CN1665388A - 功能性生物制剂的灭菌、稳定和保存 - Google Patents

Abstract

公开用于灭菌功能性生物材料、生物化学实体和生物活性分子以及在室温保存它们的方法。生物污染物被显著地降低滴度或被消除，但是本发明方法所灭菌和稳定的产品仍然保存功能的完整性。这些材料主要是结构功能性的，如骨骼，或者具有活性分子功能，当为血红蛋白和抗体的情况下。用于稳定被灭菌的生物制品的处理方法包括改变材料的温度、调控辐射剂量比例，优化辐射时间，调控含氧量、使用稳定剂、确定pH、包含特定溶剂和改变所使用的射线种类。如此处理的灭菌和稳定的生物产品可以在室温存储，从而使之相对于冻干、常规冷冻和低温保存的生物制品更加容易获得和被使用。

Description

功能性生物制剂的灭菌、稳定和保存

参照相关申请

本申请要求享有2002年6月7日申请的美国在先专利申请60/387,177的权益，该专利申请的内容在此引入作为参考。

发明背景

本发明涉及生物化学和医学的一般领域，特别涉及通过辐射来保存功能性生物材料、生物化学实体和生物活性分子，例如，但是不限于血红蛋白(包含在或独立于红细胞)，抗体，细胞因子，包括组成的或非组成的成分的血液成分，蛋白质或其他细胞成分，完整的人和动物组织，和起抗原作用的材料来检测敏感性和脱敏，和免疫接种。

许多年以来，生物材料已经被广泛地应用于人类医学和兽医、诊断用途和试验的或化学的方法中。这些材料通常具有生物学活性，意味着它们具有与它们在原始生物体或植物中所具有的相同或相似的结构的，酶学的或其他的分子功能，以致它们可以被用作诊断的、预防的和治疗的试剂。尽管生物材料非常有用，使用它们具有一定风险。这些材料会被从病毒到细菌等的各种生物污染物污染。如果这些污染物被传播给人或动物，将会引起严重的健康问题。这些污染物还可能降低功效或甚至破坏其所污染的材料。

有许多用于检测和筛选生物材料中的生物污染物或病原体的方法，但是这些筛选操作存在缺陷。这些方法并不总是可靠的，而且是昂贵的，并且仅能够检测非常特定的污染物。降低大量污染物的危害将会更加有效。许多技术已经被用于降低污染物的危害，包括热处理、化学溶剂和辐射。已经证明热处理会对产品的生物学活性产生副作用，降低产品的功效。化学溶剂、消毒剂和抗菌剂已经被用于降低污染发生的概率，特别是包装后和使用之前的细菌增生的可能性。当与人接触时，这些溶剂和试剂是有害的，通常在应用于人之前必须将它们从产品中去除。

辐射处理是另一种灭菌产品的方法。对于减少大量的生物学污染物，特别是包括细菌和病毒时，辐射处理是非常有效的。本领域的公开出版物表明，辐射灭菌的技术是非常灵活的，本领域技术人员可以采用包括所用的射线类型、含氧量、pH、辐射率、温度、溶剂、稳定剂等的特定标准，以改变产品对辐射的反应。但是，迄今开发辐射处理方法中的绝大部分工作集中在灭活污染物的方法上，并提供在结构功能和生物学功能上基本未被改变的生物材料。这种灭菌和稳定的产品应当是具有功能的，意味着它们具有与在原始生物体或植物中相同或相似的结构的，酶学的或其他分子功能，使得它们可以被用作诊断的、预防的和治疗的试剂。

A. 血液和血液成分

现有技术的缺陷在于用于医学用途的血液和血液成分的制备方面。大量的各种损伤和医学操作需要施用全血或各种血液成分。并不是每位患者都需要全血，实际上，全部血液成分的存在会导致医学问题。分离的血液部分可以在最适合确保其在输血时的生物学活性的那些特殊条件下存储。例如，当在处理中心采集供体血液时，并通过各种方法分离和存储红细胞。这种细胞可以在柠檬酸-磷酸-葡萄糖中4℃存储5周，通常被包装的红细胞单位具有200-300ml的体积，并且红细胞比容值(表示为细胞体积(corpuscular volume)百分比)为约70-90％。红细胞还可以用甘油处理，然后在-30到-196℃下冷冻保存，在甘油溶液中存储长达7年，但是必须持续在低温下冷冻使得红细胞存活到用于输血。这两种方法都要求极其小心地保持存储温度，以避免红细胞的期望生物学活性被破坏，按照美国血库标准协会，一般认为，至少70％的输注红细胞能够存活24h是用于输血操作的可接受水平。

