CN1680431A - 一种人亲和素蛋白的晶体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及晶体生长领域，具体的说本发明提供了一种亲和素蛋白的晶体及其制备方法。本发明通过基因工程的方法表达了亲和素蛋白CYPJ并培养制备了单晶。本发明的hCyPJ晶体不但可以用于精确解析CyPJ蛋白的结构，还阐明了它的活性位点。将活性位点所在区域作为药物靶点，针对这些活性位点设计药物，可以高效准确的设计出所需药物。因此，鉴于亲和素蛋白CYPJ对免疫系统的作用，本发明的亲和素蛋白CYPJ晶体及其结构对于了解CyPJ蛋白的生物学功能及发现新药具有重要的指导意义。

Description

一种人亲和素蛋白的晶体及其制备方法

技术领域

本发明涉及晶体生长领域，具体的说本发明提供了一种亲和素蛋白的晶体及其制备方法。

背景技术

亲和素蛋白(Cyclophilins，CyPs)是一类高度保守、普遍存在肽基——脯氨酰顺反异构酶活性(PPIase)的家族，它与FK560结合蛋白和parvulins共同组成了亲免素超家族(Biotechnologia(InPolish)3，135-152；Acta Pharm.45，413-420；Cell.Mol.Life Sci.55，423-436)。尽管这三种蛋白质在序列上互不关联，在结构上也不相同，但他们都具有PPIase活性，都可以催化单肽或蛋白质中脯氨酸酰亚胺肽键的顺反异构化，从而加速细胞周期蛋白质合成过程中蛋白质的折叠。CyPs作为免疫抑制药物环胞霉素A(cyclosporin A，CsA)的特异性受体，暗示他们具有多种生物学功能，例如调节细胞周期和信号转导。已有报道，一种人的CyP蛋白可结合HIV-1中的一种蛋白质，具有潜在的引起HIV感染的作用。

CyPs广泛分布于从微生物到乳动物的各类物种中。Cyclophilin A(CyPA)是首先从牛的胸腺细胞中发现的CyP家族中第一个成员，并验证它具有PPIase活性(Science，226，544-547；Nature 337，473-478)。重组人T细胞的cyclophilin A(hCyPA)的三维结构及它与CsA、四肽及一些二肽形成的复合物的三维结构已有报道(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88，9483-9487；J.Mol.Biol.228，539-550；J.Mol.Biol.234，1119-1130.；Nature，353，276-279；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，3324-3328；Biochemistry，35，7362-7368)。CyPA与HIV相关蛋白质的复合物的结构也已报道(Cell，87，1285-1294；Structure 5，139-146)。CyP家族的其他成员与CyPA具有序列同源性及三维结构类似的特性(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，11850-11854；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，5183-5186；J.Mol.Biol.331，45-56)。

CyPs催化肽基——脯氨酰键顺—反互变具有几种不同的机制(Zhao & Ke，1996)。但是，每一种机制只能解释实验中的部分结果，各种催化机理仍然具有相互矛盾的方面(J.Mol.Biol.298，123-133；Nat.Struct.Biol.10，475-481)。因此，了解CyP家族中更多成员的空间结构，将有助于我们解释CyP的功能及作用机理。

CyPJ是CyP家族的新成员，CYP-J cDNA长1.25Kb，编码161个氨基酸，已从人的胎脑cDNA文库中分离并鉴定(Cytogenet.Cell Genet.92，231-236)。在氨基酸序列上与线虫(C.elegans.)10具有72％的同源性。其具体核苷酸和氨基酸序列分别见SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种人亲和素蛋白的晶体。

本发明的另一个目的是提供一种人亲和素蛋白晶体的制备方法。

本发明提供了一种人亲和素蛋白的晶体结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，该亲和素蛋白结构中含有四个α-螺旋结构和一个β-圆筒结构；β-圆筒结构由8个反平行β-链组成；第十七位苯丙氨酸到第二十一位苏氨酸片段形成一个短螺旋H1，由第二十位精氨酸和第二十一位苏氨酸的氨基酸残基中的氮原子与第十七位苯丙氨酸的羰基氧原子之间的氢键形成；紧跟H1是短螺旋H2，开始于Pro22；短螺旋H2和短螺旋H4是标准的α-螺旋结构，分别分布在β-圆筒结构的底部和上部；一小段3₁₀螺旋-H3位于β-圆筒结构的另一侧。

本发明的亲和素蛋白结构中第八位天冬氨酸到第九位缬氨酸、第三十二位半胱氨酸到第三十五位天冬酰氨、第七十三位天冬氨酸到第七十九位亮氨酸及第一百三十五位脯氨酸到第一百四十五位天冬酰胺均分布于蛋白分子表面，第八位天冬氨酸和第九位缬氨酸直接相互连接；第三十二位半胱氨酸到第三十五位天冬酰胺、第七十三位天冬氨酸到第七十九位亮氨酸片段中各有一个β-拐角；第一百三十五位脯氨酸到第一百四十五位天冬酰胺片段含有三个氢键，形成一个大的环形结构，这三个氢键分别由第一百三十五位脯氨酸到第一百四十五位天冬酰胺的氧原子到第一百四十四位亮氨酸的氮原子、第一百三十七位天冬酰氨的氮原子到一百四十二位精氨酸的氧原子和第一百三十七位天冬酰胺的氧原子到一百四十一位酪氨酸的氮原子形成。

