CN1673741A - 细胞外电位测定装置及其制造方法 - Google Patents

Abstract

一种细胞外电位测定装置及其制造方法，细胞外电位测定装置具有膜片和检测电极。在膜片的一面上至少设有一个由曲面构成的凹坑，并设有从该凹坑的曲面上贯通膜片另一面的孔。凹坑曲面上的开口部比其它侧的开口部小，在该孔的壁面设有检测电极。

Description

细胞外电位测定装置及其制造方法

技术领域

本发明涉及在进行细胞外电位测定或由细胞活动产生的物理化学变化的测定时使用的细胞外电位测定装置及其制造方法。

背景技术

目前，以细胞的电气活动为指标，利用补片箝位法、使用荧光色素或发光指示剂的方法筛选药品辅助物质。在补片箝位法中，使用附于微型吸管前端部分的细胞膜的微小部分(补片)，利用微小电极测头电记录介由单一的通道对蛋白质分子的离子的输送。该方法是可实时检查一个蛋白质分子的功能的少数方法之一。另外，也有利用根据特定的离子浓度变化而发光的荧光色素或发光指示剂监视细胞内离子的移动，测定细胞的电气活动的方法。

但是，由于补片箝位法在进行微量吸管的制造及操作需要特殊的技术，故测定一个试样需要大量时间。因此，不适用于高速筛选大量药品辅助化合物的用途。另一方面，使用荧光色素等的方法可高速筛选大量的药品辅助化合物。但是，需要将细胞染色的工序，同时，由于使用的色素的影响在测定时检出的本底放射性水平升高，并且该色素随时间而脱色。因此，具有S/N比不良的缺点。

国际公开第02/055653号中公开有取代上述方法的方法。在该方法中，使用利用具有细胞保持部的基板和设于该基板上的电极测定细胞外电位的装置。在该方法中能够得到和利用补片箝位法得到的数据同样高质量的数据，并且，如使用荧光色素的方法，可简单高速地测定大量试样。该装置包括具有设于基板上的细胞保持部的至少一个凹部和在该凹部中检测电信号的传感器。使用附图详细说明该细胞外电位测定装置的动作。

图17是现有细胞外电位测定装置的凹部结构的模式剖面图。向凹部14内放入培养液20，被测细胞(下面称为细胞)19被设于基板16上的细胞保持部捕捉或保持。细胞保持部具有形成于基板16上的凹坑15和介由开口部连通凹坑15的通孔17。在通孔17中配置有作为传感器部的测定电极(以下称为电极)18，电极18通过配线与信号检测部连接。在进行测定时，通过利用吸引泵等从通孔17侧吸引细胞19，使细胞19紧密保持在凹坑15内。这样，由细胞19的活动产生的电信号不向凹部14中的培养液20侧泄漏，而被设于通孔17侧的电极18检测到。

但是，在所述现有的结构中，由于电极18形成在通孔17内部，故测定不稳定。另外，当将凹部14小型化时，介于细胞19和电极18之间的培养液20不能充分填充。由于这些问题，进行高精度的测定是困难的。

发明内容

本发明的细胞外电位测定装置具有膜片和检测电极。在膜片的一面上至少设置一个由曲面构成的凹坑，并设置从该凹坑的曲面上贯通到膜片另一面的孔。凹坑曲面上的开口部比另一侧的开口部小，在该孔的壁面设有检测电极。由于该细胞外电位测定装置在孔的壁面具有检测电极，故细胞外电位的测定精度高，可高效、高精度稳定地检出在细胞活动时产生的物理化学的变化。

附图说明

图1是本发明实施例的细胞外电位测定装置的立体图；

图2是图1所示的装置的A-A线的剖面图；

图3是图1所示的装置的通孔周边部的放大平面图；

图4是用于说明图1所示的装置动作的主要部分放大剖面图；

图5～图10是说明图1所示的装置的制造方法的剖面图；

图11是用于制造本发明实施例的细胞外电位测定装置的另一基板的剖面图；

图12是本发明实施例的其它细胞外电位测定装置的剖面图；

图13是图12所示的装置的通孔周边部的放大平面图；

图14是本发明实施例的又一细胞外电位测定装置的剖面图；

图15是图14所示的装置的通孔周边部的放大平面图；

图16是用于说明图14所示的装置的制造方法的剖面图；

图17是现有的细胞外电位测定装置的剖面图。

具体实施方式

图1是本发明实施例的细胞外电位测定装置的立体图，图2是图1的A-A线的剖面图，图3是从基板的下面侧看到的图2的通孔周边部的放大平面图。

首先，说明本发明的细胞外电位测定装置的结构。基板1由硅形成，在基板1的上面侧(第一面侧)形成有膜片2。膜片2的材质是与基板1相同的硅。凹坑3形成于膜片2的上面2A侧(第一面侧)，由半球状的曲面构成。通孔(以下称为孔)4从凹坑3的曲面上的规定位置连通到与膜片2的上面2A相对的下面2B侧(第二面侧)。

