CN116559055A - 一种微流控芯片、制备方法、分析装置及分析方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于用电磁声等能量处理微生物或颗粒的技术领域,尤其是涉及一种微流控芯片、制备方法、分析装置及分析方法。一种微流控芯片,包括主通道,与主通道连通设有的两个或多个进样道,主通道底部设有聚焦电极和偏转电极,所述聚焦电极用于聚集微粒,所述偏转电极用于定向移动微粒。本申请的微流控芯片通过设置多个进样道,使多流体同时进入主通道,通过调整不同进样道流体流速,使主通道内流体可控地进入出样道或废样道,实现微粒的定向移动,在移动过程中,选定特定的检测点,完成特定的检测,基于介电的在线清洗,实现对上游的多种复杂样品的兼容,以及便于对接下游更深入的分析。
Description
技术领域
本申请属于用电磁声等能量处理微生物或颗粒的技术领域,尤其是涉及一种微流控芯片、制备方法、分析装置及分析方法。
背景技术
细胞是大部分生物体结构和功能的最基本组成单位,对于细胞的研究备受关注。在细胞生物学上,依据细胞的来源组织、自身形态和分泌物等特征对细胞群体进行分类和研究。这些研究对人体药物代谢,生物体行为,信号传递等具有重大意义。而这些研究方法都是基于细胞群体,即大量的细胞,不管是对细胞形态学还是代谢组学的研究都是这些大量细胞的平均水平。这些研究方法无法用于细胞差异性的研究。近年来,科学工作者对单细胞的研究越来越重视,单细胞研究的作用也越来越大。不仅涉及到药物代谢,新药开发,还能很好的解释细胞分子机制,细胞通路等问题。因此,针对单个细胞的全面分析是现代生物学和医学研究十分重要的技术。
现阶段已经发展了多种技术进行细胞分析检测。
单细胞拉曼光谱技术(SCRS)就是其中的一种。其具有高分辨率、免标记、无损、分子特异性、非培养等优点。单细胞拉曼光谱技术(SCRS)是一种高效的细胞内化学物质信息识别技术,可以提供细胞内化合物分子构成和结构的信息,拉曼光谱在获得整个单细胞的化学物质指纹图谱时并不需要任何标记,有化学键就可以检测出来,因此可以识别活体细胞的细胞类型、生理特性和表型变化,并可利用细胞拉曼信号的变化来追踪与分选“未知细胞表型”。但是,单细胞拉曼光谱的采集会受到液体的拉曼背景的干扰。如果待测细胞环境中如果有氨基酸或者糖类等,都会对待测细胞的测定值有影响。故对待测细胞需要一定的前处理,再对处理后的细胞或者细菌等颗粒进行检测。
传统的细胞前处理方法主要有两种,一种是将细胞或者细菌离心,离心后进行多步沉淀,去上清,再加入缓冲液清洗;另一种是基于过滤的方式,将细胞或者细菌过滤至滤纸上,再将滤纸上的细胞或者细菌转移收集再清洗。完成上述的前处理再进行拉曼检测。
但是,对于复杂样品,其处理更繁琐;且传统的离线的清洗手段会影响细胞的活性以及状态,难以满足需要在线检测的需求,例如对细菌发酵过程的细菌状态的检测监控;同时失活的细胞也无法再进行下游分析。
发明内容
为了实现对上游的多种复杂样品的兼容分析和便于下游的细胞分析,本申请一种微流控芯片、制备方法及在线分析装置提供以下几个方面的技术方案。
本发明所称的“微粒”,是指能够悬浮在非有机相溶液(例如水相)、并在本发明微流控芯片内通过的颗粒,包括生物体来源的和非生物体来源的颗粒,例如真核细胞、原核细胞、单细胞生物、病毒颗粒、细胞器、生物大分子形成的颗粒、药物颗粒、药物载体颗粒、脂质体、多聚物粒子等。
第一方面,本申请提供一种微流控芯片,采用以下技术方案实现。
一种微流控芯片,包括主通道,与所述主通道连通设有两个或者多个进样道,所述主通道底部设有聚焦电极和偏转电极,所述聚焦电极用于聚集微粒,所述偏转电极用于定向移动微粒。
通过采用上述技术方案,设置多个进样道,使多样本同时进入主通道,可以通过调整不同进样道内流体的流速,使主通道内流体可控地进入出样道或者是废样道,实现微粒的定向移动。