在本发明的一个实施例中，hCyPJ晶体结构的分辨率为2.6，R因子和R_free分别为17.5％和23.6％。统计结果见表1。

一级结构如图1所示，hCyPJ与hCyPA及hCyP家族中已报道空间结构的其他有代表性成员的序列同源性对比。hCyPA的具体核苷酸和氨基酸序列分别见SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4。CyPJ与CyPA有50％的同源性，与hCyPB、鼠的CyPC和hCyPH的同源性可达45-57％。每一个不对称单位有一个hCyPJ分子，包括160个氨基酸和26个溶剂分子，C-端和Glu161电子密度低，而无法确定。每一个hCyPJ分子中有一个二硫键，由Cys18和Cys25形成。

二级结构见图1和图2。其二级结构类似于其他CyPs。每一个hCyPJ分子含有四个α-螺旋结构和一个β-圆筒结构。β-圆筒结构由8个反平行β-链组成，按顺时针方向排列分别为β1、β2、β7、β5、β6、β4、β3、β8。Phe17-Thr21片段形成一个短螺旋-H1，由Arg20和Thr21的氨基酸残基中的N原子与Phe17的羰基O原子之间的H键形成。紧跟H1是H2，开始于Pro22。H2和H4是标准的α-螺旋结构，分别分布在β-圆筒结构的底部和上部；一小段310螺旋-H3位于β-圆筒结构的另一侧(见图2)。

hCyPJ的三级结构与hCyPA的三级结构类似，二者结构之间Cα原子的rms偏差为1.8。另外，hCyPJ的N-端稍短，C-端较长，它的结构中Asp8-Val9、Cys32-Asn35、Asp73-Leu79及Pro135-Asn145片段与CyPA相比，结构上有明显的不同；所有上述片段在一级序列上均有缺失或插入(见图1)，这些片段均分布于分子表面。在hCyPJ中由于5号残基缺失，使其Asp8和Val9直接相互连接，而CyPA中则形成一个loop。hCyPJ的Cys32-Asn35及Asp73-Leu79片段中各有一个β-拐角。Pro135-Asn145片段含有三个氢键，形成一个大的loop，这三个氢键分别由Pro135的氧原子-Leu144的氮原子、Asn137的氮原子-Arg142的氧原子和Asn137的氧原子-Tyr141的氮原子形成。CyPJ的这些片段的特性在结构上与CyPA完全不同，也不同于其他CyPs，推测CyPJ具有特殊的功能，例如：它可能减轻Calcineurin的抑制作用。

关于hCyPJ的活性位点，有报道hCyPA-CsA复合物结构中，Wat18水分子扮演着一个非常重要的作用，与His54和Glu63两个活性位点的氨基酸残基形成氢键(Mikol et al.，1993)。根据序列同源形比较(图1)，hCyPJ的这两个氨基酸残基相应的为His43和Glu52。因此，His43和Glu52推测为hCyPJ的活性位点。在hCyPJ结构中发现Wat226水分子靠近这两个氨基酸残基(图4a及图4b)，它是hCyPJ结构中一个保守的水分子，当hCyPA与hCyPJ的结构叠合后，发现hCyPJ中的Wat226水分子与hCyPA-CsA复合物中Wat18水分子偏离大约1(见图4b)。尽管Wat226水分子的位置在分辨率2.6的晶体结构中不是十分准确，但可以推测Wat226水分子在hCyPJ与底物结合过程中对于His43和Glu52两个活性位点的靠近起一个催化作用。

                  表1  晶体及精细结晶数据统计

		数据集1	数据集2
				空间群		P3121	P3121
晶胞参数()	a，b	41.31	41.32
				c	172.05	172.12
	每一非称单位中的分子数		1				1
Matthews常数(3/Da)a				2.35	2.35
		分辨率()				3.0	2.6
单一衍射数目				4536	5560
		数据完整性(％)				96.7(93.6)b	95.9(92.4)b
Rmerge(％)c				10.7(39.4)b	8.4(37.2)b
		性噪比大于3σ(I)点的含量(％)				77.1(44.6)b	84.9(67.8)b
氨基酸残基数					160
		溶剂分子数					26
R-因子(％)					17.5(24.8)b
		Rfree(％)					23.6(36.4)b
Rmsdd	键长()				0.0061
		键角(°)				1.2
	Dihedrals(°)				25.0
		非正常(°)				0.68
	平均温度因子(2)			主链			26.3
侧链			28.5
				溶剂		27.4
Ramachandran区的氨基酸残基数(％)e		最合理区域					83.8
	中等合理区域				15.4
		一般合理区域				0.7
	平均原子坐标误差()f						0.26

注：

^a指每单位蛋白分子所占用的容积量(Matthews，1968)

^b圆括号中的数值对应于分辨率最高的数据区段，如数据集1中的3.11-3.00和数据集2中的2.69-2.60。

^cR_merge的计算公式是R_merge＝SUM[ABS(I-<I>)]/SUM(I)。

^dRmsd，即Root-mean-square-deviation，指平均方差根。

^e用PROCHECK计算(Morris et al，1992)。

^f由Luzzati区段得出(Luzzati，1952)。

数据完整性(Data completeness)一般来说大于95％即说明晶体制备较好。

平均温度因子(Mean temperature Factor)用于显示晶体中分子振动强弱。

晶体结构主要用R_merge、R-因子(R-factor)、R_free评价其准确度。其中，R-因子值在20％左右晶体结构就比较合理和准确。

本发明还提供了上述CyPJ蛋白晶体的制备方法，即将序列如SEQ ID NO 1所示的亲和素蛋白配制成浓度为10-20mg/ml的溶液，溶剂是含有重量体积比为15-25％的PEG8000、2-8％的二甲基亚砜、pH为7.9-8.1的缓冲液；15-25℃培养晶体生长5-8天后，将晶体切割成小粒作为晶种；每个晶种冲洗后接种于预先平衡好的新鲜悬滴液中，用于晶体生长的槽液中PEG8000的浓度降为13-15％，2-5％二甲基亚砜、pH为7.4-8.1；10-25℃培养晶体生长5-10天即得权利要求1所述的亲和素蛋白晶体。

