CN1699420A - B链修饰的单体速效胰岛素,药物组合物及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了B链修饰的单体速效胰岛素、含所述单体胰岛素的药物组合物，及其制法和用途。本发明的胰岛素类似物不仅具有单体胰岛素(生理pH值、较高浓度时不聚合)的性质，保持正常胰岛素的整体生物活力，而且免疫原性大幅度下降。
Description
技术领域
本发明涉及医学和药物学领域。更具体地，本发明涉及免疫原性降低的胰岛素B链、含该B链的单体胰岛素、含所述单体胰岛素的药物组合物，及其制法和用途。
背景技术
糖尿病发病率逐年上升，并能引发心血管疾病致死，是当今威胁人类健康的主要疾病之一。高血糖是引发各种糖尿病并发症的原因，而严格控制每天24小时的血糖浓度在正常范围是防止、延缓糖尿病后期并发症的最关键因素。
胰岛素从20世纪20年代用于治疗糖尿病以来，一直是无可替代的特效药。但是，正常人体内胰岛素的分泌是受血糖浓度调控的，一般是在进餐后30-60分钟血胰岛素浓度达到峰值，4-5小时后恢复到基础浓度，这样能够保证血糖浓度不因进餐而有大的波动。
常规胰岛素制剂在临床给药中不能模仿生理胰岛素分泌的时相性，很难有效的控制饭后的血糖升高，还有给患者带来低血糖的危险。这是因为在中性溶液中，浓度高于100nM时胰岛素以二聚体、六聚体的形式存在，而其必须解离成单体后结合专一受体发挥生理功能。这种分子间的聚合提高了胰岛素的稳定性，利于贮存和调节活性，确保能够精细、灵活地调控血糖，但给胰岛素的吸收造成很大的障碍。胰岛素制剂(0.6mM)以六聚体形式存在，注射后经过5-10万倍的稀释由六聚体转为二聚体在转为单体胰岛素方能被毛细血管吸收进入血液循环，在肌肉或皮下这种高倍的稀释是一个慢而长的过程，2-4小时只有50％的胰岛素被吸收。皮下注射胰岛素制剂后，90-120分钟后血胰岛素达到比较低的峰值，之后又不能快速降低。(Home，P.D.，et al.，Metabolism，1981，30：439；Blundall，T.，et al.，Adv.Protein Chem.，1972，26：279；Drejer，K.，Diabetes/Metabolism Reviews，1992，8：259；Insulin research group，Academia Sinica，Sci.Sin.，1974，17：779；Brange，J.Stability of insulin，1994；Brange，J.et al.，Advanced Drug Delivery Reviews，1999，35：307-335)。
在中性溶液中自聚合性质降低的胰岛素称为单体胰岛素，在给药处无须经过高倍稀释即可被迅速吸收，且缩短了给药后药物作用的时程，故而获得可用于临床的单体速效胰岛素是开发新一代治疗糖尿病药物的主要目标之一。Eli Lilly公司开发的单体胰岛素Lyspro于1996年分别在欧洲和美国用于临床，取得很好效果。皮下注射Lyspro后15分钟起效，1个小时血胰岛素浓度达到峰值，2-4小时后恢复到，饭后15分钟给Lyspro和饭前20分钟给常规胰岛素的效果相当。目前Novo公司研发的另一种单体胰岛素Aspart正处于临床研究中。(Howey，D.C.，et al.，Diabetes，1994，43：396-402；Torlone，E.et al.，Diabetologia，1994，37：713-720；Rami，B.et al.，Eur.J.Pediatr.1999，156：838-840；Vajo，Z.et al.Pharmacological reviews.2000，52：1-9)。
中国专利ZL98110912.8公开了在啤酒酵母中分泌表达单体胰岛素前体(MIP)，通过酶促转肽获得单体胰岛素的方法。该单体胰岛素的B链C端去五肽胰岛素DPI，或者B链C端去四肽胰岛素DTI(Cui，D.F.，et al.，J Pept Res，2001.57：188-92)。然而，该工艺因以下主要缺点而难以大规模生产：(1)需要化学合成小肽，如GFFY(But)Obut；(2)胰蛋白酶酶促转肽时，得率在80％以内；(3)酶促转肽后中间体需要经过强酸，如三氟乙酸(TFA)处理以脱去保护基；(4)工艺流程复杂，存在化学副反应。
此外，目前已有的单体胰岛素的免疫原性还较高，尤其是在大剂量使用，或者在不同物种间使用时(例如将人的胰岛素用于治疗狗，或者将猪的胰岛素用于人时)，会引起一定的副作用。因此缺乏适用面广，对人以及狗等宠物免疫原性都降低的单体胰岛素。
因此，本领域迫切需要开发制法简便、免疫原性低的单体胰岛素。
发明内容
本发明的目的就是提供一种制法简便、免疫原性低的单体胰岛素。
本发明的另一目的是提供含有该单体胰岛素的药物组合物。
本发明的再一目的是提供所述单体胰岛素和药物组合物的制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种胰岛素B链，具有以下氨基酸序列：
X1V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R X23X24X25X26Y27(SEQ IDNO：1)
其中，X1为Ala或不存在，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；
Y27是Lys，或Arg。
在一优选例中，Y27是Lys。
在另一优选例中，X23X24X25X26是GFFY。
在另一优选例中，X23X24X25X26Y27是GFFYK。