优选的,所述聚焦电极为尖角叉指电极,所述尖角叉指电极的尖角端的指向远离所述进样道。
通过采用上述技术方案,聚焦电极的尖角端的指向与流体的流动方向相同,能够顺利地捕获流体内微粒,使流体内微粒准确地聚集到尖角端,便于在尖角端设置光谱仪检测用设备。
优选的,所述进样道有两个,分别为第一进样道和第二进样道。
通过采用上述技术方案,使用流体驱动器将含有微粒的流体和缓冲液分别注入主通道,主通道内只有这两种通道进入的物质,控制它们的流速,流体内除微粒以外,不会流入到出样道,实现流体内细胞和/或微粒的定向移动。
第二方面,本申请提供一种微流控芯片的制作方法,采用如下的技术方案实现。
制作所述的微流控芯片,包括以下步骤:
(1)在基底层上固设所述聚焦电极和所述偏转电极;在双面胶上切割出所述主通道和所述进样道;
(2)将所述双面胶的一面与基底层贴合;
(3)在所述双面胶的另一面贴合顶盖层。
通过采用上述技术方案,设置导电的电极能使主通道内微粒受到介电力,在双面胶上刻出主通道、进样道、出样道和废样道便于上述通道的长宽高参数的设置,也方便加工。第三方面,本申请提供一种分析装置,采用如下的技术方案实现。
一种分析装置,微粒承载捕获装置,用于承载捕获微粒;
流体驱动器,与所述微粒承载捕获装置连接,用于驱动流体进入微粒承载捕获装置;
光谱仪,所述光谱仪的光谱信息采集端对准微粒承载捕获装置的微粒捕获处,用于在微粒捕获处检测光谱信息;
基因组分析装置,与微粒承载捕获装置连接,用于检测微粒信息;
电脑,与所述光谱仪和所述基因组分析装置连接,用于控制所述光谱仪和所述基因组分析装置,并记录分析从所述光谱仪和所述基因组分析装置获得的信息。
通过采用上述技术方案,为实现光谱和基因组检测的耦合分析提供了可进行的装置。
优选的,所述的微流控芯片,所述微流控芯片设有出样道;流体驱动器,所述流体驱动器用于驱动流体进入所述进样道;函数发生器,所述函数发生器为微流控芯片提供交流电;光谱仪,所述光谱仪的光谱信息采集端对准聚焦电极的尖角端;基因组分析装置,所述基因组分析装置与所述出样道连接;电脑,所述电脑用于控制所述函数发生器、所述光谱仪和基因组分析装置并采集收集信息。
通过采用上述技术方案,通过函数发生器给微流控芯片的聚焦电极和偏转电极施加电压,使微流控芯片内的微粒受到介电力。通过光谱仪、和后续分析的其他装置分别与电脑连接,实现对整个分析设备的开启、控制、数据采集、保存和分析。
优选的,所述出样道与后处理管一端连接,后处理管另一端与油池连接,所述后处理管上连通有第一加料管和第二加料管,所述油池的液滴用于基因组分析。
通过采用上述技术方案,实现后续的二次分析,完成基因组分析,从而实现光谱检测与基因组分析的耦合。
优选的,微粒承载捕获装置为微粒筛选芯片;
所述微粒筛选芯片包括储油池、样品储存池,主通道、以及第二进样道,所述主通道两端分别与储油池及第二进样道连通,所述样品储存池为密闭中空立体结构,样品储存池的出口通过支路通道与主通道连通。
通过采用上述技术方案,本申请的本意在于任何可以移动微粒的方式,包括力声电热光磁等多种微粒移动的手段,来实现微粒移动定位的目的,从而进行光谱检测。
第四方面,本申请提供一种分析方法,采用如下的技术方案实现。
一种分析方法,使用所述的微流控芯片和所述的分析装置,包括以下步骤:
(1)连接装置:
将函数发生器分别与聚焦电极和偏转电极连接;
光谱仪的光谱信息采集端对准主通道;
所述微流控芯片的所述出样道与基因组分析设备连接;
电脑分别与函数发生器、光谱仪和基因组分析设备连接;
(2)进样:将缓冲液经第一进样道通入到主通道;将包含有微粒的流体经第二进样道通入到主通道;
(3)聚焦:在聚焦电极上施加电压,使流体中的微粒聚集;
(4)光学检测:开启光谱仪,检测的信号传输到电脑程序进行分析处理;
(5)偏转:在偏转电极上施加电压,使流体中的微粒偏转;