一种已知的用于存储红细胞的方法是冷冻(冻干)红细胞，这种细胞在室温存储的时间延长，并且用于哺乳动物时容易再生。当RBC已经按照许多已有的方法冻干时，例如在水溶液或磷酸缓冲盐水(PBS)中，再生细胞被破坏，使得其不能代谢，并且细胞的血红蛋白不能携带氧气。戊二酸固定被冻干和再生的红细胞主要应用于凝集分析。

已知可以进行低剂量γ射线辐射血液来预防输血相关的移植物抗宿主疾病。当给易患病的受体输入供体淋巴细胞时，发生移植物抗宿主疾病(GVHD)。这些供体淋巴细胞增生并损害靶器官，特别是骨髓、皮肤、肝脏和胃肠道，最终将会导致死亡。最早认为这种疾病是对接受全血辐射的患者进行子宫内灌注和给受体进行同种异源骨髓移植时发生的综合症。GVHD还出现在其他免疫功能缺陷的患者中，输入细胞血液产品或者少数情况下为移植器官使得这些患者暴露于供体的淋巴细胞中。最后，最经常报道的与输血相关的GVHD(TA-GVHD)的情况是免疫完善的血液受体，这些血液来自生物学相关的或HLA相同的供体。引发TA-GVHD的产品包括未被辐射的全血、包装红细胞、血小板、粒细胞和鲜新的未冷冻的血浆。不包括脱甘油的被冷冻的红细胞、鲜新的冷冻血浆和冷冻沉淀物。

一般认为，在此讨论的术语“血液产品”可以并通常包括全血(及其部分)、血小板和/或红细胞。如在此所用的术语“白细胞”是用于包括常见类型的白细胞，包括单核细胞和嗜中性粒细胞、淋巴细胞和任何存在于血液中的除了红细胞和血小板之外的其他细胞。此外，基本上“无细胞”的血液产品可以含有一些白细胞。目前，用γ射线辐射血液产品是已知的唯一能够防止输血相关的GVBD的方法。最常见的辐射源是钴-60和铯-137。绝大多数血液中心采用不小于15Gy的25Gy的常规剂量的这些同位素，辐射血袋的任意区域来灭活输液所用的细胞产品中的淋巴细胞。

困扰输血应用的许多问题之一是导致感染性疾病的因子的传播。由于病原生物体存在于全血的不同部分中，输血后的疾病的危险性随着所用的血液产品或组分不同而变化。一些制备用于人、兽医或试验用途的产品可能含有不期望的和潜在的危险污染物，如病毒、细菌、酵母、霉菌、支原体和寄生虫。大量这种感染性因子在临床上是及其重要的，其中这些因子不仅对受体患者是危险的，而且还危及内科医生，以及处理血液和血液产品的其他医院工作人员。因此，在使用这种产品之前确定其中不含污染物是非常重要的。这对于将该产品直接施用给患者是极其重要的，例如在输血、器官移植和其他形式的人类治疗中。

B. 抗体和起抗原作用的生物分子

现有技术在抗体和作为抗原的生物分子的保存方面是不完善的。目前，抗体被广泛用于诊断检测。实际上，许多细菌学和病理学的诊断通过依赖于抗体与特定抗原反应的检测来实施。这种检测包括简单的用于测定血液类型的血细胞凝集试验到ELISA(酶联免疫吸附分析)检测。抗体在室温存储使得它们可以在野战医院迅速被使用，例如军事作战的医院，可以在没有建立实验室设施的地区实现精确、快速的诊断。目前，由于要求和需要冷藏，使得采用抗体制备物治疗患者变得十分繁琐。因此，抗体的制备、运输和存储的费用太高，而且常常超出成本限定(cost-prohibitive)。

C. 用于医学应用的组织和器官

目前，冷冻保存是保存同种异体移植组织和用于移植的组织来源材料的主要手段。近来，已经有大量的库存骨骼和肌腱发生感染。通过辐射灭菌能够防止细菌和病毒病原体的传播。而且，辐射后在室温存储将极大地简化同种异体移植组织及其衍生物，包括骨骼、胶原和非细胞真皮的制备、保存和使用。

