CN1735337A - 用于滤食水生生物的微生物饲料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用特殊微生物取代天然微生藻类来培养滤食动物如卤虫的方法，还提供了这些生物生长的最优条件。这些取代的特殊微生物为卤虫提供了充足的食物来源，随后卤虫为海洋食物链中更高级别的成员提供食物来源。

Description

用于滤食水生生物的微生物饲料

相关申请的交叉参考

本申请要求提交于2002年11月26日的美国临时专利申请系列号60/429,095的优先权，该文献全文引入本文以供参考。

发明领域

本发明涉及增加水产养殖中滤食生物如卤虫(Artemia)的产量的方法，这些滤食生物可以用作培养养殖鱼类、甲壳动物和水生有壳类动物的饲料。

发明背景

近年来，在受控设置下培养海洋物种变得越来越广泛。这种培养通常称为水产养殖，允许为人类消费生产各种海洋物种。使用水产养殖已生产出日益增加的许多可食用鱼类。尽管水产养殖显示出显著的技术进步，但为了支持这种行业的生长，必须生产人工饲料，或增加天然饲料如卤虫、盐沼臂尾轮虫(Brachinus salina)、水蚤等的产量。

海水中所有的海洋生命最终依赖微生藻类来提供它们的生长或提供海洋食物链中它们的食物的生长。这种微生藻类是海洋食物链的第一个环节，直接被滤食动物如水生有壳类动物食用，并通过海水中复杂的食物链而间接地被剩余的海洋生命消费。但藻类的生长非常缓慢，因为它们每天只分化约一次，因此它们不易获得。这种可获得性的缺乏导致水产养殖产品的成本显著增加。

在水产养殖中复制或代替天然饲料的努力获得了有限的成功。在Lavens等人(“Lavens”)的美国专利5,158,788中，描述了从酵母中产生水产养殖用的饲料的方法。Lavens需要多步骤的过程，其中通过水解酵母细胞壁来加工酵母细胞，为水产养殖产生可消化的饲料。不幸的是，Lavens建议的多步骤过程是劳动密集型的，因此在经济上不可行。最重要的是，为产生这种人工饲料所需要的细胞壁的破坏会因为酵母细胞内包含的细胞材料而引起水产养殖污染。

在海洋食物链中以微生藻类为食物的一个重要天然食物来源是卤虫。卤虫通常是指盐水丰年虾(brine shrimp)，因为它在海洋食物链中的位置、和它作为海洋环境中高级成员的食物来源的合意性，卤虫成为水产养殖中的优良饲料。它们是水产养殖中的优良饲料，这是因为不像水产养殖现有技术中的食物，它们不会遭受水产养殖中使用的微生物和污水的腐败作用，相反它们可以清洁污着微生物的水。通常已知的是，卤虫可以用作物种如虾、鱼等的饲料。

但是，用于水产养殖的卤虫的天然产量近来由于环境因素而导致短缺。卤虫生长在大的盐水湖如Utah的大盐湖(Great Salt Lake)内。卤虫已经在大盐湖收获了许多年。不幸的是，近来的收获物很少，卤虫卵的成本增长了超过三倍。据认为，这些近来的低产量是天气模式改变引起的。由温暖天气所致的严重气候紊乱和厄尔尼诺伴随的雨水过多引起了大盐湖中卤虫产量水平急剧下降。在1995-96和1996-97卤虫卵的产量接近15百万镑总重。在此总产量中，仅约50％适合使用。1997-98产量为仅约6百万镑总重。卤虫卵产量的减少，例如在厄尔尼诺的情况下，不仅引起可获得性的问题，而且引起卤虫卵的价格急剧上涨。这种成本的急剧上涨导致卤虫用作水产养殖饲料在经济上不可行。

虽然在全世界还有几处其他的卤虫来源，但大盐湖提供了世界卤虫卵消费的大于90％。虽然在俄罗斯、土耳其、和中国发现了卤虫的额外来源，但这些额外来源没能抵消大盐湖产量的降低。在水产养殖中，各种生产卤虫的方法被开发，如在越南，卤虫生长在含有丰富天然藻类的池塘中。在夏威夷，使用酵母和绿水(greenwater)为海马和亚洲海鲈鱼(Asian sea bass)水产养殖培养卤虫和轮虫。不幸的是，这些种种努力得到了有限的成功，因为这些生产卤虫的现有方法是劳动密集型的，在经济上不可行。

