CN1723040A - 用于产生和递送抗病毒剂、佐剂和疫苗促进剂的经改良重组细胞(ARCs) - Google Patents

Abstract

本发明提供了活性细胞因子和/或趋化因子组合物，以及活性细胞因子和/或趋化因子组合物的产生、经改良细胞的包封、以及活性细胞因子和/或趋化因子组合物的加工和递送的廉价方法。本发明还提供了治疗方法和促进免疫应答的方法，该方法包括对动物或人施用含有细胞因子和/或趋化因子的经改良重组细胞(ARC)的组合物。

Description

用于产生和递送抗病毒剂、佐剂和疫苗促进剂的 经改良重组细胞(ARCs)

相关申请的交互参照

本申请要求2002年10月8日提交的美国临时申请60/417,124的权益，该临时申请在此处被完整地(包括所有图、表、序列和公式)并入作为参考。

发明背景

细胞因子和趋化因子是功能免疫系统的重要成分。例如，干扰素是生物技术最先的重组药物之一并且用作抗病毒剂和用于动物健康中疫苗的免疫佐剂(2；24)。γ干扰素(IFN-γ)是一种细胞因子，其在动物中引起强烈的抗病毒和免疫佐剂应答(1-3；6；8；13；17；18；20；22；23；25)。IFN-γ-强化的疫苗(13；18)可用于治疗疾病诸如牲畜中的船热(shipping fever)和乳腺炎。然而，在当前技术下，已经证明IFN-γ既不稳定，生产又极端昂贵。每毫克的成本为数百美元，而所需的治疗水平为每剂若干毫克，所以认为使用IFN-γ作为动物健康抗病毒剂或者作为疫苗佐剂是不切实际的。干扰素和其他细胞因子(在表1中列出)作为治疗疾病的魔法的最初希望还没有被完全实现(1)。

在牲畜和其他动物，如其他哺乳动物、鸟、鱼和爬行动物中，IFN-γ直接或间接作用于先天性和适应性免疫系统的几乎每一种组分(1)。此外，IFN-γ是最多效的细胞因子之一(如果不是最多效的细胞因子的话)，深刻影响抗原加工和呈递、淋巴细胞迁移的抑制、巨噬细胞活化、B-淋巴细胞抗体产生(21)、天然杀伤(NK)细胞活性、以及与运输和免疫识别有关的白细胞细胞表面分子的上调。IFN-γ的强受体位于T、B-淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞和平滑肌细胞上。而且，由于其作为抗病毒剂的中心角色，IFN-γ是病毒破坏活性的主要靶标。例如，病毒编码可以使IFN-γ失活、干扰IFN-诱导的抗病毒途径和中断细胞内IFN-γ信号传递的蛋白质。

1986年在大肠杆菌中首先克隆并合成了具有生物学活性的牛IFN-γ(5)。在1994年报导了马IFN-γ的核苷酸序列，该序列与人IFN-γ具有67％序列同一性，与牛IFN-γ具有78％同一性。在1999年报导了重组鸡IFN-γ的结构，并且在大肠杆菌中表达了一种具有活性的截短形式(在lys133处截短)。其3D结构与牛和人IFN-γ的类似，尽管总氨基酸同一性仅为32％(14)。

发明概述

本发明提供了活性细胞因子和/或趋化因子组合物，以及活性细胞因子和/或趋化因子组合物的产生、经改良细胞的包封、以及活性细胞因子和/或趋化因子组合物的加工和递送的廉价方法。本发明还提供了治疗方法和促进免疫应答的方法，该方法包括对动物或人施用活性γ-干扰素以及其他细胞因子和/或趋化因子组合物。

在本发明的一个方面，使用本领域中熟知的基因工程，可以在多种微生物细胞，包括在细菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表达IFN-γ以及多种其他细胞因子。适宜地重构细胞因子基因并将其精确地置于强调节启动子和转录/翻译终止子之间的宿主质粒载体，可以常规地实现在具体外源宿主中IFN-γ的表达。本领域中技术人员通过普通方法也可以常规地试验任一种宿主的适宜性，而不用过多实验。一旦被转化的微生物细胞已经高水平表达了IFN-γ或其他细胞因子，则可以用作用物(包括热和化学试剂)改良细胞，该作用物杀死(消毒)细胞、稳定所表达的活性细胞因子，并改善细胞壁以最佳地释放细胞包裹的细胞因子。例如，用于本说明书中表达IFN-γ的荧光假单胞菌的细胞的消毒/改良方法是最初用于生产商业生物杀虫剂MVP的方法的改进方法(4；9；19)。根据该方法，用pH约4.3的鲁戈氏碘液处理荧光假单胞菌的细胞。该pH充分地原位消毒培养物，改善细胞壁的物理耐久性，并使得细菌细胞壁易受蛋白水解溶解(9)。该方面还消除了细胞絮凝，并且显示出减小该假单胞菌细胞壁的内毒素性质。

可以通过经口、鼻、眼或肠胃外注射方法递送含有IFN-γ的经改良重组细胞(IFN-γ/ARCs)。孵育IFN-γ/ARCs的这些方法可用于治疗人和动物(例如牛)中的疾病，含有牛IFN-γ的ARCs可用作预防剂以防止船热，或者用于母牛以保护新生牛免受病毒性疾病和/或细菌性胃溃疡。此外，还可以治疗人和除了牛之外的动物，如马、猪、鸡，以及家庭宠物。该方法还可用于缩短动物和人中的多种应激相关的疾病以及作为免疫应答的佐剂和促进剂增强多途径人接种，这可通过施用足够量的含有IFN-γ的ARCs以诱导所希望的生物学效应。

附图简述

图1是pMYC1803的质粒图。

图2是除去信号肽的合成牛γ-干扰素的编码序列、互补序列和氨基酸序列。

图3是SDS-PAGE照片，显示α和γ牛干扰素分别为约18和17kDa。培养样品在加入凝胶之前以1∶5稀释。每孔加入10μL。

图4是弗氏压碎器(French-Press)破坏的含有BAI和BGI的荧光假单胞菌培养物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的照片，其显示多数BAI出现在沉淀级分。

图5是BGI/ARC稳定性试验结果的列表说明。

图6A是体外牛肾脏细胞应答从重组大肠杆菌纯化的同种牛IFN-γ(BGI)而产生的MHC II蛋白的图解表示。图6B是体外牛肾脏细胞应答1)未转化的荧光假单胞菌MB324(ARC，无载体、无BGI)，2)转化的荧光假单胞菌BR1241(ARC，有载体、无BGI)，3)转化的荧光假单胞菌MR1605(BGI/ARC，ARC，有载体，有BGI)，和5)从重组荧光假单胞菌纯化的BGI所产生的MHC II蛋白的比较图解。

图7A图解了来自大肠杆菌的经纯化重组BGI(RecBoIFNγ)对树突细胞产生MHC II蛋白的影响。图7B是树突细胞应答1)未转化的荧光假单胞菌宿主细胞对照(MB324)，2)pMYC1803(仅用载体转化的)ARC对照(MR1241)，3)BGI/ARC(用BGI基因转化的)(MR1605)，和4)来自荧光假单胞菌的经纯化BGI(DOWIFN)而产生的MHC II的比较。

图8显示了BGI/ARCs对受试小牛体温的影响。

图9描绘了BGI/ARCs对受试小牛体重的影响。

图10描绘了BGI/ARCs对牛临床症状的影响。

图11图解了BGI/ARCs的免疫佐剂活性以及BGI-ARCs加速小牛对抗原(例如，猪血清白蛋白)的免疫应答的能力。

图12表明了BGI/ARCs对淋巴细胞的增殖性影响(通过³H胸苷的掺入来测量)。

图13表明了禽IFN-γ/ARCs(CGI/ARCs)对鸡巨噬细胞一氧化氮产生的活性。

发明详述

本主题发明提供了活性细胞因子和/或趋化因子组合物，其已经在经处理的(改良的)微生物系统中表达，该微生物系统在此处被命名为经改良的重组细胞(Amended Recombinant Cells)或ARCs。ARCs是含有表达的、异源蛋白的重组微生物细胞，该细胞已经通过特定化学消毒方法杀死，这些化学消毒方法改良了微生物细胞的细胞壁。该改良方法同时以两种不同的方式改变微生物的细胞壁的性质：A)发生细胞壁的物理强化，使得微生物细胞更难被i)剪切，ii)超声振荡，或iii)对细胞施加压力而破坏，和B)发生细胞壁蛋白质的化学变性，使得细胞更易被蛋白水解破坏。

在多个实施方案中，本主题发明提供了载体转化的微生物ARCs，这些载体含有编码IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、11-16、IL-18、IL-23、IL-24、红细胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生长因子(PDGF)、MSF、FLT-3配体、EGF、成纤维细胞生长因子(FGF；例如，aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7)、胰岛素样生长因子(例如，IGF-1、IGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、干扰素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、制癌蛋白M、干细胞因子(SCF)、转化生长因子(例如，TGF-α、TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1)、或趋化因子(如，但不限于，BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-1、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC或TECK)或表1、8和9中提供的那些细胞因子和/或趋化因子的至少一种异源基因。在优选实施方案中，ARCs含有IFN-γ(例如，牛、禽(例如，鸡)、鱼或人IFN-γ)。在另一优选实施方案中，ARCs含有IFN-γ和IFN-α(例如，牛、禽(例如，鸡)、鱼或人IFN-γ和IFN-α)。如此处所用的，术语“ARC”或“ARCs”表示含有一种或多种异源基因经改良重组细胞。不含有异源干扰素基因或者干扰素蛋白经改良重组细胞被称作“对照ARCs”或“ARC对照”。

在一些实施方案中，微生物细胞共表达一种或多种编码抗原和/或抗原性蛋白的其他异源基因。抗原或抗原性蛋白的非限制性实例包括，并且不限于，自身抗原、肿瘤抗原、MMR疫苗、脊髓灰质炎疫苗、破伤风疫苗、环境中个体通常遇到的病原(例如，食物带有的病原如克雷伯杆菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)中的种、肝炎病毒、流感病毒等)和特别导入个体环境的病原性物质，如生物毒素(例如，真菌毒素如单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒杆菌(Clostridium botulinum)神经毒素、武器化微生物细胞(例如，含有毒素DNA或RNA插入片段的病毒，或用毒素[例如，真菌毒素如单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒杆菌神经毒素]转化的细菌或真菌细胞、病毒病原、真菌病原、或细菌病原(例如，天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis))、或免疫调节蛋白如超级抗原、血清白蛋白或蛋白质稳定剂。不同的实施方案提供了表达单一异源基因(例如，单一细胞因子、趋化因子，或蛋白质)的分别的ARC组合物。在一些实施方案中，共表达的蛋白或抗原(如血清白蛋白)被来自目的动物物种的DNA编码。在一些实施方案中，在一种微生物系统中表达的所有蛋白质都包含在单一载体中。其他实施方案提供了用编码目的蛋白质的多个载体转化微生物细胞。在其他实施方案中，可以以任一方便的方式将异源基因导入宿主，提供染色体外维持或整合到宿主基因组。(异源表示该基因不存在于它所导入的宿主中，该基因也不通常在该宿主中发现。即，即使宿主生物体和异源基因的来源交换信息，该异源基因也通常发现不存在于天然的野生型宿主细胞中。通常，术语“异源的”将包括作为宿主和基因来源的不同属的物种。)

可以使用多种构建体，其包括来自质粒、病毒或着丝粒的复制系统与维持稳定的自主复制片段的组合。仅希望整合时，所用的构建体可提供复制，并且或者是转座子或者具有类似转座子的插入活性或者提供与宿主基因组的同源性。通常，所用的DNA序列在与宿主基因组序列(染色体或质粒)同源的序列之间具有异源基因。希望一种或多种异源基因以多份拷贝存在。见，例如，美国专利号4,399,216。从而，接合、转导、转染和转化可用于导入异源基因。

在使用染色体外元件的实施方案中，希望DNA构建体包括一种下述标记，其允许选择含有该构建体的那些宿主细胞。该标记通常提供杀生物剂抗性，例如，抗生素抗性或重金属抗性，为营养缺陷型宿主提供原养型互补，等等。该复制系统可提供特别的性质，如失控复制，可以包括cos细胞，或其他特别的特征。

具有可被宿主细胞识别的转录和翻译起始和终止调节信号的异源基因可以与异源基因联合使用。然而，在以下情况时，例如，通过除去前导序列修饰该异源基因或者提供编码成熟形式细胞因子和/或趋化因子的序列(其中完整基因编码前体)，通常需要操作DNA序列，从而可以提供与天然的转录起始调节序列不同的转录起始调节序列。

