CN1673369A - 一种新型促细胞凋亡素（apo）及其抗体，制备及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型促细胞凋亡素(APO)的cDNA序列、其所编码的氨基酸序列及其促进细胞凋亡的功能及用途，并提供了其抗体的制备方法及用途。其cDNA序列为381个碱基。其氨基酸序列长度为126个氨基酸。此cDNA序列在大肠杆菌中表达的蛋白对细菌的生长具有明显的抑制作用，在哺乳动物细胞中表达的蛋白能够导致细胞的凋亡。因此，此cDNA序列编码的多肽分子在临床上可作为促进肿瘤细胞凋亡，从而治疗肿瘤的诱导剂，在肿瘤分化诱导治疗方面发挥作用。通过分析其氨基酸序列确定抗原表位，合成多肽制备单克隆抗体，蛋白印记技术显示此单抗可与该新型促细胞凋亡素(APO)特异识别。因此，此单抗可能用于防止正常细胞凋亡的发生，从而保护正常组织，避免错误的细胞凋亡。
Description
技术领域 本发明属于生物医学专业领域，涉及一种新型促细胞凋亡素(Apoptoietin，简称为APO)的cDNA序列和氨基酸序列，以及该基因的功能信息，还涉及该新型促细胞凋亡素(APO)的抗体的制备及在诱导肿瘤细胞凋亡从而治疗肿瘤以及防止凋亡失控相关疾病如神经系统退行性病变方面的用途。
背景技术 凋亡是程序性、正常的细胞死亡，是机体清除多余细胞的重要手段。细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，在多细胞动物的发育、形态建成与维持过程中至关重要。作为细胞的一种基本生命现象，凋亡失控的结果将是严重的：凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病：而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合症、重症肝炎与退行性神经系统疾病如老年性痴呆症、帕金森氏症等。
本发明的目的是提供一种新型促细胞凋亡素(APO)。该发明可作为临床上全新的肿瘤细胞凋亡促进剂，为癌症患者提供新的治疗途径。
本发明以神经突起诱向因子β-Netrin为诱饵，筛选4-6月孕龄的人胎脑cDNA文库，共筛选到10个克隆与neuronatin的cDNA高度一致。其中的代表克隆JKY2290的cDNA序列为381个碱基。其氨基酸序列长度为126个氨基酸。通过BLAST分析，381个碱基的cDNA序列与人的neuronatin全程同源，但其编码的126个氨基酸序列在GenBank数据库中未查到同源序列。已知根据neuronatin cDNA序列预测产物有两种，分别为neuronatin-α和neuronatin-β，将这三种产物比对后发现我们所筛到的氨基酸序列为一种全新的neuronatin编码产物。
本发明以JKY2290为模板，将APO亚克隆至原核表达载体pGEX4T-2中，在大肠杆菌中可通过异丙基-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)诱导表达，加入IPTG和不加入IPTG对细菌生长速率的影响是不同的，加入IPTG后诱导蛋白表达，可对细菌生长产生明显的抑制作用。
本发明以JKY2290为模板，将APO亚克隆至真核表达载体pEGFP-N1中，转染真核哺乳动物细胞(COS7)，随着转染时间的增加，反映APO亚细胞定位的绿色荧光信号在细胞中的定位发生明显变化，最初在整个细胞浆中分布，后转位到细胞核，并在核内聚集。同时，出现明显的细胞凋亡现象(染色体聚集，核膜进裂)。
本发明从以上结果对此基因的功能研究认为，APO能够导致细胞的凋亡。该发明有可能寻找到新的肿瘤细胞的诱导剂，在临床上肿瘤治疗方面发挥作用。