发明概述

海洋中所有活生物的食物大多数起源于微生藻类。这种微生藻类被滤食动物如水生有壳类动物直接消耗，并通过复杂的食物链被剩余的海洋生物间接消耗。本发明的方法由以下组成：通过用特殊微生物取代天然微生藻类，并为这些生物的生长提供最优条件，从而在海洋养殖中模拟这种自然现象。然后这些取代的特殊微生物为海洋食物链中更高级别的成员提供丰富的食物来源。

如上所述，微生藻类的生长非常缓慢，即使提供所有它们需要的矿物，每24小时也只分裂约一次。另一方面，如果提供了有机能量来源，微生物如细菌、和可能某些种类的藻类、蓝绿菌、和真菌每三十分钟分裂约一次。按照本发明的方法，矿质元素被加入海水，为所选微生物的最优生长提供培养。

所加矿质元素是氮、磷、和铁，因为只有这些是海水中缺乏又对所有生命重要的矿质元素。除了所加元素，糖(蔗糖)也被加入以提供能量来源。在本发明方法的说明性实验方案中，蔗糖被用于提供能量和碳来源。蔗糖作为能量来源具有如下优点，就是它仅由碳、氧、和氢组成。但是，蔗糖只是可用作此功能的含碳物质的一个例子。

可以使用其它食物来源来支持这些特殊微生物的生长，包括这些廉价产品如压榨去除油的花生饼、糖蜜(它是制造糖的副产物)、甜菜汁和甘蔗汁等。它们的缺点是它们可以支持许多种类的微生物，其中一些可能是致病的。但是，这个缺点可以通过用氯对海水进行灭菌或过滤海水来补救。但应注意，要防止外来微生物进入培养物。在本发明的范围内可预计，在培养基内的海水可以经常更新，以防止有害生物占用培养物。

在本发明的范围内还可以预计，本发明方法可以用作固定大气二氧化碳的有效方法。把大气二氧化碳固定在植物体中需要大量能量。使用本发明的方法大量生产水生有壳类动物，其中水生有壳类动物能从大气二氧化碳中产生碳酸钙，这产生了更有能量效率的减轻空气中过量二氧化碳的方法。

发明详述

本发明通过使用特殊微生物如细菌作为食物来源，为滤食动物如卤虫的生长提供创新方法。其它滤食动物如蛤、牡蛎和扇贝等也在本发明的预计范围内。卤虫的这种生长比现有方法实现了更高的产量和可靠性。

根据本发明的方法，将海水放在培养池内，用氮、磷和铁强化，用氯灭菌，形成培养基。氯消散后，糖如蔗糖等和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)或任意其它合适生物的浓培养物被加入培养基中。加入矿物和糖并给培养物通气后，在约一天内，形成了浓的细菌培养物。加入卤虫卵，它们随后消耗细菌并生长。巨大芽孢杆菌的过夜培养物在培养池中应具有约1/10,000的体积。因为卤虫是滤食动物，依靠巨大芽孢杆菌生长旺盛，所以在本发明范围内预计，其它滤食动物如蛤、牡蛎等也可依靠这种食物生长。

有意使培养基是简单的和高度选择性的。在高盐度海水中，极少生物能生长，当只提供矿物和糖时，产生了它们所有的复杂分子。培养基的这种简单性使生物极不可能是致病的。这在下列实验中得到证实，这些实验中仅有的(主要的)细菌生物是巨大芽孢杆菌和解藻阮酸弧菌(Vibrio alginolyticus)。这些细菌都不被认为是病原体，虽然弧菌可能被分类为机会致病菌。在本发明范围内可以预计，通过使用例如巨大芽孢杆菌的克隆菌株，有害生物的任何有害影响都可被减轻。芽孢杆菌是产孢菌类，因此它比较易于保持无污染的或接近无污染的培养物。

