含白细胞凝集素的组合物与安慰剂相比显示出对老化皮肤的每一方面的效果。

实施例4：用于生产含白细胞凝集素组合物的可选替方法

生产含白细胞凝集素组合物的可选替方法的初始步骤与实施例中描述的相同。然而，在使用孔眼尺寸为7μm的标准滤器对孵化液进行过滤以除去可能在随后的过滤步骤中堵塞滤器的材料之后，可选替方法与实施例1的方法分开。在可选替方法中，将该滤液即处理过的孵化液按照制造商的说明书装载到二乙基氨基乙基（DEAE）离子交换柱上，并用20mM Tris HCl（pH8.50）溶液清洗。舍弃通流物。使用含有50mMNaCl的清洗液将白细胞凝集素蛋白从柱子上洗脱。收集洗脱液，然后使用排除尺寸为8kDa的滤器进行渗滤，以用缓冲液交换孵化液的水。在这种情形中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水，尽管其他缓冲液同样地适合。例如，含有0.5mM磷酸盐和1mM NaCl的缓冲液或pH在中性附近或略碱性（pH7.5-8.5），含有5mM NaCl并含有毫摩尔Tris（例如10mM）的缓冲液，是适合的。收集来自于渗滤步骤的渗余物，并通过添加缓冲液进行稀释。

最后，通过孔眼尺寸为0.22μm的滤器对滤液进行过滤，并收集最终滤液。该滤液是白细胞凝集素的高度富集的制备物，其不含或仅含痕量的来自于孵化液的肽。

实施例5：白细胞凝集素组合物对老化皮肤的体内效果

研究目的

本双盲皮肤护理研究的目的是评估在使用3%的包含实施例4的白细胞凝集素制备物的凝胶进行3周的治疗方案后，与未治疗的情况相比，前臂上与水合和经表皮水分丢失（TEWL）相关的变化。此外，相对于未治疗的情况下，分析了白细胞凝集素对手上老年斑的色素沉着（黑色素含量）和所选的眼部皱纹体积的影响。

材料和方法

研究按照2003年1月29日的第4版SOP“Hautpflege-Prüfung标准”进行，在测量时间点方面进行了修改。

研究在4位女性对象上双盲地进行。参见研究的对象的资格是在前臂上皮肤干燥（保湿能力检测仪基线值<20），在外眦处具有眼部皱纹，并且在双手上具有老年斑。所有4位对象正确并完全完成研究。所有4位对象的结果都包含在数据分析中。4位对象的年龄在56.3至70.9岁之间（平均为64.3±6.3岁）。

分析皮肤水合和经表皮水分丢失（TEWL）的测试位点是两个前臂。在前臂上具有4个测试区域，即每个前臂内侧上两个。两个区域用包含白细胞凝集素制备物的凝胶处理，一个用甘油（对照）处理，第四个留下不处理。处理向测试区域的指派是排列的。

用于眼部皱纹测量的测试位点是右眼和左眼周围（外眦）的皱纹区域。随机地将一侧用包含白细胞凝集素制备物的凝胶处理，而另一侧留下不处理。

在每只手上一个选定老年斑上分析包含白细胞凝集素制备物的凝胶对色素沉着的影响。此外，随机地将一只手在手背上用凝胶处理，而另一只手留下不处理。

在测量和处理开始之前，存在7天的预先调制时间段。在该时间段内和整个研究时间段中，不允许在前臂上、双眼的外眦处和双手背面使用皮肤护理产品、防晒产品、油性或保湿皮肤清洁制品和皮肤治疗剂。此外，禁止将测试位点强烈暴露于UV光（日光或日光浴室）。在机构中进行研究的几天，禁止使用美容品。

在3周时间段内，处理由对象在家中每天进行两次。将产品以约2mg/cm²的量施用到前臂测试为点（随机地，其中一个测试位点留下不处理，另一个用甘油处理作为对照）。此外，将包含白细胞凝集素制备物的凝胶施用到面部一侧的外眦和一只手背（左侧或右侧，随机地），另一侧留下不处理。

在开始第一次产品施用之前（t0）和处理三周后（t1），测量下列参数：前臂上的皮肤水合（Corneometer CM82510次重复测量）；前臂上的经表皮水分丢失（TEWL，DermaLab3次重复测量）；手背上老年斑的色素沉着（Siascope

