CN1729770A - 一种用于牛冷冻精液的中草药稀释液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于牛冷冻精液的中草药稀释液，该稀释液由基础液和中草药提取液组成，其中中草药提取液为基础液体积份数10％～14％，所述的基础液中每升含葡萄糖15g、乳糖30g和甘氨酸8g；中草药提取液从淫羊藿、巴戟天、菟丝子、甘草中提取。淫羊藿、菟丝子、巴戟天三种中草药其本身所含的各种氨基酸、无机盐、糖类等营养物质可以保证精子在低温保存过程中的代谢需要，对牛精液的冷冻和低温保存，提高牛的繁殖力有着重要的意义。对开发中草药的新用途和解决抗生素和化学物质的残留副作用，以及病原微生物的耐药性等不足也有着重要的意义。

Description

一种用于牛冷冻精液的中草药稀释液

                        技术领域

本发明涉及一种家畜人工授精技术改良中冷冻精液的稀释液，特别涉及一种用于牛冷冻精液的中草药稀释液。

                        背景技术

1780年，意大利动物学家Spallanznni将狗的精液放入雪中进行冷冻，室温融冻后观察精子的活动状态，从而开始了0℃以下保存精液的研究。20世纪初，用制冷技术或人工固态气体进行精液冷冻的研究开始出现，并且逐步引起各国科学家的重视。1908年，Maximov将植物组织和细胞浸在甘油液中，降温至-22℃，结果发现有部分细胞存活，这是首次采用低温保护剂的报道。1937年，Bernslain等用9.2％(1M)浓度的甘油液在-21℃保存部分哺乳动物及家禽的精液获得成功，并且还发现甘油浓度到达18％时会对精子产生毒害作用。1949年，Smith和Polge等用加有甘油的溶液成功地将鸡、牛、山羊的精液降温到了-79℃，同时，他们首次发现了甘油具有低温保护的性能，对于哺乳动物精液冷冻保存技术的发展做出了重要贡献。1950年，美国的瑞丁人工授精中心第一次获得了由冷冻精液人工授精产生的犊牛。1956年，Polge和Rowson通过改变精液的处理程序，提高了冻后精子的存活率和受胎率，冻后精子的复苏率可达70％～80％，并在-79℃下冷冻保存2小时至8天后的精液给38头母牛输精，有30头受胎，受胎率达79％，取得了巨大的成功。家畜精液的冷冻成功为扩大优秀种公畜的利用率和延长精液利用时间奠定了基础，也为人工授精和低温生物学的发展提供了广阔的空间。尤其是牛精液冷冻保存的成功是一项重大的技术创新，对家畜人工授精技术的发展产生了极其深远的影响。冷冻技术解决了精液长期保存的问题，使精液可以保存数年，甚至十多年之久，精液的利用率得到充分提高。由于冷冻精液在运输上比较方便，可以充分进行国内和国际间良种公畜精液的交流。不论从时间还是从空间上，都使种公畜的配种效能得到充分发挥，促进了人工授精技术的普及，加速了家畜品种改良的步伐。虽然家畜精液冷冻保存的研究和应用首先开始于牛，但近年来猪、羊、马等家畜以及特种动物的精液冷冻保存也取得了很大提高和发展。相比之下，牛冷冻精液的人工授精技术已广泛应用于生产实践，并且得到了普及。在家畜冷冻精液的稀释液研制方面，所有稀释液和保存环境的主要作用都是为了给精子提供足够的营养物供其代谢所需，防止精子迅速冷冻，进行缓冲以防止PH的变化，维持适当的渗透压，平衡电解质，抑制细菌的生长，扩大稀释倍数以增加输精头次，提高良种家畜和精液的利用效率。