在几个实验中发现，加入糖时培养池变成深绿色。这种颜色上的变化显示，在培养基中存在藻类或蓝绿藻类，它们的生长被糖所增强。在培养物中还发现了真菌，所述培养物包含大量在水产养殖中缺乏供应的不饱和脂肪酸。真菌是否能在这种简单基质中生长是未知的。

可以发现，所选的特殊微生物在每一方面都是合适的，除了它们难以消化。在选择滤食动物如卤虫或蛤时，需要考虑它们对选定的特殊微生物的消化能力。在本发明范围内预计，可以将天然特殊微生物基因改造以提供更合适的食物。但这种基因改造可以但不限于增加不饱和脂肪酸的含量。

通过实施例对本发明进行更详细的描述，这些实施例应被理解为仅仅是本发明方法的说明，而不应被理解为对其限制。

实施例1

为了测试细菌的营养值和培养过程，进行下列实验。在室外放置两个200升的玻璃培养缸。培养缸被部分遮盖。用来自红海的海水充满培养缸。在第一天，每个培养缸接受10mg来自大盐湖的卤虫、EDTA铁、尿素、和磷酸氢二钠。培养缸中最终浓度如下：氯化铁0.002g/L、EDTA钠0.0035g/L、磷酸氢二钠0.0025g/L、和尿素0.05g/L。在第三天，向培养缸1中加入十克蔗糖，培养缸2不加入任何物质。在第23天，用细的水族网(aquarium net)收获卤虫，涂沫干燥(daubed dry)，称重。从池1(有糖)中收获到27.0克卤虫，从池2(没有糖)中收获到3.0克卤虫。实验过程中的温度范围为约25至36℃。

提供糖时产生的卤虫为不提供糖的约十倍多。不存在糖时产生了一些卤虫是因为，不受任何具体理论的约束，据信在部分日光下产生了藻类作为卤虫的食物。食物的大多数是由糖产生的细菌。在此实验中，一克糖产生约三克卤虫(湿重)。

作为本实验的结果，池内的生产率计算如下：27g/200L/23天＝27g/200L/23天×1000L/m³或5×27g/年、或5×27g/m³×365/23/年、或5×27g/m³×10,000m³/公顷(一米深的池)×365/23/年÷1,000,000g/吨。这等于约21吨/公顷/年。

实验用卤虫卵开始，所以起始阶段是一种缓慢生长，直到卤虫生长到成虫尺寸并开始繁殖。在商业生产中，应保持高的生长种群，并以受控速率进行连续的部分收获。

实施例2

下一个说明性实施例在室内进行以控制温度。使用空调将室温保持在近似恒定的27℃。在第1天，将三个塑料桶中的每一个分别用五十升来自红海的海水充满。如前面的实验，每个桶接受60mg来自大盐湖的卤虫卵、和氮、磷、和铁。如前面实验，给桶通气。在第二天，桶2和3接受2.5g蔗糖、和50ml细菌的过夜培养物。取500ml新鲜海水，如前加入铁、氮、和磷，以及0.2g/L糖，通气过夜，从而制得细菌培养物。过夜后，培养物变得非常浑浊。在第5天，桶3接受2.5g糖、和与起始加入量相等的氮、磷和铁。桶3还接受50ml细菌培养物。在第9天和13天，桶3如前接受氮、磷、和铁、以及50ml细菌培养物。在第9、和13天，仅桶3接受糖，量为每天5g。在第16天，收获卤虫并称重。

桶1除了细菌接种物中少量的糖外没有接受糖，没有产出可检测的卤虫。桶2接受了总量为5.0g的糖，产出2.3g卤虫，桶3接受了总量为15g的糖，产出16.8g卤虫。

再一次，当糖被加入培养基时，细菌和卤虫生长。加入的糖越少，产生的卤虫越少。在没有阳光的封闭室内，没有藻类在培养物中生长，也没有卤虫在没有糖时产生。不受任何具体理论的约束，显示有糖时卤虫可生长，但没有阳光时卤虫不会繁殖。没有观察到卤虫后代，卤虫也不结合。这减少了最终收率，因为在有性繁殖时，最终收率由来自起始投入卵的成虫以及它们的后代组成。

