CN1712540A - 一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片 - Google Patents

一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片 Download PDF

Info

Publication number
CN1712540A
CN1712540A CN 200410020751 CN200410020751A CN1712540A CN 1712540 A CN1712540 A CN 1712540A CN 200410020751 CN200410020751 CN 200410020751 CN 200410020751 A CN200410020751 A CN 200410020751A CN 1712540 A CN1712540 A CN 1712540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
dna fragmentation
chip
unicellular
pool
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 200410020751
Other languages
English (en)
Other versions
CN1313624C (zh
Inventor
林炳承
秦建华
盖宏伟
於林芬
叶囡楠
刘欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CNB2004100207516A priority Critical patent/CN1313624C/zh
Publication of CN1712540A publication Critical patent/CN1712540A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1313624C publication Critical patent/CN1313624C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明特别提供了一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，主要涉及在微流控芯片上以集成方式实现单细胞的进样、裂解、片段化DNA标记、凋亡细胞DNA片段化电泳分离及检测等功能。芯片各功能单元与芯片结构相对应。芯片为双T型结构，由缓冲液池、细胞进样池、裂解液池、废液池、检测区域组成，各溶液池由通道连接，通道直径与所研究细胞的大小相适应，并能保证容纳单细胞运输。本发明用于筛选引起细胞凋亡各种致凋亡因子及检测不同类型细胞的凋亡。本发明操作方便易行，将各实验功能集成在一块微流控芯片上实现，而且具有较高的分析通量和分析效率，在细胞生物学等领域具有极其重大的潜在价值。