不同宿主存在不同的转录起始序列。该序列可提供细胞因子和/或趋化因子的组成型表达或受调节的表达，其中该调节可被化学品如代谢物、被温度或者被可调节的阻抑物诱导。见，例如，美国专利号4,374,927，该专利在此处被完整并入作为参考。启动子的具体选择将取决于许多因素：启动子的强度、启动子与细胞的存活力的干扰、细胞内源调节机制对启动子的影响，等等。可从多种来源包括商业来源得到多种启动子。

表1、8和9中列出的适于细胞因子表达的载体是本领域技术人员熟知的。同样，表1、8和9中列出的编码细胞因子和趋化因子的异源基因是本领域中技术人员公知的并且编码序列可从多种来源得到，这些来源包括多种专利数据库、可公开利用的数据库(如在国家医学图书馆或欧洲分子生物学实验室的核酸和蛋白质数据库)，这些数据库含有编码前述细胞因子、趋化因子或其他蛋白质的核酸或多肽序列，还包括科学文献，或者在诸如Genzyme，Inc.、R & D Systems，Inc或InvivoGen，Inc.的公司出版的目录中引用的科学文献[见例如，1995细胞因子研究产品目录、GenzymeDiagnostics，Genzyme Corporation，Cambridge MA；2002或1995Catalog of R & D Systems，Inc(Minneapolis，MN)；或2002Catalog ofInvivoGen，Inc(San Diego，CA)，它们的每一种都被完整(包括其中引用的参考文献)并入作为参考]。备选地，可以从供应商，如R & D Systems，Inc.(Minneapolis，MN 55413)或InvivoGen，Inc.(San Diego，CA 92121)得到编码细胞因子和/或趋化因子的核酸和含有编码细胞因子和/或趋化因子的核酸的载体。在主题发明的一些方面，操作微生物细胞以表达细胞因子和/或趋化因子的多种组合。

适于用于主题发明的微生物细胞包括原核生物(革兰氏阳性和革兰氏阴性生物)和低等真核生物，如真菌。适于用于本发明的细菌细胞的种类包括如下属的种类：1)肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus)的种；2)芽孢杆菌科(Bacillaceae)；3)根瘤菌科(Rhizobiaceae)，如根瘤菌属(Rhizobium)；4)螺菌科(Spirillaceae)，如发光菌属(photobacterium)、Zymomonas、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺菌属(Spirillum)；6)乳杆菌科(Lactobacillaceae)；7)假单胞菌科(pseudomonadaceae)，如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋杆菌属(Acetobacter)；8)固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。在低等真核生物中，真菌如藻状菌纲(Phycornycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，其包括酵母，如酵母属(Saccharomyces)和粟酒裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；和担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，如红酵母属(Rhodotorula)、短梗霉属(Aureobasidium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)，等等。一旦所转化的微生物细胞高水平表达细胞因子蛋白，就可通过常规方法收获细胞并用固定试剂处理以杀死细胞和稳定活性细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子和/或趋化因子在荧光假单胞菌细胞中表达；将细胞固定、收获并洗涤或任选洗涤，然后固定。

含有一种或多种异源基因的细胞宿主可以生长在任一方便的营养培养基中，其中提供选择培养基为DNA构建体提供了选择优点(例如，生长在含有抗生素的选择性培养基中)，从而基本上所有或所有细胞都保留一种或多种异源基因。然后可以按照常规方法收获这些细胞并对其以上述多种方式修饰。备选地，可以在收获前固定细胞。

通过下面的试验在此处和整个本发明中定义ARCs：A)ARCs是死亡的。它们不能在适于它们的活体形式生长的营养培养基上形成菌落。B)ARCs的物理耐久性增强。它们比未改良的活体形式更能够抵抗超声振荡的破坏，或者更能抵抗穿过弗氏压碎器造成的破坏。C)ARCs易受蛋白水解而溶解。通过显微术、光学或通过其他方法可以发现它们比它们的未改良的活体形式更容易受到胰蛋白酶(或多种其他蛋白酶)的蛋白酶水解性溶解。D)ARCs含有重组的异源基因并且表达异源蛋白，其中异源蛋白的目的功能性质被部分或完全保留。

宿主细胞失活和改良的多种技术包括用酸(如乙酸)酸化，加入或不加入卤化剂如碘，UV辐射；冻干；毒素例如抗生素；酚类；苯胺，例如碳酰替苯胺(carbanilide)和水杨酰苯胺(salicylanilide)；羟基脲；季醇；抗细菌染料；EDTA和脒；非特异有机和无机化学品，如已经提到的卤化剂，例如，氯化、溴化或碘化剂；醛，例如，戊二醛或甲醛；有毒气体，如臭氧和环氧乙烷过氧化物；补骨脂素；脱水剂；等等，它们可单独使用或联合使用。试剂的选择将取决于具体细胞因子或趋化因子、宿主细胞的性质、产生杀死细胞这一效果所需的细胞结构的经改良性质、保存细胞因子活性、物理上强化细胞壁、细胞壁蛋白的化学变性、使得细胞对蛋白质水解更敏感。

用于失活和改良以产生ARCs的适宜试剂包括卤化剂，尤其原子序数为17-80的卤素。更具体地，可以在温和条件下使用碘并进行足够时间以实现所希望的结果。其他适宜的技术包括用醛，如甲醛和戊二醛；抗感染药，如氯化苄基-二甲基-烷基铵(zephiran chloride)和十六烷基氯化吡啶鎓；如异丙醇和乙醇；多种组织固定剂，如布安氏固定剂和Helly固定剂处理(见：Humason，Gretchen L.，动物组织技术，W.H.Freeman and Company，1967)；或者联合使用物理(热)和延长细胞因子和/或趋化因子的活性的化学剂。

对于用碘卤化，温度将通常为约0℃到50℃，但是可以在室温下进行反应。本领域技术人员基于不同ARCs所表达的细胞因子的活性或活性的缺乏来确定这些变量的最佳值是常规的。本领域技术人员还可以检测其他此类变量而不用过多实验。例如，便利地，可以用溶于酸性水性介质，尤其约0.5到5M水性羧酸溶液中0.5到5％的三碘化物或碘检测碘化作用。可以使用乙酸，或者也可以使用其他羧酸，这些羧酸的碳原子通常为约1到4个。反应时间将通常为小于1分钟到约24小时，通常为约1到6小时；一般，卤化(例如，碘化)溶液的pH保持在约4.0到约7.0。在一些实施方案中，pH范围为约4.0到约6.0，约4.0到约5.0，约4.1到约4.7，约4.2到约4.6，约4.3到约4.4，或约4.3。在其他实施方案中，pH范围为约3.0到约6.0，约3.5到约5.0，约3.7到约4.7，约3.8到约4.6，约3.9到约4.4，或约4.3。如果需要，可通过与还原剂，如连二亚硫酸盐、硫代硫酸钠或其他还原剂反应除去任何残留的碘。此外，可对经修饰的细胞实施进一步处理，如彻底洗涤以除去所有反应介质，以干燥形式分离，并与本领域中技术人员通常使用的粘着剂、展开剂和佐剂配制。在一些实施方案中，可用本领域中公知的交联剂处理经修饰的细胞以制备ARCs。

在(9)和美国专利号4,695,455(它们在此处被完整并入作为参考)中描述了一种该改良方法的步骤一鲁戈氏固定。细胞一旦经改良，将细胞在水中洗涤并适当地配制以用于多种治疗性应用中。在本发明的该方面，制备了含有经改良生物的组合物并且该组合物可以以足够量施用于个体以诱导目的生物学效果。可以在任一载体中配制组合物，该载体包括，例如，E.W.Martin′s Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，PA中描述的载体。

本主题发明提供了诱导和/或促进个体中免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：对个体(如禽、两栖动物、爬行动物、甲壳动物、鱼或哺乳动物个体)施用含有表达细胞因子/趋化因子的经改良重组细胞(ARCs)、一种或几种目标抗原和任选地含有额外的佐剂分子如脂多糖(LPS)或CpG二核苷酸的组合物，所施用的组合物的量可有效产生免疫应答。在一些优选的实施方案中，ARCs共表达：a)一种或多种目标抗原，和b)一种或多种细胞因子/趋化因子，如IFN-γ或表1、8和9中列出的其他细胞因子/趋化因子。在其他实施方案中，对个体提供混合含有一种或多种抗原并含有表达一种或多种细胞因子/趋化因子的ARCs的组合物。为了所述混合组合物的目的，1)以纯化的形式，2)作为粗提物，和/或3)以单独的ARC组合物形式，其中细胞已经用编码目标抗原的DNA转化，提供一种或多种抗原。在任一实施方案中，可以任选提供本领域中技术人员公知的佐剂。在一些优选实施方案中，ARCs至少共表达IFN-γ和IFN-α。

本主题发明的另一方面提供了促进个体中免疫应答的方法，该方法包括对个体施用含有一种或多种细胞因子和/或趋化因子的经改良重组细胞(ARCs)，或其组合物，所施用的量可有效促进个体的免疫应答。在本发明的一方面，个体最高体液免疫应答(例如抗原攻击后观察到的IgM和/或IgG抗体的最大量)的出现可提前1到14天或更多天。在本发明的该方面，该个体可以以前暴露于抗原或者该抗原可以共同施用于该个体。

从而，本主题发明提供了促进个体中抗体同种型(例如，IgG1和IgG2)，或者多种型别的抗体(例如，IgM、IgG、IgA、IgE和/或IgY)产生的方法，该方法包括施用含有一种或多种细胞因子/趋化因子的ARCs的组合物。该方法还可以包括ARC施用之前、同时或随后施用抗原或免疫原。在一些实施方案中，ARC组合物是IFN-γ/ARC。其他实施方案提供了含有INF-α和IFN-γ的ARCs。在不同实施方案中，干扰素基因是人、禽(例如，鸡)、牛、哺乳动物或鱼来源的干扰素基因。

在本发明的一些实施方案中，个体暴露目标抗原2到168小时后，将表达一种或多种细胞因子和/或趋化因子的ARCs施用于该个体。“目标抗原”包括，但不限于，自身抗原、肿瘤抗原、MMR疫苗、脊髓灰质炎疫苗、破伤风疫苗、环境中个体通常遇到的病原(例如，食物带有的病原如克雷伯杆菌属、沙门氏菌属、埃希氏杆菌变种、肝炎病毒、流感病毒等)和特别导入个体环境的病原性物质，如生物毒素(例如，真菌毒素如单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒杆菌神经毒素、武器化微生物细胞(例如，含有毒素DNA或RNA插入片段的病毒，或用毒素[例如，真菌毒素如单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒杆菌神经毒素]转化的细菌或真菌细胞、病毒病原、真菌病原、或细菌病原(例如，天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶尔森氏菌)、或免疫调节蛋白如超级抗原、血清白蛋白或蛋白质稳定剂。从而，本主题发明可应用于：a)治疗暴露于生物恐怖活动中的生物剂的个体；和b)治疗暴露于环境中通常遇到的病原的个体。在本发明的该方面的优选实施方案中，ARCs共表达IFN-γ和/或IFN-α并任选地LPS。任选地，除了IFN-γ和IFN-α之外，ARCs还共表达其他蛋白质、细胞因子和/或趋化因子。

本主题发明还提供了治疗肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法，该方法包括对个体施用含有一种或多种细胞因子/趋化因子的经改良重组细胞(ARCs)或者其组合物，所施用的量可有效实现个体中的治疗效果。在一些实施方案中，术语“治疗”和/或“治疗效果”指任何方法、行动、应用、疗法等等，其中个体受到医务救护，该医务救护的目的是改善该个体的病症、生活质量或者预后前景。在其他实施方案中，术语“治疗”或“治疗效果”还包括对个体提供治疗，该治疗导致肿瘤块减小、癌细胞的数目减少、或者导致个体中所治疗的肿瘤、癌或恶性肿瘤的缓解。

本主题发明提供了刺激、抑制、或调节个体的免疫系统的方法，该方法包括施用含有根据本发明主题教导的表达细胞因子和/或趋化因子(例如，表1、8和9中列出的那些)的经改良微生物细胞(ARCs)的组合物。在一个特定实施方案中，本主题发明提供了个体中巨噬细胞的活化或刺激方法，该方法包括施用含有一种或多种异源基因的ARCs，所施用的量足够活化或刺激个体的巨噬细胞。在特定实施方案中，ARCs含有编码IFN-γ和任选地编码IFN-α的异源基因。

本主题发明还提供了增加个体中病毒抗性的方法，该方法包括施用含有根据本发明主题教导的表达细胞因子和/或趋化因子的经改良重组微生物细胞(ARCs)的组合物。在一些实施方案中，经改良微生物细胞含有细胞因子，如IFN-γ。在其他实施方案中，组合物含有调节目的生物效应的细胞因子和/或趋化因子。这些组合物所施用的量可有效刺激、抑制、调节或实现目的生物学效果(例如，抗病毒活性或表1、8或9中列出的其他活性)。从而，本主题发明还提供了诱导目的生物学效果如表1、8或9中列出的生物学效果的方法，该方法包括施用足够量的ARC组合物(例如，含有编码诱导目的生物学效果的细胞因子和/或趋化因子的异源基因的ARCs)以诱导目的生物学效果。

