CN1710068A - 骨髓间质干细胞的制备及其与控释神经营养因子的联合应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及骨髓间质干细胞制剂的制备及最佳体外神经诱导时间，及其与控释神经营养因子最佳混合比例，用于治疗脑及脊髓中枢神经系统和其它疾病的新技术。骨髓间质干细胞MSC的制备方法，包括骨髓间质干细胞的培养；骨髓间质干细胞的体外诱导；移植诱导骨髓间质干细胞与控释胶质细胞源性神经营养因子GDNF的联合应用。本发明还包括以前述方法制备的骨髓间质干细胞在制备修复中枢神经损伤药物中的应用。本发明确定了最佳神经诱导时间，最佳MSC与控释GDNF比例，通过联合局部移植的方法使损伤猴脊髓的功能康复及结构修复，为细胞与生物工程材料的联合应用提供了指导方法。因此，本发明是治疗脊髓损伤和相关疾病的有效策略，具有广阔的临床开发前景。

Description

骨髓间质干细胞的制备及其与控释神经营养因子的联合应用

[技术领域]

本发明涉及一种治疗神经系统损伤的干细胞制剂与控释神经营养因子联合应用的方法，具体地说，涉及骨髓间质干细胞制剂的制备及最佳体外神经诱导时间，及其与控释神经营养因子最佳混合比例，用于治疗脑及脊髓中枢神经系统和其它疾病的新技术。

[技术背景]

对于由神经系统损伤导致的瘫痪和其他神经系统功能障碍临床上常常无有效治疗方法，有人采用神经系统细胞移植来促进神经损伤的功能恢复，但供者神经系统细胞主要来源于胎脑或其它意外死亡者，来源不足有免疫排斥问题且在临床应用上存在伦理学障碍。因此，选择新的干细胞源移植治疗中枢神经系统疾病变得越来越重要和紧迫。干细胞具有自我复制和多向分化的功能，是形成生命机体各种组织器官的起源细胞。在正常生殖生理过程中，干细胞由受精卵分化而来。干细胞移植治疗中枢神经系统损伤取得了一定的研究成果，但对损伤神经系统的功能重建仍未达到理想的效果。这是因为损伤后神经区域神经营养因子水平下降，限制了中枢神经的修复。鉴于神经营养因子类物质在体内极易降解、半衰期短的特点，必须建立起一种持续供给的体系。在转基因技术研究领域使用最多的仍是病毒载体，但病毒转载基因的过程包裹非常复杂的“插入”程序，此外，病毒类载体的存在有引起免疫反应和重组病毒的危险，因此，在研究新型载体的同时研究新的应用方法很有必要。越来越多的新型材料应用于组织工程中来，药物控释已成为可降解生物材料的重要应用。

成人骨髓中的间质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)属于成体干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，成为另一个可供细胞移植的细胞源。然而，MSC诱导分化后的神经元其活性如何，移植到中枢神经系统是否可以继续存活，能否促进神经功能的恢复，尚有疑问。而且移植细胞与控释神经营养因子使用配比问题也有待解决。因此，建立一种可以广泛应用于临床治疗中枢神经系统疾病的具有活性的干细胞诱导技术，并建立相关的细胞与控释神经营养因子混合配比的技术具有重要的意义。

[发明内容]

本发明的目的在于提供一种既可以保持移植细胞活性又可以保证诱导的有效性的方法，并提供确定细胞与控释神经营养因子移植混合物分配比例的方法。

本发明的目的是通过以下方式而实现的：骨髓间质干细胞的制备方法，包括骨髓间质干细胞的培养；骨髓间质干细胞的体外诱导；移植诱导骨髓间质干细胞与控释神经营养因子GDNF的联合应用。

骨髓间质干细胞的培养包括：抽取健康猴骨髓，分离单个核细胞；接种于含15％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的L-DMEM培养液中，培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastic growth factor， bFGF)3ng/ml，培养瓶中贴壁培养；取5-8代骨髓间质干细胞进行鉴定，体外诱导观察其成骨、成脂肪多向分化潜能；移植前48小时5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸(5-Bromo-2-deoxyuridine， BrdU)按10umol/L浓度标记，计数备用。其中骨髓间质干细胞的体外诱导时间为1.5小时；3.0×10⁶骨髓间质干细胞与GDNF含量为0.5ug的控释胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic fanctor，GDNF)为最佳配比。

