CN1696656A - 基于胶体晶体的生物分子检测方法 - Google Patents

Abstract

基于胶体晶体的生物大分子检测方法是用来对生物样品中进行检测的一种简单、方便的高通量检测的方法。在生物分子的检测过程中，使用胶体晶体膜作为流动载体，其检测分如下几步：第一步：光子晶体与形貌联合编码膜的制作；第二步：核酸或蛋白质探针分子的固定；第三步：目标分子的杂交；第四步：是目标分子的识别：利用光纤光谱仪确定反射光谱，利用显微镜来观察膜的形貌，然后以胶体晶体的反射谱带与光刻后的形貌的组合作为编码，从而识别生物分子的种类，根据目标分子(5)上的荧光信号来确定目标分子的存在与否。该检测方法可以广泛应用于临床诊断与检测、药物筛选，环境中微生物样品的检测、动植物育种等领域。

Description

基于胶体晶体的生物分子检测方法

技术领域

本发明是用来对生物样品中进行检测的一种简单、方便的高通量检测的方法。可以广泛应用于临床诊断与检测、药物筛选，环境中微生物样品的检测、法医鉴定、海关农产品进出口检验检疫、基因序列以及功能分析、微生物分形、动植物育种等领域。

背景技术

随着基因组时代和后基因组时代的到来，高通量的基因检测和蛋白质的检测技术已日益成为这一生命科学基础研究的基本手段和工具。高通量生物分子的平行检测能够高效率地发现新的功能基因和蛋白质组。已被广泛应用于新的功能基因的克隆，表达以及蛋白质组的研究中，而且在开发新的药物、临床检测以及动植物检疫中都有广泛的应用前景。目前在高通量生物大分子的检测中，主要依靠的是以玻璃片等为载体依靠位置编码的阵列型生物芯片和以荧光微球为流动载体液相芯片技术，但这两种技术都存在一定的缺陷，生物芯片技术虽然编码量大，但是需要昂贵的点样系统，并且杂交速度慢；而以荧光微球为载体的液相芯片技术，由于采用了动态杂交技术从而极大地提高了杂交速度。但由于技术上的问题，编码量尚待提高。在本专利中我们提出了以胶体晶体胶体晶体作为流动载体作为生物检测中大分子的身份标识，从而有望使上述问题得到解决。

胶体晶体是光子晶体的一种。胶体晶体中球形粒子的周期排列会形成光带隙结构从而控制光在其中的传播。在胶体晶体中，具有和光带隙相同频率的光无法被传播。这些入射光将被胶体晶体反射。在反射光谱上，胶体晶体的光带隙表现为一个很强的反射峰。反射峰的位置随光带隙而变化。相对于其它种类的具有三维有序结构的胶体晶体来说，胶体晶体具有制备简便，容易在大面积范围内成膜等优点。我们将利用胶体晶体的这一光学特性实现对流动载体的编码。基本原理如下：首先在不同的胶体晶体载体上修饰不同种类的探针分子，由于光带隙的位置随组成胶体晶体的球形粒子的大小而变化，因此在任何一种胶体晶体载体上固定的生物分子的种类都可以通过测定光带隙位置来确定。在检测时，将探针分子修饰过的胶体晶体载体与含荧光标记过的目标分子的检测液混合，在探针分子和目标分子反应后，探针分子的种类通过胶体晶体载体的反射光谱确定，而目标分子的存在与否则通过荧光光谱、比色、化学发光等确定。

条形码技术广泛的应用于人们的生产和生活中，条形码作为生物分子编码，使生物分子的编码制作简单，检测方式直观而又方便，降低了检测成本，已经引起了许多相关科学工作者的注意。此外，利用载体的形状也可来对生物分子进行编码。

本发明将胶体晶体膜编码与条形码技术或载体形貌结合起来，扩大胶体晶体编码的数量。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种基于胶体晶体的生物大分子检测方法，在检测时可根据胶体晶体的特征反射谱与条形码或形貌来确定探针的种类，根据杂交信号的有无来确定目标分子的存在与否。本发明杂交速度快，成本低廉，是一种简单快速的高通量生物检测方法。