近年来，随着我国农业产业结构的调整以及人民生活水平的提高，奶牛的饲养量急剧增加，而我国奶牛的产奶量普遍较低，利用冷冻精液通过人工授精技术改良我国低产奶牛就成为当务之急。但是，由于以前牛冷冻精液的研究比较成功，近年来的研究力度减小，人们仍然利用原来的稀释液和冷冻方法进行精液稀释和冷冻，生产实践中有时导致冻后精子存活率不高，影响人工授精效果。因此，根据目前的趋势，利用我国丰富的中草药资源开发新的稀释液就显得非常必要，这样既可以提高精子冻后的存活率，又加快了我国奶牛的改良力度，为加快我国低产奶牛的改良力度，迅速提高当地奶牛的产奶量，增加奶牛业的经济效益，拉动地方和区域经济发展具有积极的作用。

中草药在其生长繁殖过程中，从土壤、空气和阳光中汲取了自身需要的各种营养，并生产出抗拒不良环境及病原侵害的物质和功能，保持着各种成分结构的自然状态和生物活性，与地球的各种生物保持着天然的平衡关系，成为对人和动物有益又容易被接受的天然外源性有机物质。天然中草药中一般含有蛋白质、脂肪、糖、氨基酸、淀粉、维生素、矿物质和微量元素等营养物质。这些营养成分和中草药含有的其它生物活性物质可以促进动物的生长发育，提高动物产品的产量和质量；许多中草药具有清热解毒、补气活血的功能，可以杀菌、消炎、抗病毒，与抗生素的效果相同。经过多年来众多研究者对中草药单味及复方的研究，中草药在抗菌(特别是对一些耐抗生素及化学合成药的菌株)、抗病毒、抗肿瘤等方面均具有重要作用；中草药能够提高动物机体免疫细胞的数量和功能，刺激机体产生较高水平的抗体，延长抗体的维持时间。近年来，中草药免疫药理已受到广泛重视。研究结果表明，中草药成分中的有效生物活性物质主要有多糖、甙类、生物碱、挥发成分、有机酸，它们均具有一定免疫促进和调节作用。邰光远等用黄芪、白术、柴胡、金银花、连翘、木香、厚朴等组方，饲喂生长雏鸡，试验组鸡成活率提高17.6％，血液白细胞提高10％，淋巴细胞提高8％，单细胞提高0.85％；外加激素都具有毒副作用和残留等不良作用，而天然中草药虽然本身不是激素，却可以起到“激素样”的作用，而且还能起到减轻或消除外源性激素的毒副作用；中草药具有双向调节作用，对同一脏腑的不同功能状态能实施趋向平衡状态的调整作用。例如，有的中药既可以使DNA合成亢进降至正常，又可使DNA合成抑制调节兴奋而恢复到正常的合成状态；中草药具有抗应激作用。国内众多学者已对20多种中草药进行了研究，发现补气、助阳、补血、滋阴、安神等中药有较强的抗应激作用。如西洋参水提液灌胃能明显延长低压缺氧和窒息性小鼠的存活时间。同时，许多学者对以补益为主的各种中草药复方进行了研究，也取得了良好效果；中草药毒副作用小。天然中草药所含成分都是有机物，是经过传统式炮制和科学的配伍，其毒性大大减少或基本消除，而且天然中草药与化学合成药物合用，还能降低或消除化学合成类药物的毒副作用。

目前，关于中草药对家畜精液品质影响的研究较多，但大多是将中草药以饲料添加剂的形式进行饲喂，然后测定精液品质的变化。而关于将中草药直接添加到精液保存稀释液中的研究很少，几乎没有。因此，将中草药直接添加到稀释液中，研究中草药对解冻后的精液品质的影响十分必要，可以填补此项空白，以开发经济实用的新型中式稀释液配方，适应我国产业结构调整后奶牛业乃至其他家畜快速繁殖的需要。但是，含有中草药的精液稀释液由于研究者较少，并且中草药的成分相当复杂，其作用机理也不甚清楚，最佳配伍比例的中草药稀释液的开发应用还需要不断深入进行探索，同时也要完善其提取工艺，提高效率，以开发出具有独特优点的用于牛冷冻精液的中草药稀释液。