Description

一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片
技术领域：
本发明涉及微全分析技术，特别提供了一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片。
背景技术：
细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程。细胞凋亡与细胞生长、分化一样属于各具特征的细胞事件或过程，它们决定着细胞和组织的基本特征和命运。由于细胞凋亡在正常胚胎和器官的发育、免疫反应以及许多长期困扰人类的重大疾病如肿瘤、免疫缺陷与神经退行性变等疾病发生过程中具有举足轻重的作用，近几年来，它已成为生物学和医学领域中的研究热点。基于细胞凋亡异常在许多恶性肿瘤发病学上的重要地位，以选择性的诱导肿瘤细胞凋亡为目的的凋亡干预技术已成为治疗恶性肿瘤的基本策略。
大量研究表明，细胞凋亡信号传导途径的实质是一套连续的生化反应系统，该系统使细胞外刺激和细胞内应答以及细胞凋亡效应之间偶联，调控着细胞的生命。这些作用的最终结局表现为一系列细胞形态学变化和生化改变，其中由核酸内切酶激活所致的染色质DNA片段化是细胞凋亡最重要和最具特征性的生化指标。传统的分析方法包括琼脂糖平板电泳和毛细管电泳技术。前者只能对大量群体细胞进行总体分析(至少1×106细胞)，其分辨率、灵敏度均较低，且操作过程繁琐、分析过程难以集成化。后者虽可在毛细管电泳进行单个细胞分析，但所需时间相对较长，集成化程度不高。这些局限性在一定程度上限制了对细胞凋亡过程更深入、更全面的研究和认识。
微流控芯片技术是近几年发展起来的一项崭新的分析技术，它具有单细胞水平对细胞进行操作的优势，它为在同一芯片上将细胞培养，输运，清洗和电泳分离等过程集成一体提供了可能性。同时，微流控芯片的流体网络特征(二维或三维)，使之有可能对细胞进行更为复杂的物理或化学分析，配合高灵敏度的检测器可使该技术为单细胞水平研究复杂的细胞生物学过程提供强大的技术支撑。
目前，国际上仅有一个实验室报道利用芯片技术进行单个细胞DNA片段化分析，检测对象为细胞内单链DNA，但由于受所采用细胞裂解方式(氢氧化钠)的限制，分析过程相对较长，且没有芯片通道内对单细胞的连续操作过程，分析通量相对较低。
发明内容：
本发明的目的是在微流控芯片上以集成方式实现单细胞的进样、裂解、片断化DNA标记、凋亡细胞DNA片段化电泳分离及检测。特别提供了一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：该芯片由三个基本功能单元构成，其中第三个基本功能单元分别和另外两个单元连接：
第一个基本单元是细胞进样单元；
第二个基本单元是细胞的裂解液进样单元；
第三个基本单元是细胞裂解、片段化DNA标记、DNA片段化分离及检测单元。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第一个基本单元所用的进样溶液细胞密度是104～106/mL；采用低电场电驱动细胞进样，进样电压为10～100V/cm。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第二个基本单元采用低电场电驱动细胞裂解液进样，进样电压为10～100V/cm。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元是芯片缓冲液池和废液池之间的连接通道：
细胞裂解采用化学裂解方法，凋亡细胞裂解在芯片通道内在线完成。
DNA片段化分离所用的筛分介质是0.5％～5％羟丙基甲基纤维素50cp，粘度5～30kD，DNA片段化电泳分离为100～250V/cm。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元是通过激光诱导荧光单点法检测实现的。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述片段化DNA标记所用标记染料是预先加在运行缓冲液或细胞裂解液中的荧光染料；荧光染料的激发波长、发射波长与激光诱导荧光检测用激光器的激光波长相适应。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：对片段化DNA进行在线动态标记所采用的标记染料浓度是1uM。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述DNA片段化分离的分离电压为170V/cm。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述检测位置在反应通道中的裂解液进样通道和细胞进样通道之间，与裂解液进样通道和细胞进样通道的距离之比为1比2。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：
所述芯片为双T型结构，其由以下几个部分组成：缓冲液池(1)、细胞进样池(2)、裂解液进样池(3)、废液池(4)、检测区域(5)；双T型结构芯片的各个溶液池之间由通道连接，通道直径与所研究的细胞大小相适应，并能保证容纳单个细胞的运输；
芯片的双T型结构与权利要求1中所述各基本功能单元相对应：细胞进样池(2)对应第一个基本单元；裂解液进样池(3)对应第二个基本单元；细胞进样池与裂解液进样池之间的反应通道对应第三个基本单元。
本发明适用于对引起细胞凋亡各种致凋亡因子的筛选，以及不同类型细胞如肿瘤细胞、神经元、及胚胎等多种细胞凋亡的检测。本发明操作方便易行，将细胞进样、裂解、片断化DNA标记、DNA片段化分离、检测过程集成在一块微流控芯片上完成，而且具有较高的分析通量和分析效率，在细胞生物学、医学等领域具有重大的潜在价值。
附图说明：
图1单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片结构示意图；
图2芯片电泳图。
具体实施方式：
实施例
1本实施例药物诱导细胞凋亡模型的构建：
以人急性早幼粒白细胞系(NB4cells)为对象，细胞培养于含10％新生牛血清的RPMI1640培养液中。用具代表性的抗肿瘤药物(三氧化二砷，As2O3)诱导细胞凋亡。将一定浓度的As2O3加入细胞培养液中使药物终浓度为1uM，然后继续培养48小时。收集细胞，于1000rpm离心5分钟后用PBS溶液清洗一次，再经重悬后待用。
2芯片设计：
本实施例所采用芯片设计如附图1所示，芯片为双T型结构，芯片分离通道宽50微米，深20微米。因为哺乳类细胞的大小通常在10-25um直径大小范围，所设计芯片分离通道直径与细胞大小在一个数量级，并能保证容纳单个细胞的运输。图中四个圆孔分别代表不同溶液池，其中1，4为缓冲液和废液池，2和3分别为细胞进样池和裂解液进样池，检测区域在1，4之间的连接通道内。
芯片的双T型结构与芯片的各基本功能单元相对应：细胞进样池(2)对应细胞进样单元；裂解液进样池对应裂解液进样单元；细胞进样池与裂解液进样池之间的反应通道对应细胞裂解、片段化DNA标记、DNA片段化分离及检测单元。
3细胞裂解方式和片段化DNA标记方式
在低电场驱动下(50V/cm)，经药物处理的细胞和细胞裂解液(2％SDS)分别由池2和3进样，当进入分离通道时，细胞与裂解液混合，在10ms左右细胞迅速裂解。裂解后释放的片段化DNA与运行缓冲液中的荧光染料结合，进行在线动态标记。所采用的最佳染料标记浓度为1uM。有效标记后的DNA片段在分离电场和筛分介质的作用下，在检测区域通过激光诱导荧光单点法实现检测。实验中所用细胞密度在105/mL左右，可避免高密度细胞悬液中细胞之间发生粘连，影响单个细胞在通道中的运行。
4DNA片段化芯片电泳分离条件
a.筛分介质
本实施例中所用运行缓冲液中的主要有效成分即筛分介质为自行优化所得的1.5％羟丙基甲基纤维素50cp(1.5％HPMC-50cp，粘度15kD)，该筛分介质与常规介质相比黏度较低，特别适合于微流控芯片通道的微小尺寸，通道清洗方便，易于更换溶液，并可满足于细胞凋亡过程中芯片DNA片段化的分离要求。
b.分离电压
芯片电泳过程中，分离电压的选择直接影响到片段化DNA的分离质量，高分离电压显著降低分离效果(＞250V/cm)，而低电压则明显延长分离时间(＜100V/cm)，不利于快速分析。本实施例经优化的最佳分离电压为170V/cm。
5.凋亡细胞电泳结果
如附图2所示，经As2O3作用后的NB4细胞发生凋亡，出现DNA片段化，并可经芯片电泳检测。图中的前3个小峰为片段化DNA，与DNA标准品比较后确认片段大小为180bp、360bp和540bp，第4个最高峰为基因组DNA。