设于凹坑3的规定位置的曲面上的孔4的开口部4C比设于膜片2下面2B侧的开口部4D小，而且，孔4的壁面具有直线形状。即，连接设于凹坑3的规定位置的曲面上的开口部4C和设于膜片2下面2B侧的开口部4D的壁面的棱角线形成直线。这样，通过在基板1上使用硅，得到利用干式蚀刻高精度形成膜片2、凹坑3、孔4的细胞外电位测定装置。

另外，为了测定的稳定性，在孔4的壁面及膜片2的下面2B设有以贵金属为主体的检测电极(以下称为电极)5。通过将电极5也设在孔4的壁面，可提高细胞外电位的测定精度。另外，通过使用贵金属，得到显示至少稳定形成氧化膜等的电极特性的电极5。用于电极5的贵金属优选金或白金等。

其次，参照图4说明本实施例的细胞外电位测定装置的动作。图4是细胞外电位测定装置主要部分的放大剖面图，表示在膜片2上形成凹坑3、孔4、电极5的位置。首先说明检测培养液的物理化学变化的顺序。

当培养液6填满膜片2上部时，凹坑3、孔4由于培养液6的表面张力而依次被培养液填满。而且，当将膜片2的上部空间加压，或将膜片2的下部空间减压时，培养液6从孔4排出到膜片2的下面2B侧的开口部4D。此时，当将加压或减压的条件设定为适度的值时，如图4所示，培养液6在开口部4D的前端形成弯月状，构成稳定的状态。

然后，说明测定被测细胞(以下称为细胞)7的细胞外电位或细胞产生的物理化学变化的顺序。如图4所示，同时放入细胞7和培养液6，当将膜片2的上部空间加压，或将膜片2的下部空间减压时，细胞7和培养液6都被引入凹坑3内。这里，凹坑3由规定的曲面构成，为保持细胞7而形成更加有效的形状，是理想的。

另外，在凹坑3内保持细胞7，然后上下调整压力，使培养液6在孔4的出口侧即开口部4D形成适当的弯月形。细胞7在凹坑3内保持，堵塞孔4的凹坑侧的开口部4C。然后，对细胞7施加刺激的行为。该刺激的种类具有例如进行化学药品、毒物等化学的刺激、进行机械位移、光、热、电气、电磁波等的物理刺激。

而且，在细胞7相对这些刺激活跃地反应时，例如细胞7通过细胞膜具有的离子通道放出或吸收各种离子。该反应直接地在细胞7与培养液6接触的位置产生，但也间接地在孔4内的培养液6和细胞7之间进行离子交换。

其结果是，由于孔4内的培养液6的离子浓度和细胞7的细胞内液的离子浓度改变，故可介由培养液6通过电极5检测该变化。这里，由于电极5也形成在孔4的整个壁面，故形成到保持细胞7附近。因此，即使电极5进行介有培养液6的细胞外电位的测定，也不受噪音的影响，可高精度地进行细胞7的细胞外电位变化或细胞产生的物理化学的变化。

然后，参照图5～图11说明具有图2所示的结构的细胞外电位测定装置的制造方法。图5～图11是用于说明图2所示的细胞外电位测定装置制造方法的工序剖面图。

如图5所示，在该细胞外电位测定装置的制造方法中，准备由硅构成的基板1，在基板1的下面形成抗蚀膜8。然后，如图6所示，通过从基板1的下面侧进行蚀刻，在基板1的上部形成膜片2。这里，为使膜片2形成规定的厚度，应高精度地控制进行蚀刻的量。特别是在基板1由硅形成的情况下进行过量的蚀刻时，会有贯通膜片2的危险。

为解决这种问题，基板1的材料可使用具有图11所示的硅层13、13B和这些层夹着的二氧化硅层12的层积结构的材料。这种基板被称为SOI(Silicon On Insulator)基板，提前决定硅层13的厚度，由二氧化硅层12大幅降低蚀刻速率。因此，不必另外加工膜片2的膜厚，可高精度地形成膜片2的厚度。另外，在使用这种材料时，根据需要，使用公知的方法除去形成膜片2后露出的二氧化硅层12。如上所述，通过使用SOI基板，可实现高精度、生产性优良的细胞外电位测定装置及其制造方法。

其次，在形成膜片2后，除去抗蚀膜8。然后，如图7所示，在膜片2的上面2A侧形成抗蚀膜9。此时的抗蚀膜9的蚀刻孔9A的形状设计成与必要的后述的通孔(以下称为孔)4A的形状大致相同。