(6)二次检测:将出样道流出的液体加入酶和含barcoad的凝胶珠悬液,混合后形成液滴,对液滴进行单细胞测序以实现基因组分析。
通过采用上述技术方案,在聚焦电极的作用下聚集微粒,设定光谱检测点,再在偏转电极的作用下,使微粒经出样道流出,出样道流出的细胞经过处理再进行基因组检测。完成单细胞多表型分析。优选的,使用微粒筛选芯片,在支路通道和主通道的交界处设置光谱仪的光谱信号采集端;电脑连接光谱仪和基因组分析装置,用流体驱动器注入样品储存池中;在第一进样口注入缓冲液。
通过采用上述技术方案,能够实现同一个单细胞的光谱和基因组检测的耦合。
综上,本申请包括以下至少一个有益技术效果:
1、本申请的微流控芯片通过设置多个进样道,使多流体同时进入主通道,通过调整不同进样道内流体的流速,使主通道内流体可控地进入出样道或者是废样道,实现微粒的定向移动,在移动过程中,选定特定的检测点,完成特定的检测。
2、本申请的分析装置通过函数发生器给微流控芯片的聚焦电极和偏转电极施加电压,使微流控芯片内的微粒受到介电力。通过光谱仪和基因组分析等后续分析的其他装置分别与电脑连接,实现对整个分析设备的开启、控制、数据采集、保存和分析。
3、本申请基于介电的在线清洗,实现对上游的多种复杂样品的兼容,以及便于对接下游更深入的分析。
附图说明
图1是微流控芯片结构示意图。
图2是聚焦电极和偏转电极的参数特征示意图。
图3是实施例2的微流道结构示意图。
图4是微流控芯片层结构图。
图5是光谱信号检测后耦合单细胞测序示意图。
附图标记说明:10、主通道;11、聚焦电极;12、偏转电极;13、第一进样道;14、第二进样道;15、出样道;16、废样道;17、微粒;18、光谱信息采集端; 22、后处理管;23、第一加料管;24、油池;25、第二加料管;26、含barcoad的凝胶珠;27、顶盖层;28、双面胶;29、基底层;30、第三进样道;31、第二出样通道; 35、液滴;a:上电极角度;b:下电极角度;d:电极与电极之间的距离;D:电极的宽度;L:电极对的宽度。
具体实施方式
以下结合附图1-5,对本申请作进一步详细说明。
实施例1
本实施例是微流控芯片。参照图1,微流控芯片设有主通道10,主通道10一端连通有两个进样道,本申请所述进样道可以是直线形,也可以是折线形、弯曲的或者不规则形状的,本实施例中的两个进样道,分别为第一进样道13和第二进样道14,形状如图1所示,本申请的不同进样道的宽度可以不同,本实施例中第一进样道13和第二进样道14的宽度相同。在主通道10的另一端连通有出样道15和废样道16。第一进样道13和出样道15在主通道10的同一侧,第二进样道14和废样道16都在主通道10的另一侧,主通道10的底部设有聚焦电极11和偏转电极12。
聚焦电极11和偏转电极12是沿着进样道至出样道15的方向依次设置。聚焦电极11为尖角叉指电极,电极是弯折的,具有夹角,其形状类似“>”,尖角叉指电极成对设置,本申请至少具有一对聚焦电极11,每对电极中的两个电极互相平行,且间隔分布,每对电极对中的一个电极自主通道10的一侧延伸至主通道10底部,电极对中的另一个电极自主通道10的另一侧延伸至主通道10底部。如果设置有多对聚焦电极11,那么位于主通道10同一侧的电极一端相连。本实施例中设有两个作为聚焦电极11的电极对,尖角叉指电极的尖角端的指向远离进样道。
偏转电极12也是成对出现的。每个电极是直板形电极,相对于主通道10倾斜设置,其形状类似“/”。成对设置的偏转电极12的两个电极是互相平行的,且间隔设置的,平行且间隔设置的偏转电极12对的形状类似“//”。实施例中设有一个作为偏转电极12的电极对。
参照附图2,图中a表示上电极角度;b表示下电极角度;d表示电极与电极之间的距离;D表示电极的宽度;L表示电极对的宽度。本申请的a和b的范围均在0-90°,聚焦电极11的数量为至少一对聚焦电极11,偏转电极12至少有一个,均可实现本申请的目的。本实施例中聚焦电极11有两对,偏转电极12有两个,电极对宽度L为1毫米,电极的宽度D为25微米,电极间的距离d为25微米,上电极角度a为30度,下电极角度b也为30度。