进一步改善晶体培养的条件，可以将槽液中二甲基亚砜的浓度提高为4-8％，pH改为7.2-7.8。

在本发明的一个实施例中，采用下述方法得到本发明的CyPJ蛋白晶体：

(1)CyPJ基因的克隆

CyPJ基因通过PCR方法进行扩增，扩增引物分别为：CEA(5’-ATA AGA ATGCGG CCG CTC TGT GAC ACT GCA TAA-3’)和CEB(5’-ATC GCT CGA GCT GAGCAA ATG GGT TGG CAT)。这两个PCR引物含有NotI和XhoI限制性酶切位点，可以直接亚克隆到pTXB1载体(NewEngland Biolab)的多克隆位点中。在Mxeintein/Chitin结合域的上游插入CyPJ的cDNA阅读框构建CyPJ的报告基因重组质粒，由IPTG诱导的T7启动子控制融合基因的表达。PCR产物随后用NotI和XhoI酶切、凝胶纯化、然后与同样酶切过的pTXB1载体连接、测序。然后将CyPJ重组质粒转入E.coli ER2566(NewEngland Biolab)中。

(2)hCyPJ的表达与纯化

CyPJ重组体在22℃、0.2mM IPTG诱导下，培养20小时后，离心、收菌。CyPJ蛋白的纯化根据Chintin Beads系统的标准操作程序进行。首先，将超声破菌、离心后得到的CyPJ融合蛋白的上清液在4℃以0.6ml/min的流速过柱，以大于10倍柱体的洗脱缓冲液(20nM HEPES(pH8.0)500mM NaCl，0.1mMEDTA，0.1％Triton-X100)洗去吸附在柱子上的杂蛋白；然后，以3倍柱体积的新鲜配制的缓冲液(20mM HEPES，50mM NaCl，0.1mM EDTA，30mM DTT，pH8.0)快速洗脱柱子，随后将柱子放于4℃，过夜。最后，用3倍柱体的缓冲液(20mMHEPES，50mM NaCl，0.1mM EDTA，pH8.0)洗脱柱子，收集CyPJ蛋白。纯化的蛋白加入20mM的NH₄HCO₃用Milipore 10000离心管离心3次，立即将处理后的蛋白放于-70℃冷冻过夜。然后在冷冻干燥机上冷冻干燥得到蛋白冻干粉，将其储存于4℃冰箱中备用。

(3)晶体培养

hCyPJ晶体在20℃通过接种技术培养的。hCyPJ的晶体培养采用了悬滴式汽相扩散法：蛋白质浓度为10mg/ml，与槽液(0.1M Tris-HCl(pH8.0)，17-20％PEG8000(w/v)，3％DMSO)以1∶1混合。培养一周，将晶体切割成小粒作为晶种。每个晶种冲洗后接种于预先平衡好的新鲜悬滴液中。用于晶体生长的槽液的组成类似于上述提到的池液组成，只是PEG8000的浓度降至13-15％(w/v)。单晶大小为0.4mm×0.3mm×0.1mm，收集的数据见表1的数据集1。

进一步改善晶体培养条件，提高DMSO浓度至6％，提高池液pH值至7.6，得到的单晶大小为0.3mm×0.3mm×0.1mm，收集的数据见表1的数据集2。

在另一方面，本发明还提供了亲和素蛋白CYPJ晶体的一种应用，即将该晶体应用于抗肿瘤药物的制备中。

CyPJ具有促进肿瘤细胞生长的作用，本发明的hCyPJ晶体不但可以用于精确解析了CyPJ蛋白的结构，还阐明了它的活性位点。将活性位点所在区域作为药物靶点，针对这些活性位点设计药物，可以高效准确的设计出所需药物。因此，本发明对于了解CyPJ蛋白的生物学功能及发现新药具有重要的指导意义。

附图说明

图1 hCyPJ与CyP家族有代表成员的序列对比图。CyP家族代表成员有：人CyPA，人CyPB，小鼠CyPC和人CyPH。每种蛋白的β-折叠和螺旋分别用点线和实线表示。

图2 hCyPJ的飘带图。螺旋、β-折叠和无规则卷曲分别用兰色、红色和绿色表示。二硫键用紫色表示。图形用SETOR(J.Mol.Graphics 11，134-138.)程序处理。

图3 hCyPJ Cα骨架与hCyPA Cα骨架的叠合图。hCyPJ用红色表示，hCyPA用绿色表示。图中标注的氨基酸残基数分别对应于Met1，Asp8，Val9，Ala33，Asn35，Glu74，Leu79，Pro135，Asn145，Ala160。此图形用SETOR程序处理。