然后，如图8所示，利用干式蚀刻从膜片2侧进行蚀刻。此时，蚀刻气体仅使用促进蚀刻的气体。在基板1由硅构成的情况下，促进蚀刻的气体可使用SF₆、CF₄、XeF₂等。这些气体具有使作为基板1的硅的蚀刻不仅向深度方向，还向横方向促进的作用。在试验中，使用XeF₂确认效果。由此，蚀刻的形状如图8所示，构成以蚀刻孔9A的开口部为中心的半球状，形成凹坑3。另外，抗蚀膜9几乎未被蚀刻，故一直保持最初的状态。

然后，如图9所示，利用离子性干式蚀刻在基板1的膜片2上形成孔4A。此时，将基板1倾斜地设置，使其相对垂直于离子行进的方向的面构成大于0°的角度θ，形成孔4A。在形成孔4A时，通过反复进行利用促进蚀刻的气体进行的蚀刻工序和在被蚀刻的内壁形成保护膜的工序，进行干式蚀刻。此时的蚀刻气体在各工序中交互使用促进蚀刻的气体和抑制蚀刻的气体。促进蚀刻的气体有SF₆、CF₄、XeF₂等，抑制蚀刻的气体有CHF₃、C₄F₈等。在使用这些促进蚀刻的气体进行微量蚀刻后，利用抑制蚀刻的气体在被蚀刻的壁面形成作为CF₂的聚合物的保护膜。通过反复进行这些工序的干式蚀刻法可使孔4A仅在设于抗蚀膜9上的蚀刻孔9A下方方向直线地进行。

这里，详细说明仅在蚀刻孔9A的下方进行干式蚀刻的方法。在促进蚀刻的气体进行的蚀刻工序中，在利用外部线圈的电感耦合法生成的等离子产生区域中，在电容耦合其它高频电源的基板1上施加高频。由此，由于在基板1上产生负偏压并使作为等离子中的正离子的SF₅ ⁺和CF₃ ⁺朝向基板1冲撞，故蚀刻垂直地向下方前进。在抑制蚀刻的气体得到的保护膜的形成工序中，同样，利用电感耦合法生成等离子。但是，由于在等离子产生区域中未在基板1上施加高频，故在基板1上完全不产生偏压。因此，存在于等离子中的构成保护膜的材料的CF⁺未受偏压，向基板1中被蚀刻的壁面形成均匀的保护膜。在试验中，作为促进蚀刻的气体，使用SF₆，作为抑制的气体使用C₄F₈。通过反复交互进行这些工序，蚀刻垂直地仅向下方进行，故结果如图9所示，形成直线的孔4A。

在此，例如凹坑3的深度为10um，孔4A的深度为10um，蚀刻孔9A的直径为5um时，使基板1相对垂直于离子行进的方向的面在大于0°且小于7°的范围内倾斜，如上进行设置的条件是最高效的。

然后，如图10所示，使基板1在膜片2的上面2A的面内旋转移动180°，进行蚀刻，形成通孔(以下称为孔)4B。在此，通过将相对和离子行进的方向垂直的面倾斜的角度θ设为规定角度，如图10所示，孔4A、4B形成连通的状态。其结果是合并孔4A、4B的孔形成图2所示的孔4的结构。结果是设于凹坑3曲面上的规定位置的开口部4C形成比设于膜片2下面2B侧的开口部4D小的形状。另外，孔4壁面的棱角线形成直线的结构。

然后，利用通常的薄膜形成方法在孔4的整个壁面和膜片2的下面2B形成由金/钛两层构成的电极5，形成图2所示的结构。此时，孔4的开口部4D比开口部4C大，孔4壁面的棱角线是直线。因此，通过使用薄膜形成方法从基板1的下面侧形成电极5，可不切断电极5，而容易地连续开口到开口部4C。

另外，在形成通孔的工序中，如图9所示，进行蚀刻后，也可以使基板1在膜片2的上面2A的面内以180°以外的角度旋转。例如图12、图13所示，每旋转90°后进行蚀刻，这样也可以形成通孔10。利用这种方法可自如设计设于膜片2下侧的开口部10D的形状，同时，可增大开口部10D的面积。由此，在从下方吸引时，压力被高效传递，故容易保持细胞7。另外，通过将旋转移动的角度设为360°/n(n为自然数)，可提高通孔10剖面形状的对称性，更加易于保持细胞7，提高了生产性。

下面说明不同通孔的形成方法。图14是本发明实施例的其它细胞外电位测定装置的剖面图，图15是通孔(下面称为孔)11周边部的放大图，图16是用于说明制造方法的剖面图。

在图14、图15所示的装置中，孔11的形状为圆锥台形状。下面说明制造方法。直至形成凹坑3的工序可利用和实施例1的图5～图8所示的制造工序相同的方法进行，故省略详细说明。

