CN1733904A - 一种液体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基 - Google Patents

一种液体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液体培养获得针叶树种胚状体及其培养基。本发明所提供的针叶树种胚状体液体培养基，包括诱导培养基、增殖培养基和成熟培养基。应用上述液体培养基，液体培养获得针叶树种胚状体的方法，包括如下步骤：诱导培养、增殖培养和成熟培养，得到所述胚状体。本发明通过对各个阶段培养基组分的优化，提高了胚性愈伤组织诱导频率，早期原胚质量大大改善，本方法比现有培养系统中每克胚性愈伤组织上发生5～25个子叶胚，畸形胚占到70％以上，且体细胞胚生根率0～7％等状况提高了几十倍，真正突破了针叶树体细胞胚规模化发生难关。

Description

一种液体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基
技术领域
本发明涉及植物外植体的培养方法，特别是涉及一种液体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基。
背景技术
植物体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程；经体细胞胚胎发生形成类似合子胚的结构称为体细胞胚(somaticembryo)；体细胞胚胎发生是由一类称为胚性细胞(embryogenic cell)的组织发育而来，这是体细胞胚胎发生技术体系能否建立的关键。随着现代生物技术的飞速发展，体细胞胚胎发生已经成为针叶树细胞工程中植株再生的重要途径，可以用来研究无性系细胞起源、调控和发育，利于阐明植物有性胚与无性胚发生机理，还是植物细胞全能性、分化及其形态建成研究的理想实验体系，也是进行基因转导、种质保存、微体快繁、人工种子研制的重要手段。它还是基因工程的桥梁，可大幅度缩短林木育种与繁殖周期，尤其是用于针叶树育种与繁殖工程，理论价值与经济意义重大。
目前，植物体细胞胚胎发生的方式分直接发生、间接发生和混合发生三种：直接发生即体细胞胚直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成，其来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、合子胚等，约20多种外植体可按直接方式产生体细胞胚；但有相当部分植物，尤其是木本植物的体细胞胚发生是间接方式，即体细胞胚是从愈伤组织，有时也从已形成体细胞胚的一组细胞中发育而成；此外，某些植物既可按直接方式又可按间接方式进行体细胞胚发生，叫混合发生方式，如取自鸭茅叶基的外植体，先形成愈伤组织，再进行体细胞胚发生；若取其叶尖则体细胞胚直接从外植体上产生。对于针叶树种来说，常用的离体培养基有MS、DCR、SH、LP、GD等，存在的问题主要有：早期原胚形成的状态不好、胚性愈伤组织质量不高、早期原胚发育不完全与子叶发育不正常、玻璃化问题、下胚轴不伸长、体细胞胚不生根等。
发明内容
本发明的目的是提供一种液体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基。
本发明所提供的针叶树种胚状体液体培养基，包括诱导培养基、增殖培养基和成熟培养基，其中，所述诱导培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2：
KNO3                      1836-2836mg/L，
NH4NO3                   243-360mg/L，
KH2PO4                   70-130mg/L，
CaCl2.2H2O               300-450mg/L，
MgSO4.7H2O               130-250mg/L，
H3BO3                    2-11mg/L，
ZnSO4.7H2O               3-7mg/L，
MnSO4.H2O                6.5-10.5mg/L，
Na2MoO4.2H2O            0.11-0.21mg/L，
KI                          0.28-0.63mg/L，
CuSO4.5H2O               0.01-0.035mg/L，
CoCl2                     0.01-0.035mg/L，
FeSO4.7H2O               13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O             15-27mg/L，
肌醇                        50-1500mg/L，
维生素B1                   0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                    400-700mg/L，
蔗糖                        20,000-5,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸           0.3-2.7g/L，
酸水解酪蛋白                350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤                0.05-3.1mg/L，
激动素                      0.05-2.6mg／L，
琼脂                        2,500-7,000mg/L；
所述增殖培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2：
KNO3                      1836-2836mg/L，
NH4NO3                   243-360mg/L，
KH2PO4                   70-130mg/L，
CaCl2.2H2O               300-450mg/L，
MgSO4.7H2O               130-250mg/L，
H3BO3                    2-11mg/L，
ZnSO4.7H2O               3-7mg/L，
MnSO4.H2O                6.5-10.5mg/L，
Na2MoO4.2H2O            0.11-0.21mg/L，
KI                          0.28-0.63mg/L，
CuSO4.5H2O               0.01-0.035mg/L，
CoCl2                     0.01-0.035mg/L，
FeSO4.7H2O                13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O              15-27mg/L，
肌醇                         50-1500mg/L，
维生素B1                    0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                     400-700mg/L，