我国牛精液冷冻保存的研究始于20世纪60～70年代，虽然起步较晚，但成效显著，精液冷冻效果好，加之冷冻精液人工授精的诸多优点，目前已在全国各地普及应用，为牛的改良发挥了巨大作用。近年来，为了调整农业产业结构，各地相继将奶牛业作为拉动地方经济发展的支柱产业，并从国外大量引进良种奶牛，以改良我国低产奶牛品种。但是，多年来我国奶牛冷冻精液一直沿用原有的冷冻稀释液配方、冷冻-解冻技术，与国外同类研究相比，我国奶牛冷冻精液的整体水平仍然偏低。

我国中草药资源极其丰富，性能各异，具有化学合成药品难以比拟的优点，为开发冻精液的中草药稀释液的提供了新的资源途径。关于中草药对家畜精液品质的影响，谢成侠、龙翔等利用中草药添加剂饲喂公猪后，研究其对猪精液品质的影响，具有明显的改善作用。而对于以中草药提取液直接添加到精液稀释液中研究其对家畜冷冻精液效果的研究报道极少，在牛冷冻精液方面几乎没有报道。在目前化学药物研制转向自然药物的大趋势下，化学合成保护液已经有了一定的局限性，因而开发天然中草药冷冻精液保护液就显得十分迫切。

以下是申请人检索的相关参考文献：

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                        发明内容

本发明的目的在于，提供一种新型的用于牛冷冻精液的中草药稀释液，该中草药稀释液旨在通过以淫羊藿为主要成分，同时配伍其他与之有类似效用的中草药，选用相应的中草药，并且在稀释液中以最佳比例进行添加，探索出适宜的牛冷冻精液中草药稀释液配方，提高牛冷冻精液解冻以后的活率，以克服现有稀释液配方效果不稳定，冻精解冻以后存活率较低的缺陷。

为了实现上目的，本发明采取如下的技术解决方案：

一种用于牛冷冻精液的中草药稀释液，该稀释液由基础液和中草药提取液组成，其中中草药提取液为基础液体积份数10％～14％，所述的基础液中每升含葡萄糖15g、乳糖30g和甘氨酸8g；中草药提取液由下列重量比的原料提取而成：淫羊藿35％～37％、巴戟天27％～30％、菟丝子20％～22％、甘草12％～15％，原料的总和为100％。

实现上述用于牛冷冻精液的中草药稀释液的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)用电子天平准确称量葡萄糖15g/L；乳糖30g/L；甘氨酸8g/L，经双蒸水定容、过滤、灭菌后，冷却至室温，配制成基础液，然后置于2～5℃的冰箱中备用；

2)先将配方中的不同中草药准确称量后，用10倍量双蒸水浸泡1小时左右，然后分别将之移入旋转蒸发器的旋转蒸煮瓶内，60℃蒸煮1小时后滤出煮液，再加入6倍量双蒸水蒸煮30分钟，之后合并两次提取液，70℃减压浓缩至原体积的1/5，静置沉淀后取上清液过滤，将滤液离心、过滤后得到中草药提取液，置于冰箱备用；

3)在稀释液配制时，将上述中草药提取液以12％～14％的体积份数混入基础液中，再按照常规的冷冻方法制作冷冻精液即可。

本发明的用于牛冷冻精液的中草药稀释液，由于在基础液中添加了中草药淫羊藿、菟丝子、巴戟天等，而淫羊藿、菟丝子、巴戟天三种中草药本身所含的各种氨基酸、无机盐、糖类等营养物质可以保证精子在低温保存过程中的代谢需要，对牛精液的冷冻和低温保存，提高牛的繁殖力有着重要的意义。对开发中草药的新用途和解决抗生素和化学物质的残留副作用，以及病原微生物的耐药性等不足也有着重要的意义。

                      具体实施方式

本发明的实现可以在奶牛繁育中心、各地家畜改良站或者家畜人工授精中心等应用，将中草药按照配方要求的剂量购买后，先提取其有效成分，经过过滤、消毒后，在制作冷冻精液时替代部分基础液(基础液主要组成成分：葡萄糖15g/L、乳糖30g/L、甘氨酸8g/L)，再按照相应的冷冻方法制作冷冻精液即可。