图4  推测的活性位点结构的(2Fo-Fc)电子密度图。分别标注了His43，Gln52，Thr59-Arg61片段和Wat226水分子。

图5  His43，Gln52，Thr59-Arg61片段和Wat226水分子与hCyPA-CsA复合物结构中相应残基和水分子的叠合图。HCyPJ和hCyPA分别用红色和绿色表示。这些图形用TURBO-FRODO程序处理。

图6  hCyPJ结构中His43，Arg44，Gln52，Asn92，His110，Tyr115和Wat226位点图。前6个氨基酸残基用红色标出，Wat226用蓝色标出。hCyPA-CsA结构与hCyPJ叠加，单一的CsA用绿色标出。His43，Arg44，Gln52和Wat226位于CsA一侧，而Asn92，His110和Tyr115位于另一侧。

具体实施方式

实施例一  hCyPJ晶体的构建

(1)CyPJ基因的克隆

CyPJ基因通过PCR方法进行扩增，扩增引物分别为：CEA(5’-ATA AGA ATGCGG CCG CTC TGT GAC ACT GCA TAA-3’)和CEB(5’-ATC GCT CGA GCT GAGCAA ATG GGT TGG CAT)。这两个PCR引物含有NotI和XhoI限制性酶切位点，可以直接亚克隆到pTXB1载体(NewEngland Biolab)的多克隆位点中。在Mxeintein/Chitin结合域的上游插入CyPJ的cDNA阅读框构建CyPJ的报告基因重组质粒，由IPTG诱导的T7启动子控制融合基因的表达。PCR产物随后用NotI和XhoI酶切、凝胶纯化、然后与同样酶切过的pTXB1载体连接、测序。然后将CyPJ重组质粒转入E.coli ER2566(NewEngland Biolab)中。

(2)hCyPJ的表达与纯化

CyPJ重组体在22℃、0.2mM IPTG诱导下，培养20小时后，离心、收菌。CyPJ蛋白的纯化根据Chintin Beads系统的标准操作程序进行。首先，将超声破菌、离心后得到的CyPJ融合蛋白的上清液在4℃以0.6ml/min的流速过柱，以大于10倍柱体的洗脱缓冲液(20nM HEPES(pH8.0)500mM NaCl，0.1mMEDTA，0.1％Triton-X¹00)洗去吸附在柱子上的杂蛋白；然后，以3倍柱体积的新鲜配制的缓冲液(20mM HEPES，50mM NaCl，0.1mM EDTA，30mM DTT，pH8.0)快速洗脱柱子，随后将柱子放于4℃，过夜。最后，用3倍柱体的缓冲液(20mMHEPES，50mM NaCl，0.1mM EDTA，pH8.0)洗脱柱子，收集CyPJ蛋白。纯化的蛋白加入20mM的NH₄HCO₃用Milipore 10000离心管离心3次，立即将处理后的蛋白放于-70℃冷冻过夜。然后在冷冻干燥机上冷冻干燥得到蛋白冻干粉，将其储存于4℃冰箱中备用。

(3)晶体培养

hCyPJ晶体在20℃通过接种技术培养的。hCyPJ的晶体培养采用了悬滴式汽相扩散法：蛋白质浓度为10mg/ml，以槽液(0.1M Tris-HCl(pH8.0)，17-20％PEG8000(w/v)，3％ DMSO)为溶剂。培养一周，将晶体切割成小粒作为晶种。每个晶种冲洗后接种于预先平衡好的新鲜悬滴液中。用于晶体生长的槽液的组成类似于上述提到的池液组成，只是PEG8000的浓度降至13-15％(w/v)。单晶大小为0.4mm×0.3mm×0.1mm，收集的数据见data set 1。

进一步改善晶体培养条件，提高DMSO浓度至6％，提高池液pH值至7.6，得到的单晶大小为0.3mm×0.3mm×0.1mm，收集的数据见表1的数据系列2。

实施例二  hCyPJ晶体结构的测定

(1)X-衍射数据的收集

X-衍射数据是采用装配有CCD检测器的X-衍射仪收集，3.0分辨率的数据见data set 1，2.6分辨率的数据见data set 2。

X-衍射数据的处理是采用软件HKL2000(Mthods Enzymol.276，307-326.)。晶体属于空间群P321或P3₁21或P3₂21，a＝b＝41.31，c＝172.12。晶体数据和统计数据见表1。

(2)结构的确定

hCyPJ三维结构的确定是采用分子置换法和Amore程序(Navaza，1994)，hCyPA的分子结构(分辨率1.63)作为模型(PDB Entry 2CPL)(Ke，1992)。两个蛋白质序列中不同的氨基酸残基被丙氨酸取代。对空间群P321、P3₁21和P3₂21一个一个进行分子置换(采用数据系列1，在10-4范围)，空间群P3₁21与其他两个空间群比较，未观察到显著峰。因此，确定CyPJ单晶的空间群为P3₁21，a＝b＝41.31，c＝172.12，每一个不对称单位含有一个分子。通过精修，得到初始电子云密度图及分辨率为3.0的R因子为0.49，并根据hCyPJ的真实序列和电子密度图建立了hCyPJ的初始结构模型。分子置换方案见表2。

                                        表2  CyPJ的分子取代方案

α(°)a	β(°)a	γ(°)a	Txb	Tyb	Tzb	CC_Fc	RF_Fd
								114.49	51.19	77.99	0.5647	0.2213	0.0860	39.1	46.5