本主题发明还提供了在个体中诱导至少一种目的生物学效果的方法，该方法包括施用含有一种或多种异源基因的ARCs或者ARCs的组合物，所施用的量可有效诱导目的生物学效果。示例的细胞因子和/或趋化因子的生物学效果是技术人员公知的并且与多种细胞因子和/或趋化因子相关的生物学功能的非限制性实例在表8-9中列出。

本主题发明还提供了可人用和兽用的方法。术语“个体”包括鱼、禽、哺乳动物和/或爬行动物。从所公开的方法受益的哺乳动物物种包括并且不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；驯养的动物(宠物)，如狗、猫、豚鼠、仓鼠、越南大肚猪、兔和雪貂；驯养的农场动物，如奶牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊，和山羊；通常在动物园中的外来动物，如熊、狮、虎、豹、象、河马、犀牛、树袋熊、羚羊、树懒、瞪羚、斑马、角马、大草原犬、树袋熊、袋鼠、负鼠、浣熊、熊猫、大熊猫、鬣狗、海豹、海狮、和海象。爬行动物包括，并且不限于，短吻鳄，鳄鱼，海龟，乌龟，蛇，鬣蜥，和其他蜥蜴。禽类包括，并且不限于，鸡、火鸡、鸽子、畏缩、鹦鹉、金刚鹦鹉、鸽子、几内亚母鸡、多情鹦鹉、长尾小鹦鹉、火烈鸟、鹰、鹰、猎鹰、秃鹰、鸵鸟、孔雀、鸭、和天鹅。鱼包括，并且不限于，鱿鱼、枪乌贼、鳗鱼、章鱼、鳕鱼、金枪鱼、鲑鱼、鳕鱼、桠鱼、鳟鱼、黑线鳕、比目鱼、鲽、银鱼、喷鱼(blowfish)、鸡泡鱼(pufferfish)、狗鱼、石斑鱼、大比目鱼、鲤鱼、鲈鱼、梭子鱼、翻车鱼、罗非鱼、鲤鱼、鲶鱼、金鱼、鲤科小鱼、棉鲤(koi)、鲈鱼、鲭、腌鱼、水虎鱼、刺蝶鱼、小丑鱼(clownfish)、扁鲨、绿青鳕、鳕鱼、飞鱼、箭鱼、亚口鱼、七鳃鳗、蝠魟(manta ray)、海鹞鱼、鲑鱼、鳐鱼、青鱼、古比、熏鱼、棘鱼、牙鳕、鲈鱼、白鲑、weaverfish、深海狗母鱼(spiderfish)、胡瓜鱼、粘鱼、西鲱、肺鱼、弹涂鱼、腔棘鱼、比目鱼、太平洋油鲽、keogh、檬鳎、鲆、鳐属、勃氏笛鲷、鲂鱼、青鳕、琵琶鱼、鹦哥鱼(parrotfish)、炮弹鱼(triggerfish)、霓虹脂鲤、梭鱼类、石头鱼(stonefish)、鲉、濑鱼、丁鲷、斜齿鳊、枪鱼、锯鳐、旗鱼、金枪鱼、凤尾鱼、鲟鱼、石头泥鳅(stoneloach)、短鲫、barbie、河鳟、比目鱼、尖吻鲈(barmundi)、朱文锦(shebunkin)、斗鱼、雀鳝、海龙、蓑鲉、海鳗、绿色美洲鳗(morayeel)、翻车鱼、剪刀鱼(scissorfish)、梭鲈、斑马鱼、胭脂鱼、沙丁鱼、白鲑、pilotfish、虾虎鱼、喉盘鱼、大鳐鱼、海鲂。还包括鲨鱼，包括但不限于，灰鲭鲨、大白鲨、锤头鲨、蓝鲨、长尾鲨、须鲨(wobbegong)、柠檬鲨、白鳍鲨(whitetip)、白尖礁鲨(whitetipreef)、灰色礁鲨、公牛鲨、沙鲨、护士鲨、鲸鲨、姥鲨(basking)、豹鲨、虎鲨、鼠鲨、巨口鲨、翅鲨、天使鲨、沉睡鲨(sleeper)、灯笼鲨、猫鲨(swell)、角鲨鱼、妖鲨、沙虎鲨、尖鼻鲨(sharpnosed)、黑鳍礁鲨、黑鼻鲨、牛头鲨、黑鳍鲨、窄头双髻鲨(bonnet)、褐鲨、绒毡鲨、黑鲨、饰妆鲨、加拉帕戈斯鲨、cookie cutter、鳄鱼鲨、尖吻鲨、星鲨、猫斑鲨(marbled cat)、圆鼻鲨、锯鲨、七鳃鲨、窄头双髻鲨、丝鲨、小尾鲨、白斑角鲨、赞比西鲨、光尾鲨、宽纹虎鲨、鲸真鲨。爬行动物的非限制性实例包括，并且不限于，鳄鱼、短吻鳄、蛇、蛙和龟(如鳄龟和海龟)。

其他爬行动物和/或鱼包括在Regulatory Fish Encyclopedia，美国食品和药物管理局，Seafood Products Research Center，Center for FoodSafety & Applied Nutrition；The 2001 Seafood List，U.S.Food & DrugAdministration，Center for Food Safety & Applied Nutrition；《鱼类目录》，William N.Eschmeyer编辑，California Academy of Sciences，SanFrancisco，1998；以及《爬行动物和两栖动物百科全书》，第二版，Harold G.Cogger和Richard G.Zweifel(Editors)，1998，Academic Press，San Diego，CA中列出。这些爬行动物和鱼类列表的每一个都被完整并入作为参考。

在不同实施方案中，可以经口、肠胃外、作为喷雾剂(包括吸入喷雾剂)、局部、直肠、鼻、经口腔、阴道或通过植入的储库施用根据本发明的组合物。如此处所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、intrastriatial、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内(intrasternal)、或颅内注射和灌输技术。

从而，本主题发明可用作治疗动物(如奶牛)中船热或保护新生小牛免受病毒性疾病和/或细菌胃肠炎的方法。该方法还可用于缩短各种应激相关的疾病，以及作为佐剂增强口服和IM/SQ人接种。在任一实施方案中，施用含有一种或多种细胞因子和/或趋化因子的经分离ARCs或ARC组合物，所施用的量可有效减轻疾病或疾病症状的严重性和/或防止疾病或疾病症状的发作。在一些实施方案中，ARCs含有IFN-γ。

从而，本主题发明提供了非限制性实施方案和方面，它们包括：

A)含有编码细胞因子和/或趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARC)；

B)根据实施方案A的ARC，其中异源基因编码IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、11-16、IL-18、IL-23、IL-24、促红细胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生长因子(PDGF)、MSF、FLT-3配体、EGF、成纤维细胞生长因子(FGF；例如，aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7)、胰岛素样生长因子(例如，IGF-1、IGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、干扰素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、制癌蛋白M、干细胞因子(SCF)、转化生长因子(例如，TGF-α、TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1)、或趋化因子(如，但不限于，BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-1、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC或TECK)或表1、8和9中提供的那些细胞因子和/或趋化因子。

C)根据前面任一实施方案的ARC，其中异源基因编码IFN-γ(例如，牛、禽(例如，鸡)、鱼或人IFN-γ)；

D)根据前面任一实施方案的ARC，其中ARC还含有编码IFN-α(例如，牛、禽(例如，鸡)、鱼或人IFN-α)的异源基因。

E)根据前面任一实施方案的ARC，其还含有一种或多种异源基因，该异源基因编码自身抗原、肿瘤抗原、MMR疫苗、脊髓灰质炎疫苗、破伤风疫苗、和环境中个体通常遇到的病原(例如，食物带有的病原如克雷伯杆菌属、沙门氏菌属、埃希氏杆菌变种、肝炎病毒、流感病毒等)相关的抗原和特别导入个体环境的病原性物质或抗原，如生物毒素(例如，真菌毒素如单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒杆菌神经毒素、武器化微生物细胞相关的抗原(例如，含有毒素DNA或RNA插入片段的病毒，或用毒素[例如，真菌毒素如单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒杆菌神经毒素]转化的细菌或真菌细胞、病毒病原或其抗原、真菌病原或其抗原、或细菌病原或其抗原(例如，天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶尔森氏菌)、或免疫调节蛋白如超级抗原、血清白蛋白或蛋白质稳定剂。

F)根据前面任一实施方案的ARC，其中ARC含有单一异源基因(例如，单一细胞因子、趋化因子或蛋白质)；

G)根据前面任一实施方案的ARC，其中异源基因被包含在单一载体中；

H)根据实施方案A到F的ARC，其中异源基因包含在多个载体中；

I)根据前面任一实施方案的ARC，其中微生物细胞为革兰氏阳性、革兰氏阴性生物，或者低等真核生物，如真菌；

J)根据前面任一实施方案的ARC，其中经改良的重组细胞为：a)如下属的细菌：1)肠杆菌科，包括埃希氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属和变形杆菌属的种；2)芽孢杆菌科；3)根瘤菌科，如根瘤菌属；4)螺菌科，如发光菌属、Zymomonas、沙雷氏菌属、气单胞菌属、弧菌属、脱硫弧菌属、螺菌属；6)乳杆菌科；7)假单胞菌科，如假单胞菌属和醋杆菌属；8)固氮菌科和硝化杆菌科；b)低等真核生物，真菌如藻状菌纲和子囊菌纲，其包括酵母，如酵母属和粟酒裂殖酵母属；和担子菌纲酵母，如红酵母属、短梗霉属、掷孢酵母属；

K)根据实施方案A-J的ARC，其中微生物细胞是荧光假单胞菌；

L)根据前面权利实施方案任一项的含有编码趋化因子和/或细胞因子的一种或多种异源基因的ARC和载体的组合物；

M)诱导和/或促进个体中针对抗原或免疫原的免疫应答的方法，该方法包括步骤：对个体(如禽、两栖动物、爬行动物、甲壳动物、鱼，或哺乳动物个体)施用：

a)含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARC)；

b)包含含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物；或

c)根据实施方案A到L的ARC；和

d)任选地，目标抗原；和

e)任选地，脂多糖(LPS)，所施用的量可有效产生免疫应答；

N)根据实施方案M的方法，其中ARCs共表达：a)一种或多种目标抗原，和b)一种或多种细胞因子/趋化因子，如IFN-γ或表1、8和9中列出的其他细胞因子/趋化因子。

O)促进个体对抗原或免疫原的免疫应答的方法，该方法包括向个体施用：

a)含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARC)；

b)包含含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物；或

c)根据实施方案A到L的ARC；

所施用的量可有效促进个体的免疫应答；

P)促进个体中针对抗原或免疫原的不同类(例如，IgM、IgG、IgA，和/或IgE)和亚类抗体产生的方法，该方法包括对个体施用：

a)含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARC)；

b)包含含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物；或

c)根据实施方案A到L的ARC；

所施用的量可有效促进个体中抗体类别的产生。

Q)根据实施方案M到P的方法，其还包括施用ARC组合物之前、同时、或之后施用抗原或免疫原。

R)根据实施方案M到Q的方法，其中ARC或ARC组合物含有IFN-γ；

S)根据实施方案M到Q的方法，其中ARC或ARC组合物含有IFN-α和IFN-γ；

T)根据实施方案R到S的方法，其中IFN-γ来源于人、禽(例如，鸡)、牛或鱼；

U)根据实施方案R到S的方法，其中IFN-α和IFN-γ来源于人、禽(例如，鸡)、牛或鱼；

V)根据实施方案M到U的方法，其中个体暴露于抗原或免疫原2到168小时后将表达一种或多种细胞因子和/或趋化因子的ARC或ARC组合物施用于该个体；

W)根据实施方案M到V的方法，其中抗原或免疫原是个体在环境中通常遇到的病原或者专门导入该个体所在环境中的病原物质；

X)根据实施方案M到W的方法，其中抗原或免疫原选自自身抗原、肿瘤抗原、MMR疫苗、脊髓灰质炎疫苗、破伤风疫苗、环境中个体通常遇到的病原(例如，食物带有的病原如克雷伯杆菌属、沙门氏菌属、埃希氏杆菌变种、肝炎病毒、流感病毒等)或者其抗原，和特别导入个体环境的病原性物质或者其抗原，如生物毒素(例如，真菌毒素如单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒杆菌神经毒素、武器化微生物细胞(例如，含有毒素DNA或RNA插入片段的病毒，或用毒素[例如，真菌毒素如单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒杆菌神经毒素]转化的细菌或真菌细胞、病毒病原或其抗原、真菌病原或其抗原、或细菌病原或其抗原(例如，天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶尔森氏菌、或免疫调节蛋白如超级抗原、血清白蛋白或蛋白质稳定剂；