甘露醇                       1000-4000mg/L，
蔗糖                         20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸            0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白                 350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤                 0.05-3.1mg/L；
所述成熟培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2：
KNO3                        1836-2836mg/L，
NH4NO3                     243-360mg/L，
KH2PO4                     70-130mg/L，
CaCl2.2H2O                 300-450mg/L，
MgSO4.7H2O                 13-250mg/L，
H3BO3                      2-11mg/L，
ZnSO4.7H2O                 3-7mg/L，
MnSO4.H2O                  6.5-10.5mg/L，
Na2MoO4.2H2O              0.11-0.21mg/L，
KI                            0.28-0.63mg/L，
CuSO4.5H2O                 0.01-0.035mg/L，
CoCl2                       0.01-0.035mg/L，
FeSO4.7H2O                 13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O               15-27mg/L，
肌醇                          50-1500mg/L，
维生素B1                     0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                      400-700mg/L，
甘露醇                        1000-4000mg/L，
蔗糖                          20,000-55,000mg/L，
PEG4000                       15000-190000mg/L，
酸水解酪蛋白                  350-1050mg/L，
脱落酸                        7-150mg/L，
琼脂                          2,500-7,000mg/L。
其中，诱导培养基组分优选为：
KNO3                         2102mg/L，
NH4NO3                      248mg/L，
KH2PO4                      77g/L，
CaCl2.2H2O                  326mg/L，
MgSO4.7H2O                  155mg/L，
H3BO3                       3.5mg/L，
ZnSO4.7H2O                  3.9mg/L，
MnSO4.H2O                   7.6mg/L，
Na2MoO4.2H2O               0.113mg/L，
KI                             0.38mg/L，
CuSO4.5H2O                  0.0125mg/L，
CoCl2                        0.0125mg/L，
FeSO4.7H2O                  13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O                15-27mg/L，
肌醇                           50-1500mg/L，
维生素B1                      0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                       400-700mg/L，
蔗糖                           20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸              0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白                   350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤                   0.05-3.1mg/L，
激动素                         0.05-2.6mg/L，
琼脂                           2,500-7,000mg/L。
增殖培养基组分优选为：
KNO3                         2803mg/L，
NH4NO3                      331mg/L，
KH2PO4                      103mg/L，
CaCl2.2H2O                  326mg/L，
MgSO4.7H2O                  206mg/L，
H3BO3                       9.5mg/L，
ZnSO4.7H2O                  5.2mg/L，
MnSO4.H2O                   10.2mg/L，
Na2MoO4.2H2O               0.15mg/L，
KI                             0.51mg/L，
CuSO4.5H2O                  0.0125mg/L，
CoCl2                        0.0125mg/L，
FeSO4.7H2O                  13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O                15-27mg/L，
肌醇                      50-1500mg/L，
维生素B1                 0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                  400-700mg/L，
甘露醇                    1000-4000mg/L，
蔗糖                      20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸         0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白              350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤              0.05-3.1mg/L；