1次测量，黑色素含量）；以及使用3D体内皮肤测量系统PRIMOS

Pico对一只选定眼在外眦处的皱纹体积的体内测量（3次重复测量，皱纹体积以mm³为单位，利用产生的高度图像来计算）。

在一周的产品处理后检查对象对产品正确施用的顺从性。

所有测量在空调房中，在21.5℃（±1℃）和50%（±5%）相对湿度下，在对象将她们露出的测试区域适应于这些室内气候条件至少30min后进行。在时间点t1处的测量和处理发生在最后一次产品处理后10-20小时。

退出

不存在退出。

不适的不利皮肤反应

不存在不适的不利反应。

结果

在每日两次产品处理共三周后，用包含3%v/v白细胞凝集素制备物的凝胶处理的皮肤与未处理的情况相比，在4位对象上显示出皮肤水合平均增加约23%（图5）。

在每日两次处理共三周后，用凝胶处理的皮肤与未处理的测试位点相比，在4位对象上显示出经表皮水分丢失平均减少约14.5%（皮肤屏障功能提高）（图6）。

在每日两次处理共三周后，用凝胶处理的皮肤与未处理的测试位点相比，显示出眼部皱纹体积减少约23%（图7）。

在每日两次处理共三周后，用凝胶处理的老年斑与未处理的测试位点相比，在4位对象上显示出色素沉着（黑色素含量）平均减少约10.0%（图8）。

序列：

1.来自于鲑鱼胚胎的白细胞凝集素多肽：

MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDT

SQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNW

VQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLP

WTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIE

GKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGML

MGHVTYDLGRLWVVSKSAVTMVCTH

2.来自于鲑鱼白细胞的白细胞凝集素多肽：

SIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWV

QAAGLPKQLDAGGEQFIVGANMDDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPW

TGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNNGWSHIEG

KLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMCML

MGHVTYDLGRLWVVSKSAVTMVCTH

3.来自于鲑鱼的白细胞凝集素-2多肽：

MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDT

SQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNW

VQAAGLLKQLDAGGNQFVVGANMDDTPFCLTSSATVGYKGPGSPLP

WTGLPGAVKYYSCGHFGCWAVNKNDDIFLMSLNQDCQNNGWSHID

GKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGML

MGHVTYDLGRLWVVSKSGGTMVCTH

4.来自于鲑鱼的白细胞凝集素-3多肽：

MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVA

TDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAG

NWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSP

LPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSH

IEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMG

MLMGHVTYDLGRLWVVYKSAVTMVCTH

Claims (24)