本申请中聚焦电极11和偏转电极12的电极高度为10纳米到10微米,50-150纳米更佳。本实施例中聚焦电极11和偏转电极12的高度均为100纳米。
本申请的主通道10的长度不限,长度越大,可以增设越多的聚焦电极11,能够达到很好的聚焦效果。本实施例中的主通道10的长度为1.5毫米。
本实施例的实施原理为:细胞悬液中含有葡萄糖和蔗糖等物质,做单细胞的检测分析时,这些物质会干扰并影响单细胞的检测结果,所以在做检测分析时,需要将单细胞从细胞悬液中分离出来,本申请通过设置两个进样道,在第一进样道13中通入缓冲液纯水,实现微粒17的在线清洗。通过在主通道下部设置聚焦电极11和偏转电极12,并在聚焦电极11和偏转电极12上周期性施加高频交流电,使流体中的微粒17沿着电极运动,是因为微粒17在不易极化的溶液中,通过施加非均匀电场,由于微粒17易被极化,会受到垂直于电极并指向电极的介电力,与此同时,微粒17还会受到平行于流动方向并指向流动方向的流体推动力,两者的合力会将微粒17沿着电极移动。
实施例2
本实施例是微流控芯片。参照图3,本实施例与实施例1的基本相同,与实施例1的区别在于:微流控芯片包含三个进样道(第一进样道13、第二进样道14和第三进样道30),两个出样道(第一出样道15和第二出样道31),一个废样道16。本申请的每个进样道的宽度可以区别设置,本实施例中的第一进样道13、第二进样道14和第三进样道30宽度相同。三个进样道中以不同的流速通入流体,通过流速控制其流出通道为第一出样道15或者为第二出样道31或者为废样道16。本实施例中第二进样道14通入细胞悬液,第三进样道30通入缓冲液,缓冲液为纯水,第一进样道13中通入裂解液,实现微粒17的在线清洗和裂解,第一出样道15接检测设备,裂解液、水和培养基通过第二出样道31流出,细胞悬液的残余物质通过废样道16排除。
本实施例使用流体驱动器将含有微粒的流体和缓冲液分别注入主通道,主通道内只有这两种通道进入的物质,控制它们的流速,流体内除微粒以外,不会流入到出样道15,实现流体内微粒的定向移动。
本实施例的实施原理与实施例1基本相同,根据细胞分选不同的细胞进入不同的出样道,或者为第一出样道15或者为第二出样道31,对分选出的微粒17可以通过不同出样道分析。
实施例3
本实施例是微流控芯片的制作方法。参照图4,微流控芯片由三部分组成:带有电极结构的基底层29、双面胶28层和顶盖层27。
基底层29的制作:在ITO玻璃上蚀刻出所需电极结构的ITO电极,本实施例中蚀刻出的电极为图4中所示的形状,图4中的聚焦电极11和偏转电极12的高度为示意图,其实际高度为100纳米,图中电极高度与玻璃高度的比例不代表实际高度比例)。在基底玻璃打上进样道和第一进样道13、第二进样道14、出样道15和出样道16的字样。基底层29的玻璃为石英玻璃。
双面胶28层的制作:在双面胶28上面使用刀具切割出所需要的通道结构,本实施例的通道结构为图4中的通道结构。
在带有电极结构的基底层29上对准电极结构贴上双面胶28结构层,再在双面胶28层上盖上顶盖层27,双面胶28粘结上下两层玻璃构成主通道10等通道结构。
本实施例微流控芯片制作方法的实施原理:通过双面胶28粘结两层玻璃板,透明度高。主通道10、第一进样道13、第二进样道14、出样道15和废样道16刻在双面胶28上,与上下两层玻璃板形成可供微粒17通过的通道。电极刻在基底层29玻璃上,电极形状可控性强,操作性强,粘结牢固。
实施例4
本实施例是结肠癌细胞微粒17的拉曼-测序分析方法的具体操作步骤。
将培养好的结肠癌细胞微粒17经过消化、清洗、重悬在含有葡萄糖和蔗糖的混合溶液中,此溶液可以保持细胞微粒17的渗透压活性,同时可以在介电场下实现对细胞微粒17的介电捕获。