注：①^aα，β，γ是旋转角。

②^bTx，Ty，Tz上位移部分矢量。

③^cCC_F是晶体中观察到的衍射强度与模型中计算的衍射强度间的相对系数。

④^dRF_F是晶体中观察到的衍射强度与模型中计算的衍射强度间的R因子(％)数值。

(7)结构精修

结晶的精修是采用CNS程序(Acta Cryst.D54，905-921)。TURBO-FRUDO(Roussel，A.& Cambillau，C.(1991).TURBO-FRODO，Silicon GraphicsPartner Geometry Dictionary.Silicon Graphics，Mountain View，CA.)程序采用手工方法对模型进行调整。(对于只有B values＜50²)在随后的精修过程中在模型中加入了溶剂分子。

实施例三  hCyPJ晶体结构的解析

(1)结构的评价

hCyPJ晶体结构的分辨率为2.6，R因子和R_free分别为17.5％和23.6％。统计结果见表1。

(2)一级结构

图1表示hCyPJ与hCyPA及hCyP家族中已报道空间结构的其他有代表性成员的序列同源性对比。CyPJ与CyPA有50％的同源性，与hCyPB、鼠的CyPC和hCyPH的同源性可达45-57％。每一个不对称单位有一个hCyPJ分子，包括160个氨基酸和26个溶剂分子，C-端和Glu161电子密度低，而无法确定。每一个hCyPJ分子中有一个二硫键，由Cys18和Cys25形成。

(3)二级结构

hCyPJ的二级结构见图1和图2，其二级结构类似于其他CyPs。每一个hCyPJ分子含有四个α-螺旋结构和一个β-圆筒结构。β-圆筒结构由8个反平行β-链组成，按顺时针方向排列分别为β1、β2、β7、β5、β6、β4、β3、β8。Phe17-Thr21片段形成一个短螺旋-H1，由Arg20和Thr21的氨基酸残基中的N原子与Phe17的羰基O原子之间的H键形成。紧跟H1是H2，开始于Pro22。H2和H4是标准的α-螺旋结构，分别分布在β-圆筒结构的底部和上部；一小段3₁₀螺旋-H3位于β-圆筒结构的另一侧(见图2)。

(4)三级结构

hCyPJ的三级结构于hCyPA的三级结构类似，二者结构之间Cα原子的rms偏差为1.8。另外，hCyPJ的N-端稍短，C-端较长，它的结构中Asp8-Val9、Cys32-Asn35、Asp73-Leu79及Pro135-Asn145片段与CyPA相比，结构上有明显的不同；所有上述片段在一级序列上均有缺失或插入(见图1)，这些片段均分布于分子表面。在hCyPJ中由于5号残基缺失，使其Asp8和Val9直接相互连接，而CyPA中则形成一个loop。hCyPJ的Cys32-Asn35及Asp73-Leu79片段中各有一个β-拐角。Pro135-Asn145片段含有三个氢键，形成一个大的loop，这三个氢键分别由Pro135的氧原子-Leu144的氮原子、Asn137的氮原子-Arg142的氧原子和Asn137的氧原子-Tyr141的氮原子形成。CyPJ的这些片段的特性在结构上与CyPA完全不同，也不同于其他CyPs，推测CyPJ具有特殊的功能，例如：它可能减轻Calcineurin的抑制作用。

(5)结构的活性位点

有报道hCyPA-CsA复合物结构中，Wat18水分子扮演着一个非常重要的作用，与His54和Glu63两个活性位点的氨基酸残基形成氢键(Mikol et al.，1993)。根据序列同源形比较(图1)，hCyPJ的这两个氨基酸残基相应的为His43和Glu52。因此，His43和Glu52推测为hCyPJ的活性位点。在hCyPJ结构中发现Wat226水分子靠近这两个氨基酸残基(图4及图5)，它是hCyPJ结构中一个保守的水分子，当hCyPA与hCyPJ的结构叠合后，发现hCyPJ中的Wat226水分子与hCyPA-CsA复合物中Wat18水分子偏离大约1(见图5)。尽管Wat226水分子的位置在分辨率2.6的晶体结构中不是十分准确，但可以推测Wat226水分子在hCyPJ与底物结合过程中对于His43和Glu52两个活性位点的靠近起一个催化作用。

hCyPJ晶体结构的解析可以说明hCyPJ与CsA结合的活性位点结构在细节上与hCyPA-CsA复合物具有一些不同之处，这些特异性对于开发新药具有重要的指导意义。

实施例四  人CYPJ在真核细胞(L02细胞株)中的表达和稳定表达株的筛选

在该实施例中，将编码人CYPJ的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人CYPJ cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5’-ATACTCGAGATGTCTGTGACACTGCATAC-3’

该引物含有XholI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人CYPJ编码序列的20个核苷酸；

3’端引物序列为：

5’-AATAAGCTTCTGAGCAAATGGGTTGGC-3’

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点和人CYPJ的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细胞表达载体pcDNA3.1上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用XholI和HindIII消化pcDNA3.1载体，随后将插入片段连接到pcDNA3.1载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用PCR方法鉴定插入片段大小，并测序验证人CYPJ的cDNA片段已正确插入了载体。

CYPJ-pcDNA3.1和pcDNA3.1质粒转染L02细胞，采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集单克隆细胞G418加压连续传代培养，western检测CYPJ蛋白的表达。因为pcDNA3.1质粒载体带有myc，和CYPJ形成融合蛋白，所以可以用myc抗体做一抗检测CYPJ的表达。步骤：