本发明还包括以前述方法制备的骨髓间质干细胞在制备修复中枢神经损伤药物中的应用。

本发明具有的重要用途如下：

1.猴MSC的原代培养要比大鼠MSC的培养困难，而这种难度和成人MSC的培养难度相当，本发明建立起一种改良的培养方法从而使MSC的培养变得容易。

2.本发明确定了体外诱导最佳时间的方法，既可以保证诱导的有效性，又可以保证移植细胞的活性。

3.本发明解决了细胞与控释神经营养因子的移植比例的问题，从而达到两组的优化组合。

4.本发明采用自体MSC移植，因而具有很大的应用优势。

5.本发明采用猴为对象，其遗传背景与人较大鼠等低等动物更为接近，脊髓损伤后的病理改变过程与人类更为接近。

6.采用标准化的猴脊髓挫伤模型，损伤程度相当于人类的截瘫，其与临床上发生的大多数脊髓损伤类型接近，因而具有良好的模拟性。

7.本发明观察指标全面，诱发电位检测为临床常用的评价脊髓功能的方法。病理分析全面，实验结果可靠，具有重大的参考价值。本发明对实验动物的观察期长达4～5个月，其中一只长达1年，实验结果更加有意义。

8.所使用控释载体对机体无毒无害，可以完全降解，可以产业化生产，应用方便。

9.所使用的MSC经过流式分析、多向分化潜能的鉴定，使用可靠。

10.MSC移植前，经中药提取物诱导，既可以保证移植细胞在体内继续向神经方向分化，有避免了MSC体内成瘤的潜在危险。

胚胎干细胞、神经干细胞存在着获取困能、伦理问题等，因而在应用上存在着很大限制；造血干细胞在治疗神经损伤性方面很有局限性；而骨髓间质干细胞由于获取容易，体外扩增容易，因而很容易获取所需数量的细胞，在操作上具有简单性、可行性，更为重要的是MSC可从自体获取，根本不用考虑免疫排斥反应，因而在应用后不需要使用免疫抑止剂，而当前免疫移植剂的价格是很昂贵的，而且应用后还存在着很大副作用，因此MSC的推广应用不但可以为患者节省一大笔开支，而且较少不必要的副作用。所以，MSC较其他细胞在治疗神经损伤性疾病方面具有最强的竞争力。经神经诱导的MSC可以在脊髓内更好向神经元细胞分化，而且避免了其成瘤的可能性。

总之，本发明确定了最佳神经诱导时间，最佳MSC与控释GDNF比例，通过联合局部移植的方法使损伤猴脊髓的功能康复及结构修复。为细胞与生物工程材料的联合应用提供了指导方法。因此，此项发明是治疗脊髓损伤和相关疾病的有效策略，具有广阔的临床开发前景。

[附图说明]

图1是GDNF控释生物材料扫描电镜像。显示GDNF包裹于单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体(Poly(lactic acid)-Poly(eyhylene glycol)，mPEG-b-PLA)形成的微球体中，随着材料的降解，GDNF可以释放出来发挥生物学活性。

图2显示正常皮层体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potential，CSEP)呈正(P)、负(N)双向波型。

图3显示经颅磁刺激运动诱导电位(motor evoked potential，MEP)波型呈多极性波。

图4显示脊髓损伤部位神经元[尼氏染色(×400)]。

A.实验组脊髓损伤部位前角神经元数量多，运动神经元胞体清晰，细胞可见数量众多的尼氏小体。

B.对照组脊髓损伤部位前角神经元数量减少，胞体内尼氏小体消失，细胞水肿。

图5显示脊髓损伤部位皮质脊髓侧束[甘氨银浸镀法染色(×400)]

A.实验组脊髓损伤部位皮质脊髓侧束横切面组织结构正常，轴突密度高，着色深。

B.对照组脊髓损伤部位皮质脊髓侧束横切面结构疏松、紊乱，轴突密度低。

C.实验组脊髓损伤部位皮质脊髓侧束纵切面轴索排列整齐，结构完整，连续性好。

D.对照组脊髓损伤部位皮质脊髓束纵切面轴索断裂，结构破坏。

图6免疫双标组化反应(×400)，显示实验组脊髓前角免疫双标阳性细胞(核蓝紫色，胞浆棕褐色)，在前角运动神经元周围可观察到BrdU和NSE双标阳性细胞。

[具体实施方式]