配方：基础液，内含中草药淫羊藿、巴戟天、菟丝子、甘草；其中草药的重量比配方为：淫羊藿35～37％、巴戟天27～30％、菟丝子20～22％、甘草12～15％，中草药原料的总和为100％。

在提取中草药时，先将配方中的不同中草药准确称量后，用10倍量双蒸水浸泡1小时左右，然后分别移入旋转蒸发器的旋转蒸煮瓶内，60℃蒸煮1小时后滤出煮液，再加入6倍量双蒸水蒸煮30分钟，之后合并两次提取液，70℃减压浓缩至原体积的1/5，静置沉淀后取上清液过滤，将滤液离心、过滤后置于冰箱备用。

在上述中草药中，淫羊藿、菟丝子和巴戟天在传统中医学中归于滋阴壮阳类药，临床多用于治疗男子遗精、滑精、阳萎、不育和少腹冷痛、腰膝酸软等“肾虚”病症。存在于精子尾部轴鞘中的酶和精浆中的糖、蛋白质、有机酸等物质是精子运动所必须的启动剂和能量来源，因而改变精浆中的微量元素、介质、酶以及酸碱度、渗透压等，均可影响精子的活动，获能过程和穿卵功能。淫羊藿中含有黄酮、木脂素、生物碱和多糖，此外含有挥发油、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸等；菟丝子含有树脂甙、糖类、蛋白质、维生素、β-胡萝卜素等多种营养物质；巴戟天含有蒽醌类、蒽醌糖类，其单糖混合物主要为葡萄糖和甘露糖，并含有少量多糖、氨基酸、脂类及有机酸类、生物碱、黄酮类化合物、微量元素等多种营养物。

淫羊藿、菟丝子、巴戟天三种中草药对牛精液较好的冷冻效果主要得益于其本身所含的各种化学物质的作用。例如，淫羊藿中含有的3-O-2-L-鼠李糖等，糖类菟丝子中含有的3-O-β-D-半乳糖、7-O-β-D-葡萄糖及β-D-芹糖等，巴戟天醇提物中含有的葡萄糖和甘露糖和水溶性部分中分离出多糖等，在精液冷冻和低温保存过程中能起到抗冻、耐低温的保护作用。同时，菟丝子能增加SOD活性，抑制体内过氧化脂质的生成，具有一定的抗衰老、抗氧化作用，对细胞抗衰老具有一定作用，淫羊藿甙也有一定的延缓衰老的作用。淫羊藿、菟丝子、巴戟天不但具有补气活血、补肾壮阳的功能，还具有杀菌、消炎、抗病毒等作用。淫羊藿还有雌性激素和维生素作用。巴戟天的乙醇浸出液对枯草杆菌有抑制作用，说明巴戟天具有抗炎作用。三种中草药中含有的各种氨基酸、无机盐、糖类等营养物质可以保证精子在低温保存过程中的代谢需要。

另外，在上述配方中加入甘草，具有缓冲药性的功效，甘草可以延缓其它不利于精子活动物质的释放，从而延长了精子的存活时间。

因此，基于淫羊藿、菟丝子、巴戟天中所含有的各种化学物质对牛精液冷冻和低温保存具有显著的效果，该配方以淫羊藿、菟丝子、巴戟天为主要成分，同时配伍甘草，得到了效果较好的中草药稀释液配方，且其中草药提取液的最佳添加浓度为基础液的10％～14％。对牛精液的冷冻和低温保存，提高牛的繁殖力有着重要的意义。对开发中草药的新用途和解决抗生素和化学物质的残留，副作用及病原微生物的耐药性等问题也有着重要的意义。

本发明的中草药稀释液，冷冻、解冻后精子活率平均达到0.52，精子顶体完整率最高达到76.80％，畸形率仅14.61％，低温保存时间长达138小时。

以下是发明人给出的一个具体试验实施例，试验选用体质健壮、性欲旺盛的成年荷斯坦种公牛，按种公牛饲养管理要求进行饲养，其采精频率为每周3次。利用假阴道采集法采集公牛精液，精液采集后，立即在35～37℃下镜检。所采集的精液为乳白色或乳黄色，无异味，精子形态正常，活率达到0.7以上方可用于制作冷冻精液。