1.一种用于改善哺乳动物皮肤的美容外观的方法，在所述方法中，向所述动物给药：

（i）多肽，其包含在SEQ ID No.1-4任一个中所示的氨基酸序列或与所述序列有至少90%同一性的序列或任何所述序列的一部分；或

（ii）包含（i）和一种或多种可药用赋形剂和/或稀释剂的美容组合物。

2.权利要求1的方法，其中所述多肽或组合物通过或可以通过至少包含下列步骤的方法来获得：

a）将鱼卵、优选地鲑鱼卵悬浮在极小体积的水中；

b）诱导所述卵的同步快速孵化，优选地使对于超过95%的胚胎来说，孵化在不到2小时内完成；

c）对所述孵化的卵进行过滤以获得孵化液；以及

d）对所述孵化液进行过滤以获得所述多肽和/或组合物，其中过滤所述孵化液的步骤至少包括下列步骤：

（i）使用孔眼尺寸为至少5μm的滤器过滤所述孵化液，并收集滤液；

（ii）使用孔眼尺寸为0.30-0.60μm的滤器过滤来自于步骤（i）的滤液，并收集滤液；

（iii）用可药用缓冲液交换来自于步骤（ii）的滤液中的水；

（iv）使用排除尺寸为至少80kDa的滤器过滤从步骤（iii）获得的溶液，并收集滤液；以及

（v）使用孔眼尺寸为0.15-0.30μm的滤器过滤来自于步骤（iv）的滤液，并收集滤液，其中所述滤液提供包含所述多肽的组合物。

3.权利要求1的方法，其中所述多肽或组合物通过或可以通过至少包含下述步骤的方法来获得：

a′）将鱼卵、优选地鲑鱼卵悬浮在极小体积的水中；

b′）诱导所述卵的同步快速孵化，优选地使对于超过95%的胚胎来说，孵化在不到2小时内完成；

c′）对所述孵化的卵进行过滤以获得孵化液；以及

d′）对所述孵化液进行过滤以获得所述多肽和/或组合物，其中过滤所述孵化液的步骤至少包括下列步骤：

（i′）使用孔眼尺寸为至少5μm的滤器过滤所述孵化液，并收集滤液；

（ii′）对来自于步骤（i′）的滤液进行离子交换层析并收集洗脱液；

（iii′）用可药用缓冲液交换来自于步骤（ii′）的洗脱液中的水；以及

（iv′）使用孔眼尺寸为0.15-0.30μm的滤器过滤从步骤（iii′）获得的溶液并收集滤液，其中所述滤液提供包含所述多肽或其部分的组合物。

4.权利要求3的方法，其包括使用孔眼尺寸为0.30-0.60μm的滤器过滤来自于步骤（i′）的滤液并收集滤液的其他步骤。

5.权利要求3或4的方法，其中所述步骤（ii′）包括：

（a）将所述滤液装载到离子交换柱、优选地DEAE（二乙基氨基乙基）柱上；

（b）用适合的缓冲液，优选地包含pH8.5的20mM Tris-HCl的清洗液清洗所述柱子；

（c）使用洗脱缓冲液或溶剂从所述柱子洗脱所述多肽，优选其中所述洗脱缓冲液包含另外含有50mM NaCl的所述清洗液；以及

（d）收集来自于步骤（c）的洗脱液。

6.权利要求2的方法，其中：

a）步骤（i）中的滤器的孔眼尺寸为5-15μm，其中所述孔眼尺寸优选地为7μm；

b）步骤（ii）中的滤器的孔眼尺寸为0.35-0.55μm，其中所述孔眼尺寸优选地为0.45μm；

c）步骤（iv）中的滤器的排除尺寸为80-120kDa，其中所述排除尺寸优选地为100kDa；和/或

d）步骤（v）中的滤器的孔眼尺寸为0.22μm。

7.权利要求3至5任一项的方法，其中：

a）步骤（i′）中的滤器的孔眼尺寸为5-15μm，其中所述孔眼尺寸优选地为7μm；

b）权利要求4中滤器的孔眼尺寸为0.35-0.55μm，其中所述孔眼尺寸优选地为0.45μm；和/或

c）步骤（iv′）中的滤器的孔眼尺寸为0.22μm。

8.权利要求2至7任一项的方法，其中步骤（iii）或（iii′）包含渗滤。

9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述皮肤是老化的皮肤或有疤痕的皮肤。

10.权利要求1至9任一项的方法，其中在所述动物中改善皮肤的美容外观包含皮肤日射病的治疗。

11.权利要求1至10任一项的方法，其中所述改善包含减少或防止皱纹、细纹、色素沉着过度、松弛、皮肤干燥、脱落和/或经表皮水分丢失的美容外观或普遍程度。

12.权利要求1至11任一项的方法，其中所述动物的皮肤被保湿。

13.权利要求1至9任一项的方法，其中在所述动物中改善皮肤的美容外观包括减少疤痕组织或使疤痕组织最小化或改善疤痕的美容外观。

14.权利要求13的方法，其中所述疤痕是受伤或纹的结果。

15.权利要求14的方法，其中所述疤痕是痤疮疤痕。

16.权利要求14的方法，其中所述纹是萎缩纹、妊娠纹、膨胀纹、表皮膨胀纹、妊娠纹、萎缩性线纹或白线纹。

17.权利要求13至16任一项的方法，其中所述疤痕处于皮肤愈合的增殖或成熟阶段，优选成熟阶段。

18.权利要求1至17任一项的方法，其中所述多肽或美容组合物用于表面施用到所述皮肤。

19.权利要求1至11任一项的方法，其中在所述动物中改善皮肤的美容外观包括减少对表皮和/或真皮的浅层皮肤损伤或使对表皮和/或真皮的浅层皮肤损伤最小化。

20.权利要求1至8任一项中所限定的多肽或美容组合物，其用于改善哺乳动物皮肤的美容外观，优选地其中所述皮肤如权利要求9中所限定，所述美容外观的改善如权利要求10至17或19任一项中所限定，和/或所述施用如权利要求18中所限定。

21.权利要求1至8任一项中所限定的多肽或美容组合物在制造药物中的应用，所述药物用于改善哺乳动物皮肤的美容外观，优选地其中所述皮肤如权利要求9中所限定，所述美容外观的改善如权利要求10至17或19任一项中所限定，和/或所述施用如权利要求18中所限定。

22.一种美容组合物，其可从权利要求2至8任一项中所限定的方法获得，所述方法还包括从来自于步骤（v）或（iv′）的滤液制备所述美容组合物的步骤。

23.权利要求1至22任一项的方法、应用、多肽或美容组合物，其中所述多肽或美容组合物被涂布、浸渍或化学键合在产品、材料或装置上。

24.一种按照权利要求2至8任一项中限定的方法来分离多肽的方法。

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