然后，如图16所示，形成构成圆锥台形状的孔11。此时，使基板1相对垂直于离子行进的方向的面倾斜比0°大的角度θ，在膜片2的上面2A的面内连续旋转，同时，进行干式蚀刻。通过进行这样的干式蚀刻，设于凹坑3曲面上的规定位置的开口部11C和设于下面2B侧的开口部11D形成圆形。形成具有开口部11C的直径比开口部11D的直径小的圆形的孔11。另外，孔11的壁面棱角线形成直线。

此时，在进行一次促进蚀刻的工序时，最好使膜片2至少旋转一次。由此，孔11均等地形成在膜片2的厚度方向。另外，通过使旋转速度一定，孔11的剖面形状的对称性提高，生产性提高。另一方面，若间歇地旋转，则孔11的剖面形状具有特殊的形状，可实现对应粘度、表面张力等性质不同的各种培养液6的装置。

然后，如图14、图15所说明的，在孔11的整个壁面及膜片2的下面2B形成电极5。在此，在使基板1相对与离子行进的方向垂直的面倾斜一定角度后，使其连续地旋转，同时进行蚀刻，这样使孔11的开口部11C、11D的形状构成圆形。另外，孔11的壁面形成直线的倒圆锥状。因此，可不断开电极5而容易地形成。

通过利用以上这种方法形成孔11，可构成不切断电极5，而容易地进行的结构，得到中途切断电极5的可能性小的细胞外电位测定装置。

另外，在以上的说明中，干式蚀刻基板1，形成膜片2，但在膜片2的强度足够时，不需要该工序。即，基板1和膜片2共有第一面，具有作为膜片2保持部的功能，此外，也可以利用其它部件取代基板1保持膜片2单体。

如上所述，本发明的细胞外电位测定装置及其制造方法对利用检测电极高效稳定地测定细胞活动时产生的物理化学的变化的装置是有用的。例如，对利用化学物质检出细胞产生的反应，判定对细胞的药理效果的药品筛选是有用的。

Claims (17)

1、一种细胞外电位测定装置，其特征在于，包括：膜片，其在第一面侧至少设置一个由曲面构成的载置细胞用的凹坑，并且还设置有在所述凹坑的曲面上具有第一开口部、在与所述第一面对向的第二面侧具有比所述第一开口部大的第二开口部的通孔；检测电极，其至少设置在上述通孔的壁面上。

2、如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，通孔壁面的棱角线是直线形状。

3、如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，还具有保持所述膜片的保持部。

4、如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，还具有与所述膜片共有所述第一面并保持所述膜片的基板。

5、如权利要求4所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，所述基板由硅构成。

6、如权利要求4所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，所述基板层积有两个硅层和夹于所述硅层中间的二氧化硅层。

7、如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，所述检测电极含有金和白金的至少任一种。

8、一种细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，包括：形成在膜片的第一面上设置蚀刻孔的抗蚀膜的步骤A；通过从所述抗蚀膜上进行蚀刻，在所述膜片上至少形成一个具有曲面并载置细胞的凹坑的步骤B；从所述凹坑的曲面侧利用离子进行的干式蚀刻形成通孔的步骤D；在所述步骤D之前，相对与所述离子的行进方向垂直的面倾斜大于0°的角度设置所述膜片的步骤C；至少在所述通孔的内部形成检测电极的步骤E。

9、如权利要求8所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，在进行所述步骤D之后，使所述膜片在所述第一面内旋转规定的角度，再次进行所述步骤D。

10、如权利要求9所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，旋转移动的角度为360°/n(n为自然数)。

11、如权利要求8所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，在所述步骤C中，将所述膜片相对垂直于所述离子行进方向的面倾斜大于0°且小于7°的角度来进行设置。

12、如权利要求8所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，在所述步骤D中，反复交替进行促进蚀刻的步骤F和在所述步骤F中被蚀刻的内壁上形成保护膜的步骤G。

13、如权利要求12所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，在所述步骤F中，促进蚀刻的气体使用含有XeF₂、CF₄、SF₆中的任一种的气体，在所述步骤G中，形成保护膜的气体使用含有CHF₃、C₄F₈中的任一种的气体。

14、如权利要求8所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，在所述步骤C之后，使所述膜片在所述第一面内旋转，同时进行所述步骤D。

15、如权利要求14所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，在所述步骤D中反复交替进行促进蚀刻的步骤F和在所述步骤F中被蚀刻的内壁上形成保护膜的步骤G，同时，在进行一次所述步骤F期间使所述膜片至少旋转一次。

16、如权利要求14所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，所述膜片以一定的速度旋转。

17、如权利要求14所述的细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，间歇地旋转所述膜片。

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