在本发明的第二方面，提供了一种胰岛素，它含有上述的胰岛素B链。
在一优选例中，所述胰岛素是单体胰岛素。
在另一优选例中，所述的胰岛素的结构如下：
其中，X1、X23、X24、X25、X26、Y27如上定义。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，含有本发明所述的胰岛素和药学上可接受的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种单体胰岛素表达前体，它从氨基端至羧基端分别含有本发明上述的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链。更佳地，所述连接肽为Ala-Ala-Lys。
在本发明的第五方面，提供了一种分离的DNA，该DNA编码上述的胰岛素B链、或单体胰岛素表达前体。还提供了含有所述DNA的载体，以及含有所述DNA或所述载体的宿主细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种制备胰岛素的方法，包括步骤：
(a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码单体胰岛素表达前体的DNA，从而表达出所述的单体胰岛素表达前体；
所述的前体从氨基端至羧基端分别含有胰岛素B链、连接肽(更佳地，所述连接肽为(Ala)2-5Lys)、和胰岛素A链，其中胰岛素B链具有以下氨基酸序列：
X1V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R X23X24X25X26Y27
式中，X1、X23、X24、X25、X26和Y27如上定义；
(b)分离出所述的单体胰岛素表达前体；
(c)用胰蛋白酶酶切割所述的单体胰岛素表达前体；
(d)分离出单体胰岛素。
附图说明
图1显示了单体胰岛素B27K-DTrI前体基因片段序列及其对应的氨基酸序列。
图2显示了B1A B27K-DTrI前体基因片段序列及其对应的氨基酸序列。
图3显示了(Des B1)B27K-DTrI前体基因片段序列及其对应的氨基酸序列。
图4显示了pPIC9K/MIP质粒的结构示意图。
图5显示了蛋白质浓度对层析的保留时间的影响，横坐标为蛋白质浓度，纵坐标中Kav为保留因子。
图6显示了蛋白质浓度对和峰形的影响，横坐标为蛋白质浓度，纵坐标中Fs为对称因子。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现在胰岛素B链末端添加碱性氨基酸，可以大大简化胰岛素的生产工艺，而对胰岛素活性基本无影响。同时，如果进一步将B1第一位的Phe去除或用Ala替换，则获得的单体胰岛素不仅活性基本上无影响，而且免疫原性会大幅下降。例如在Des B1或B1为Ala替代的羧端去四肽胰岛素上再添加一个碱性氨基酸后得到胰岛素类似物(Des B1)B27K-DTrI和B1AB27K-DtrI不仅具有单体胰岛素(生理pH值、较高浓度时不聚合)的性质，基本保存天然胰岛素的生物活力，而且其免疫原性明显下降。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“DOI”指B链羧端去八肽胰岛素。
如本文所用，术语“B27K-DtrI”指B链1位为Phe且27位氨基酸为赖氨酸的B链羧端去三肽胰岛素。
如本文所用，术语“B1A B27K-DtrI和(Des B1)B27K-DTrI”分别指B链第1位为Ala或不存在、且27位氨基酸为赖氨酸的B链羧端去三肽胰岛素。其基本结构如下：
X1V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R X23X24X25X26Y27(SEQ IDNO：1)
其中，X1为Ala或不存在，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；Y27是Lys，或Arg。研究已表明，胰岛素B链只要具有前25个氨基酸(从第23位起的氨基酸可以任意变化)就可具有一定活性。因此，在本发明中，第23-26位的氨基酸可以是任意氨基酸，较佳地是除了Lys，Arg和Cys之外的任何氨基酸，尤其是L型氨基酸。
如本文所用，“本发明的多肽”指B1A B27K-DtrI或(Des B1)B27K-DTrI的胰岛素、及相应的单体胰岛素表达前体(MIP)。
如本文所用，“本发明的多核苷酸”指编码本发明多肽的多核苷酸。
本发明的多肽可以是重组多肽或合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明的多核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。首先可用人工合成的方法来合成有关序列，因为胰岛素的长度较短。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明中，B1A B27K-DTrI或(Des B1)B27K-DTrI多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含B1A B27K-DTrI或(DesB1)B27K-DTrI编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