参照图1和图5,打开拉曼仪器,打开激光,使得激光与光谱信息采集端18对齐;开机预热一段时间后,对系统进行校准。连接各个装置:将含有细胞微粒17的细胞悬液从第二进样道14经过流体驱动器即注射泵泵入微流控芯片的主通道10内;取纯水作为缓冲液从第一进样道13泵入微流控芯片的主通道10内。调整第一进样道13内的纯水和第二进样道14内的流体的流速比,使第一进样道13内的纯水的流速为20微升每分钟,第二进样道14内的流体的流速为10微升每分钟,此时,细胞悬液内的葡萄糖不会流入到出样道15中,使用函数发生器在聚焦电极11和偏转电极12上施加介电场(聚焦电极11和偏转电极12可以同时施加电压,也可以分开控制分别施加电压):电压为16伏特,频率为10兆赫兹。开始拉曼信号的检测,检测完成后,对微粒17的拉曼光谱进行保存分析。第一进样道13的流速是第二进样道14的二倍,使第二进样道14流入的缓冲液不会影响第一进样道13的流体中的细胞的检测。将废样道16作为废液收集。将出样道15的出样口与后处理管22连接,通过第二加料管25加入的酶和第一加料管23加入的含barcoad的凝胶珠26悬液混合后在油池24处形成液滴35,后续对产生的液滴进行逆转录、cDNA扩增、构建文库、高通量测序等一系列微粒17测序的流程。从而实现对所测微粒17的基因组分析。对比拉曼光谱保存的数据和基因组测序所得到的数据进行微粒17的多表型分析。能够实现同时对同一单细胞进行在线的光谱和基因组分析的耦合检测。实现对微粒17的光谱和基因组的多表型分析。
本实施例一种分析方法的实施原理为:细胞悬液中含有葡萄糖和蔗糖等物质,做单细胞的检测分析时,这些物质会干扰并影响单细胞的检测结果,所以在做检测分析时,需要将单细胞从细胞悬液中分离出来,本申请通过设置两个进样道,在第一进样道13中通入缓冲液纯水,实现细胞微粒17的在线清洗。通过在主通道下部设置聚焦电极11和偏转电极12,并在聚焦电极11和偏转电极12上周期性施加高频交流电,使流体中的微粒17沿着电极运动,是因为细胞/微粒在不易极化的溶液中,通过施加非均匀电场,由于细胞/微粒易被极化,会受到垂直于电极并指向电极的介电力,与此同时,细胞微粒17还会受到平行于流动方向并指向流动方向的流体推动力,两者的合力会将细胞微粒17沿着电极移动。
光谱仪的信号采集区域对准聚焦电极11的尖角端,尖角端透过透明的基底层29和顶盖层27,实现主通道10内的微粒17的光谱信息的采集和分析,并且不破坏微粒17结构,便于接下来对微粒17的处理,再进行二次分析。
对出样道15出来的微粒17处理成液滴,对其进行逆转录、cDNA扩增、构建文库、高通量测序等一系列微粒17测序的流程。
以上均为本申请的较佳实施例,并非依此限制本申请的保护范围,故:凡依本申请的结构、结构、原理所做的等效变化,均应涵盖于本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种微流控芯片,包括主通道(10),其特征在于:
与所述主通道(10)连通设有的两个或多个进样道,
所述主通道(10)底部设有聚焦电极(11)和偏转电极(12),
所述聚焦电极(11)用于聚集微粒,
所述偏转电极(12)用于定向移动微粒。
2.根据权利要求1所述一种微流控芯片,其特征在于:所述聚焦电极(11)为尖角叉指电极,所述尖角叉指电极的尖角端的指向远离所述进样道。
3.根据权利要求2所述一种微流控芯片,其特征在于:所述进样道有两个,分别为第一进样道(13)和第二进样道(14)。
4.一种微流控芯片的制作方法,制作如权利要求1-3任一所述的微流控芯片,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在基底层(29)上固设所述聚焦电极(11)和所述偏转电极(12);在双面胶(28)上切割出所述主通道(10)和所述进样道;
(2)将所述双面胶(28)的一面与基底层(29)贴合;