先前，大多数方法涉及筛选或检测由生物材料、生物化学实体和生物活性分子形成的产品中的特定污染物，而不是从产品中去除污染物。只是不使用被检测为污染物阳性的产品。筛选方法的例子包括检测来自血液供体的人血中的特定病毒。但是，这种方法并不总是可靠的。鉴于与假阴性结果相关的结论，降低了检测的价值和准确性。在某些情况下，假阴性结果会危及生命，例如，在获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的情况下，例如当检测人免疫缺陷病毒时(HIV)时。此外，在有些情况下，确定产品是否被污染即使不需要数月时间，也需要数周。

最近，人们致力于研究在使用生物材料、生物化学实体和生物活性分子之前去除或灭活其中的污染物的方法。这种方法包括热处理、过滤、添加化学灭活剂和使用γ射线或其他射线处理。已经充分证明，γ射线辐射对于破坏病毒和细菌是有效的。实际上，有位作者提出，γ射线辐射是用于降低和消除病毒含量的最有效方法。虽然已经通过辐射灭菌生物材料，但是该材料在加工后通常被冷却或冷冻存储。通过基于灭菌的严格加热来灭活病毒是不可取的，这种方法会破坏血液的功能成分、特别是红细胞(erythrocyte)(红细胞(red blood cell))和凝血细胞(血小板)和不稳定的血浆蛋白。

鉴于上述内容，需要提供一种灭菌含有生物材料、生物化学实体和生物活性分子的产品的方法，有效地去除生物污染物，并且同时不会对该产品产生副作用。不期望的生物污染物的例子包括病毒、细菌、酵母、霉菌、支原体和寄生虫。因此，非常期望具有一种安全和经济的方法和设备，其能够在将人的全血或血液产品输入给受体之前去除其中的致病性病毒、微生物或寄生虫，因此，防止受体被这些致病性因子感染。与此同时，适当去除污染的血液将不会对必须处理这些体液的医院工作人员造成日常的感染威胁。在存储和处理供体血液和血液产品的血库中，这种需求更加急切。同样期望具有一种安全和经济的方法和设备，其能够在将生物材料人或动物组织(如皮肤、骨骼、筋膜和肌腱)导入或移植到受体之前除去其中的致病性病毒、微生物或寄生虫，从而防止受体感染这样的疾病。因此，本发明满足这些和其他的需要。

发明概述

简要而概括地说，本发明在于通过辐射来保存生物材料、功能性生物化学实体和生物活性分子。本发明还包括用于制备在环境温度和室温存储，特别是不需要进行辐射前的冻干(冷冻干燥)或辐射后冷冻或冷藏的产品的方法，该产品衍生自生物材料、生物化学实体、生物活性分子。更加特别地，本发明涉及灭活组合物中的潜在生物污染物(如病毒、细菌、酵母、霉菌、支原体和寄生虫)，该组合物包括抗体、外周血液细胞(如，红细胞和血小板)、从全血(如病毒感染的人的血液)中收集的血浆蛋白片段(如，白蛋白和凝血因子)、体液(包括但是不限于，尿液，脑脊液，羊水和滑液)、用于制备抗病毒疫苗的离体介质、细胞培养介质(例如，胎牛血清和牛血清)或者衍生自这种组合物的产品，和用于静脉营养的糖、氨基酸、肽和脂肪的溶液。本发明还在于基于血液的蛋白质和生物来源的蛋白质，包括，但是不限于单克隆抗体、肉毒杆菌毒素和植物来源的蛋白质、血红蛋白(包含在和独立于红细胞)、抗体和疫苗。已有或潜在的污染不是评价本发明的先决条件。

迄今，辐射处理方法中的大部分工作集中在灭活污染物而提供结构和生物学功能大部分未被改变的生物材料的方法上。本发明建立在已知的辐射处理方法上，表明辐射处理不仅在灭菌上是有效的，而且在保存生物材料、生物化学实体和生物活性分子的功能方面也是有效的，而不需要在辐射后显著地控制灭菌产品的温度。本发明独特的保存和处理方法可使无菌产品在环境温度保存，同时保持产品的生物活性的功效和作用机制。