优选的用于酵母系统的表达载体包括(但并不限于)：pYES2，pYD1，pTEF1/Zeo，pYES2/GS，pPICZ，pGAPZ，pGAPZalph，pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-S1，pPIC3.5K，pPIC9K，和PAO815(都可从Invitrogen公司购得)。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS细胞等动物细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在一优选例中，本发明的B1A B27K-DTrI或(Des B1)B27K-DTrI是先以单体胰岛素表达前体形式表达，然后在经酶切处理得到B1A B27K-DTrI或(Des B1)B27K-DTrI。从氨基端至羧基端，单体胰岛素表达前体分别含有本发明的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链。连接肽没有特别限制，只要起连接作用，并且在与A链相连的氨基酸残基为Lys或Arg即可。一类连接肽例子是(Ala)2-5Lys，例如Ala-Ala-Lys。
酶切处理可以用任何切割Lys和/或Arg的酶，例如胰蛋白酶。酶切条件可根据选用的酶而变化。一种优选的酶切条件是：溶剂：0.02-0.05M Tris缓冲液，pH：7-8，底物浓度，约5mg/ml，胰蛋白酶用量，约为底物质量1/50，4-25℃，1-6小时。
MIP酶切后，用分子筛层析等方法分离酶切产物，即可获得本发明的B1AB27K-DTrI或(Des B1)B27K-DTrI。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如1-90wt％)的本发明的B1A B27K-DtrI和/或(Des B1)B27K-DTrI多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明药物组合物可用于治疗糖尿病及其并发症。使用药物组合物时，是将安全有效量的B1A B27K-DTrI或(Des B1)B27K-DTrI蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的单体胰岛素不仅可以单独使用，还可以与其他治疗糖尿病的药物(如其他胰岛素)一起使用。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的胰岛素具有强的单体性质。
(2)本发明的单体胰岛素可以由表达的单体胰岛素前体经过一步酶切得到，无需酶促转肽或体外复性处理。
(3)含有该结构的胰岛素的药物组合物用于注射以外的给药途径，有很高的生物利用度。
(4)由于将胰岛素分子中B链第1位的Phe去除或用Ala取代，大大降低了胰岛素分子的免疫原性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
表达载体的构建
毕赤酵母(P.pastoris)的密码子用法与酿酒酵母(S.cerevisiae)基本相似，但在个别氨基酸如Glu上有一定差异[Zhao，X.，Huo，K.K.and Li，Y.Y.(2000).Synonymous codon usage in Pichia pastoris Sheng Wu Gong Cheng XueBao16(3)：308-11.]。依照P.pastoris的密码子偏好性，化学合成单体胰岛素B27K-DTrI前体基因片段(图1)。
用相同方法化学合成编码B1A B27K-DTrI(图2)和(DesB1)B27K-DTrI的DNA(图3)。与S.cerevisiae相似，合适的prepro-leader有助于胰岛素前体在P.pastoris中的分泌表达，将化学合成的DNA片段克隆到pPIC9K质粒(Invitrogen公司)的EcoRI、NotI位点，形成α-Mating factor leader-EAEAYVEFK-MIP表达框架。其中富含EA的间隔肽(例如EAEAYVEFK，SEQ ID NO：9)有利于胰岛素前体的分泌，MIP为B1A B27K-DtrI前体或(Des B1)B27K-DTrI前体。获得的分别含有两种MIP片段的pPIC9K质粒(即pPIC9K/B1A B27K-DtrI或pPIC9K/(DesB1)B27K-DTrI)。为了描述方便起见，这两种质粒通称为pPIC9K/MIP(图4)。
实施例2
质粒转化和MIP表达菌株的筛选
3ug经Bgl II线性化的pPIC9K/MIP质粒电转化毕赤酵母GS115(his4)(购自NRRL，保藏号NRRL Y-15851，US6,730,499)，0.4cm电击杯，2.4KV，5.3ms，连续电击两次，转化的酵母细胞涂MD板。质粒pPIC9K/MIP经过Bgl II线性化处理后，进入酵母细胞后部分会重新环化通过单点插入整合到染色体中，得到Mut+表型转化子，另外一部分线性质粒通过取代整合到染色体中，得到Muts表型转化子，在此过程中会自发形成多拷贝插入整合。从MD板上挑取200个单克隆，分别接种到含G418为0、0.5、4mg/ml的YPD板，三块板上都长出菌落的克隆进入表型鉴定实验。用甲醇酵母表达胰岛素前体时，胰岛素前体的表达量随整合进酵母染色体的基因拷贝数的增加而增加。从200个转化子中选择得到40个抗G4184mg/ml的克隆。将抗G4184mg/ml的克隆同时接种到MD(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖)板和MM板(1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)上，在MM板上生长速度与MD板上无显著差异的克隆为Mut+表型，而在MM板上生长缓慢的克隆为Muts表型。通过MD板和MM板比照实验，40个抗G4184mg/ml的克隆中，Mut+表型占50％。因为Mut+菌株的发酵周期较短，选择Mut+菌株进行小规模发酵，选取MIP的分泌量较高的菌株。20个Mut+表型克隆分别接种到2ml YPD培养基中，30℃培养48小时，转换成含3％甲醇的YPM培养基，再培养72小时，上清用含0.5％BSA的PBS稀释后用放射免疫法测定MIP的相对含量，表达量平均为4mg/L，最高表达量为约5mg/L，用于摇瓶发酵。