技术方案：本发明的基于胶体晶体的生物大分子检测方法在生物分子的检测过程中，使用胶体晶体膜作为流动载体，其检测分如下几步：

第一步，光子晶体与形貌联合编码膜的制作：底层聚二甲基硅氧烷膜上组装有光刻后的胶体晶体膜，光刻后的胶体晶体膜上形成一定的形貌，然后在上覆盖有顶层聚二甲基硅氧烷膜；

第二步：核酸或蛋白质探针分子的固定：探针在硅烷试剂的偶联作用下，与底层聚二甲基硅氧烷膜的下表面与顶层聚二甲基硅氧烷膜上表面发生共价偶联，从而实现胶体晶膜作为流动载体与探针分子的偶合；

第三步：目标分子的杂交：核酸或蛋白样品经过纯化或扩增等处理后，标有荧光、酶等标记，然后与固定在胶体晶体膜上的探针分子杂交后，发生特异性结合，目标分子结合在探针分子上；

第四步，是目标分子的识别：利用光纤光谱仪确定反射光谱，利用显微镜来观察膜的形貌，然后以胶体晶体的反射谱带与光刻后的形貌的组合作为编码，从而识别生物分子的种类，根据目标分子上的荧光信号来确定目标分子的存在与否。光子晶体与形貌联合编码的方法是胶体晶体编码与符号或形状混合编码。胶体晶体膜的制备方法为：底层聚二甲基硅氧烷膜上组装有光刻后的胶体晶体膜，光刻后的胶体晶体膜上覆盖有顶层聚二甲基硅氧烷膜，底层聚二甲基硅氧烷膜或顶层聚二甲基硅氧烷膜被聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯替换，再进行底层聚二甲基硅氧烷膜表面亲水化处理。

底层聚二甲基硅氧烷膜上组装胶体晶体膜时，胶体晶体膜是不同直径的聚苯乙烯胶体晶体，或聚甲基丙烯酸甲酯胶体晶体，或二氧化硅胶体晶体。核酸或蛋白质探针分子的固定方法是：先用辐射接枝，紫外臭氧或等离子体处理技术，然后利用硅烷化试剂进行偶联生物分子。

底层聚二甲基硅氧烷膜表面亲水化处理是紫外臭氧产生亲水的羟基；或是紫外接枝，紫外射线引发自由基聚合反应；或是氧等离子处理，即氧气在等离子发生装置中电离，产生氧阴离子，臭氧，氧自由基等，可以使PDMS表面甲基转化为羟基，可与硅烷化试剂反应，硅烷化之后引发剂引发接枝反应。

本发明在胶体晶体膜上写入条形码、数字、字母或其他可相互区分的符号，或将胶体晶体膜切割成不同形状。利用胶体晶体的反射谱与各种符号或形状对流动载体进行混合编码。然后在载体上固定生物大分子探针，将靶物质与大分子杂交。洗脱之后，利用反射光纤光谱仪测定胶体晶体膜的特征反射光谱，利用显微镜来识别形貌编码从而识别生物探针分子。然后检测杂交到生物探针上的信号(例如荧光信号、化学发光的信号，电化学信号等)，根据杂交信号的有无来确定目标分子的存在与否。

编码载体的制备以及探针的固定与杂交：

(1)制备：按10∶1∶10的质量比将PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在玻璃基底或者硅基底上，高温固化。固化后的底层PDMS表面进行亲水化处理(紫外臭氧处理，将PDMS表面的-CH3转变为-OH基，然后利用带不饱和键的硅烷试剂与表面带有-OH基的PDMS发生水解反应，再进行接枝反应；或在紫外光下直接引发接枝反应；氧等离子体处理产生-OH基)。将某一粒径的胶体晶体[PS(聚苯乙烯)胶体晶体，PMMA胶体晶体，二氧化硅胶体晶体等]利用溶剂挥发法或者垂直提拉法自组装在PDMS膜上，形成胶体晶体膜。利用溶剂挥发法或者垂直提拉法自组装在PDMS膜上，形成胶体晶体膜。将胶体晶体膜进行激光刻蚀，刻出不同的条形码、其他符号或刻成不同的形状。然后按5∶1∶5的比例将PDMS前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在胶体晶体膜上，静置过夜，然后将其固化，形成顶层PDMS膜。