Claims (10)

1、一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：该芯片由三个基本功能单元构成，其中第三个基本功能单元分别和另外两个单元连接：
第一个基本单元是细胞进样单元；
第二个基本单元是细胞的裂解液进样单元；
第三个基本单元是细胞裂解、片段化DNA标记、DNA片段化分离及检测单元。
2、按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第一个基本单元所用的进样溶液细胞密度是104～106/mL；采用低电场电驱动细胞进样，进样电压为10～100V/cm。
3、按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第二个基本单元采用低电场电驱动细胞裂解液进样，进样电压为10～100V/cm。
4、按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元是芯片缓冲液池和废液池之间的连接通道：
DNA片段化分离所用的筛分介质是0.5％～5％羟丙基甲基纤维素50cp，粘度5～30kD，DNA片段化电泳分离为100～250V/cm。
5、按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元是通过激光诱导荧光单点法检测实现的。
6、按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述片段化DNA标记所用标记染料是预先加在运行缓冲液或细胞裂解液中的荧光染料；荧光染料的激发波长、发射波长与激光诱导荧光检测用激光器的激光波长相适应。
7、按照权利要求1或6所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：对片段化DNA进行在线动态标记所采用的标记染料浓度是1uM。
8、按照权利要求1或4所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述DNA片段化分离的分离电压为170V/cm。
9、按照权利要求1或5所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述检测位置在反应通道中的裂解液进样通道和细胞进样通道之间，与裂解液进样通道和细胞进样通道的距离之比为1比2。
10、按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：
所述芯片为双T型结构，其由以下几个部分组成：缓冲液池(1)、细胞进样池(2)、裂解液进样池(3)、废液池(4)、检测区域(5)；双T型结构芯片的各个溶液池之间由通道连接，通道直径与所研究的细胞大小相适应，并能保证容纳单个细胞的运输；
芯片的双T型结构与权利要求1中所述各基本功能单元相对应：细胞进样池(2)对应第一个基本单元；裂解液进样池(3)对应第二个基本单元；细胞进样池与裂解液进样池之间的反应通道对应第三个基本单元。
CNB2004100207516A 2004-06-15 2004-06-15 一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片 Expired - Fee Related CN1313624C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2004100207516A CN1313624C (zh) 2004-06-15 2004-06-15 一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2004100207516A CN1313624C (zh) 2004-06-15 2004-06-15 一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1712540A true CN1712540A (zh) 2005-12-28
CN1313624C CN1313624C (zh) 2007-05-02

