CN1710104A - 基于微球载体的阵列式生物芯片及其编码解码方法 - Google Patents

Abstract

基于微球载体的阵列式生物芯片及其编码解码方法是一种对生物样品进行核酸检测的一种简单、方便的高通量检测的方法，该芯片由微球载体(2)，聚二甲基硅氧烷层(3)，玻璃片(4)，编码分子(5)，核酸或蛋白质探针分子(6)几部分构成；微球载体为有序排列，并由聚二甲基硅氧烷层(3)固定在玻璃片上，编码分子与核酸或蛋白质探针分子(6)共价偶连到微球载体上。编码解码方法是利用作为微球载体的珠光染料，或荧光微球，或磁性球粒子同一物理性不同的两种状态，与粒子上的编码序列杂交信号有无的特性，形成一个特异的二进制数，从而为粒子编码；最后，样品中靶分子的存在与否利用其与探针序列杂交信号的有无来确定。

Description

基于微球载体的阵列式生物芯片及其编码解码方法

技术领域

本发明是一种对生物样品进行核酸检测的一种简单、方便的高通量检测的一种基因芯片及其芯片的编码解码方法。

背景技术

核酸是生物体内的遗传物质，是遗传信息的携带者，具有种属特异性，生物体内的生理现象和病理现象都直接或间接与基因相关。因此基因的检测广泛应用于科学研究和临床诊断以及众多的生物种与个体鉴定中，是上述领域的基础工具。由于各种基因的功能是休戚相关的，因此高通量的基因检测技术的开发意义深远。在现有的高通量的基因检测技术中主要是以位置编码的以玻片等为载体的阵列式生物芯片和以荧光微球为载体并以荧光为编码方式的液相生物芯片技术。但这两种方法都存在着一定的缺陷，前者虽然编码量大，但是检测速度慢，并且需要昂贵的精密点样装置；后者虽然杂交速度快，但是受编码量小，只能编码上百种基因，所以在应用上受到了限制。在高通量的检测技术中主要还是以位置编码的阵列式生物芯片为主，但是这重技术需要昂贵的点样装置。针对上述问题，lumnix公司开发出了一种方便低成本的阵列式生物芯片。其基本原理是，以2微米的玻璃珠为载体，在其上预先合成出若干段特异性的寡核苷酸作为每个核酸的编码序列，然后再在编码序列上继续延伸，合成靶分子的特异性探针。检测的时候利用与编码序列互补的标记有应荧光物质的核酸片段作为寻码序列，根据其与若干编码序列杂交后的荧光信号的有无形成一个二进制的数字，每个玻璃珠载体对应一个特异的二进制的数字，此数字对应于同一个玻璃珠上的探针作为其编码。目标信号的有无则根据靶分子与特异探针序列的荧光信号的有无来确定。该技术主要有两个特，一是以若干寡核苷片段作为识别目标信号身份的编码，二是在其检测的时候需将合成有编码序列和目标序列的玻璃珠载体固定在在末梢刻有微槽的光纤上，然后再进行荧光信号的检测。该技术简单，编码量大，但是每个微球需对应于一个光纤，成本上千个微小的球则需成百上千个微光纤，不能直接用常规的芯片实验室的现有检测仪器检测，增加了额外的成本。开发一种能够将微球载体固定在玻璃片等平板上的技术则能够将此编码方式和常规的芯片实验室的检测仪器结合起来，以降低该编码方式应用成本则具有实用价值。

自组装技术常见于胶体晶体的形成，该技术主适用于粒径在亚微米与几个微米的单分散球形成三维有序结构。而粒径在几十微米到几百微米的单分散微球自组装形成二维有序结构则主要利用粒子在重力场中的作用和磁性粒子在磁场中的作用将微球限制在刻蚀有二维有序结构的摸板中而形成。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种基于微球载体的阵列式生物芯片及其编码解码方法，本发明能采用核酸序列编码和微球光学性质二元编码的生物芯片，利用自组装的方法将微球有序排列并固定在玻璃片等平板上，直接利用扫描仪进行检测。本发明的芯片编码量高，灵敏度高，不需用点样系统，降低了芯片的制作成本。

技术方案：本发明的基于微球载体的阵列式生物芯片是二元编码微球阵列式生物芯片利用模板诱导的自组装方法在片面上形成并固定粒子的二维周期阵列，有机的与基因扫描仪检测结合起来。本发明采用二元编码，即利用微球载体本身的物理性质(光学性质，电磁学性质等)与核酸序列混合编码的方式。

基于微球载体的阵列式生物芯片由微球载体，聚二甲基硅氧烷层，玻璃片，编码分子，核酸或蛋白质探针分子几部分构成；各微球载体之间的距离相等，并由聚二甲基硅氧烷层固定在玻璃片上，编码分子与核酸或蛋白质探针分子共价偶连到微球载体上。微球载体的材料为珠光染料，或荧光微球，或磁性球。