1)按《分子克隆实验操作指南》方法，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转至硝酸纤维素薄膜，转移时，电压为100V，冰上1个小时；置于丽春红染色液中5～10分钟，置于水中洗去染料，显出蛋白标准分子量条带，并用铅笔进行标记或者使用预染蛋白分子量Marker；

2)封闭：

将膜放置于20ml封闭缓冲液中，室温下置于摇床震荡结合1小时；

3)一抗反应：

加入myc抗体，将膜放入室温下置于摇床震荡结合2小时；用洗涤缓冲液洗膜两次，每次10分钟；

4)二抗反应：

按1∶1,0000将羊抗鼠耦联HRP的抗体稀释于封闭缓冲液，将膜放入室温下置于摇床震荡反应1小时；用洗涤缓冲液洗膜四次，每次10分钟。

5)发光反应：

把膜用TBS浸泡数秒，ECL发光试剂显影曝光。

结果鉴定CYPJ表达蛋白的分子量大小约为18KDa。

对照pcDNA3.1质粒转染组的鉴定用Neo基因的PCR扩增，扩增出特异性的Neo基因片段。测序证实后，确认为转染pcDNA3.1质粒的稳定株。

实施例五  稳定表达株的裸鼠致瘤实验

BALB/C-nu/nu裸鼠在无特定病原体(SPF)条件下饲养，4周-6周的裸鼠9只，对数生长期的上述单克隆细胞株L02-CYPJ-pcDNA3.1和L02-pcDNA3.1细胞分别取3X10⁶悬浮于PBS 200ul中，用6号针头的注射器分别注射在裸鼠的左右腋下。裸鼠的皮下移植瘤成功率为100％，潜伏期为14天，瘤体表面光滑或者呈结节状，直径大于2cm时有溃破和干涸。60天后比较左右两侧肿瘤的重量，结果L02-CYPJ-pcDNA3.1一侧的肿瘤明显大于L02-pcDNA3.1，统计结果有显著性差异。用不同的单克隆重复三次，结果都有显著性差异，认为该基因有促进L02肿瘤细胞生长的功能。

                           序列表

<110>复旦大学

<120>一种人亲环蛋白的晶体及其制备方法

<130>7

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1620

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>CDS

<222>(683)..(1168)

<223>

<400>1

gccgagtgta aagcattgct tgaggttgcc caggtagttt cgccttacac ttcttgtccc     60

agtgcaatta ttagtagagc tccctttcac tgtcaaattt ccggttgggg ataaattgca    120

ttgtcgtttt ggtttgagat aggaagatga ggggaggaag gaggtgaggc ggtaaggggc    180

gttctctctc ttgggtcccg cgcccaactt ccgctggccc aaagaaacta taattttgaa    240

ccaacagacc tctgctggca tctgcgattg catttttcct gttttaacaa cggctgtgct    300

agacgaagtg gtgaagccca agtatggagt aacgtcatta attctttcat tcacttattc    360

gaatgcttgc tgagttctgt gttgctactg gtttagttct tgggatactg cgagtgaaca    420

gtgggcggcg aggctgttgt tgcaacgtca gagtaaaaga aggaccctgc acctcggcct    480

cccaaagtgt taggattata ggcgtgagcc accacgcccg gcgaggtttt tatttaaaat    540

gttcagtaaa gatgagcgtg tgtgagttaa gacaggaaaa tgagcctaat tctttttttc    600

ttttgggact agagacttat ttttgagctc gctgtaagac tgagaaatca cgtagtcctt    660

cctgaaacca ctaagaggaa aa atg tct gtg aca ctg cat aca gat gta ggt     712

                         Met Ser Val Thr Leu His Thr Asp Val Gly

                         1               5                   10

gat att aaa att gaa gtc ttc tgt gag agg aca ccc aaa aca tgt gag      760

Asp Ile Lys Ile Glu Val Phe Cys Glu Arg Thr Pro Lys Thr Cys Glu

                15                  20                  25

aat ttc ttg gct ctt tgt gcc agt aat tac tac aat ggc tgt ata ttt      808

Asn Phe Leu Ala Leu Cys Ala Ser Asn Tyr Tyr Asn Gly Cys Ile Phe

            30                  35                  40

cat agg aat atc aag ggt ttc atg gtt caa aca gga gat cca aca gga     856

His Arg Asn Ile Lys Gly Phe Met Val Gln Thr Gly Asp Pro Thr Gly

        45                  50                  55

act gga aga gga ggc aac agt att tgg ggc aag aag ttt gag gat gaa     904

Thr Gly Arg Gly Gly Asn Ser Ile Trp Gly Lys Lys Phe Glu Asp Glu

    60                  65                  70

tac agt gaa tat ctt aag cac aat gtt aga ggt gtt gta tct atg gct     952

Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys His Asn Val Arg Gly Val Val Ser Met Ala