(3)在所述双面胶(28)的另一面贴合顶盖层(27)。
5.一种分析装置,其特征在于,包括:
微粒承载捕获装置,用于承载捕获微粒;
流体驱动器,与所述微粒承载捕获装置连接,用于驱动流体进入微粒承载捕获装置;
光谱仪,所述光谱仪的光谱信息采集端对准微粒承载捕获装置的微粒捕获处,用于在微粒捕获处检测光谱信息;
基因组分析装置,与微粒承载捕获装置连接,用于检测微粒信息;
电脑,与所述光谱仪连接,或者与所述光谱仪和所述基因组分析装置连接,用于控制所述光谱仪和所述基因组分析装置,并记录分析从所述光谱仪和所述基因组分析装置获得的信息。
6.如权利要求5所述的分析装置,其特征在于:
微粒承载捕获装置为权利要求1-3任一所述的微流控芯片,所述微流控芯片设有出样道(15);
所述微流控芯片由函数发生器提供交流电;
所述光谱仪的光谱信息采集端(18)对准聚焦电极(11)的尖角端;
所述基因组分析装置与所述出样道(15)连接。
7.根据权利要求6所述的一种分析装置,其特征在于:
所述出样道(15)与后处理管(22)一端连接,后处理管(22)另一端与油池(24)连接,所述后处理管(22)上连通有第一加料管(23)和第二加料管(25),所述油池(24)的液滴用于基因组分析。
8.根据权利要求5所述的分析装置,其特征在于:
微粒承载捕获装置为微粒筛选芯片;
所述微粒筛选芯片包括储油池(24)、样品储存池(33),主通道(10)、以及第二进样道(14),所述主通道(10)两端分别与储油池(24)及第二进样道(14)连通,所述样品储存池(33)为密闭中空立体结构,样品储存池(33)的出口通过支路通道(36)与主通道(10)连通。
9.一种分析方法,其特征在于: 使用权利要求1-3任一所述的一种微流控芯片,包括以下步骤:
(1)连接装置:
将函数发生器分别与聚焦电极(11)和偏转电极(12)连接;
光谱仪的光谱信息采集端(18)对准主通道(10);
电脑分别与函数发生器和光谱仪连接;
(2)进样:将缓冲液经第一进样道(13)通入到主通道(10);将包含有微粒微粒的流体经第二进样道(14)通入到主通道(10);
(3)聚焦:在聚焦电极(11)上施加电压,使流体中的微粒聚集;
(4)光学检测:开启光谱仪,检测的信号传输到电脑程序进行分析处理;
(5)偏转:在偏转电极(12)上施加电压,使流体中的微粒偏转;
(6)二次检测:将出样道(15)流出的液体加入酶和含barcoad的凝胶珠(26)悬液,混合后形成液滴,对液滴进行单细胞测序以实现基因组分析。
10.根据权利要求9所述的一种分析方法,其特征在于:使用权利要求8所述的分析装置,在支路通道(36)和主通道(10)的交界处设置光谱仪的光谱信号采集端;电脑连接光谱仪和基因组分析装置,用流体驱动器注入样品储存池(33)中;在第一进样口(13)注入缓冲液;处理微粒后再进行基因组分析。
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Cited By (1)
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2022
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN109225366A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-01-18 | 大连海事大学 | 一种基于纳米-微米组合通道交流介电泳的高通量细胞分离装置及方法 |
CN109225366B (zh) * | 2018-10-12 | 2023-10-03 | 大连海事大学 | 一种基于纳米-微米组合通道交流介电泳的高通量细胞分离装置及方法 |
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