或为：
KNO3                     2453mg/L，
NH4NO3                  290mg/L，
KH2PO4                  90mg/L，
CaCl2.2H2O              326mg/L，
MgSO4.7H2O              181mg/L，
H3BO3                   9.5mg/L，
ZnSO4.7H2O              4.52mg/L，
MnSO4.H2O               8.87mg/L，
Na2MoO4.2H2O           0.131mg/L，
KI                         0.44mg/L，
CuSO4.5H2O              0.0125mg/L，
CoCl2                    0.0125mg/L，
FeSO4.7H2O              13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O            15-27mg/L，
肌醇                       50-1500mg/L，
维生素B1                  0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                   400-700mg/L，
甘露醇                     1000-400mg/L，
蔗糖                       20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸          0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白               350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤               0.05-3.1mg/L。
成熟培养基组分优选为：
KNO3                     2336mg/L，
NH4NO3                  276mg/L，
KH2PO4                  86mg/L，
CaCl2.2H2O              326mg/L，
MgSO4.7H2O                   172mg/L，
H3BO3                        3.1mg/L，
ZnSO4.7H2O                   4.3mg/L，
MnSO4.H2O                    8.45mg/L，
Na2MoO4.2H2O                0.125 mg/L，
KI                              0.42mg/L，
CuSO4.5H2O                   0.0125mg/L，
CoCl2                         0.0125mg/L，
FeSO4.7H2O                   13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O                 15-27mg/L，
肌醇                            50-1500mg/L，
维生素B1                       0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                        400-700mg/L，
甘露醇                          1000-4000mg/L，
蔗糖                            20,000-55,000mg/L，
PEG4000                         15000-190000mg/L，
酸水解酪蛋白                    350-1050mg/L，
脱落酸                          7-150mg/L，
琼脂                            2,500-7,000mg/L。
应用上述液体培养基，液体培养获得针叶树种胚状体的方法，包括如下步骤：
1)诱导培养：将针叶树种未成熟胚消毒后接种于诱导培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到胚性愈伤组织；
2)增殖培养：将胚性愈伤组织接种于增殖培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到增殖胚性细胞系；
3)成熟培养：将增殖胚性细胞系接种于成熟培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到所述胚状体。
经过上述暗培养的胚性愈伤组织出现可见小胚后，还在22-28℃、1600～2000lx的光照条件下进行光培养。
本发明通过对各个阶段培养基组分的优化，提高了胚性愈伤组织诱导频率，早期原胚质量大大改善，胚头与胚柄正常率达到90％以上，原胚的愈伤化和畸形胚减少45％，高质量子叶胚90％以上，每升增殖后的液体培养基中含有3000～10000个原胚，每克胚性愈伤组织上可发生180～320个子叶胚，畸形胚近于10％以下，且可见的子叶胚基本为同步化、标准化，其生根、伸长率达到90％；比现有技术中胚性细胞系的增殖频率和增殖数量提高6～10倍，子叶胚发生频率与固体培养体系相当，但由于增殖的胚性细胞或原胚数量大，所以，实际获得的正常子叶胚的数量是固体系统的3～5倍；同时，本方法比现有培养系统中每克胚性愈伤组织上发生5～25个子叶胚，畸形胚占到70％以上，且体细胞胚生根率0～7％等状况提高了几十倍，真正突破了针叶树体细胞胚规模化发生难关。
附图说明
图1为培养获得的胚状体照片。
具体实施方式
实施例1、
一、实验材料与方法
1、实验材料
华北落叶松、日本落叶松、长白落叶松、日本×华北杂种落叶松、日本×长白杂种落叶松等的未成熟合子胚。
日本落叶松选自辽宁省清源县大孤家林场30年生种子园中的日永8、日永85、日抚27、日草103等无性系；长白落叶松采自辽宁省抚顺市哈达林场30年生长白落叶松种子园中的长3、长14、长11、长4C、长33等无性系；华北落叶松采自山西省管埁林局秋千沟林场华北落叶松母树林中华3、华6、华7等无性系。日本、长白、华北落叶松各组合杂交技术采用开放式控制授粉方法进行。
2、实验方法
1)接种、诱导培养：
用镊子从球果中取出种子，70％酒精浸泡1min，0.1％升汞溶液浸泡6min，无菌水冲洗5次后，接种备用，在超净台中剥取种胚，从侧部划开种壳，取出种仁，划破内种皮，挑开胚乳，将嫩胚同胚柄一起接种于培养基上，每皿接种15～25个，整齐排放、重复4次，在温度21～27℃下暗培养，20～30天根据颜色、形态、结构等特征，初步确定胚性愈伤组织；
2)增殖培养：
针叶树胚性愈伤组织在诱导培养基中继代培养两次后，转接于增殖培养基中进行增殖、继代培养，每次转接时均选取新分化的胚性愈伤组织，在三角瓶中液体增殖时按照重量于体积比2％进行接种，即100ml液体培养基中接种2克新鲜的胚性细胞系，摇床转速120转/分钟，在23±5℃、暗培养条件下进行培养，每20-35天继代一次。