实施例3
摇瓶发酵与胰岛素前体的纯化
高表达MIP酵母菌株接种到100毫升YPD培养基中，在500毫升三角瓶中30℃培养48小时，静置后细胞沉降，倾倒去上清后再加入100毫升MM培养基(含1％甲醇)，30℃继续培养96小时，每24小时补加甲醇一次，发酵完毕后离心收集发酵液。
疏水吸附柱XAD-7(购自Sigma公司)对MIP有很好的吸附能力，能够除去发酵液中的无机盐、大部分的多糖和色素以及杂蛋白。XAD-7柱经5Vc(即5倍总的柱床体积，以下同)甲醇洗涤、10Vc水平衡后，10Vc离心去细胞发酵液上柱，10Vc水、2Vc 15％乙醇含5％醋酸依次洗涤，60％乙醇含5％醋酸洗脱，280nm检测。洗脱液旋转蒸发除去乙醇和醋酸后用Sephadex G25除去色素和部分多糖，流动相为1mol/L醋酸，280nm检测。收集蛋白峰用阳离子交换柱SP-fastflow(Amersham Biosciences公司)除去多脂类等杂质(起始流动相为50mMNaAc-HCl pH4.0缓冲液，上样后用5Vc起始缓冲液洗去不吸附杂质，在15Vc内流动相中NaCl浓度从0线性增至1mol/L，280nm检测)，从而分别获得了纯度大于90％的胰岛素前体(即B1A B27K-DtrI前体和(Des B1)B27K-DTrI前体)。
实施例4
胰岛素前体的酶切
MIP分子存在4个碱性氨基酸位点，由于在一定的溶液环境中，各个位点所处分子构象不同，胰蛋白酶对其作用的动力学不一样。在非最适条件：10mg/mlMIP，溶于100mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH6.0，TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)-胰蛋白酶(W)∶MIP(W)＝1∶200，30℃水浴，观察到连接肽Ala-Ala-Lys*、间隔肽Lys*、B链27位Lys*均比B链22位Arg*更易于酶切。为了避免链22位Arg*处酶切形成DOI，而最有效地切除间隔肽和连接肽，我们考虑了反应温度、反应时间、pH值、酶与底物比例四个因素进行了正交试验，得到最优化条件为：5±4mg/ml MIP，溶于100±50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH7.5±2，TPCK-胰蛋白酶(W)∶MIP＝1∶200±150，30℃反应60分钟，酶切产率可达95％以上。酶切反应液用HAc调pH4.0终止反应后过Sp-fast flow离子交换柱除去杂蛋白(起始流动相为50mM NaAc-HCl pH4.0缓冲液，上样后用5Vc起始缓冲液洗去不吸附杂质，在20Vc内流动相中NaCl浓度从0线性增至1mol/L，280nm检测)，从而分别获得B1A B27K-DtrI和(Des B1)B27K-DtrI。
实施例5
B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI的鉴定与活性分析
B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI的C8 HPLC分析为单峰(C8反相柱(4.6×250mm)，流动相A为0.1％TFA，流动相B为含0.1％TFA的70％乙腈，梯度(30-70％B/10-40min)，流速为1ml/min)。
B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI经电喷雾质谱电喷雾质谱分析(MATLCQ ESI-MS)，电喷电压为4.25KV，毛细管温度为200℃。测出的分子量分别为5433和5362，与理论分子量相符。氨基酸组成测定结果与理论值相符。
小鼠惊厥法测定B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI的体内生物活性的测定参考中国药典1985版，方法如下：取雄性昆明小鼠，体重为27-30g，按体重随机分四组，每组24只，实验前禁食2小时。样品用盐酸调至pH值为5的生理盐水溶解，1OD280nm＝1mg/L。估计样品效价为标准品的80％，高剂量为0.09U/ml，低剂量为0.045U/ml，溶剂为盐酸调节pH为2.5的生理盐水。25℃，15分钟内每只小鼠皮下注射0.3ml，置于37℃观察90分钟，惊厥的、死亡的、使其仰卧后3秒内不能自行翻身者均认为是阳性反应。数据按质反应测定法计算。
结果表明，B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DtrI的体内生物活性均和胰岛素相当。
实施例6
B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI的单体性质测定