Y)根据实施方案M到X的方法，其中ARC或ARC组合物含有IFN-γ，并任选地含有IFN-α，和任选地含有LPS；

Z)根据实施方案M到Y的方法，其中ARC或ARC组合物除了IFN-γ之外还含有其他蛋白质、细胞因子和/或趋化因子；

AA)根据实施方案M到Z的方法，其中其他蛋白质、细胞因子和/或趋化因子与IFN-γ共表达；

BB)根据实施方案M到AA的方法，其中其他蛋白质、细胞因子和/或趋化因子被加入含有IFN-γ的ARC或ARC组合物；

CC)另一实施方案提供了治疗肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法，该方法包括对个体施用：

a)含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARC)；

b)包含含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物；或

c)根据实施方案A到L的ARC；

所施用的量可有效治疗肿瘤、癌症或恶性肿瘤；

DD)根据实施方案CC的方法，其还包括施用化疗剂和任选地施用肿瘤/癌症抗原；

EE)本主题发明还提供了在个体中诱导目的生物学效果的方法，该方法包括对个体施用：

a)含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARC)；

b)包含含有编码细胞因子/趋化因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物；或

c)根据实施方案A到L的ARC；

FF)在实施方案EE的一方面，目的生物学效果选自：1)个体中巨噬细胞的活化或刺激；2)个体免疫系统的刺激、抑制、或调节；3)增加个体的病毒抗性；和4)实现如表1、8或9中提出的目的生物学效果；

GG)在另一个实施方案中，本主题发明可用作治疗动物(如奶牛)中船热或保护新生小牛免受病毒性疾病和/或细菌性胃肠炎的方法。该方法还可用于缩短各种应激相关的疾病以及作为佐剂增强个体(如人)中IM/SQ接种。在任一实施方案中，所施用的经分离ARCs或ARC组合物的量可有效减轻疾病或疾病症状的严重性和/或防止疾病或疾病症状的发作。在一些实施方案中，ARCs含有细胞因子，如IFN-γ；

HH)在实施方案M到GG的方法的多种实践中，可以经口、肠胃外、作为喷雾剂(包括吸入喷雾剂)、局部、直肠、鼻、经口腔、阴道或通过植入的储库施用根据主题发明的组合物。如此处所用的术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、intrastriatial、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、或颅内注射和灌输技术；

II)本主题发明还提供了制备a)含有编码趋化因子和/或细胞因子的一种或多种异源基因的经改良重组细胞(ARC)或b)根据实施方案A到L的ARC的方法，该方法包括向细胞导入一种或多种异源基因。该细胞可以生长在任一方便的营养培养基中，其中提供选择培养基为DNA构建体提供了选择优点(例如，生长在含有抗生素的选择性培养基中)，从而基本上所有或所有细胞都保留一种或多种异源基因。然后可以按照常规方法收获这些细胞并采用上述多种方式进行改良。备选地，可以在收获前固定细胞；和

JJ)在实施方案II的一方面，可以使用多种技术失活并改良宿主细胞，这些技术包括用酸(如乙酸)酸化，加入或不加入卤化剂，如碘，UV辐射；冻干；毒素，例如，抗生素；酚类；苯胺，例如碳酰替苯胺和水杨酰苯胺；羟基脲；季醇；抗细菌染料；EDTA和脒；非特异有机和无机化学品，如卤化剂，例如，氯化、溴化或碘化剂；醛，例如，戊二醛或甲醛；有毒气体，如臭氧和环氧乙烷过氧化物；补骨脂素；脱水剂；等等，它们可单独使用或联合使用。备选地，可以施用前面的段落31、32、33和/或34中提出的方法。还可以在任一载体中配制组合物，这些载体包括例如，E.W.Martin′s Remington′s Pharmaceutical Science，Mack PublishingCompany，Easton，PA中描述的载体。

术语“含有”、“由...组成”和“基本上由...组成”根据它们的一般意思定义。在本申请中这些术语可以相互代替以便附加与每个术语相关的特定意思。同样，在主题申请全文中，术语“约”可以用短语“至少约”代替，术语“含有”可以用“包含”代替。

下面是阐明实施本发明的方法实施例。这些实施例不应被理解为限制，而是应该包括本主题发明的多种可变方案。除非另外说明，溶剂混合物比例是按体积计，百分数按重量计。

实施例1-荧光假单胞菌宿主细胞和表达系统

生产菌株MB324被用于转化实验，质粒pMYC 1803(图1)用于亚克隆实验。用限制酶SpeI和XhoI切除载体的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)BuiBui插入片段后，插入牛IFN-γ(BGI)基因或鸡IFN-γ(CGI)基因。用SeqWeb软件从GenBank得到公开的BGI(图2)和CGI核苷酸序列。修饰所要合成的序列以排除信号序列并包括核糖体结合位点、SpeI和XhoI限制性位点。所得序列信息被送到Operon Technologies进行基因合成。用P.E.377测序仪对所克隆的基因测序并用Factura和AutoAssembler软件分析。通过Genosys制备用于测序的正向和反向引物。

实施例2-干扰素基因的亚克隆

将含有5mL L-培养基(LB)的锥形管(50mL)接种来自荧光假单胞菌MB 324的冰冻甘油储用培养物的冰片。培养物在旋转摇床中以300转/分钟和30℃孵育过夜。0.75mL每种培养物用于接种250mL侧面带挡板的摇瓶中的50mL LB。培养物在300转/分钟和30℃下摇动2小时并生长到A600(600nM处吸光度)为0.2到0.3。然后将培养物在冰上冷却并以3000转/分钟离心沉淀。用冷的无菌蒸馏水洗涤沉淀物3次并将沉淀重悬在水中。

向电穿孔杯中加入细胞悬浮物(每个电穿孔杯中约100μL)，将其与10μL干扰素基因或对照连接混合物混合；用BioRad GenePulser在0.2cm杯中以200欧姆、25μF和2.25kV对重悬的细胞电穿孔，并以4.6到4.8的时间常数“脉冲”。

向每个样品加入1mL LB，并将液体转移到冰冻的2059Falcon管中。将管宽松地盖上，并以280转/分钟和30℃摇动2小时。将100μL到200μL等分试样涂布到L-培养基-四环素(LB-四环素)(30μg/mL)琼脂上并在30℃孵育过夜。随机从两个100μL平板接种的每一块平板选出一个菌落并从200μL平板接种的平板选出两个菌落，并用于接种含有上述LB-四环素培养基的50mL锥形管。所得培养物的样品与无菌甘油(1.0mL培养物加0.25mL 75％甘油)混合并保存在-70℃。剩余的培养物(1.8mL)在2mLEppendorf管中离心10分钟。将沉淀重悬在0.5mL Qiagen P1溶液中，并用0.5mL P2溶液轻轻倒转6次。

约5分钟内，将样品用N3溶液再次倒转6次并冰冻。离心冷却的样品10分钟，小心地与沉淀和表面泡沫分离，并将所得上清液(约1.5mL)转移到新Eppendorf管中。用Qiagen自旋柱和收集管通过将全部1.5mL样品自旋加到柱子上，通过约0.7mL到0.8mL等分试样的两次30秒、1400转/分钟(14K)自旋进一步纯化样品。用0.62mL Qiagen PB和0.85mL PE洗涤自旋柱，最后自旋90秒。将柱子转移到新的Eppendorf管，以50μLTris-EDTA洗脱1分钟，以14K自旋1分钟。洗脱液被转移到新Eppendorf管并在-20℃保存。用XhoI和SpeI消化所得小量制备物并通过琼脂糖凝胶电泳分析。

实施例3-干扰素蛋白的表达和定量

基于小量制备结果，选择具有IFN-γ插入片段的一个克隆用于表达分析。荧光假单胞菌MR 843和MR837用作干扰素阴性对照。接种LB四环素的摇瓶生长到A600为0.15到0.5并标准化到0.15，以2％稀释到含有200mL四环素生产培养基的1升摇瓶中。30℃下旋转摇动24小时使荧光假单胞菌细胞生长到A600约0.4。用0.6mL 100mM IPTG+5mL 40％MSG对细胞诱导48小时。通过显微术检查细胞的总体外观和包含体形成。

取50mL样品并在4℃保存在锥形管中以通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达。将100μL以14K离心5分钟以沉淀细胞。将沉淀物重悬在100μL1×Laemmli缓冲液中并煮沸3分钟，将上清液样品用Laemmli缓冲液以1∶1稀释然后煮沸。将10μL煮沸的样品与30μL新鲜Laemmli缓冲液混合并继续沸腾3分钟。制备物过夜冰冻，第二天解冻，加热到70℃5分钟，加入12个泳道、15％BioRad凝胶的孔(每孔10μL)中并用BioRad电泳缓冲液电泳。电泳以50伏特运行20分钟，然后以75伏特运行1小时20分钟。电泳后，将凝胶在蒸馏水中洗涤3次，每次5分钟，并用BioRad BioSafe染料染色1.5小时。染色的凝胶在蒸馏水中脱色，每隔一小时换一次蒸馏水。用MD光密度计通过样品与无干扰素的对照和BSA蛋白质标准的考马斯蓝强度完成定量。

顺利地用pMYC1803的SpeI和XhoI位点处的BGI基因替换BuiBui毒素基因(图1)。对CGI基因的亚克隆得到类似结果。所选择的所有转化体都具有目的干扰素插入片段，这首先通过琼脂糖凝胶电泳，然后通过对插入的DNA测序进行验证(图2)。选择了荧光假单胞菌的含有DnaK陪伴蛋白的株系MB324的一个克隆用于进一步研究。

在对BGI和CGI所预期的分子量处观察到蛋白质的一个主要带(例如，见图3)，并且假单胞菌中BGI和CGI两者的表达为总细胞蛋白的约40％。通过纯化主要带中所含的蛋白质，结合对所纯化产物的生物测定来证实具有真实BGI或CGI的主要带的身份。优化表达并用假单胞菌实现高密度发酵，在单个发酵生产试验中得到的干扰素产量大于1000Kg。

实施例4-溶解性测定

将0.975mL荧光假单胞菌培养物在微量离心管中以14,000转/分钟离心5分钟。倒出上清液并将细胞重悬在高达起始体积的裂解缓冲液中[裂解缓冲液：Tris HCl，50mM，最终pH7.5；NaCl，200mM；甘油，5％v/v；EDTA，20mM；Triton X-100，5％v/v；并最后加入1mM DTT]。向螺口微量离心管(2mL)中装入约3/4体积的0.1mm玻璃珠并用细胞悬液加满。快速摇动离心管以混合珠子并除去气泡，并进一步装入细胞悬液至顶部。将管盖上、密封，并插入BioSpec小型珠-搅拌器中以5000转/分钟搅拌60秒。在搅拌之间的时间里将样品置于冰上，搅拌3到5次，直到约90％的细胞都被裂解。通过显微镜观察细胞裂解。从每个管吸量0.025mL裂解细胞制备物(没有珠子)置于新的微量离心管中并离心5分钟。小心地将上清液级分转移到含有0.075mL LSB的另一管中，并向沉淀级分加入0.100mLLSB。用涡旋搅拌器使上清液和沉淀部分重悬，盖上管，并将其置于沸水浴中5分钟，并通过SDS-PAGE分析级分的0.005mL到0.010mL等分试样。用弗氏压碎器或BioSpec Mini珠子搅拌器评估假单胞菌中表达的BGI或CGI蛋白质的溶解性得到相同结果。

如图4所示，检测了假单胞菌中BGI的溶解性并表明多数(如果不是全部)BGI保持可溶形式。对CGI得到类似结果。为了进行这些溶解性试验，将存活的未改良假单胞菌细胞在弗氏压碎器(或者小型-珠子搅拌器)中破碎，离心以将细胞碎片和任何包含体与可溶蛋白分离。这两种级分的SDS凝胶表明BGI保留在可溶级分，而BAI(牛α-干扰素)—该实施例中的一种标记，其已经被克隆并且为了另一实验而被表达—主要在不可溶的级分中。此外，不像BGI(或CGI)，BAI在假单胞菌中形成大的包含体，其在相差显微镜下清晰可见。

图4中显示了弗氏压碎器处理的含有BAI和BGI的荧光假单胞菌培养物的SDS-PAGE分析。将假单胞菌细胞在弗氏压碎器中破裂并以16000g离心5分钟。泳道1-4是上清液样品，显示出可溶的BGI的单一主要带(约17kDa)，看不到BAI。泳道5-8是沉淀的样品，其显示了与少量污染性可溶BGI(较低的带，约17kDa)一起的不可溶BAI主要带(约18kDa)。污染似乎是由于溢出的上清液级分和未裂解的细胞。