75                  80                  85                  90

aat aat ggc ccg aac acc aat gga tct cag ttc ttc atc acc tat ggc    1000

Asn Asn Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Thr Tyr Gly

                95                  100                 105

aaa cag cca cat ttg gac atg aaa tac acc gta ttt gga aag gta ata    1048

Lys Gln Pro His Leu Asp Met Lys Tyr Thr Val Phe Gly Lys Val Ile

            110                 115                 120

gat ggt ctg gaa act cta gat gag ttg gag aag ttg cca gta aat gag    1096

Asp Gly Leu Glu Thr Leu Asp Glu Leu Glu Lys Leu Pro Val Asn Glu

        125                 130                 135

aag aca tac cga cct ctt aat gat gta cac att aag gac ata act att    1144

Lys Thr Tyr Arg Pro Leu Asn Asp Val His Ile Lys Asp Ile Thr Ile

    140                 145                 150

cat gcc aac cca ttt gct cag tag ctatgataga cctggacaaa taacttgaca   1198

His Ala Asn Pro Phe Ala Gln

155                 160

aattgctgga acacacttat tgtggtttac ccggttttaa ttatgtcaga gattgcatca  1258

tccttctgct tgtttacaac tatgatcttc tatgaaatgg tggtaccaag gggcgcccaa  1318

cagcttttat ccccattctt agagcatatt ctttattata atgattatcc aacatatttc  1378

tttaatttta atacaaaaaa tacatcattt aatttttgtt acatatgaac attcattttt  1438

aaatgctcag cctcaagtgc aggcattttt gagtggcctg attacatatt cctcccacag  1498

caagtccgta tcctggaagt gttattttat aataaaattt aaaaagtttt aaagaattaa  1558

atcgtaggac aaattaatta aaatattgtg taaaattacc ttcaggctaa aaaaaaaaaa  1618

aa                                                                 1620

<210>2

<211>161

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Met Ser Val Thr Leu His Thr Asp Val Gly Asp Ile Lys Ile Glu Val

1               5                   10                  15

Phe Cys Glu Arg Thr Pro Lys Thr Cys Glu Asn Phe Leu Ala Leu Cys

            20                  25                  30

Ala Ser Asn Tyr Tyr Asn Gly Cys Ile Phe His Arg Asn Ile Lys Gly

        35                  40                  45

Phe Met Val Gln Thr Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly Gly Asn

    50                  55                  60

Ser Ile Trp Gly Lys Lys Phe Glu Asp Glu Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys

65              70                      75                  80

His Asn Val Arg Gly Val yal Ser Met Ala Asn Asn Gly Pro Asn Thr

                85                  90                  95

Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Thr Tyr Gly Lys Gln Pro His Leu Asp

            100                 105                 110

Met Lys Tyr Thr Val Phe Gly Lys Val Ile Asp Gly Leu Glu Thr Leu

        115                 120                 125

Asp Glu Leu Glu Lys Leu Pro Val Asn Glu Lys Thr Tyr Arg Pro Leu

    130                 135                 140

Asn Asp Val His Ile Lys Asp Ile Thr Ile His Ala Asn Pro Phe Ala

145                 150                 155                 160

Gln

<210>3

<211>1652

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>CDS

<222>(73)..(570)

<223>

<400>3

aaaaggggcg ggaggccagg ctcgtgccgt tttgcagacg ccaccgccga ggaaaaccgt     60

gtactattag cc atg gtc aac ccc acc gtg ttc ttc gac att gcc gtc gac    111

              Met Val Asn Pro Thr Val Phe Phe Asp Ile Ala Val Asp

              1               5                    10

ggc gag ccc ttg ggc cgc gtc tcc ttt gag ctg ttt gca gac aag gtc       159

Gly Glu Pro Leu Gly Arg Val Ser Phe Glu Leu Phe Ala Asp Lys Val

    15                  20                  25

cca aag aca gca gaa aat ttt cgt gct ctg agc act gga gag aaa gga       207

Pro Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ser Thr Gly Glu Lys Gly

30                  35                  40                  45

ttt ggt tat aag ggt tcc tgc ttt cac aga att att cca ggg ttt atg       255

Phe Gly Tyr Lys Gly Ser Cys Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe Met

                50                  55                  60

tgt cag ggt ggt gac ttc aca cgc cat aat ggc act ggt ggc aag tcc       303

Cys Gln Gly Gly Asp Phe Thr Arg His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser

            65                  70                  75

atc tat ggg gag aaa ttt gaa gat gag aac ttc atc cta aag cat acg       351

Ile Tyr Gly Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe Ile Leu Lys His Thr