本发明通过GOLDKEY软件分析此氨基酸序列的抗原表位，选择CVPSPEEHLARSVRGQ编码肽段合成多肽，并通过碳化二亚胺法与BSA偶联后作为免疫用抗原。取BSA偶联多肽300μg作为抗原免疫Balb/c小鼠，按常规细胞融合方法制备单抗。所制备的抗体能够特异识别新型促细胞凋亡素(APO)编码蛋白。
本发明所提供的抗体可与细胞内的新型促细胞凋亡素(APO)中和，用于防止凋亡的发生，从而保护组织，避免不该发生的细胞凋亡。因此，可用于凋亡失控相关疾病如神经系统退行性病变的防治与治疗。
发明内容
1.本发明所提供的新型促细胞凋亡素(APO)具有如下cDNA序列：
CGGACTCCGAGACCAGCGGATCTCGGCAAACCCTCTTTCTCGACCACCCACCTA
CCATTCTTGGAACCATGGCGGCAGTGGCGGCGGCCTCGGCTGAACTGCTCATCA
TCGGCTGGTACATCTTCCGCGTGCTGCTGCAGGTGTTCAGGTACTCCCTGCAGA
AGCTGGCATACACGGTGTCGCGGACCGGGCGGCAGGTGTTGGGGGAGCGCAGGC
AGCGAGCCCCCAACTGAGGCCCCAGCTCCCAGCCCTGGGCGGCCGTATCATCAG
GTGCTCCTGTGCATCTCGGCCAGCACGGGAGCCAGTGCCGCGCAGGAATGTGGG
GTCCCCTGTGTTCCCTCGCCAGAGGAGCACTTGGCAAGGTCAGTGAGGGGCCAG
TAG
2.本发明所提供的新型促细胞凋亡素(APO)具有如下氨基酸序列：
RTPRPADLGKPSFSTTHLPFLEPWRQWRRPRLNCSSSAGTSSACCCRCSGTPCR
SWHTRCRGPGGRCWGSAGSEPPTEAPAPSPGRPYHQVLLCISASTGASAAQECG
VPCVPSPEEHLARSVRGQ
3.本发明所提供的新型促细胞凋亡素(APO)具有以下生物学特性：
在大肠杆菌中表达的蛋白对细菌的生长具有明显的抑制作用，在哺乳动物细胞中表达的蛋白能够导致细胞的凋亡。
4.本发明所提供的新型促细胞凋亡素(APO)抗体的制备方法
1)抗原的制备：合成多肽CVPSPEEHLARSVRGQ，用碳化二亚胺法与BSA偶联，偶联产物作为抗原。
2)抗体的制备：将1)中制备的抗原免疫Balb/c小鼠，通过传统的细胞融合方法制备单克隆抗体。
3)抗体的纯化：将2)中所得的单克隆抗体经离心、沉淀、脱盐、得粗提抗体，然后经亲和纯化，即得纯化抗体。
4)鉴定抗体的特异性、灵敏度、稳定性。
5.本发明所提供的新型促细胞凋亡素(APO)在促肿瘤细胞凋亡及肿瘤治疗中的用途。
6.本发明所提供的新型促细胞凋亡素(APO)抗体用于防止正常细胞凋亡，从而可用于凋亡相关疾病如神经退行性病变的治疗。
附图说明
图1：新型促细胞凋亡素(APO)的cDNA序列
图2：新型促细胞凋亡素(APO)的氨基酸序列
图3：新型促细胞凋亡素(APO)cDNA序列与GenBank核酸数据库全序列相似性比较结果
图4：10个克隆编码产物的序列比对结果。蓝色代表一致的氨基酸残基，前部分一致的序列为载体编码序列
图5：IPTG诱导后的生长曲线。新型促细胞凋亡素(APO)在大肠杆菌中诱导表达，对细胞的生长具有明显的抑制作用。具体地说，生长速率比较结果为0mM＞0.1mM＞0.5mM IPTG。
图6：不同时间绿色荧光定位变化。具体地说，用pEGFP-N1空载体和pEGFP-N1/APO载体分别转染真核哺乳动物细胞后，不同时间观察绿色荧光信号在细胞内的定位变化。空载体转染后，随时间增加定位无变化，荧光在全细胞内均匀分布。随着转染时间的增加，融合蛋白的绿色荧光在细胞中的定位发生明显变化，最初在整个细胞浆中分布，后转位到细胞核，并在核内聚集。同时，出现明显的细胞凋亡现象。