实施例1、改良骨髓间质干细胞(MSCs)的制备技术实例。抽取健康猴髂骨骨髓，分离单个核细胞，接种于含15％FBS的L-DMEM培养液中(其中添加bFGF，3ng/ml)，塑料培养瓶中贴壁培养。取5-8代骨髓MSCs进行鉴定，方法包括流式细胞仪检测其表面抗原标志，体外诱导观察其成骨、成脂肪多向分化潜能。移植前48小时Brdu按10umol/L浓度标记，计数备用。

实施例2、用于移植的MSCs体外最佳诱导时间的确定。将MSCs诱导细胞分为0小时组(对照)、1小时组、1.5小时组、2小时组和3小时组，每组分为6个样本，分别进行巢蛋白(NESTIN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化染色，并利用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

(平均)   NESTIN阳性率(％)   NSE阳性率(％)   细胞凋亡百分比(％)

0小时组           0             0                2.7

1小时组           10            15               2.8

1.5小时组         25            30               3.2

2小时组           10            35               5.7

3小时组           3             55               7.2

从结果中可以看出，诱导1.5小时既可以保证诱导的效果又可以保证细胞的活性，是最佳诱导时间。而目前关于诱导细胞的移植并没有关注移植细胞活性的问题，若移植细胞诱导后活性丧失必然影响到移植的效果。

实施例3、移植诱导MSCs与控释神经营养因子的最佳配比的确定。将GDNF含量不同的控释GDNF分别在培养液中放置1周，然后将此培养液配成神经诱导液分别对3.0×10⁶猴MSCs进行诱导，每组6个样本，并检测3小时的细胞凋亡百分比。

GDNF含量ug              细胞凋亡百分比(平均)

0                       7.2

0.25                    6.4

0.375                   5.8

0.5                     3.8

0.625                   3.8

0.75                    3.6

从结果中可以看出，GDNF含量在0.5时可以明显降低诱导细胞的凋亡百分比，而且再增加含量效果无明显增加，因此，3.0×10⁶细胞与GDNF含量为0.5ug的控释GDNF为最佳配比，因在本实验中移植细胞总量为1.2×10⁷，因子所需GDNF总量为2ug。而在目前，移植细胞与控释因子在移植过程中的比例仍无有效的确定方法。

实施例4、实验移植骨髓MSCs源性神经前体细胞与GDNF控释生物材料治疗脊髓人为损伤所致的猴神经功能障碍实例。按实例1、实例2所述方法分别分离培养MSCs及制备GDNF控释生物材料。制备动物模型，取8只健康雄性恒河猴，体重4kg，随机分组。采用肌肉盐酸氯胺酮注射液与地西泮注射液复合麻醉，手术按改良Allen’s法制作胸段脊髓损伤模型。

实验设计如下：

移植组：损伤后第10天，消化计数诱导的猴MSCs，将3.0×10⁶cells/kg与含2ugGDNF的控释生物材料制成200uL的PBS悬液，分五点注射到实验组(n＝4)脊髓损伤部位(损伤脊髓阶段头尾端左右前角部位各一点，损伤中端后中间沟一点)

PBS组：给予同等剂量的PBS。

采用美国Nicolet公司生产的VikingIV型诱发电生理仪分别于术前、脊髓休克期过后、治疗后4-5月进行皮层体感诱发电位(CSEP)、经颅磁刺激运动诱发电位(MEP)检测，客观评价脊髓感觉与运动功能；按照改良Tarlov评分法分标准进行运动功能评价；为了解治疗对脊髓结构的保护作用，应用尼氏染色观察前角运动神经元，应用甘氨银法观察轴索，并进行图形分析。为了解移植细胞在猴脊髓内的存活与分化情况，本发明对脊髓石蜡切片进行免疫双标组化法检测Brdu标记细胞的存活、迁移与神经分化情况。

CSEP检测结果(表1)。

表1 CSEP测潜伏期与波幅的均值( x±s) n＝8

组别               潜伏期(ms)        潜伏期(ms)           波幅(μV)    波幅降低度(μV)