在中性溶液中较高浓度胰岛素聚合后形成单体、二体、六体的混合物，使用FPLC凝胶过滤法测定脱锌胰岛素的聚集性质(Superdex 75(HR10/30)柱，流动相为PBS(phosphate-buffered saline，pH7.4)，流速为0.4ml/min，上样量为0.1ml，室温，280nm检测)。随着脱锌胰岛素浓度的上升，其在Superdex 75(HR10/30)柱上的保留时间缩短、峰的不对称性增强，分别用Kav和Fs来描述这种变化，用对称因子Fs描述混合物均一度，用分配系数Kav描述混合物的平均分子量。Fs＝W0.05h/2A，其中W0.05h为在0.05峰高处的峰宽，A为0.05峰高处的前半峰宽；Kav＝(Vr-V0)/(Vc-Vo)，其中Vr为流出体积，V0为外水体积，Vc为总的柱床体积。
在上述相同的条件下，比较了脱锌胰岛素、B1A B27K-DTrI和(DesB1)B27K-DTrI的Kav、Fs随蛋白浓度而变化的情况。结果如图5和图6所示，表明B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI有显著的单体性质。
实施例7
B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI的免疫原性测定
用常规的放射免疫分析法测定样品的免疫原性，方法如下：
使用标准的试剂盒(购自上海生物制品研究所，95卫药准字R-108号)。将碘标记的胰岛素和未标记的B1A B27K-DTrI(或(Des B1)B27K-DTrI)，与一抗(豚鼠抗人胰岛素多克隆抗体)竞争性结合，通过二抗(羊抗豚鼠抗体)沉淀胰岛素-一抗复合物来测定与一抗结合的碘标胰岛素的量。样品(B1A B27K-DTrI或(DesB1)B27K-DTrI)的抗原性越强，则与一抗结合的碘标胰岛素越少。
结果表明，B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI的免疫原性明显下降，与B27K-DtrI和人胰岛素相比下降至少100％。
实施例8
药物组合物
按以下配方混合各组分，制得胰岛素B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DtrI的注射剂。
配方A
| B1A B27K-DTrI | 2g |
| 注射用水 | 1L |
| NaCl | 9g |
| 人血清白蛋白 | 5g |
配方B
| (Des B1)B27K-DtrI | 2g |
| 注射用水 | 1L |
| NaCl | 9g |
| 人血清白蛋白 | 5g |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海生物泰生命科学研究公司
<120>B链修饰的单体速效胰岛素，药物组合物及其制法
<130>043292
<160>9
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(26)
<223>Xaa＝Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Lys，Arg，Phe，Tyr，Trp，Pro，Cys，Met，His，或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝Ala或无
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(27)
<223>胰岛素B链
<400>1
Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25
<210>2
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(21)
<223>胰岛素A链
<400>2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210>3
<211>173
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(173)
<223>单体胰岛素B27K-DTrI前体编码序列
<400>3
gaattcaagt tcgtcaacca acacttgtgt ggttcccact tggtcgaggc tttgtacttg 60
gtctgtggtg aaagaggttt cttctacaag gctgctaagg gtatcgtcga acaatgttgt 120
acctccatct gctccttgta ccaattggag aactactgta actaggcggc cgc 173
<210>4
<211>51
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(51)
<223>单体胰岛素B27K-DTrI前体
<400>4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Ala Glu Val Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile
20 25 30
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
35 40 45
Tyr Cys Asn
50
<210>5
<211>173
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(173)
<223>单体胰岛素B1A B27K-DTrI前体编码序列