试验设置了三个不同配方：

配方一为淫羊藿20g；

配方二为淫羊藿20g、熟地黄20g；

配方三为淫羊藿25g、巴戟天20g、菟丝子15g、甘草10g。

上述所有中草药均购于陕西杨凌后稷药房。在提取中草药时，先将不同配方的中草药准确称量后，用10倍量双蒸水浸泡1h左右，然后分别将之移入旋转蒸发器的旋转蒸煮瓶内，60℃蒸煮1h后滤出煮液，再加入6倍量双蒸水蒸煮30min，之后合并两次提取液，70℃减压浓缩至原体积的1/5，静置沉淀后取上清液过滤，将滤液离心、过滤后置于冰箱备用。

用电子天平准确称量葡萄糖15g/L；乳糖30g/L；甘氨酸8g/L，经双蒸水定容、过滤、灭菌后，冷却至室温，配制成基础液，置于2～5℃的冰箱中备用。采精前，加入卵黄(240ml/L)、青霉素(10万单位)配制成I液，I液中加入甘油稀释(终浓度为3％)，同时按最终体积分数6.25％、12.5％、25.0％和50.0％四种浓度添加中草药稀释液，配制成II液。I液和II液需要现用现配。试验时采用二次稀释法，先将I液按1∶1的比例缓缓倒入精液中进行等温稀释(32～35℃)后，用12～15层纱布包裹后，连同II液放入2～5℃冰箱中平衡1～2h。然后加入II液，使精液与稀释液之比为1∶2，继续平衡1～2h。

本试验选取以淫羊藿为主要成分的三种不同配方的提取液，每个配方均设置四个浓度水平添加于稀释液中。不同配方及不同浓度的中草药提取液对牛精子冻后活率、顶体完整率、畸形率、低温存活时间的影响见表1、表2、表3、表4。以下是对精子活率、畸形率、顶体完整率、低温存活时间的检测方法：(1)精液解冻后立即在35～37℃的温度下进行活率检查。评定时，用玻璃棒蘸取1滴精液，滴于载玻片上，加上盖玻片，使盖玻片和载玻片之间充满精液，然后置于400X～600X显微镜下观察。在显微镜视野中，通过对精液上、中、下三层液面精子活动情况综合观察，评定精子活率。(2)取一滴解冻后的精液滴在干净的载玻片上，用另一载玻片呈45°，将精液抹向另一侧，制成抹片。自然风干后用1～2ml福尔马林磷酸盐缓冲液固定15min，水洗干燥后用姬姆萨染色90min，然后除去抹片上的染液，风干后置于1000倍生物显微镜下观察300个以上的精子，记录精子总数和顶体完整精子数。(3)取一滴解冻后的精液滴在干净的载玻片上，然后向该精液滴上加一滴伊红染色剂，染色3～5min后盖上盖玻片，置于400倍显微镜下镜检，检查不同视野300个以上精子，记录精子总数和畸形数，求出精子畸形率。(4)将稀释后的精液保存在4℃的冰箱内，每4h检查一次精子活率，直至精子全部死亡为止，记录精子保存时间。

表1  不同配方中草药提取液对奶牛冻精活率的影响

浓度	对照组	配方一	配方二	配方三
					-	0.44±0.09	-	-	-

6.25％12.5％25.0％50.0％

----

0.43±0.110.45±0.140.33±0.10**0.31±0.07**

0.38±0.090.40±0.090.15±0.09**0**

0.50±0.07*0.56±0.08**0.43±0.070.03±0.05**

注：^*表示差异显著(P＜0.05)，^**表示差异极显著(P＜0.01)。下同。

从表1可知，三种不同配方的提取液中，配方三中草药提取液效果最好，牛精子冻后活率显著高于其他各组(P＜0.05)，在添加浓度为12.5％时精子活率极显著地高于其他浓度水平(P＜0.01)；而其添加量为25.0％和50.0％时，精子冻后活率均显著降低。