实验组 治疗前     16.04±0.82          20.46±0.80          10.56±1.30

                                                                        3.78±1.32a

       治疗后     16.75±0.58^b       20.60±1.18^c         6.65±0.90

对照组 治疗前     16.42±1.20          19.82±1.52           9.95±0.84

                                                                        9.95±0.84

       未治疗                                                0

与对照组比较：^at＝-11.194，P＜0.01；与实验组正常比较，^bt＝-2.013，P＝0.07；与实验组正常比较，^ct＝-0.274，P＝0.8

损伤前所有猕猴胫后神经均可引出正常的CSEP信号(图2)。损伤后所有动物CSEP信号消失，4～5月后，治疗组与损伤前相比潜时期无明显延长，但波幅降低(6.65±0.90)μV，波幅降低度(3.78±1.32)μV，与对照组波幅降低度(9.95±0.84)μV之间具有显著性差异，p＜0.01；对照组CSEP信号仍然无法引出。表明移植组的感觉功能获得了一定程度的恢复，而PBS组无变化。

MEP检测结果(表2)。

表2实验不同阶段MEP的潜伏期和波幅( x±s)

               潜伏期(ms)                                     波幅(mv)

         正常           4-5月后        正常            4-5月后       波幅降低度

实验组   20.15±0.94    29.92±1.44    0.88±0.030     0.43±0.084   0.45±0.032

对照组   20.92±0.82                   0.92±0.052     0             0.92±0.052

实验组波幅降低度与对照组比较P＜0.01

MEP由多极性波组成(图3)，损伤后第10天，所有实验动物MEP缺失，治疗后4～5月，实验组MEP波型有一定恢复，但潜时期延长(p＜0.01)，波幅降低(P＜0.01)，对照组MEP仍然缺失。波幅降低度是指与正常波幅之间的差值，间接反映了脊髓损伤后波幅恢复的程度，波幅降低度越小，与正常值之间的差值就越小，波幅恢复程度就越高，治疗效果就越好。实验组的波幅降低度明显低于对照组，p＜0.01。表明移植组的运动功能获得了一定程度的恢复，而PBS组未观察到这种变化。

Tarlov评分结果。由于皮质脊髓束损伤(上运动神经元瘫)，脊髓休克期(损伤后一周左右)，过后，猕猴主要保持一种迟缓性瘫痪状态：下肢屈曲、内收，髋及膝关键屈曲，各趾跖屈。对照组这种状态保持到实验终期，评分等级0级；治疗后3周期始，实验组可观察到股部肌肉和膝关节的轻微运动，8周时这种运动变得较为明显，膝关节活动度增加，并可以观察到趾及踝关节的运动，3月中，膝关节活动度明显加大，但仍不能完全伸展，下肢仍无法支撑自身体重，站立不能，继续观察4周以上，治疗效果不再有明显改观，处死动物，评分等级1-2级。表明移植组的运动功能有一定恢复，而PBS组运动功能始终不能恢复。

尼氏染色结果(表3)。

表3前角运动神经元数量(个)(x± s)

                    实验组              对照组

神经元计数          18.3±0.90          5.6±0.68

P＜0.01

实验组脊髓前角大、中型运动神经元数量较多，尼氏小体染色正常(图4A)；对照组神经元数量显著减少(p＜0.01)，尼氏小体消失(图4B)。

轴突染色结果(表4，5)。

表4脊髓皮质脊髓侧束横切面轴突数量和横切面积( x±s)

                        项  目

             轴突数(个)/平均视野        面积(um²)/平均视野

             左侧①       右侧②     左右平均③     左侧④              右侧⑤

左右平均⑥

实验组       1423±261    1404±189  1412±220      13213.89±2954.23   10238.61±1200.02

11771.25±1131.05

对照组       734±175     707±229   720±168       6024.71±1542.92    4992.22±1949.45

5538.45±2000.28

①P＜0.01，②P＜0.01，③P＜0.01，④P＜0.01，⑤P＜0.01，⑥P＜0.01表5脊髓皮质脊髓侧束纵切面纵切面积；光密度值( x±s)