基于微球载体的阵列式生物芯片的编码解码方法中，利用作为微球载体的珠光染料，或荧光微球，或磁性球粒子同一物理性不同的两种状态(荧光信号的有无或强弱，磁通量的有无或强弱)，与粒子上的编码序列杂交信号有无的特性，形成一个特异的二进制数，从而为粒子编码，并且其编码量是单纯的核酸序列编码量的两倍；在解码的时候先检测出粒子本身的两种物理状态，形成编码数字的第一位，再利用解码序列与编码序列杂交信号确定编码数字的第2位与最后一位数字；最后，样品中靶分子的存在与否利用其与探针序列杂交信号的有无来确定。编码的方法是采用珠光染料，或荧光微球，或磁性球微球载体和几段十几个碱基长度的核酸序列作为编码分子进行混合编码。

解码的时候利用微球载体检测仪解读微球载体的两种物理状态，用反射光谱或荧光光谱形成编码数字的第一位数字，而后在解码分子与若干编码分子的杂交作用下，根据杂交信号的有无形成2进制编码数字的第二位数和最后一位数，从而形成一个编码数字对核酸或蛋白质探针分子进行解码。

自组装用的模板由微加工而成。在其上可加工微坑道组成的有序结构，或者是由截面成v形或矩形的微沟槽排列成的有序结构。然后将单分散的珠光微球、荧光微球，磁性粒子等散布其上，然后将其振荡，在重力作用下这些单分散的微球将会有序填充到微坑或微沟槽中，然后抖掉没有填充的粒子。将涂有PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚物的平板或者涂有熔融的PS(聚苯乙烯)的平板压印填充粒子有序结构的摸板，将有序结构转引到平板上，然后高分子聚合将其粒子的二维有序结构固定在平板上，以利于后续的解码与目标分子的杂交检测。

微球载体可以是珠光染料，荧光微球，磁性球等。珠光染料有特征反射峰，荧光微球在激发波长下有特征发射峰，磁性微球在磁性大小不一样。利用粒子同一物理性不同的两种状态(荧光信号的有无或强弱，磁通量的有无或强弱，与粒子上的编码序列杂交信号有无的特性，同样可以形成一个特异的二进制数，从而为粒子编码，并且其编码量是单纯的核酸序列编码量的两倍；如果与单纯核酸序列编码方式同样的编码量，则其编码序列可以少一段，并且在解码的时候其杂交次数可以少一次。

有益效果：本发明实现了单分散微球在平板上的二维有序排列(每个微球之间的距离一定)(每个微球之间的距离一定)与固定，并且利用粒子的物理性质与核酸序列的混合编码来标识探针序列的身份，同时利用核酸或蛋白质探针分子来特异性的识别目标分子的存在与否。

本发明的特点在于：

1)、本发明利用粒子自组装技术在摸板上形成有序结构，并将其复制并固定到平板上，不需昂贵的点样装置，降低了芯片的制作成本。

2)、粒子的物理性质与核酸序列混合编码，想比单纯的核酸序列编码，其编码辆扩大了两倍。如果采用相同的编码量，则解码的时候少一次杂交，提高了效率。

3)、灵敏度提高：由于采用了粒子作为探针载体，载体比表面积大，本芯片能够提高检测的灵敏度。

本发明可以广泛应用于临床诊断与检测、药物筛选，环境中微生物样品的检测、法医鉴定、海关农产品进出口检验检疫、基因序列以及功能分析、微生物分形、动植物育种等领域。

附图说明

图1是本发明模板诱导单分散微球自组装成二维有序序列并固定在平板上的原理示意图。图1a为刻有微槽或微坑道的模板诱导微球自组装成二维有序序列后的剖视图。图1b为涂有PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚合物或熔融的PS(聚苯乙烯)的玻片压印在在模板上排列的二维微球阵列。图1c为将二维微球阵列转移并固定在玻璃片上。

图2是本发明在玻璃平上形成的两种二维有序阵列。图2a是以有序排列(每个微球之间的距离一定)的微槽为模板形成线状阵列模板并且固定在玻璃片上后的俯视图。图2b是以微坑道为模板组装成微球阵列后转移并固定在模板上后形成的周期结构的俯视图。

图3是本发明的二元编码方式以及解码、靶分子物质的检测原理。图3a是微球物理性质与核酸序列混合编码的示意图。图3b是解码示意图。图3c是目标信号的检测是示意图。

以上的图中有：模板1，微球载体2，聚二甲基硅氧烷层3，玻璃片4，编码分子5，核酸或蛋白质探针分子6，解码分子7，微球载体检测仪8，靶分子9。

具体实施方式

本发明的二元编码微球自组装阵列式生物芯片的制作以及检测由四个步骤作成：(1)微球载体表面改性以及原位合成编码序列和探针序列；(2)微球载体在膜板上的自组装以及自组装有序微球阵列转移并且固定到玻璃板上.(3)解码：依靠微球物理性质的两个不同状态以及解码分子与编码序列杂交信号的有无形成一组2进制的数字，为每个微球上的探针标识身份。(4)目标分子与微球上的探针进行杂交反映，根据杂交信号确定目标分子的信息。