图7：DAPI染色确定被转染细胞的细胞核形态。具体地说，能看到绿色荧光的细胞已转染pEGFP-N1/APO载体。同时，通过4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色可观察到细胞核凝集，核膜进裂。而没有荧光的细胞仍保持细胞核的完整性。
图8：Western blot结果。通过Western blot检测抗体的特异性，所用抗原为原核表达蛋白，分子量为37KD。不同的杂交瘤细胞株制备的腹水(2B2，2F8)检测到同一特异条带。
图9：小鼠脑石蜡切片免疫组化结果。用所制备的单克隆抗体能与细胞内的蛋白特异识别，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色能看到阳性细胞染色。
具体实施方式
1.将腺病毒载体与新型促细胞凋亡素(APO)在原核细胞(E.coli)中同源重组，获得腺病毒载体与新型促细胞凋亡素(APO)构建的基因重组药物。使用基因重组药物，可制备成临床级基因治疗制品，作为临床上新的肿瘤细胞诱导剂，用于癌症的治疗。
2.本发明所提供的抗体可制备成抗体药物，可与细胞内的新型促细胞凋亡素(APO)中和，用于防止凋亡的发生，从而保护组织，避免错误的细胞凋亡。临床上可用于治疗凋亡失控相关疾病如退行性神经系统疾病(老年性痴呆症、帕金森氏症等)。
Claims (6)
1.本发明所提供的新型促细胞凋亡素Apoptoietin(APO)具有如下cDNA序列：
CGGACTCCGAGACCAGCGGATCTCGGCAAACCCTCTTTCTCGACCACCCACCTAC
CATTCTTGGAACCATGGCGGCAGTGGCGGCGGCCTCGGCTGAACTGCTCATCATC
GGCTGGTACATCTTCCGCGTGCTGCTGCAGGTGTTCAGGTACTCCCTGCAGAAGC
TGGCATACACGGTGTCGCGGACCGGGCGGCAGGTGTTGGGGGAGCGCAGGCAGCG
AGCCCCCAACTGAGGCCCCAGCTCCCAGCCCTGGGCGGCCGTATCATCAGGTGCT
CCTGTGCATCTCGGCCAGCACGGGAGCCAGTGCCGCGCAGGAATGTGGGGTCCCC
TGTGTTCCCTCGCCAGAGGAGCACTTGGCAAGGTCAGTGAGGGGCCAGTAG
2.根据权利要求1所述的新型促细胞凋亡素APO具有如下氨基酸序列：
RTPRPADLGKPSFSTTHLPFLEPWRQWRRPRLNCSSSAGTSSACCCRCSGTPCRS
WHTRCRGPGGRCWGSAGSEPPTEAPAPSPGRPYHQVLLCISASTGASAAQECGVP
CVPSPEEHLARSVRGQ
3.根据权利要求1所述的新型促细胞凋亡素APO具有以下生物学特性：在大肠杆菌中表达的蛋白对细菌的生长具有明显的抑制作用，在哺乳动物细胞中表达的蛋白能够导致细胞的凋亡。
4.根据权利要求1所述的抗新型促细胞凋亡素APO抗体的制备方法
1)抗原的制备：合成多肽CVPSPEEHLARSVRGQ，用碳化二亚胺法与BSA偶联，偶联产物作为抗原。
2)抗体的制备：将1)中制备的抗原免疫Balb/c小鼠，通过传统的细胞融合方法制备单克隆抗体，同时免疫家兔制备多克隆抗体。
3)抗体的纯化：将2)中所得的单克隆抗体经离心、沉淀、脱盐、得粗提抗体，然后经亲和纯化，即得纯化抗体。
4)鉴定抗体的特异性、灵敏度、稳定性。
5.根据权利要求1所述的新型促细胞凋亡素APO在促肿瘤细胞凋亡及肿瘤治疗中的用途。
6.根据权利要求1所述的新型促细胞凋亡素APO抗体用于防止正常细胞凋亡，从而可用于凋亡相关疾病如神经退行性病变的治疗。
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