3)成熟培养：
针叶树胚性愈伤组织在增殖培养基中增殖培养到一定数量后，转接于成熟培养基中进行成熟培养，在23±5℃、暗培养条件下进行培养。在成熟培养基上约20～65天时间段内，不同胚性细胞系的成熟时间差异较大，有可见的小胚发生后，移到25±3℃、1600～2000lx的光照条件下进行光培养，即得到体细胞胚。
其中，所用的培养基组分如表1所示。
                                表1.培养基组分  (mg/L)
化合物 诱导培养基   增殖培养基   成熟培养基
大量元素KNO3NH4NO3KH2PO4CaCl2.2H2OMgSO4.7H2O微量元素H3BO3ZnSO4.7H2OMnSO4.H2ONa2MoO4.2H2OKICuSO4.5H2OCoCl2铁盐FeSO4.7H2ONa2.EDTA.H2O维生素及其它有机成分MyO-Inositol(肌醇)Thiamine.HCl(维生素B1)L-Glutamine(谷氨酰胺)D-Mannitol(甘露醇)蔗糖PEG40002，4-DCasein acid Hydrolysates(CH)BAKinetin 2102248773261553.53.97.60.1130.380.01250.012513.9318.651,0000.5450-30,000-1.15000.40.4 28033311033262069.55.210.20.150.510.01250.012513.3317.891,0000.54502,00030,000-0.75000.1- 2336276863261723.14.38.450.1250.420.01250.012516.1321.641,0000.5450-30,00080,000-500--
 ABAPhytagel(琼脂)pH     --5.8     --5.8     303,0005.8
二、实验结果
采用上述培养基、培养条件得到的体细胞胚照片如图1，体细胞胚发生数量如表2。
              表2.落叶松不同胚性细胞系体细胞胚发生数量
胚性细胞系号 正常子叶胚(个/g)   畸形子叶胚(个/g)   子叶胚总数(个/g)   畸形胚比率(％)
    1     282.7     31.2     313.9     9.94
    2     212.8     10.4     223.2     4.66
    3     187.2     18.7     205.9     9.08
    4     210     13     223     5.83
    5     216     27.3     243.5     11.21
    6     152.     14.8     166.6     8.88
结果表明，本方法提高了胚性愈伤组织诱导频率，早期原胚质量大大改善，胚头与胚柄正常率达到90％以上，原胚的愈伤化和畸形胚减少45％，高质量子叶胚90％以上，每升增殖后的液体培养基中含有3000～10000个原胚，每克胚性愈伤组织上可发生180～320个子叶胚，畸形胚近于10％以下，且可见的子叶胚基本为同步化、标准化，其生根、伸长率达到90％；比现有技术中胚性细胞系的增殖频率和增殖数量提高6～10倍，子叶胚发生频率与固体培养体系相当，但由于增殖的胚性细胞或原胚数量大，所以，实际获得的正常子叶胚的数量是固体系统的3～5倍；同时，本方法比现有培养系统中每克胚性愈伤组织上发生5～25个子叶胚，畸形胚占到70％以上，且体细胞胚生根率0～7％等状况提高了几十倍，真正突破了针叶树体细胞胚规模化发生难关。
实施例2、
按照实施例1相同的方法进行培养，所用的培养基如表3，进行针叶树种的体细胞胚培养，可得到与实施例1相同的结果。
其不同之处在于，增殖培养是在发酵罐中进行的，接种量按照重量于体积比0.5～1％进行接种，即100ml液体培养基中接种0.5～1克新鲜、游离的胚性细胞系，在23±5℃、暗培养条件下进行培养。
                           表3培养基配方  (mg/L)
            化合物 诱导培养基   继代培养基   成熟培养基
大量元素KNO3NH4NO3KH2PO4CaCl2.2H2OMgSO4.7H2O微量元素H3BO3ZnSO4.7H2OMnSO4.H2ONa2MoO4.2H2OKICuSO4.5H2OCoCl2铁盐FeSO4.7H2ONa2.EDTA.H2O维生素及其它有机成分MyO-Inositol(肌醇)Thiamine.HCl(维生素B1)L-Glutamine(谷氨酰胺)D-Mannitol(甘露醇)蔗糖PEG40002，4-DCasein acid Hydrolysates(CH)KinetinABAPhytagel(琼脂)pH 2102248773261553.53.97.60.1130.380.01250.012513.9318.651,0000.5450-30,000-1.15000.40.4--5.8 2453290903261819.54.528.870.1310.440.01250.012513.3317.891,0000.54503,00030,000-0.55000.3---5.8 2336276863261723.14.38.450.1250.420.01250.012516.1321.641,0000.5450-30,00080,000-500--303,0005.8

Claims (6)

1、一种针叶树种胚状体液体培养基，包括诱导培养基、增殖培养基和成熟培养基，其中，所述诱导培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2：
KNO3                       1836-2836mg/L，
NH4NO3                    243-360mg/L，
KH2PO4                    70-130mg/L，
CaCl2.2H2O                300-450mg/L，
MgSO4.7H2O                130-250mg/L，
H3BO3                     2-11mg/L，
ZnSO4.7H2O                3-7mg/L，
MnSO4.H2O                 6.5-10.5mg/L，
Na2MoO4.2H2O             0.11-0.21mg/L，
KI                           0.28-0.63mg/L，
CuSO4.5H2O                0.01-0.035mg/L，
CoCl2                      0.01-0.035mg/L，
FeSO4.7H2O                13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O              15-27mg/L，
肌醇                        50-1500mg/L，
维生素B1                   0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                    400-700mg/L，
蔗糖                        20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸           0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白                350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤                0.05-3.1mg/L，