具体制备流程如下：

微球载体2可以是珠光光染料，荧光微球，磁性微求等，本发明中，不同材料的微球只需要其同一物理性质的两种状态(荧光信号的有无或强弱，磁通量的有无或强弱作为编码用。在微球自组装之前，需先根据材料的不同性质对其表面进行改性，最终使材料的末端接出一个还有主链较长，末端带有氨基，羟基活性集团；根据设计好的序列在微球载体上固相亚磷酰胺三酯法合成出编码序列5和探针序列6。

微球载体2有序结构的转移和固定如图1所示：

将合成有编码序列5和探针序列6的微球载体2转移到模板1上，模板1上刻有微坑道或者微槽的有序列结构，采用将微球载体2进行震荡，在重力场或者磁场(磁性微球)的作用下，微球载体被有序排列(每个微球之间的距离一定)(每个微球之间的距离一定)在模板1上的微坑道或着微槽上。将PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚体或者融溶的PS(聚苯乙烯)涂在玻璃板4成厚度小于微球直径的PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚体或者融溶的PS(聚苯乙烯)层3，而后将玻璃板4压到有序排列(每个微球之间的距离一定)(每个微球之间的距离一定)的微球载体2上，在PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚体或者融溶的PS(聚苯乙烯)层3的黏附作用下，微球载体2的有序结构被转移到玻璃板4上，然后PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚体或者融溶的PS(聚苯乙烯)层固化，将微球载体2的有序结构固定在玻璃板上4上。不同的模板1形成不同的有序结构若模板1刻有有序排列(每个微球之间的距离一定)的微坑道，则形成间隔排列的微球载体2阵列，如图2b；若模板1刻有微槽，则形成线装的有序排列(每个微球之间的距离一定)，如图2a所示。

解码过程分两步进行，先是微球载体2的解码，用微球检测仪器8(光纤光谱仪)解读微球载体2的两种物理状态，用反射光谱(珠光)或荧光光谱(荧光微球)形成编码数字的第一位数字。而后在解码分子7与若干编码分子5的杂交作用下，根据杂交信号的有无形成2进制编码数字的第二位数和最后一位数，如图3b所示。

目标物质信息的解读如图3c所示，根据靶分子9与核酸或蛋白质探针分子6杂交杂交的信号的有无以及强弱来判断目标物质的信息。

Claims (5)

1、一种基于微球载体的阵列式生物芯片，其特征在于该阵列式生物芯片由微球载体(2)，聚二甲基硅氧烷层(3)，玻璃片(4)，编码分子(5)，核酸或蛋白质探针分子(6)几部分构成；各微球载体(2)之间的距离相等，并由聚二甲基硅氧烷层(3)固定在玻璃片(4)上，编码分子(5)与核酸或蛋白质探针分子(6)共价偶连到微球载体(2)上。

2、根据权利要求1所述的基于微球载体的阵列式生物芯片，其特征在于微球载体(2)的材料为珠光染料，或荧光微球，或磁性球。

3、一种如权利要求1所述的基于微球载体的阵列式生物芯片的编码解码方法，其特征在于利用作为微球载体的珠光染料，或荧光微球，或磁性球粒子同一物理性不同的两种状态，与粒子上的编码序列杂交信号有无的特性，形成一个特异的二进制数，从而为粒子编码，并且其编码量是单纯的核酸序列编码量的两倍；在解码的时候先检测出粒子本身的两种物理状态，形成编码数字的第一位，再利用解码序列与编码序列杂交信号确定编码数字的第2位与最后一位数字；最后，样品中靶分子的存在与否利用其与探针序列杂交信号的有无来确定。

4、根据权利要求3所述的基于微球载体的阵列式生物芯片的编码解码方法，其特征在于编码的方法是采用珠光染料，或荧光微球，或磁性球微球载体(2)和几段十几个碱基长度的核酸序列作为编码分子(5)来进行混合编码。

5、根据权利要求3所述的基于微球载体的阵列式生物芯片的编码解码方法，其特征在于解码的时候利用微球载体检测仪(8)解读微球载体(2)的两种物理状态，用反射光谱或荧光光谱形成编码数字的第一位数字，而后在解码分子(7)与若干编码分子(5)的杂交作用下，根据杂交信号的有无形成2进制编码数字的第二位数和最后一位数，从而形成一个编码数字对核酸或蛋白质探针分子(6)进行解码。

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