Family

ID=35718334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2004100207516A Expired - Fee Related CN1313624C (zh) 2004-06-15 2004-06-15 一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1313624C (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103529195A (zh) * 2013-10-24 2014-01-22 山东大学 用于痕量靶标物质测量的检测方法
CN106754873A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 四川大学 Dna分离试剂盒
CN111304077A (zh) * 2020-03-03 2020-06-19 广东工业大学 一种用于核酸提取的集成微流控芯片及其提取方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003075437A (ja) * 2001-09-04 2003-03-12 Tsukuba Bio Syst:Kk 近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導によるｄｎａの断片化の検出方法
ATE336721T1 (de) * 2002-06-03 2006-09-15 Pamgene Bv Hoch-durchsatz assay zur messung von zellulären antworten mit hilfe von mikroarrays
CN1223856C (zh) * 2002-07-18 2005-10-19 中国科学院大连化学物理研究所 一种蛋白质分析用微流控芯片及其在蛋白质分析中的应用
CN100439514C (zh) * 2002-08-23 2008-12-03 中国科学院大连化学物理研究所 一种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103529195A (zh) * 2013-10-24 2014-01-22 山东大学 用于痕量靶标物质测量的检测方法
CN103529195B (zh) * 2013-10-24 2014-08-06 山东大学 用于痕量靶标物质测量的检测方法
CN106754873A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 四川大学 Dna分离试剂盒
CN106754873B (zh) * 2016-12-05 2019-11-26 四川大学 Dna分离试剂盒
CN111304077A (zh) * 2020-03-03 2020-06-19 广东工业大学 一种用于核酸提取的集成微流控芯片及其提取方法
CN111304077B (zh) * 2020-03-03 2023-10-24 广东工业大学 一种用于核酸提取的集成微流控芯片及其提取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1313624C (zh) 2007-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11534756B2 (en) Compact device for detection of nanoscale analytes
US9109197B2 (en) Device for concentrating and separating cells
CN1181337C (zh) 微流体系统中实体分子的操纵方法及相关试剂盒
Wolff et al. Integrating advanced functionality in a microfabricated high-throughput fluorescent-activated cell sorter
EP1941021B1 (en) Method and apparatus for characterizing and counting particles, in particular biological particles
Pappas et al. Cellular separations: a review of new challenges in analytical chemistry
JP4773348B2 (ja) 高感度かつ迅速なバイオ検出法
CN1376779A (zh) 细胞分离方法及其应用
CN1304846C (zh) 一种用于流式细胞检测的微流控芯片检测系统
JP2005521425A5 (zh)
CN104583420A (zh) 核酸样品制备
WO2012055304A1 (zh) 一种用于细胞和颗粒分离的分选仪及分选方法
CN101842161A (zh) 用于目标物质的俘获磁性拣选系统
CN1200111C (zh) 一种基于微流控技术的流式细胞仪
CN105136763B (zh) 基于气液界面单细胞捕获及叶绿素荧光表征的单微藻细胞活性动态监测新方法与装置
CN102636473A (zh) 激发光偏离共线型光学系统检测装置及其检测方法
US20220056390A1 (en) Bacteria separation system and methods
CN1313624C (zh) 一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片
Wang et al. The automatic and high‐throughput purification and enrichment of microalgae cells using deterministic lateral displacement arrays with different post shapes
KR20230158469A (ko) 입자 분리기 시스템, 재료 및 사용 방법
KR20070065629A (ko) 세포 또는 바이러스의 농축 또는 정제용 미세유동장치 및방법
Karacaoğlu et al. Microfluidic systems as a novel approach for microalgal bioprocess
CN101216427A (zh) 小而密低密度脂蛋白的微流控电泳分析方法
CN116559055A (zh) 一种微流控芯片、制备方法、分析装置及分析方法
CN1566951A (zh) 一种基于微流控芯片的细胞分选方法及其专用芯片

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070502

Termination date: 20130615