实施例5-假单胞菌改良的重组细胞(ARC)改良方法

用于该方法中的所有材料都被完全灭菌。将完成的荧光假单胞菌发酵培养物倒入含有无菌磁力搅拌棒的无菌烧杯中。缓慢搅拌培养物，并用酒精消毒的pH-探头监视pH。在约10分钟内逐滴加入冰乙酸，直到pH达到约4.3。滴定培养物到约pH4.3后，加入浓鲁戈氏碘到1％v/v[鲁戈氏碘：无菌蒸馏水90mL；KI，10g/100mL；碘，5g/100mL；冰乙酸，10mL]。充分搅拌溶液并将其无菌转移到含有无菌搅拌板的新无菌烧瓶中。盖上溶液并将其在室温搅拌1小时。可以处理细胞更长时间(例如，长达2小时)而得到类似结果。将鲁戈氏/细胞混合物转移到无菌500mL有盖瓶中并以7500转/分钟离心15分钟。倒出并丢弃上清液。室温下加入无菌蒸馏水至原始体积，用无菌刮刀移去沉淀，并用高压灭菌的IKA(Ultra-Turrax)重悬，以T25匀浆器在#2设置下处理约10秒。如上面描述的重复重悬和离心，洗涤细胞3次以除去鲁戈氏溶液。在最后洗涤期间，将ARC细胞重悬到1/10原始体积，并在-80℃下在无菌螺口管中冰冻长期保存。将0.1到1.0mL样品涂布在L-培养基和LB-四环素上以证实没有活细胞。

实施例6-干扰素生物活性的定量

对于体外生物测定，使牛肾脏(MDBK)细胞生长至汇合，并与对照假单胞菌样品和与BGI/ARC样品的多种稀释物孵育24小时。用疱疹性口腔炎病毒(VSV)攻击所有平板并再孵育24小时(10和29-32)。

牛肾脏(MDBK)细胞在微量滴定板中汇合。丢弃上清液并向每孔加入100μL MEM加5％FBS。向两列的顶部两行每孔加入100μL样品。用最初浓度为100U/mL的干扰素作为阳性对照。标准BGI的比活性为3×10⁶U/mg。在第一行中以1∶2连续稀释并继续进行到板的底部。在37℃过夜孵育微量滴定板以允许样品中的任一种干扰素都诱导MDBK细胞中的抗病毒状态。第二天，将VSV原种在MEM中稀释得到约50个噬菌斑-形成单位(PFU)/100μL。从微量滴定板除去所有液体后向每孔加入100μL稀释后的病毒。板在37℃孵育1小时以使VSV感染MDBK细胞。然后从板除去病毒接种物。从10mL吸液管向每孔加入一滴甲基纤维素。将微量滴定板再次在37℃孵育过夜，之后除去甲基纤维素，并对板用结晶紫染色约5分钟。

由于BGI/ARC细胞的出色的抗病毒效果，最初的实验是令人惊奇的。含有BGI/ARCs的经固定完整细胞得到最佳结果，其滴度为10⁷到10^8.5。在保护50％肾脏细胞免于VSV感染而死亡方面，需要高水平稀释，产生活性仅需要几十皮克BGI/ARC。相比，重组改良细胞中的牛IFN-α(BAI)的活性低得多(表2)。

如表3中所阐明的，随后类似的体外实验证实BGI/ARCs保护牛肾细胞免受VSV感染的效能。

ARCs中与BGI共表达的BAI的低活性(注意：尽管其活性低，但是BAI与BGI协同作用，刺激BGI活性增加10倍，参见表2)似乎是由于所观察到的假单胞菌中多数BAI蛋白作为不可溶的包含体而聚集。最近使用用于溶解大肠杆菌或其他表达系统中的包含体的groEL/groES陪伴蛋白和融合蛋白结果表明这些或其他陪伴蛋白可用于使BAI在细胞内保持为可溶的活性形式。然而，用于本研究的dnaK陪伴蛋白株系MB324在这方面对于BAI似乎仅稍微有效。

实施例7-BGI/ARC稳定性

取出在-80℃及在-20℃、4℃、室温(RT)和37℃保存6个月的BGI/ARCs样品(无菌水中)，以检测贮存期稳定性；不对样品实施操作，也不向样品加入额外的物质。各种孵育时间后使样品返回到-80℃并保存直到完成6个月试验期。使用牛肾细胞-VSV攻击试验时，对BGI/ARC样品的生物测定表明在-20℃或4℃的6个月保存中没有活性损失。此外，BGI/ARC样品在室温保持稳定8到17天，并且BGI/ARCs可以在37℃保持稳定长达4天(见图5)。

固定的假单胞菌细胞中BGI的量和活性都非常高。如下面的实施例中所阐明：1)假单胞菌是IFN-γ的良好生物工厂，能够产生的干扰素为总细胞蛋白的高达40％或以上；2)ARC稳定性和改良方法不明显破坏IFN-γ，也不产生对所表达的IFN-γ含量的屏障；3)BGI/ARCs在皮克范围内具有活性；5)BGI/ARCs具有很好的微粒流动、注射器处理和悬浮性质；6)经固定ARC的制备物保护BGI和其他表达的蛋白质产物免受反复处理、冰冻，或其他潜在的破坏性操作导致的变性。

在哺乳动物中，通过同种抗原、肿瘤或有丝分裂原可以刺激活化的T细胞和天然杀伤细胞产生干扰素。γ-干扰素除了抗病毒活性，还表现出抑制肿瘤(10-12)和促进B细胞终末分化成产生免疫球蛋白的细胞(15；16)。γ-干扰素还可以活化巨噬细胞、增强天然杀伤细胞的细胞毒性、刺激T-细胞细胞毒性、和通过特异的细胞表面受体(17)与α-干扰素协同作用(7)。从而，BGI/ARCs的增强的γ-干扰素活性非常有利地用于杰出的治疗性或预防性产品，而且当IFN-γ与其他细胞因子共表达时还有额外的价值。

如在下面的实施例中证明的，BGI/ARCs在体内比体外发挥地更好。尽管其他实验室(13；18；26)已经表明IFN-γ以及其他物种的特异γ-干扰素是非常有效的佐剂，但是IFN-γ/ARCs的增强的活性、它们在稳定性方面、低成本、容易生产、长效释放、不絮凝和微粒流动性方面的所述优点使得IFN-γ/ARCs是非常吸引人的备选佐剂。此外，用牛IFN-γ/ARCs得到的结果表明它们能够令人惊奇地作为免疫促进剂以及有效的免疫佐剂。从荧光假单胞菌提取的IFN-γ活性极强，并且令人惊奇地，其当在肾组织培养物测定中试验时具有同样高的活性。如在下面实施例中所示的，ARC包封形式的IFN-γ在体内比其可溶形式更具活性，并且具有作为免疫促进剂的额外令人惊奇的性质。

实施例8-主要组织相容性(MHC)II类诱导测定

评估BGI活性的另一方法是测定BGI对肾或树突状细胞诱导产生MHC II类抗原的能力的影响。将MDBK或树突状细胞以5×10⁶个细胞/mL重悬在MEM加10％磷酸盐缓冲液中。将4mL等分到6孔板中并在37℃过夜孵育。从板除去所有培养基并用HBSS洗涤每孔。一半的孔接受5mL MEM加100ng/mL BGI。另一半接受MEM与BGI。将板在37℃过夜孵育。再次除去培养基并用HBSS洗涤孔。向每孔加入1mL下面的混合物：17.5mL利多卡因、32.2mL HBSS，用1N NaOH调pH至7.4。用细胞刮刀从孔中除去细胞，洗除利多卡因，FACS染色，并用BectonDickenson Facscan分析。(2；3；5；7；14；15；18；19；26；和27)。

在下面的测定中使用从牛分离的商业化牛肾细胞(MDBK)或树突状细胞。“MHC％”值指所测量的表达MHC抗原的细胞百分数。如在表4(从图6A和6B得到)中所阐明的，实施BGI/ARCs、ARC对照和两种不同BGI纯化样品的并列比较。

图6A是来自大肠杆菌的纯重组牛IFN-γ(RecBoIFNγ)的MHC表达曲线的图解说明。图6B图解了1)未转化的荧光假单胞菌宿主细胞对照(MB324)，2)pMYC1803(仅用载体转化)ARC对照(MR1241)，3)BGI/ARC(用BGI基因转化)(MR1605)，和4)从荧光假单胞菌纯化的BGI(DOWIFN)的比较。MB324和MR1241的表达基本上相同。

还测定了从血液收获的树突状细胞的MHC表达。图7A阐明了从大肠杆菌纯化的RecBoIFNγ的效果。图7B是1)未转化的荧光假单胞菌宿主细胞对照(MB324)，2)pMYC1803(仅用载体转化)ARC对照(MR1241)，3)BGI/ARC(用BGI基因转化)(MR1605)，和4)从荧光假单胞菌纯化的BGI(DOWIFN)的比较。

实施例9-牛中BGI活性的剂量滴定(2；3；5；7；14；15；18；19；26；和27)

试验了四组牛以确定可以表现出可检测的生物学活性的牛IFN-γ/ARC(BGI/ARC)的最小剂量。对每组5头小牛的四组小牛A、B、C和D分别皮下注射BGI/ARCs，剂量为4800、480、48和0μg。0μg ARC对照和实验样品相同，只是对照假单胞菌细胞缺少牛IFN-γ基因。

用于该实验的方案如下：

1.将3mL BGI/ARC和3mLARC对照用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释到终体积6mL，其足够为5头小牛的每一头提供5个等量1mL剂量，分别代表高BGI浓度和ARC对照组。此外，通过将0.4mL BGI/ARC母液或将母液的1/10稀释液用PBS稀释到终体积4.0mL，从而制备母液BGI/ARC制备物的两种连续10倍稀释液。然后将3mL每种BGI/ARC连续稀释液(1/10和1/100)稀释到终体积6mL，其足够为两组小牛的每一头提供5个1mL剂量，分别代表1/10和1/100稀释的BGI/ARC样品。

2.将BGI/ARC和ARC对照分散到无菌、密封的玻璃小瓶中并用适宜的组编号(表5)、日期、和施用用法说明标记。

3.将样品在4℃保存直到由动物照料人员施用。

为临床兽医提供了动物编号和它们的组名称列表。通过产生一组随机编号(Excel程序)将小牛随机分配到实验组中。对随机号编号并顺序分配到组A、B、C和D。

用于检测生物学活性的标准是体温和体重的变化。单次皮下注射约4800μg BGI/ARC诱导处理48小时后体温的显著上升(图8)，以及体重长时间(＞4天)下降(图9)。单次皮下注射约480μg BGI/ARC诱导处理48小时后体温轻微上升(＜1℃)，以及体重长时间(＞4天)下降。单次皮下注射约48μg BGI/ARC没有诱导体温的可检测变化但是导致处理后24小时体重略微(＜5kg)下降。单次皮下注射约0.5mL ARC对照样品没有诱导体温或体重中的可检测的变化。

来自4800μg BGI/ARC剂量的组A的一个动物在处理后第一天死亡。尸体解剖结果揭示与肿胀(瘤胃郁积)诊断一致的病灶。没有报导其他总的或组织病灶。该组中的其他小牛幸存下来但是表现出典型的干扰素用药过量的症状，包括严重的体重损失和体温升高。每天评估动物的各种临床病征，包括跛、嗜睡、厌食、腹泻、和注射部位肿胀。组A动物(4800μg BGI)的大多数在处理后第2、3和4天表现出这些临床病征。组B(480μg BGI)动物也表现出高频率的临床病征但是仅在处理后的第一天表现(图10)。剂量滴定研究表明为佐剂研究所选的BGI/ARC中BGI的剂量应该在50μg或更小的范围内。用BGI的该剂量处理的动物应该不表现出任何临床上可检测的不利反应。小牛中BGI/ARCs所产生的强烈的特征性干扰素反应与ARC-递送的BGI一致，该ARC-递送的BGI的比活性比纯化的可溶牛IFN-γ的比活性高大约1000倍。

注射后0、2和4天检验每头动物中血清触珠蛋白水平(表6)。组C的牛在48μg BGI/ARC剂量下产生平均243,011ng/mL触珠蛋白。将该结果与未处理的动物中产生的平均38,807ng/mL触珠蛋白比较表明低至48μg的剂量也可诱导触珠蛋白产量的显著增加。

还测定了注射后0、2和4天时每头动物中血清2’5’A合酶水平并将其在表7中阐明。

实施例10：BGI/ARC对二次免疫应答的影响

用50μg猪血清白蛋白(PSA)免疫小牛，并联合下面的处理：组A：250μg BGI/ARC；组B：25.0μg BGI/ARC；组C：2.5μg BGI/ARC；组D：ARC对照(缺少BGI插入片段的ARC)，用足够ARCs提供细胞量上与组A相当的对照。小牛在第0天接受初次免疫(箭头)，在第28天接受二次免疫(箭头)。每组动物由6头6-8月龄、Angus-Hereford杂交小牛组成，这些小牛为雌性或阉割的雄性。所给出的数据是平均值±SEM并且在图11中图解。