(2)探针的固定：双层胶体晶体膜的固定方法如下：方案1：紫外臭氧或氧等离子体处理PDMS膜，APTES(三乙氧基氨丙基硅烷)与PDMS膜反应，通过戊二醛将氨基修饰的核酸探针或抗原、抗体结合在PDMS膜上。方案2：紫外接枝丙稀酸或丙稀氰(氰基水解之后变成羧基)，利用NHS活化羧基之后，然后再用EDC(碳二亚氨)作为偶联剂将带氨基的探针分子与胶体晶体膜相连接。

(3)目标分子的杂交：经提纯、扩增后并有可识别标记的目标分子与固定在不同膜上的不同探针分子混合后，震荡加速杂交。

(4)检测.利用反射光谱仪检测胶体晶体膜的反射光谱，利用显微镜来观察图形，两者结合确定来确定探针分子的种类。利用荧光显微镜或者分光光度记分别检测荧光标记或化学发光标记的目标分子，然后根据信号的有无来确定目标分子的存在与否。

有益效果：本发明利用胶体晶体对生物分子进行编码，从而能够实现目标分子检测时的动态杂交反应，该方法简单易行。

1、条行码或其他符号和形状与胶体晶体混合编码膜替代荧光微球进行编码降低了编码物质的制作成本，并且简化了检测仪器，降低了检测成本。

2.胶体晶体和图形的混合编码膜编码相比较于荧光微球编码而言性质稳定。

3.混合编码膜，理论上可编码上万种生物分子，而荧光微球目前只能编码上百种生物分子。

4.混合编码膜作为流动载体的一种，与平板芯片相比较，能加快杂交反应速度，从而提高检测的效率。

附图说明

图1是形貌编码与胶体晶体混合编码膜的制备流程图以及以及探针固定与杂交后的结构图。

图2是形貌编码与胶体晶体条形码联合编码的几种形式的示意图。

以上图形有底层PDMS1，胶体晶体膜2，顶层PDMS膜3，探针4，目标分子5。

具体实施方式

图1是形貌编码与胶体晶体混合编码膜的制备流程图以及以及探针固定与杂交后的结构图。第一步是底层PDMS1在玻璃片或者硅片上的灌注，固化后，从玻璃片上剥离下来，第二步是底层PDMS1的亲水化处理，第三步是胶体晶体膜在亲水化的底层PDMS1，第四步是光刻形成具有特定形貌的胶体晶体膜2，第5步是顶层PDMS膜3的形成，第六步是在底层PDMS膜1的下表面和顶层PDMS膜3的上表面固定探针4，第七步是目标分子5与探针分子的杂交。

图2是形貌编码与胶体晶体条形码联合编码的几种形式。形貌编码可以是条形码，阿拉伯数字，英文字母，各种图形以及不同形状的膜。形貌编码与胶体晶体条形码联合编码可以是条形码，阿拉伯数字，英文字母，各种图形以及不同形状的膜中的任何一种与胶体晶体编码的组合，也可以是形貌编码中两种形式或多种形式之间的任意组合与胶体晶体的编码。

形貌编码与胶体晶体混合编码膜制备以及探针的固定与杂交见图1。

(I)制备：按10∶1∶10的比例将PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在玻璃基底或者硅基底上，高温固化。固化后的底层PDMS膜1表面进行亲水化处理(紫外臭氧处理，然后利用带不饱和键的硅烷试剂处理，再进行接枝反应；或在紫外光下直接引发接枝反应；氧等离子体处理)。将某一粒径的胶体晶体(PS(聚苯乙烯)胶体晶体，PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)胶体晶体，二氧化硅胶体晶体等)利用溶剂挥发法或者垂直提拉法自组装在PDMS膜上，形成胶体晶体膜，将胶体晶体膜进行激光刻蚀，刻出不同的条形码，符号或形状，形成图形编码2。然后按5∶1∶5的比例将PDMS前聚体、固化剂、正己烷混合在一起，灌注在胶体晶体膜上，静置过夜，然后将其固化，形成顶层PDMS膜3。