表2  不同配方中草药提取液对牛冻精顶体完整率的影响

浓度	对照组	配方一	配方二	配方三
					-6.25％12.5％25.0％50.0％	65.23±1.92----	-64.92±1.8765.06±1.1660.68±1.47*53.98±2.03**	-65.63±1.0470.83±1.76*73.73±2.12**59.89±2.18*	-70.56±1.67*76.80±1.21**64.83±1.2454.01±3.01**

从表2可以看出，与对照组相比较，配方三中草药提取液在添加量为6.25％和12.5％时精子顶体完整率分别显著高于其它浓度水平(P＜0.05)；无论那个配方，当中草药提取液添加量为50.0％时均极显著地降低了精子顶体完整率(P＜0.01)。

表3  不同配方中草药对奶牛冻精畸形率的影响

浓度	对照组	配方一	配方二	配方三
					-6.25％12.5％25.0％50.0％	19.33±2.92----	-19.60+5.3118.21±8.2321.89±2.67*25.11±6.44**	-20.25±6.3620.34±2.7722.55±6.16**26.13±3.24**	-17.99±3.63*14.61±3.22**19.45±2.5723.36±2.92**

从表3可见，配方一和配方二两组中草药提取液在添加浓度较低时对精子冻后畸形率的影响不明显，而添加浓度为25.0％和50.0％时则显著增大了精子冻后的畸形率；配方三在添加量为6.25％和12.5％时使精子冻后畸形率显著降低，在添加浓度为25.0％时与对照组没有差异，但添加量达到50.0％时则非常显著地增大了精子畸形率(P＜0.01)。

表4  不同配方中草药对牛精子低温保存时间的影响

组别	提取液浓度	有效保存时间(h)	总保存时间(h)
				对照组配方一组配方二组配方三组	-	45±3.96	95
6.259％12.5％25.0％50.0％	57±3.46*53±4.0132±4.33*12±3.78**	111976319
			6.25％12.5％25.0％50.0％		44±5.0134±4.1614±5.05**7±5.07**	89592111
6.25％12.5％25.0％50.0％	62±4.03*65±3.78**39±4.2319±3.92**	1171387527

从上表可以看出，本研究的三个配方中草药提取液中，配方一和配方三在添加比例为6.25％和12.5％时的保存效果最好，与对照组和配方二组相比，差异显著(P＜0.05)。在同一配方的中草药提取液中，不同添加比例的影响较大，均以添加水平6.25％和12.5％时的效果较好，精液低温存活时间长，与高添加量相比差异极显著(P＜0.01)。

Claims (2)

1.一种用于牛冷冻精液的中草药稀释液，其特征在于，该稀释液由基础液和中草药提取液共同组成，其中草药提取液为基础液体积份数10％～14％，所述基础液中每升含葡萄糖15g、乳糖30g和甘氨酸8g；中草药提取液由下列重量比的原料提取而成：淫羊藿35％～37％、巴戟天27％～30％、菟丝子20％～22％、甘草12％～15％，原料的总和为100％。

2.一种实现权利要求1所述的用于牛冷冻精液的中草药稀释液的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)用电子天平准确称量葡萄糖15g/L；乳糖30g/L；甘氨酸8g/L，经双蒸水定容、过滤、灭菌后，冷却至室温，配制成基础液，然后置于2～5℃的冰箱中备用；

2)将配方中的淫羊藿、巴戟天、菟丝子、甘草准确称量后，用10倍量双蒸水浸泡1小时左右，然后分别将之移入旋转蒸发器的旋转蒸煮瓶内，60℃蒸煮1小时后滤出煮液，再加入6倍量双蒸水蒸煮30分钟，之后合并两次提取液，70℃减压浓缩至原体积的1/5，静置沉淀后取上清液过滤，将滤液离心、过滤后得到中草药提取液，置于冰箱备用；

3)在稀释液配制时，将上述中草药提取液以12％～14％的体积份数混入基础液中，再按照常规的冷冻方法制作冷冻精液即可。