二次免疫应答的数据与初次免疫的数据一致。BGI/ARC的最低剂量(2.5μg BGI)最大地增强了抗体滴度，而ARC减、BGI对照几乎没有增强免疫应答。对照和最大滴度之间的差异从初次应答中的27倍增加到二次应答中的150倍以上。如图12中所阐明的，BGI/ARCs对淋巴细胞具有增殖效果(通过3H胸苷的掺入测量)。

本实施例阐明ARCs是廉价生产、制备和递送稳定化IFN-γ的有价值的工具。IFN-γ/ARCs还令人惊奇地用作免疫佐剂和免疫应答的促进剂。如此处描述的：1)荧光假单胞菌表达系统可用于廉价生产大量活性IFN-γ，其表达水平等于商业杀虫剂MVP^(9)蛋白所得到的表达水平(此处描述的方法可以从一次100,000升发酵产生1吨以上的IFN-γ)；2)化学灭菌方法改良了假单胞菌细胞、稳定了ARCs的IFN-γ含量，并提供了巨噬细胞或其他IFN-γ反应性细胞内或表面上IFN-γ的有效释放；3)改良并稳定的BGI/ARCs在它们的完整形式中是有活性的，并且IFN-γ的皮克水平就能够保护细胞免受病毒感染(见，例如，牛肾细胞的VSV感染)；4)不像许多其他重组蛋白，IFN-γ是可溶的并且可以在荧光假单胞菌中以可溶形式过量表达并且即使以大于总细胞蛋白的40％的水平表达时也不在细胞中形成包含体；5)BGI/ARCs具有很好的贮存期性质，在37℃数周后仍然保持稳定和活性并且当冰冻时可以保持活性6个月以上而不损失活性；6)BGI/ARCs具有优越的物理性质；它们是机械上耐久的、不絮凝的显微颗粒，可以以悬浮液保持并容易穿过注射器；7)BGI/ARCs具有所希望的长效释放性质；8)BGI/ARCs中IFN-γ的微克量在牛中出乎意料地产生强烈应答并且出乎意料地促进剧烈免疫佐剂应答和免疫加强，和9)BGI/ARCs可以通过肌内、皮下施用或者通过粘膜导入体内，使得可能实施非侵入性递送。下面的实施例利用禽IFN-γ/ARCs(CGI/ARCs)进一步阐明本主题发明的有用性。

实施例11：IFN-γ对禽巨噬细胞的影响

得到禽(鸡)巨噬细胞系(MQ-NCSU和HD11)，将其扩增并制备用于体外试验的原种。两种细胞系都生长在24孔板中并用不同浓度的重组鸡IFN-γ(CGI)刺激。进行两个独立实验。在第一个实验中，将细胞铺板1天后用CGI处理。在第二个实验中，将细胞铺板5天后用CGI处理。

在第一个实验(即，铺板后1天后用CGI处理巨噬细胞)中的第1、2、3、5、6、9、13和16(CGI处理后)测定细胞的一氧化氮(NO)产生。分析铺板后5天用CGI处理的细胞在CGI处理后1、2、3、6、9和15天时NO的产生。从单个孔除去培养上清液的样品并以4,000转/分钟离心至少5分钟使上清液澄清。用Greiss试剂一式两份地确定NO浓度。对于每个NO测定，还用来自没有用CGI刺激的细胞的对照作为空白。CGI激活NO产生，并且NO产生在此处用于表示CGI活性。表10给出了所观察到的最大NO浓度，观察了最大NO浓度的天数(加入CGI后)以及与细胞系产生最大NO相关的重组CGI浓度。

使用铺板后第二天的细胞进行第二组实验。用重组的经纯化CGI(RCGI)、BGI/ARC、CGI/ARC(批1)和CGI/ARC(批2)刺激细胞。用10ng或100ng IFN-γ刺激后3天或4天测定细胞系的NO产生。这些结果在表11和12和图13中给出。尽管牛γ干扰素(BGI)的活性比CGI小，但是令人惊奇地发现BGI刺激禽巨噬细胞。

实施例12-对禽施用含有鸡IFN-γ的ARCs

如上面描述的制备CGI/ARCs，并根据本领域中公知的方法制备来自HN植物抗原(见，例如，美国专利号5,310,678和2003年5月5日提交的美国临时申请60/467,998，它们在此处完整并入作为参考)，这些方面具有下面的修改。植物来源的抗原NT1细胞在传代后6-12天收获。对直接从细胞培养物收获的完整湿润NT1细胞过滤以除去过多培养基，过滤步骤为将Spectramesh 30过滤器置于Buchner漏斗并倒入细胞，使用轻微真空使培养基穿过过滤器。

为了制备用于测定检测的HN疫苗物质，将0.5g细胞置于2mL提取缓冲液(Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)，1mM EDTA，pH7.2)，然后在冰上超声处理约2分钟。用Branson 450超声波仪进行超声处理，该超声波仪具有可更换的微型尖端(microtip)，输出控制为8，工作期60次共两分钟(对于更大的制备(＞5g)，在冰上进行超声处理5-10分钟)。然后将超声处理物置于冰上备用。从预先失活的卵滴度≥10^10.6EID₅₀/mL的尿囊液(Lohman Animal Health)得到失活的NDV La Sota品系。将尿囊液以冰冻制剂保存(-80℃)备用。

为了接种，从SPAFAS(North Franklin，Conn.)得到1天龄的SPF小鸡并将其置于笼中并允许其适应直到7天龄。每次处理的小鸡数目基于完全随机化的设计，该设计使用重复测量。任何过多的小鸡都被随机置于单个笼中并用于代替死于运输或安置压力(placement stress)的小鸡。将0.1-0.25mL注射到后颈实施皮下接种。

如下实施抗原和CGI/ARCs的剂量和施用。通过将冻干的CHN提取物与25μg CGI/ARC物质在DPBS中水合制备植物来源的样品。将失活的尿囊液解冻并通过向样品直接加入25μg CGI/ARC混合。对于含有油/水乳液样品的植物来源的样品，将冻干的材料直接重悬在含有0.5％Tween和2.5％Drakeol油和0.165％Span80的DPBS中。施用两次抗原接种，为(7天龄的第0天)并在第14天(21天龄)施用第二次加强剂量，然后在第35天(42天龄)施用失活的NDV-感染的尿囊液(上面描述)，并在第42天(49天龄)结束试验。在研究的第14、21、35和42天通过颈静脉或外周翼静脉的静脉穿刺从每只鸟收集1到2mL血样。

为了测量免疫应答，从Colorado Serum(L#8152)得到Alsever溶液中的鸡血红细胞(CRBC)。为了制备1％CRBCs溶液，将5mL转移到15mL锥形管并以250×g离心10分钟。从RBC沉淀移去上清液和血沉棕黄层(buffy coat)；将沉淀重悬在1×DPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液)(L#003435E JRH)中洗涤并以250×g离心10分钟，进行2次。将沉淀以1％(v/v)重悬在DPBS中。为了证实悬浮液浓度，将400μl转移到1.6mL去离子水中并通过剧烈混合裂解细胞。OD₅₄₀为0.4-0.5。将1％溶液保存在2-7℃备用。

为了检测血细胞凝集，首先以Static Guard^喷雾96孔U形底平皿(Falcon)并印迹到纸巾上。将病毒样品在DPBS中以1∶2预稀释并将50μl DPBS置于96孔平皿的每个孔。向第一行加入稀释病毒，然后连续2-倍稀释以得到每个病毒样品稀释液的所希望的数目。向每孔加入50μl1％CRBC并将板以600转/分钟混合20秒。将板置于湿润纸巾上并孵育直到对照孔中的CRBCs(DPBS和CRBCs以1∶1比例)沉到板的底部，或者在2-7℃至少1小时。终点为提供100％凝集的系列中最后一个孔的稀释。

将病毒在DPBS中预稀释以提供每50μl 4-8HA单位(基于滴定上述病毒)。用第1列和3-12列每孔25μl DPBS设置单独的板；向列1和3中每孔加入25μl血清；列3中的血清被连续2倍稀释直到10个孔。然后将预滴定的病毒(25μl)加入列3-12的所有孔并以600转/分钟混合20秒，将板室温孵育1小时±15分钟。每孔加入50μl 1％CRBC，以600转/分钟混合20秒并对于AIV在湿室中2-7℃过夜孵育，对于NDV在2-7℃孵育1-2小时。血清的滴度是抑制凝集100％的连续稀释中的最后一个孔。

用Microsoft Excel 2000版本9.0.3821SR-1为每个处理组确定血清几何平均滴度(GMT)。对于这些计算，＜10的背景ELISA滴度被给予的值为1。用最小二乘法分析确定经处理鸟和对照的最小二乘法均值的差异。如果处理组和未接种的攻击对照组之间存在显著差异，那么认为处理是有效的。

在表13中显示了每个取血日期的HI滴度。当用20μg剂量植物来源的HN蛋白与IFN-γ一起施用时，在第21天(第二个剂量后7天)HI滴度增加4倍，当该HN蛋白与油/水乳液联合施用时HI滴度在第21天增加2倍。结果表明和不用CGI/ARC施用的抗原相比，使用与IFN-γ(CGI/ARC)共同施用的抗原可以诱导对靶抗原的增强的血清应答(见表13)。

参考文献

1.Ada，G.和G.Karupiah.1997.特别参考病毒感染对宿主防御机制的综述，1-18页.G.Karupiah(编辑)，Gamma Interferon in Antiviral Defense.Chapman & Hall，New York.

2.Anderson，K.P.，E.H.Fennie，和T.Yilma.1988.通过在初次免疫时IFN-γ处理增强对疱疹性口腔炎病毒”G+蛋白的二次抗体应答.J.Immunol.140：3599-3604.

3.Babiuk，L.A.，L.M.S0rdillo，M.Campos，H.P.A.Hughes，A.Rossi-Campos和R.Harland.1991.干扰素用于控制牛的感染性疾病.Journal of Dairy Science74：4385-4398.

4.Barnes，Andrew C.和Cummings，Susan G.生物杀虫剂的细胞封装.86300128[US 693080 1985-01-22].7-15-1992.1-9-1986.参考类型：专利

5.Cerretti，D.P.，K.McKereghan，A.Larsen，D.Cosman，S.Gillis和P.E.Baker.1986.牛γ干扰素的克隆、测序和表达.J.Immunol.136：4561-4564.

6.Fox，L.K.，H.D.Liggit，T.Yilma，和L.B.Corbeil.1990.γ干扰素的乳腺内施用对哺乳动物吞噬细胞功能的影响.Zentralbl.Veterinarmed.37：28-30.

7.Fransen，L.，M.R.Ruysschaert，J.van der Heyden，和W.Fiers.1986.重组肿瘤坏死因子：各种人和鼠转化细胞系的物种特异性.CellImmunol.100：260-267.

8.Friedman，R.M.和S.N.Vogel.1983.干扰素对免疫系统特别重要.Adv.Immunol.34：97-140.

9.Gaertner，F.H.，T.C.Quick，和M.A.Thompson.1993.CellCap：杀虫性生物毒素蛋白的封装系统，73-83页，L.Kim(编辑)，AdvancedEngineered Pesticides.Marcel Dekker，Inc.，New York.

10.Gough，R.E.，W.H.Allan，D.J.Knight和J.W.G.Leiper.1975.干扰素诱导剂brl-5907对新生牛疾病和鸟流感失活疫苗的佐剂作用的进一步研究.J.Immunol.19：185-188.

11.Grosser，I.，C.Maury和F.Belardelli.1987.注射干扰素敏感和干扰素抗性弗罗德白血病细胞的小鼠中干扰素的抗肿瘤作用vi.手术后佐剂疗法抑制肝脏和脾脏转移.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 39：789-792.

12.Knight，E.J.1976.人成纤维细胞干扰素的相同糖蛋白中的抗病毒和细胞生长抑制活性.Nature 262：302-303.

13.Lofthouse，S.A.，A.E.Andrews，M.H.Elhay，V.M.Bowles，E.N.T.Meeusen和A.D.Nash.1996.细胞因子作为反刍动物疫苗的佐剂.International Journal for Parasitology 26：835-842.

14.Michalski，W.P.，B.J.Shiell，T.E.O′Neil，G.Beddome，和J.W.Lowenthal.1999.大肠杆菌中表达的重组鸡IFN-γ：C-末端截短的分析和对生物活性的影响.J.Interferon Cytokine Res.19：383-392.

15.Opdenakker，G.，Y.Cabeza-Arvelaiz和J.Van Damme.1989.干扰素与其他细胞因子的相互作用.Experientia 45：513-520.

16.Persia，B.，E.T.Dayton，R.Lasarus，V.Fanning和G.Trinchieri.1983.免疫干扰素诱导人单核细胞和骨髓细胞上单体IgG1的受体.CellImmunol.154：287-295.