<400>5
gaattcaagg ctgtcaacca acacttgtgt ggttcccact tggtcgaggc tttgtacttg 60
gtctgtggtg aaagaggttt cttctacaag gctgctaagg gtatcgtcga acaatgttgt 120
acctccatct gctccttgta ccaattggag aactactgta actaggcggc cgc 1731
<210>6
<211>51
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(51)
<223>单体胰岛素B1A B27K-DTrI前体
<400>6
Ala Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Ala Glu Val Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile
20 25 30
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
35 40 45
Tyr Cys Asn
50
<210>7
<211>170
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(170)
<223>单体胰岛素(Des B1)B27K-DTrI前体编码序列
<400>7
gaattcaagg tcaaccaaca cttgtgtggt tcccacttgg tcgaggcttt gtacttggtc 60
tgtggtgaaa gaggtttctt ctacaaggct gctaagggta tcgtcgaaca atgttgtacc 120
tccatctgct ccttgtacca attggagaac tactgtaact aggcggccgc 170
<210>8
<211>50
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(50)
<223>单体胰岛素(Des B1)B27K-DTrI前体
<400>8
Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Ala Glu Val Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val
20 25 30
Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
35 40 45
Cys Asn
50
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>间隔肽
<400>9
Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Lys
1 5
Claims (10)
1.一种胰岛素B链，其特征在于，具有以下氨基酸序列：
X1VNQHLCGSHLVEALYLVCGERX23X24X25X26Y27
其中，X1为Ala或不存在，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；
Y27是Lys，或Arg。
2.如权利要求1所述的胰岛素B链，其特征在于，X23X24X25X26Y27是GFFYK。
3.一种胰岛素，其特征在于，它具有权利要求1所述的B链，并且是单体胰岛素。
4.如权利要求3所述的胰岛素，其特征在于，其结构如下：
其中，X1为Ala或不存在，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；
Y27是Lys，或Arg。
5.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求3所述的胰岛素和药学上可接受的载体。
6.一种单体胰岛素表达前体，其特征在于，从氨基端至羧基端分别含有权利要求1所述的胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链。
7.一种分离的DNA，其特征在于，它编码权利要求1所述胰岛素B链、或权利要求6所述的单体胰岛素表达前体。
8.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的DNA。
9.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的表达载体或含有权利要求7所述的DNA。
10.一种制备胰岛素的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码单体胰岛素表达前体的DNA，从而表达出所述的单体胰岛素表达前体；
所述的前体从氨基端至羧基端分别含有胰岛素B链、连接肽、和胰岛素A链，其中胰岛素B链具有以下氨基酸序列：
X1VNQHLCGSHLVEALYLVCGERX23X24X25X26Y27
式中，X1为Ala或不存在，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；Y是Lys，或Arg；
且连接肽为(Ala)2-5Lys；
(b)分离出所述的单体胰岛素表达前体；
(c)用胰蛋白酶酶切割所述的单体胰岛素表达前体；
(d)分离出单体胰岛素。
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