每克糖的卤虫收率稍大于每克糖一克卤虫(湿重)。一米深的池中，每公顷每年的收率应为每公顷每年约五十吨。这个实验的缺陷在于，桶3与桶1的区别不仅在于桶3接受了糖而桶1没有，还在于桶3还接受了额外的矿物和细菌接种物而桶1没有。这被另一个实验校正，其显示了关键因素是糖。

实施例3

用四个各自为50升的塑料桶进行另一个说明性实施例。与上述的海水一起，如前面说明性实施例中一样，放入氮、磷、铁、和约60mg卤虫卵。在第二天，向桶2、3、和4加入2.5g糖(0.25g/cc的水溶液10ml)。还向桶中加入50ml的过夜细菌培养物。在第3天，用悬挂在水面以上约六英寸处的100瓦电灯泡照射桶2。实验过程中一直开着灯。在第5天，向桶2、3和4加入2.5g蔗糖。在第5天，向所有桶加入五十毫升细菌培养物。在第9天，向桶2、3和4加入2.5g蔗糖，五十毫升细菌培养物也被加入所有桶中。在第12天，向桶2、3和4加入2.5g糖，所有的桶接受50ml细菌培养物、以及与起始加入量相等的氮、磷、和铁。

在第16天，收获卤虫并称重。未接受糖的桶1没有产生可检测的卤虫。接受10g糖和光的桶2产生了7.97g卤虫。接受10mg糖、没有接受光的桶3产生了6.08g卤虫。因为气泵失效，所有卤虫死亡，桶4没有收获。

当糖加入到培养基时，细菌和卤虫生长。没有糖和日光，就不产生卤虫。当有一些来自一百瓦电灯泡的光时，产生的卤虫比没有光时多。电灯泡提供的光远比自然日光的全光谱要少。在本发明范围内可预计，生产操作在室外进行，从而日光会具有强的正面效果。光线的效果是由于光线本身还是产生的少量藻类，这是未知的。在这个说明性实施例中，每g糖得到了约0.8g卤虫。

实施例4

用塑料盆在室外的阴影下进行一个附加的说明性实施例。在第1天，用20升海水、和如前的矿物氮、磷和铁分别充满3个塑料盆。每个盆接受约24mg卤虫卵。给盆通气。在第2、5、9、12和14天，向盆1和2加入一克蔗糖。在加入蔗糖的同一天，向所有三个盆加入20ml细菌培养物。在第18天，收获卤虫并称重。盆1产生2.12g卤虫，盆2产生2.20g卤虫，未接受糖的盆3产生0.15g卤虫。不受任何具体理论约束，据信收率低是由于高温，但很明显糖是重要的。有糖时产生的卤虫比无糖时多十倍多。

实施例5

在还一个说明性实施例中，从Honolulu Harbor在邻近实验位置的区域中获取海水，放置在容器内。以约100mg/L的浓度向海水中加入蔗糖。还加入到海水中的是无机物如尿素、磷酸钠、EDTA和FeCl₃，浓度为约50mg/L。将容器密封，通过玻璃塞向其中吹入空气。在约两天内出现了细菌的浓菌绒(dense bloom)。培养物中的细菌主要是多效杆菌(pleiotrophic rods)，但也有一些快速游动的细菌。这种由“野生盐水细菌(wild saltwater bacteria)”(WSB)组成的细菌培养物是本实施例的起子细菌培养物。

在研究中心，在大聚乙烯池的约5000升海水内，开展大池试验。池位于室外，被部分遮盖。给池通气，水温范围为约28至29℃。加入6％次氯酸盐(即次氯酸钠)将池消毒。每1000升海水加入约750ml 6％次氯酸盐。允许次氯酸盐在约一天内随通气自然消散。次氯酸盐从池中消散后，加入约60g卤虫卵。接下来一天(第2天)和第5、7、9和11天，加入1∶1000的细菌稀释液、无机物和蔗糖。