17.Pestka，S.，J.A.Langer，K.C.Zoon和C.E.Samuel.1987.干扰素和它们的作用.Annu.Rev.Biochem.56：727-777.

18.Pighetti，G.M.和L.M.Sordillo.1996.当针对乳腺炎接种时用重组牛γ干扰素作为佐剂初次免疫后奶牛的特异免疫应答.American Journalof Veterinary Research 57：819-824.

19.Rammler，David H.，Gaertner，Frank H.和Edwards，David L.用芽孢杆菌内毒素基因转化的假单胞菌宿主.Mycogen Corporation.980129[05281532].1-25-1994.11-23-1992.参考类型：专利

20.Sordillo，L.M.和L.A.Babiuk.1990.用重组牛γ干扰素控制急性实验性大肠杆菌乳腺炎.Journal of Dairy Science 73：212.

21.Steinbeck，M.J.，J.A.Roth，和M.L.Kaeberie.1986.通过重组γ干扰素活化牛嗜中性粒细胞.Cell Immunol.98：137-144.

22.Vilcek，J.和E.Demaeyer.1985.Interferon，卷2：干扰素和免疫系统.Elsevier，Amsterdam.

23.Yilma，T.，K.Anderson，K.Brechling和B.Moss.1987.在感染性牛痘病毒重组体中表达佐剂基因γ干扰素，393-396页.R.M.Chanock，H.Glensburg，和R.Lerner(编辑)，Vaccines 87.Modern approaches to newvaccines including prevention of AIDS.Cold Spring Harbor，New York.

24.Yilma，T.，S.Owens，E.H.Fennie和K.P.Anderson.1989.通过γ干扰素增强初次和二次免疫应答.Adv.Exp.Med.Biol.251：145-152.

25.Yip，Y.K.，H.C.Kelker，K.T.Pearlstein和J.Vilcek.1984.人免疫干扰素的纯化和结构-功能表征.3：283.

26.Zuffa，A.和N.Feketeova.1980.用失活的油佐剂感染性牛鼻气管炎疫苗接种的牛受到保护而免于实验性感染.27：725-733.

表1：与免疫应答有关的因子

家族	成员	其他名称
			干扰素(IFN)	IFN-α	白细胞干扰素
IFN-β	成纤维细胞干扰素
		IFN-γ		免疫干扰素
肿瘤坏死因子(TNF)	TNF				TNF-α，恶液质素
		淋巴毒素	TNF-β
	白介素(IL)			IL-1α，IL-1β	内源致热原，淋巴细胞活化因子，白细胞内源调节剂，促红细胞生成素
IL-2		T-细胞生长因子
			IL-3	多潜能CSF、肥大细胞生长因子
IL-4		B-细胞刺激因子1(BSF-1)
			IL-5	T-细胞取代因子(TRF)、嗜酸性粒细胞分化因子、B细胞生长因子II(BCGF-II)
IL-6		B-细胞刺激因子2(BSF-2)、β2-干扰素、Haptocyte刺激因子(HSF)
			集落刺激因子(CSF)	粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)	CSF-2
粒细胞-CSF(G-CSF)	Pluripoietin
		巨噬细胞-CSF(M-CSF)		CSF-1
促红细胞生成素
		其他生长和调节因子(GF)		表皮生长因子(EGF)
成纤维细胞生长因子(酸性和碱性-EGF)
			胰岛素样生长因子-1(IGF-1)	生长调节素C
胰岛素样生长因子-2(IGF-2)	生长调节素A
			神经生长因子(NFG)
血小板衍生生长因子(PDGF)
			转化生长因子-α(TGF-α)
转化生长因子-β(TGF-β)

表2：病毒攻击试验

样品	干扰素	抗病毒滴度
			ARC对照(未转化的，MB324的经改良细胞)	无	＜103
BAI/ARC(BAI-转化的，MB324的经改良细胞)	0.36mg/mL	103
			BGI/ARC(BGI-转化的，MB324的经改良细胞)	1.8mg/mL	106.5
BGI/ARC+BAI/ARC(1.26mgγ+0.54mgα)	1.8mg/mL	107.5
			提取物对照(未转化的，MB324的提取物)	无	＜103
BGI提取物(BGI-转化的，MB324的提取物)	0.41mg/mL	106

表3：病毒攻击试验

样品	干扰素	抗病毒滴度
			ARC对照#1(未转化的MB324，经改良细胞)	无	＜102
ARC对照#2(pMYC1803-转化的MB324，经改良细胞)	无	＜102
			BGI/ARC(BGI-转化的MB324，经改良细胞)	1.8mg/mL	107
荧光假单胞菌纯化的BGI	1.6mg/mL	107.3
			大肠杆菌纯化的BGI	2.0mg/mL	107.5

表4：使用牛肾细胞的MHC II类诱导试验

总ARC蛋白(pg)		MB324/ARC载体对照细胞BGI(pg)/MHC％		BGI/ARCBGI-转化的细胞BGI(pg)/MHC％
						66000000		0/21		22000.00/100
6600000		0/21		2200.00/100
						660000		0/21		220.00/100
66000		0/20		22.00/99
						6600		0/20		2.20/90
660		0/19		0.22/60
BGI蛋白(pg)	BGI/ARCBGI-转化的细胞MHC％		从荧光假单胞茵纯化的BGI(DASstd.)MHC％		从大肠杆菌纯化的BGI(对照)MHC％
						0	20		20		20
22	-		30		-
						220	60		60		40
2200(2.2ng)	85		80		60
						22000	93		90		80
220000	98		98		98
						2200000(2.2μg)	99		99		-
22000000	100

表5：组的设计和处理

组A含量：6mL/小瓶剂量：在颈部右边皮下注射1mL	BGI/ARC(0.5mL/动物)	计算的BGI剂量4800μg/动物
			组B含量：6mL/小瓶剂量：在颈部右边皮下注射1mL	BGI/ARC(0.05mL/动物)	计算的BGI剂量480μg/动物
组C含量：6mL/小瓶剂量：在颈部右边皮下注射1mL	BGI/ARC(0.005mL/动物)	计算的BGI剂量48μg/动物
			组D含量：6mL/小瓶剂量：在颈部右边皮下注射1mL	ARC对照(0.5mL/动物)	计算的BGI剂量0μg/动物

表6：血清触珠蛋白(ng/mL)

组/剂量	奶牛#	第0天                     第2天                     第4天
					AIFN-γ/ARC4800μg	345	3414.732	343278	339763
349	14621.58	314864	313533
				362		8043.093	329346	341830
377	33402.99	330788	332746
				BIFN-γ/ARC480μg		331	2442.108	299233.1	314455
332	431.2447	304025	318863
					347	4095.792	279063	302801
351	3386.858	289166	148700
					376	12092.41	318965	318863
CIFN-γ/ARC48μg	333	1145.308	293940						222203
				356	30964.4	301475	279036
	365	11002.64	328728					336975
				375	30780.89	284906	194211
	378	9255.905	266531					182632
				DIFN-γ/ARC0μg	328	4226.292	17537.6		27173.22
329	949.357	22061.81	29538
					344	1125.977	10012.77	59289.64
355	11862.54	18949.82	15312.98
					371	10119.1	107177	62724
平均值	组	第0天                     第2天                     第4天
					A	14870.6	329569.0	331968.0
	B	4489.7	298090.4	280736.4
					C	16629.8	295116.0	243011.4
	D	5656.7	35147.8	38807.6
					SD	组	第0天                     第2天                     第4天
A	13182.9	11629.1	12890.2
				B		4467.6	15115.9	74102.4
C	13523.5	22874.3	54395.4
				D		5078.3	40508.4	21004.7
中位值	组	第0天                     第2天                     第4天
					A	11332.3	330067.0	336254.5
	B	3386.9	299233.1	314455.0
					C	11002.6	293940.0	222203.0
	D	4226.3	18949.8	29538.0

表7：血清2’5’A合成酶水平(pMol/dL)

组	奶牛#	第0天                    第2天                    第4天
					AIFN-γ/ARC4800μg	345	169.4	54.8	103.7
349	81.1	26.6	300.1
				362		1227.1	73.0	138.0
377	439.4	407.5	646.7
				BIFN-γ/ARC480μg		331	137.7	59.8	185.7
332	135.1	218.4	70.7
					347	164.5	89.3	86.0
351	311.7	219.3	244.4
					376	391.0	618.4	195.1
CIFN-γ/ARC48μg	333	142.5	71.5						143.4
				356	537.5	50.1	66.6
	365	105.7	355.3					144.8
				375	81.8	48.4	59.7
	378	249.9	142.8					87.4
				DIFN-γ/ARC0μg	328	358.2	143.8		119.3
329	393.1	16.2	41.5
					344	132.g	203.6	47.3
355	94.3	129.6	263.1
					371	76.0	234.5	206.4
平均值	组	第0天                    第2天                    第4天
					A	479.2	140.5	297.1
	B	228.0	241.1	156.4
					C	223.5	133.6	100.4
	D	210.9	145.5	135.5
					SD	组	第0天                    第2天                   第4天
A	521.4	179.1	248.3
				B		116.6	223.2	74.8
C	187.0	129.7	41.2
				D		152.3	84.1	97.7
中位值	组	第0天                    第2天                    第4天
					A	304.4	63.9	219.0
	B	164.5	218.4	185.7
					C	142.5	71.5	87.4
	D	132.8	143.8	119.3

表8：趋化因子

参考	蛋白质	功能
			BCA-1/BLC-1	吸引B细胞的趋化因子-1(B-淋巴细胞化学引诱)(CXCL13)	B-细胞引诱剂
BRAK/Kec	乳腺和肾脏中的CXC趋化因子/肾脏表达的趋化因子(SCYB14，CXCL14)	与Mφ发育有关
			CXCL16	CXC-趋化因子16
ENA-78/LIX	上皮细胞衍生的亲神经	嗜中性粒细胞活化肽

	活化蛋白78(CXCL5，SCYB5)
			Eotaxin-1	Eotaxin-1(CCL11)	嗜酸性粒细胞趋化性
Eotaxin-2/MPIF-2	Eotaxin-2(CCL24，CKβ6)	T细胞和嗜酸性粒细胞趋化剂
			Exodus-2/SLC	Eotaxin-2(CCL21，CKβ9，SCYA21)	Angiostatic活性，T细胞、树突细胞、CD34+造血细胞、NK细胞，和B细胞的趋化剂
Fractalkine/Neurotactin	Fractalkine/Neurotactin(CX3CL1)	T细胞和单核细胞的趋化剂
			GROα/MGSA	黑素瘤生长刺激活性蛋白(CXCL1)	嗜中性粒细胞活性
HCC-1	Hemofiltrate CC趋化因子1(SCYA14，CCL14)	单核细胞和THP-1细胞的趋化剂
			IL8	白介素8(CXCL8)	嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞的化学引诱剂；激活嗜中性粒细胞
I-TAC	干扰素刺激的T细胞α化学引诱剂(CXCL11)
			Lymphotactin/ATAC/SCM	Lymphotactin(CL1，LTN)	T细胞和NK细胞的化学引诱剂
MCP-1/MCAF	单核细胞趋化蛋白1(CCL2，SCYA2)	单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化剂；增加嗜中性粒细胞抗肿瘤活性
			MCP-3	单核细胞趋化蛋白3(CCL7，SCYA7)	单核细胞和嗜酸性粒细胞的趋化剂；增加单核细胞抗肿瘤活性
MCP-4	单核细胞趋化蛋白4(CCL13，SCYA13)	T细胞、活化的淋巴细胞和单核细胞的化学引诱剂
			MDC/STCP-1/ABCD-1	巨噬细胞衍生的趋化因子(CCL22，SCYA22)
MIP-1α	巨噬细胞炎症蛋白1α	淋巴细胞的化学引诱剂

	(CCL3，SCYA3)
			MIP-1β	巨噬细胞炎症蛋白1β(CCL4，SCYA4)	单核细胞、树突细胞、NK细胞和T细胞的化学引诱剂
MIP-2α/GROβ	巨噬细胞炎症蛋白2α(CXCL2)
			MIP-3α/Exodus/LARC	巨噬细胞炎症蛋白3α(CCL20，SCYA20)	淋巴细胞、活化的NK细胞、树突细胞的化学引诱剂
MIP-3β/Exodus-3/ELC	巨噬细胞炎症蛋白3β(CCL19，SCYA19)	T细胞、B细胞和树突细胞的化学引诱剂
			MIP-4/PARC/DC-CK1	巨噬细胞炎症蛋白4(CCL18，CKβ7，SCYB18)	T细胞的化学引诱剂
RANTES	Rantes，以前为“T细胞特异蛋白”(CCL5)	记忆T细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱剂
			SDF1α	基质细胞延伸的因子1α	嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的化学引诱剂
TARC	胸腺和活性调节的趋化因子(CCL17)	活化的TH2-细胞的化学引诱剂
			TECK	胸腺-表达的趋化因子(CCL25)	胸腺细胞、Mφ、Thp-1细胞和树突细胞的化学引诱剂