(II)探针的固定：双层胶体晶体膜的固定方法如下：紫外臭氧或等离子体处理PDMS膜，APTES与PDMS膜反应，通过戊二醛将探针4(氨基修饰的核酸或抗原、抗体)结合在底层PDMS膜1的下表面与顶层PDMS膜3的上表面上.

(III)目标分子的杂交：经提纯、扩增后并有可识别标记的目标分子5与固定在不同膜上的不同探针分子4混合后，震荡加速杂交。

(IV)检测.利用反射光谱仪检测胶体晶体膜的反射光谱，利用显微镜来观察图形，两者结合确定来确定探针分子的种类。利用荧光显微镜或者分光光度记分别检测荧光标记或化学发光标记的目标分子，然后根据信号的有无来确定目标分子的存在与否。

Claims (6)

1.一种基于胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于在生物分子的检测过程中，使用胶体晶体膜作为流动载体，其检测分如下几步：

第一步，光子晶体与形貌联合编码膜的制作：底层聚二甲基硅氧烷膜(1)上组装有光刻后的胶体晶体膜(2)，光刻后的胶体晶体膜(2)上形成一定的形貌，然后在上覆盖有顶层聚二甲基硅氧烷膜(3)；

第二步：核酸或蛋白质探针分子的固定：探针(4)在硅烷试剂的偶联作用下，与底层聚二甲基硅氧烷膜(1)的下表面与顶层聚二甲基硅氧烷膜(3)上表面发生共价偶联，从而实现胶体晶膜作为流动载体与探针分子的偶合；

第三步：目标分子的杂交：核酸或蛋白样品经过纯化或扩增等处理后，标有荧光、酶等标记，然后与固定在胶体晶体膜上的探针分子杂交后，发生特异性结合，目标分子(5)结合在探针分子(4)上；

第四步，是目标分子的识别：利用光纤光谱仪确定反射光谱，利用显微镜来观察膜的形貌，然后以胶体晶体的反射谱带与光刻后的形貌的组合作为编码，从而识别生物分子的种类，根据目标分子(5)上的荧光信号来确定目标分子的存在与否。

2、如权利要求1所述的基于胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于光子晶体与形貌联合编码的方法是胶体晶体编码与符号或形状混合编码。

3、如权利要求1所述的基于胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于，胶体晶体膜的制备方法为：底层聚二甲基硅氧烷膜(1)上组装有光刻后的胶体晶体膜(2)，光刻后的胶体晶体膜(2)上覆盖有顶层聚二甲基硅氧烷膜(3)，底层聚二甲基硅氧烷膜(1)或顶层聚二甲基硅氧烷膜(3)被聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯替换，再进行底层聚二甲基硅氧烷膜(1)表面亲水化处理。

4、如权利要求1所述的基于胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于，底层聚二甲基硅氧烷膜(1)上组装胶体晶体膜(2)时，胶体晶体膜(2)是不同直径的聚苯乙烯胶体晶体，或聚甲基丙烯酸甲酯胶体晶体，或二氧化硅胶体晶体。

5、如权利要求1所述的基于胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于核酸或蛋白质探针分子的固定方法是：先用辐射接枝，紫外臭氧或等离子体处理技术，然后利用硅烷化试剂进行偶联生物分子。

6、如权利要求3所述的基于胶体晶体的生物大分子检测方法，其特征在于底层聚二甲基硅氧烷膜(1)表面亲水化处理是紫外臭氧产生亲水的羟基；或是紫外接枝，紫外射线引发自由基聚合反应；或是氧等离子处理，等离子处理后聚合物表面产生亲水的羟基，可与硅烷化试剂反应，硅烷化之后引发剂引发接枝反应。