                             项   目

                面积(um²)/平均视野        平均光密度               平均积分光密度

实验组(左)      25319.27±2108.01           0.4340±0.0279           11388.82

±1307.20

      (右)      26118.50±2597.80           0.4197±0.0386           12009.36

±1512.68

(左右平均)      25718.88±2302.82           0.4268±0.0293           11499.09

±1390.00

对照组(左)      15205.86±1468.36           0.3192±0.0675           5235.30

±1179.30

      (右)      13662.06±3668.50           0.3212±0.0302            4664.26

±1618.21

(左右平均)      14413.96±2323.76           0.3202±0.0477            4949.78

±1479.82

左侧面积/平均视野比较P＜0.01；左侧平均光密度值比较P＜0.05；左侧平均积分光密度值比较P＜0.01；

右侧面积/平均视野比较P＜0.01；右侧平均光密度值比较P＜0.01；右侧平均积分光密度值比较P＜0.01；

实验组组织结构完整，轴突密度高；对照组侧索框架结构破坏严重，皮质脊髓侧束轴突密度低，轴索破坏(图5)。光密度反映物体对光的吸收率，可反映轴突染色的深浅度。轴突染色越深，其对光线的吸收越多，故光密度越高。积分光密度是平均光密度与面积的乘积，颜色越深，面积越大，积分光密度越高。结果显示治疗组后索轴索平均光密度、积分光密度高于对照组，有显著性差异，p＜0.01。表明移植组组织结构恢复程度较好。

免疫组化染色结果表明，移植后4～5个月，实验组脊髓损伤区仍然有BrdU标记的猴骨髓间质干细胞源性细胞存活，并且可以表达神经元标志物NSE(图6)，说明使用本方法可以使移植到脊髓中的诱导的猴骨髓间质干细胞存活，而且有机的与脊髓神经组织整合在一起，并进一步具备分化为神经组织细胞的能力。这种双标阳性的细胞在每张脊髓切片(厚4um)中的数量为6-8个，散在分布，脊髓内各处都可以出现。我们推测移植细胞替代损伤组织细胞的方式可能是其修复脊髓损伤的一个重要机制。

神经营养因子已经显示出对中枢神经损伤的修复作用，如何有效的应用神经营养因子修复神经损伤是目前研究的一个重点。鉴于神经营养因子类物质在体内极易降解、半衰期短的特点，必须建立起一种持续供给的体系。在转基因技术研究领域使用最多的仍是病毒载体，但病毒转载基因的过程包裹非常复杂的“插入”程序，此外，病毒类载体的存在有引起免疫反应和重组病毒的危险，因此，在研究新型载体的同时研究新的应用方法很有必要。

药物控释已成为可降解生物材料的重要应用。单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体(mPEG-b-PLA)是一种良好的生物材料，然而这种生物材料是否可以用来进行脊髓局部移植治疗还不清楚。

当mPEG-b-PLA植入脊髓后，首先发生的是材料吸水，渗入材料的水很快在材料表面和内部之间形成一个梯度。但是这种梯度会在几天内消失，因为像水这样的小分子的扩散速度比酯键的断裂速度快得多。因而，可以认为酯键的水解开始时是均匀的。降解会使能加速酯键水解的羧基端基的数目增加，只有能溶于周围水性介质的低聚物才能从材料上脱离下来。随着时间的延长，那些位于材料表面的可溶性齐聚物可以在完全降解之前被分离出来，而那些在材料内部的齐聚物仍然受到束缚，导致内部的酸性大于表层，从而产生羧基浓度的内外差异。随着降解的进行，材料内部会有越来越多的羧基加速内部材料的降解，并进一步增大内外差异。当内部材料完全转变成可降解性齐聚物并溶解在水性介质中时，就会形成表面由没有完全降解的高聚物组成的中空结构，其表面厚度由很多因素决定。酶解作用在材料的降解过程中尤其在后期也发挥了一定作用。

Claims (5)

1、骨髓间质干细胞的制备方法，包括骨髓间质干细胞的培养；骨髓间质干细胞的体外诱导；移植诱导骨髓间质干细胞与控释胶质细胞源性神经营养因子GDNF的联合应用。

2、根据权利要求1所述制备方法，其特征在于骨髓间质干细胞的培养包括：抽取健康猴骨髓，分离单个核细胞；接种于含15％胎牛血清FBS的L-DMEM培养液中，培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子 bFGF，3ng/ml，培养瓶中贴壁培养；取5-8代骨髓间质干细胞进行鉴定，体外诱导观察其成骨、成脂肪多向分化潜能；移植前48小时5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸 Brdu按10umol/L浓度标记，计数备用。

3、根据权利要求1所述制备方法，其特征在于骨髓间质干细胞的体外诱导时间为1.5小时。

4、根据权利要求1所述制备方法，其特征在于3.0×10⁶骨髓间质干细胞与GDNF含量为0.5ug的控释GDNF为最佳配比。

5、以前述方法制备的骨髓间质干细胞在制备修复中枢神经损伤药物中的应用。

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