表9：细胞因子

参考	蛋白质	功能
			GM-CSF	巨噬细胞集落刺激因子	造血谱系(例如，粒细胞、MФ、嗜酸性粒细胞和红细胞)的生长和分化
IFNα	α干扰素	抗肿瘤和抗病毒活性
			IFNβ	β干扰素	抗病毒、抗细菌和抗癌活性
IFNγ	γ干扰素	刺激CTL应答；对转化细胞的抗病毒和抗增殖活性
			白介素

IL-1β	白介素-1β	刺激B细胞成熟/增殖
			IL-2	白介素-2	调节免疫应答和T细胞增殖
IL-4	白介素-4	激活B细胞
			IL-6	白介素-6	B细胞分化
IL-10	白介素-10	免疫抑制和消炎
			IL-12elasti	白介素-12(亚单位之间有弹性蛋白接头)	活化的T细胞和MNK细胞的生长因子；增强NK/LAK细胞的裂解活性
IL-13	白介素-13	消炎剂
			IL-15	白介素-15	刺激T淋巴细胞和NK增殖
IL-16	白介素-16	CD4淋巴细胞、单核细胞、树突细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱剂
			IL-18	白介素-18	诱导IFN-γ和增强NK活性
IL-18Bpa	白介素-18结合蛋白，同种型A	早Th1细胞因子应答的抑制剂
			IL-23	白介素-23	刺激记忆T细胞增殖；刺激IFN-γ产生
IL-24	白介素-24
			VIP	血管活性肠肽	血管舒张剂；降低动脉血管压力；刺激心肌收缩性；平滑肌弛缓剂；MФ激活剂；刺激T-细胞增殖
TNF超家族
			LIGHT/TNFSF14	肿瘤坏死因子超家族成员14	诱导凋亡，刺激T细胞，抑制体内肿瘤形成
sTALL-1/TNFSF13B(也称为BlyS，BAFF，THANK)	肿瘤坏死因子超家族成员13B	刺激B细胞增殖
			TNFα/TNFSF2	肿瘤坏死因子α	肿瘤细胞的细胞裂解；诱导细胞分化
TWEAK/TNFSF12	肿瘤坏死因子超家族成员12(也称为Apo3L)	诱导肿瘤细胞死亡，影响星形细胞行为

表10：用纯化的重组CGI刺激的禽巨噬细胞NO产生

细胞系	CGI浓度(μg)	NO浓度(μM)	CGI加入后的天数
				HD11(1天)	12.5	40.68	13
HD11(5天)	12.5	145.38	2
				MQ-NCSU(1天)	1.0	30.41	5
MQ-NCSU(5天)	12.5	35.08	2

表11：用100ng IFN-γ处理的禽巨噬细胞中3天后的NO产生(μM)

细胞系	RCGI	BGI/ARC	CGI/ARC(批1)	CGI/ARC(批2)
					HD11	[NO]＝3.4	[NO]＝17.2	[NO]＝59.5	[NO]＝81.1
MQ-NCSU	[NO]＝17.8	[NO]＝53.90	[NO]＝76.5	[NO]＝84.9

表12：用100ngIFN-γ处理的禽巨噬细胞中4天后的NO产生(μM)

细胞系	RCGI	BGI/ARC	CGI/ARC(批1)	CGI/ARC(批2)
					HD11	[NO]＝0.5	[NO]＝2.4	[NO]＝2.4	[NO]＝16.8
MQ-NCSU	[NO]＝6.7	[NO]＝28.0	[NO]＝53.8	[NO]＝72.6

表13：鸡IFN-γ(CGI/ARC)存在下针对植物细胞来源的HN的禽免疫应答

处理组描述	NDV HI GMT
					第14天	第21天	第35天	第42天
	pHN(20μg)SQ	1	19	43					8
pHN(20μg)+CGI/ARC(25μg)SQ					1	76	91	13
	pHN(20μg)+CGI/ARC(25μg)SQ水乳液中的油	2	38	71					17
来自尿囊液的失活NDV+CGI/ARC(25μg)SQ					1	6	5	25
	NT对照+CGI/ARC(25μg)IN/Ocular&SQ水乳液中的油	1	1	1					2

                                  序列表

<110>美国陶氏益农公司

<120>用于产生和递送抗病毒剂、佐剂和疫苗促进剂的经改良重组细胞(ARCs)

<130>DAS-103XC1

<150>US 60/417,124

<151>2002-10-08

<160>3

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>475

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的牛IFN-γ

<400>1

agagaactag taaaaaggag aaatccatgc agggccaatt ttttagagaa atagaaaact    60

taaaggagta ttttaatgca agtagcccag atgtagctaa gggtgggcct ctcttctcag    120

aaattttgaa gaattggaaa gatgaaagtg acaaaaaaat tattcagagc caaattgtct    180

ccttctactt caaactcttt gaaaacctca aagataacca ggtcattcaa aggagcatgg    240

atatcatcaa gcaagacatg tttcagaagt tcttgaatgg cagctctgag aaactggagg    300

acttcaaaaa gctgattcaa attccggtgg atgatctgca gatccagcgc aaagccataa    360

atgaactcat caaagtgatg aatgacctgt caccaaaatc taacctcaga aagcggaaga    420

gaagtcagaa tctctttcga ggccggagag catcaacgta atgactcgag tctct         475

<210>2

<211>475

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的牛IFN-γ

<400>2

tctcttgatc atttttcctc tttaggtacg tcccggttaa aaaatctctt tatcttttga  60

atttcctcat aaaattacgt tcatcgggtc tacatcgatt cccacccgga gagaagagtc  120

tttaaaactt cttaaccttt ctactttcac tgttttttta ataagtctcg gtttaacaga  180

ggaagatgaa gtttgagaaa cttttggagt ttctattggt ccagtaagtt tcctcgtacc  240

tatagtagtt cgttctgtac aaagtcttca agaacttacc gtcgagactc tttgacctcc  300

tgaagttttt cgactaagtt taaggccacc tactagacgt ctaggtcgcg tttcggtatt  360

tacttgagta gtttcactac ttactggaca gtggttttag attggagtct ttcgccttct  420

cttcagtctt agagaaagct ccggcctctc gtagttgcat tactgagctc agaga       475

<210>3

<211>144

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的牛IFN-γ

<400>3

Met Gln Gly Gln Phe Phe Arg Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe

1               5                   10                  15

Asn Ala Ser Ser Pro Asp Val Ala Lys Gly Gly Pro Leu Phe Ser Glu

            20                  25                  30

Ile Leu Lys Asn Trp Lys Asp Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser

        35                  40                  45

Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Leu Lys Asp Asn

    50                  55                  60

Gln Val Ile Gln Arg Ser Met Asp Ile Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln

65                  70                  75                  80

Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu Glu Asp Phe Lys Lys Leu

                85                  90                  95

Ile Gln Ile Pro Val Asp Asp Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Asn

            100                 105                 110

Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ser Asn Leu Arg

        115                 120                 125

Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Thr

    130                 135                 140

Claims (38)

1.经改良的重组细胞(ARC)，其包含至少一种编码趋化因子或细胞因子的异源基因。

2.根据权利要求1的ARC，其中异源基因编码IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、11-16、IL-18、IL-23、IL-24、促红细胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生长因子(PDGF)、MSF、FLT-3配体、EGF、成纤维细胞生长因子(FGF)、aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、胰岛素样生长因子(IGF-1)、IGF-2；血管内皮生长因子(VEGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β；白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、制癌蛋白M、干细胞因子(SCF)、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、选自BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-1、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC和TECK的趋化因子；或表1、8和9中提供的那些细胞因子或趋化因子。

3.根据权利要求2的ARC，其中异源基因编码IFN-γ。

4.根据权利要求3的ARC，其中所述IFN-γ是牛、禽、鱼或人IFN-γ。

5.根据权利要求4的ARC，其中所述IFN-γ是牛IFN-γ。

6.根据权利要求4的ARC，其中所述禽IFN-γ是鸡IFN-γ。

7.根据权利要求2的ARC，其中ARC还包含编码INF-α的异源基因。

8.根据权利要求1的ARC，其中所述细胞为选自革兰氏阳性生物、革兰氏阴性生物、酵母和真菌的微生物细胞。

9.根据权利要求8的ARC，其中微生物细胞是荧光假单胞菌。

10.根据权利要求1的ARC，其还包含载体。

11.诱导或促进个体对抗原或免疫原的免疫应答的方法，该方法包括对个体施用包含编码趋化因子或细胞因子的至少一种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)；或对个体施用包含含有编码趋化因子或细胞因子的至少一种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物。

12.根据权利要求11的方法，其中所述方法还包括施用目标抗原。

13.根据权利要求12的方法，其还包括施用脂多糖(LPS)。

14.根据权利要求11的方法，其中所述异源基因编码INF-γ。

15.根据权利要求14的方法，其中所述INF-γ是牛、禽、鱼或人IFN-γ。

16.根据权利要求15的方法，其中所述INF-γ是牛IFN-γ。

17.根据权利要求15的方法，其中所述禽INF-γ是鸡INF-γ。

18.根据权利要求11的方法，其中ARCs共表达至少一种目标抗原。

19.促进个体对抗原或免疫原的免疫应答的方法，该方法包括对个体施用：

a)包含编码趋化因子或细胞因子的至少一种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)；或

b)包含含有编码趋化因子或细胞因子的至少一种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物；

所施用的量可有效促进个体的免疫应答。

20.根据权利要求19的方法，其中所述方法促进IgM、IgG、IgA、IgE或IgY抗体的形成。

21.根据权利要求19的方法，其还包括在ARC组合物施用之前、同时或随后施用抗原或免疫原。

22.根据权利要求19的方法，其中ARCs或ARC组合物包含IFN-γ。

23.根据权利要求19的方法，其中ARCs或ARC组合物包含IFN-α和IFN-γ。

24.根据权利要求22的方法，其中INF-γ是人、禽、牛或鱼IFN-γ。

25.根据权利要求23的方法，其中IFN-α和IFN-γ为人、禽、牛或鱼源的。

26.根据权利要求19的方法，其中抗原或免疫原是个体在环境中通常会遇到的病原或者专门导入个体环境中的病原物质。

27.根据权利要求26的方法，其中抗原或免疫原是：1)选自真菌毒素、单端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒蛋白和肉毒杆菌神经毒素的生物毒素；2)选自天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶尔森氏菌和武器化微生物细胞的病毒或细菌病原；或3)真菌病原。

28.治疗肿瘤、癌症或恶性肿瘤的方法，该方法包括对个体施用：

a)包含编码趋化因子或细胞因子的至少一种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)；或

b)包含含有编码趋化因子或细胞因子的至少一种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物；

所施用的量可有效治疗肿瘤、癌症或恶性肿瘤。

29.根据权利要求28的方法，其还包括施用化疗剂和任选地施用肿瘤或癌抗原。

30.在个体中诱导目的生物学效果的方法，该方法包括对个体施用：

a)包含编码趋化因子或细胞因子的至少一种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)；或

b)包含含有编码趋化因子或细胞因子的至少一种异源基因的经改良重组细胞(ARCs)的组合物。

31.根据权利要求30的方法，其中目的生物学效果选自：1)活化或刺激个体的巨噬细胞；2)刺激、抑制或调节个体的免疫系统；3)增加个体的病毒抗性；4)实现如表1、8或9中所示的目的生物学效果；5)治疗动物的船热；6)保护新生动物免于病毒性疾病或细菌性胃肠炎；和7)降低疾病或疾病症状的严重性。

32.制备经改良重组细胞(ARC)的方法，该方法包括以下步骤：

a)向细胞中导入编码细胞因子和任选地编码趋化因子的至少一种异源基因；

b)在营养培养基中生长所述细胞；

c)收获所述细胞；和

d)失活或固定所述细胞。

33.根据权利要求32的方法，其中异源基因编码IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、11-16、IL-18、IL-23、IL-24、促红细胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生长因子(PDGF)、MSF、FLT-3配体、EGF、成纤维细胞生长因子(FGF)、aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、胰岛素样生长因子(IGF-1)、IGF-2；血管内皮生长因子(VEGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β；白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、制癌蛋白M、干细胞因子(SCF)、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、选自BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-1、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neu rotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC和TECK的趋化因子；或表1、8和9中提供的那些细胞因子或趋化因子。

34.根据权利要求33的方法，其中异源基因编码IFN-γ。

35.根据权利要求34的方法，其中所述INF-γ是牛、禽、鱼或人INF-γ。

36.根据权利要求35的方法，其中所述IFN-γ是牛INF-γ。

37.根据权利要求35的方法，其中所述禽IFN-γ是鸡IFN-γ。

38.根据权利要求33的方法，其中ARC还包含编码INF-α的异源基因。

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