        80                  85                  90

ggt cct ggc atc ttg tcc atg gca aat gct gga ccc aac aca aat ggt       399

Gly Pro Gly Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly

    95                  100                 105

tcc cag ttt ttc atc tgc act gcc aag act gag tgg ttg gat ggc aag       447

Ser Gln Phe Phe Ile Cys Thr Ala Lys Thr Glu Trp Leu Asp Gly Lys

110                 115                 120                 125

cat gtg gtg ttt ggc aaa gtg aaa gaa ggc atg aat att gtg gag gcc       495

His Val Val Phe Gly Lys Val Lys Glu Gly Met Asn Ile Val Glu Ala

                130                 135                 140

atg gag cgc ttt ggg tcc agg aat ggc aag acc agc aag aag atc acc       543

Met Glu Arg Phe Gly Ser Arg Asn Gly Lys Thr Ser Lys Lys Ile Thr

            145                 150                 155

att gct gac tgt gga caa ctc gaa taa gtttgacttg tgttttatct             590

Ile Ala Asp Cys Gly Gln Leu Glu

        160                 165

taaccaccag atcattcctt ctgtagctca ggagagcacc cctccacccc atttgctcgc     650

agtatcctag aatctttgtg ctctcgctgc agttcccttt gggttccatg ttttccttgt     710

tccctcccat gcctagctgg attgcagagt taagtttatg attatgaaat aaaaactaaa     770

taacaattgt cctcgtttga gttaagagtg ttgatgtagg ctttatttta agcagtaatg     830

ggttacttct gaaacatcac ttgtttgctt aattctacac agtacttaga ttttttttac     890

tttccagtcc caggaagtgt caatgtttgt tgagtggaat attgaaaatg taggcagcaa     950

ctgggcatgg tggctcactg tctgtaatgt attacctgag gcagaagacc acctgagggt    1010

aggagtcaag atcagcctgg gcaacatagt gagacgctgt ctctacaaaa aataattagc    1070

ctggcctggt ggtgcatgcc tagtcctagc tgatctggag gctgacgtgg gaggattgct  1130

tgagcctaga gtgagctatt atcatgccac tgtacagcct gggtgttcac agatcttgtg  1190

tctcaaaggt aggcagaggc aggaaaagca aggagccaga attaagaggt tgggtcagtc  1250

tgcagtgagt tcatgcattt agaggtgttc ttcaagatga ctaatgtcaa aaattgagac  1310

atctgttgcg gttttttttt tttttttttc ccctggaatg cagtggcgtg atctcagctc  1370

actgcagcct ccgcctcctg ggttcaagtg attctagtgc ctcagcctcc tgagtagctg  1430

ggataacggg cgtgtgccac catgcccagc taatttttgt atttttagta tagatggggt  1490

ttcatcattt tgaccaggct ggtctcaaac tcttgacctc agctgatgcg cctgccttgg  1550

cctcccaaac tgctgagatt acagatgtga gccaccgcac cctacctcat tttctgtaac  1610

aaagctaagc ttgaacactg ttgatgttct tgagggaagc at                     1652

<210>4

<211>165

<212>PRT

<213>人类

<400>4

Met Val Asn Pro Thr Val Phe Phe Asp Ile Ala Val Asp Gly Glu Pro

1               5                   10                  15

Leu Gly Arg Val Ser Phe Glu Leu Phe Ala Asp Lys Val Pro Lys Thr

            20                  25                  30

Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ser Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr

        35                  40                  45

Lys Gly Ser Cys Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe Met Cys Gln Gly

    50                  55                  60

Gly Asp Phe Thr Arg His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly

65                  70                  75                  80

Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe Ile Leu Lys His Thr Gly Pro Gly

                85                  90                  95

Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe

            100                 105                 110

Phe Ile Cys Thr Ala Lys Thr Glu Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val

        115                 120                 125

Phe Gly Lys Val Lys Glu Gly Met Asn Ile Val Glu Ala Met Glu Arg

    130                 135                 140

Phe Gly Ser Arg Asn Gly Lys Thr Ser Lys Lys Ile Thr Ile Ala Asp

145                 150             155                     160

Cys Gly Gln Leu Glu

                165

Claims (5)

1.一种亲和素蛋白晶体，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，其特征在于，该亲和素蛋白结构中含有四个α-螺旋结构和一个β-圆筒结构；β-圆筒结构由8个反平行β-链组成；第十七位苯丙氨酸到第二十一位苏氨酸片段形成一个短螺旋H1，由第二十位精氨酸和第二十一位苏氨酸的氨基酸残基中的氮原子与第十七位苯丙氨酸的羰基氧原子之间的氢键形成；紧跟H1是短螺旋H2，开始于Pro22；短螺旋H2和短螺旋H4是标准的α-螺旋结构，分别分布在β-圆筒结构的底部和上部；一小段310螺旋-H3位于β-圆筒结构的另一侧。

2.一种如权利要求1所述的亲和素蛋白晶体，其特征在于，该亲和素蛋白结构中第八位天冬氨酸到第九位缬氨酸、第三十二位半胱氨酸到第三十五位天冬酰氨、第七十三位天冬氨酸到第七十九位亮氨酸及第一百三十五位脯氨酸到第一百四十五位天冬酰胺均分布于蛋白分子表面，第八位天冬氨酸和第九位缬氨酸直接相互连接；第三十二位半胱氨酸到第三十五位天冬酰胺、第七十三位天冬氨酸到第七十九位亮氨酸片段中各有一个β-拐角；第一百三十五位脯氨酸到第一百四十五位天冬酰胺片段含有三个氢键，形成一个大的环形结构，这三个氢键分别由第一百三十五位脯氨酸到第一百四十五位天冬酰胺的氧原子到第一百四十四位亮氨酸的氮原子、第一百三十七位天冬酰氨的氮原子到一百四十二位精氨酸的氧原子和第一百三十七位天冬酰胺的氧原子到一百四十一位酪氨酸的氮原子形成。

3.一种如权利要求1所述亲和素蛋白的制备方法，其特征在于，将序列如SEQ ID NO 1所示的亲和素蛋白配制成浓度为10-20mg/ml的溶液，溶剂是含有重量体积比为15-25％的PEG8000、2-8％的二甲基亚砜、pH为7.9-8.1的缓冲液；15-25℃培养晶体生长5-8天后，将晶体切割成小粒作为晶种；每个晶种冲洗后接种于预先平衡好的新鲜悬滴液中，用于晶体生长的槽液中PEG8000的浓度降为13-15％，2-5％二甲基亚砜、pH为7.4-8.1；10-25℃培养晶体生长5-10天即得权利要求1所述的亲和素蛋白晶体。

4.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于，槽液中二甲基亚砜的浓度为4-8％，pH为7.2-7.8。

5.一种如权利要求1所述亲和素蛋白晶体的应用，其特征在于，将该晶体应用于抗肿瘤药物的制备中。

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