在第12天收获池。虽然没有从卵到成虫的存活率为仅约7％，但从约60g卵中获得约3031g卤虫的总收率还是显著的。最终卤虫密度为约0.6g/L，或每4ml海水约一只卤虫。因为池内卤虫生长良好，细菌被迅速从海水中清除，在第5和7天(1∶250细菌稀释液)和第9和11天(1∶125细菌稀释液)使用了更浓的细菌稀释液。

实施例6

在还一个说明性实施例中，仍是从Honolulu Harbor在邻近实验位置的区域内获取海水，放置在容器内。以约100mg/L的浓度向海水中加入蔗糖。还加入海水的是无机物，如尿素、磷酸钠、EDTA和FeCl₃，浓度为约50mg/L。将容器密封，通过玻璃塞向其中吹入空气。在约两天内出现了细菌的浓菌绒。培养物中的细菌主要是多效杆菌，但也有一些快速游动的细菌。这种由WSB组成的细菌培养物是这项工作的起子细菌培养物。

本说明性实施例在一升热压灭菌过的海水中进行，海水在含有上述浓度的无机物和蔗糖的两升烧瓶内。将两升烧瓶放在室内，始终盖住。将烧瓶持续通气，用气垫(air blanket)与外面隔绝，温度保持在约23℃。在第一天，向烧瓶中加入6mg卤虫卵。在第二天和第5、7、9、和11天，加入1∶1000野生盐水细菌稀释液和蔗糖。因为卤虫生长迅速并吃掉细菌，所加细菌处于较低的稀释液1∶100，在第10和12天，除了上述饲料，还加入额外的细菌饲料。

在第13天收获烧瓶。烧瓶的总收率为从约6mg卵中得到约2.3g卤虫。最终卤虫密度为约2.3g/L或近似。产生的2.3g卤虫在13天的生长中消耗了约1.2g蔗糖。卤虫的孵化和存活率为约54％，卤虫的平均尺寸非常大。

虽然本发明的说明性实施方案建议使用卤虫作为饲料，但本领域的技术人员会理解，这些卤虫可以单独使用，或与按照本发明方法生长的其它滤食动物一起使用，或与常规饲料混合使用。

虽然本发明的说明性实施方案建议使用卤虫作为滤食动物，但本领域的技术人员会理解，可以使用其它滤食动物如蛤和软体动物。

虽然本发明的说明性实施方案建议使用细菌作为特殊微生物，但本领域的技术人员会理解，可以使用在培养基中能成倍增加的其它微生物。

虽然本发明展示并描述了其示范性实施方案，但在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种其它改变、省略和增加。

Claims (19)

1.一种培养滤食动物的方法，包括以下步骤：

给罐提供包含微生物的海水；

向所述海水中加入必需元素；

向所述海水中加入食物来源，形成混合物，并连续向所述混合物中通气，从而形成细菌的浓菌绒；和

向所述混合物中加入卤虫卵。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述必需元素选自氮、铁和磷。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物是选自巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)和解藻阮酸弧菌(Vibrio alginolyticus)中的细菌。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物是野生盐水细菌。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述细菌被基因改造以促进额外的营养性质。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述细菌是选自巨大芽孢杆菌和解藻阮酸弧菌中的克隆细菌。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述食物来源是蔗糖。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述食物来源选自糖蜜、花生饼、甘蔗汁、和甜菜汁。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述滤食动物是卤虫。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述滤食动物选自蛤和软体动物。

11.如权利要求9所述的方法，还包括从所述海水中收获成年卤虫的步骤。

12.如权利要求1所述的方法，还包括将所述海水消毒的步骤。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述消毒步骤包括向所述海水中加入氯。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述消毒步骤包括将所述海水高压灭菌。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述消毒步骤包括过滤所述海水。

16.如权利要求1所述的方法，还包括更换所述海水以防止有害生物的步骤。

17.一种为鱼或甲壳动物的幼虫准备食物的方法，其中由卤虫卵生长所释放的无节幼体或由卵胎繁殖所沉积的无节幼体被喂给所述幼虫，该方法包括按权利要求9的方法生产卤虫卵或卤虫无节幼体。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述卤虫卵在与其它饲料的混合物中被喂给所述幼虫。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述卤虫卵被喂给蛤、牡蛎、鲻鱼、虱目鱼、和软体动物。