激动素                      0.05-2.6mg/L，
琼脂                        2,500-7,000mg/L；
所述增殖培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2：
KNO3                       1836-2836mg/L，
NH4NO3                    243-360mg/L，
KH2PO4                    70-130mg/L，
CaCl2.2H2O                300-450mg/L，
MgSO4.7H2O                130-250mg/L，
H3BO3                     2-11mg/L，
ZnSO4.7H2O                3-7mg/L，
MnSO4.H2O                 6.5-10.5mg/L，
Na2MoO4.2H2O             0.11-0.21mg/L，
KI                      0.28-0.63mg/L，
CuSO4.5H2O            0.01-0.035mg/L，
CoCl2                  0.01-0.035mg/L，
FeSO4.7H2O            13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O          15-27mg/L，
肌醇                    50-1500mg/L，
维生素B1               0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                400-700mg/L，
甘露醇                  1000-4000mg/L，
蔗糖                    20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸       0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白            350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤            0.05-3.1mg/L；
所述成熟培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2：
KNO3                     1836-2836mg/L，
NH4NO3                  243-360mg/L，
KH2PO4                  70-130mg/L，
CaCl2.2H2O              300-450mg/L，
MgSO4.7H2O              130-250mg/L，
H3BO3                   2-11mg/L，
ZnSO4.7H2O              3-7mg/L，
MnSO4.H2O               6.5-10.5mg/L，
Na2MoO4.2H2O           0.11-0.21mg/L，
KI                        0.28-0.63mg/L，
CuSO4.5H2O              0.01-0.035mg/L，
CoCl2                    0.01-0.035mg/L，
FeSO4.7H2O              13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O            15-27mg/L，
肌醇                      50-1500mg/L，
维生素B1                 0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                  400-700mg/L，
甘露醇                    1000-4000mg/L，
蔗糖                      20,000-55,000mg/L，
PEG4000                   15000-190000mg/L，
酸水解酪蛋白              350-1050mg/L，
脱落酸                    7-150mg/L，
琼脂                      2,500-7,000mg/L。
2、根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于：所述诱导培养基组分为：
KNO3                     2102mg/L，
NH4NO3                  248mg/L，
KH2PO4                  77mg/L，
CaCl2.2H2O              326mg/L，
MgSO4.7H2O              155mg/L，
H3BO3                   3.5mg/L，
ZnSO4.7H2O              3.9mg/L，
MnSO4.H2O               7.6mg/L，
Na2MoO4.2H2O           0.113mg/L，
KI                         0.38mg/L，
CuSO4.5H2O              0.0125mg/L，
CoCl2                    0.0125mg/L，
FeSO4.7H2O              13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O            15-27mg/L，
肌醇                      50-1500mg/L，
维生素B1                 0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                  400-700mg/L，
蔗糖                      20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸         0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白              350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤              0.05-3.1mg/L，
激动素                    0.05-2.6mg/L，
琼脂                      2,500-7,000mg/L。
3、根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于：所述增殖培养基组分为：
KNO3                        2803mg/L，
NH4NO3                     331mg/L，
KH2PO4                     103mg/L，
CaCl2.2H2O                 326mg/L，
MgSO4.7H2O                 206mg/L，
H3BO3                      9.5mg/L，
ZnSO4.7H2O                 5.2mg/L，
MnSO4.H2O                  10.2mg/L，
Na2MoO4.2H2O              0.15mg/L，
KI                            0.51mg/L，
CuSO4.5H2O                 0.0125mg/L，
CoCl2                       0.0125mg/L，
FeSO4.7H2O            13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O          15-27mg/L，
肌醇                    50-1500mg/L，
维生素B1               0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                400-700mg/L，
甘露醇                  1000-4000mg/L，
蔗糖                    20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸       0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白            350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤            0.05-3.1mg/L；
或为：
KNO3                      2453mg/L，
NH4NO3                   290mg/L，
KH2PO4                   90mg/L，
CaCl2.2H2O               326mg/L，
MgSO4.7H2O               181mg/L，
H3BO3                    9.5mg/L，
ZnSO4.7H2O               4.52mg/L，
MnSO4.H2O                8.87mg/L，
Na2MoO4.2H2O            0.131mg/L，
KI                          0.44mg/L，
CuSO4.5H2O               0.0125mg/L，
CoCl2                     0.0125mg/L，
FeSO4.7H2O               13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O             15-27mg/L，
肌醇                       50-1500mg/L，
维生素B1                  0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                   400-700mg/L，
甘露醇                     1000-4000mg/L，
蔗糖                       20,000-55,000mg/L，
2，4-二氯苯氧乙酸          0.3-2.7mg/L，
酸水解酪蛋白               350-1050mg/L，
6-苄氨基嘌呤               0.05-3.1mg/L。
4、根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于：所述成熟培养基组分为：
KNO3                     2336mg/L，
NH4NO3                  276mg/L，
KH2PO4                 86mg/L，
CaCl2.2H2O             326mg/L，
MgSO4.7H2O             172mg/L，
H3BO3                  3.1mg/L，
ZnSO4.7H2O             4.3mg/L，
MnSO4.H2O              8.45mg/L，
Na2MoO4.2H2O          0.125mg/L，
KI                        0.42mg/L，
CuSO4.5H2O             0.0125mg/L，
CoCl2                   0.0125mg/L，
FeSO4.7H2O             13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O           15-27mg/L，
肌醇                     50-1500mg/L，
维生素B1                0.4-0.6mg/L，
谷氨酰胺                 400-700mg/L，
甘露醇                   1000-4000mg/L，
蔗糖                     20,000-55,000mg/L，
PEG4000                  15000-190000mg/L，
酸水解酪蛋白             350-1050mg/L，
脱落酸                   7-150mg/L，
琼脂                     2,500-7,000mg/L。
5、一种液体培养获得针叶树种胚状体的方法，包括如下步骤：
1)诱导培养：将针叶树种未成熟胚消毒后接种于权利要求1所述固体培养基的诱导培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到胚性愈伤组织；
2)增殖培养：将胚性愈伤组织接种于权利要求1所述液体培养基的增殖培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到增殖胚性细胞系；
3)成熟培养：将增殖胚性细胞系接种于权利要求1所述固体培养基的成熟培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到所述胚状体。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：成熟培养还在22-28℃、1600～2000lx的光照条件下进行光培养。
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CN101633903B (zh) * 2009-07-30 2012-07-18 齐玉琛 一种同步化调控针叶树体细胞胚发生方法
CN110050784A (zh) * 2019-05-23 2019-07-26 南京林业大学 抗松材线虫病马尾松胚性愈伤组织超低温保存方法

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