从多个方面看，这是一个显著进步。最重要的是，可以在环境温度保存被加工的材料，降低了如果没有严格地遵循处理方法而破坏材料的功效的危险。在全世界的许多地方，冷藏甚至仍是一种奢侈。由于这些地方不能够对药剂和疫苗保持冷藏，对它们采取常规灭活，这极大地影响这些地方的公共健康。如果能够在不发达地区提供能够在环境温度稳定的疫苗或生物材料，这将会对这些地区的人类健康产生极大的影响。在环境温度存储还将给发达地区带来极大影响，将会节约用于存储的开支和运输费用，在许多情况下将提供更加方便和容易使用的产品，并且使生产变得花费更少。

应用本发明的一种可能是制备用于医学用途的血液和血液成分。本发明包括灭菌和存储全血样本或小部分生物来源的蛋白质或结构的方法，以便充分地减少或消除传播传染性疾病特别是病毒性疾病的危险，该结构包括植物或动物来源的组成成分如细胞和组织。本发明还包括制备生物材料的方法，这种方法对于大部分医疗机构来说是低廉的和容易获得的。这种方法可以保存生物材料，而不需要冷藏或会导致大量的额外费用的其他处理。此外，本发明教导对生物蛋白质进行灭菌和稳定，例如灭菌抗体和血液的其他化学成分，使得生物蛋白质可以安全地存储在室温，并且在后来的使用中极大地降低细菌或特定的病毒污染的危险。

按照本发明的方法可以制备许多功能性生物材料。这种灭菌产品可以被用在用于预防或治疗病症或疾病的方法中，使得在将有效量的生物材料施用给患者之前，该生物材料可以存储在环境温度。类似地，由被辐射的生物材料、生物化学实体和生物活性分子形成的灭菌和稳定的产品可以被纳入到诊断检测方法和试剂盒中，和作为成分用于工业和化学过程中。同样地，也可以通过这种方法来灭菌和制备含有糖、氨基酸、肽和脂肪的营养液，以便存储在室内(环境)温度。

本发明的方法包括辐射一种或多种生物材料、生物化学实体和生物活性分子的方法，来保存其功能，并且可以在或者接近环境温度存储得到的灭菌和稳定的产品。适合用于本发明的功能性生物材料包括，但是不限于，血液或血液成分，例如红细胞、白细胞，包括单核细胞、血小板、凝血因子、免疫球蛋白，包括单一的或多聚的免疫球蛋白。同样适合的功能性生物材料包括，但是不限于，动物组织(包括哺乳动物和其他动物门的组织)，例如软骨、骨髓(包括骨髓细胞悬浮液)，完整的或加工的韧带、肌腱、神经、骨骼(包括脱矿物质的骨基质)、移植物、关节、股骨、股骨头、牙齿、皮肤移植物、心脏瓣膜、角膜、动脉、静脉、脂肪、糖、胶原(包括天然的、无纤维的(afibrillar)、聚合不全的(atelomeric)、可溶的和不可溶的、重组的和转基因的、天然序列和修饰的序列)和器官(包括用于移植的器官，如心脏、肝脏、肺、肾脏、肠、胰腺、四肢和指趾)。

类似地，本发明可以被应用于非细胞材料，例如蛋白质(包括重组的和转基因的蛋白质)、蛋白质材料、氨基酸、肽、糖、脂肪、酶(包括消化酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-葡糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronodate-2-sulfatase))、抗原、骨髓、壳质(chitin)及其衍生物(包括NO-羧基壳聚糖--NOCC)。本发明的方法和生成的产品的灭菌和稳定包括通过经受测定量到计算量的辐射来辐射生物材料、生物化学实体和生物活性分子，有效地降低病毒和细菌污染的危险，同时灭菌和稳定生物材料。

在本发明中，辐射方法可以在各种温度进行，包括但是不限于，从室温到非常低的温度的范围，包括液氮下的温度。在极少情况下，在辐射的同时加热目标样本是有利的。

结合附随的附图，从如下的详细描述，本发明的其他特征和优势将是显而易见的。这些附图作为实例阐明本发明的特征。

附图简介

附图1描述所检测的样本的特征的表格。

附图2描述有/无亚甲兰时，Hct对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图3描述有/无亚甲兰时，pO₂对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图4描述有/无亚甲兰时，O₂SAT对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图5描述有/无亚甲兰时，FO₂Hb对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图6描述有/无亚甲兰时，FMetHb对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图7描述有/无亚甲兰时，FHHb对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图8描述有/无亚甲兰时，Na对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图9描述有/无亚甲兰时，WBC对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图10描述有/无亚甲兰时，RBC对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图11描述有/无亚甲兰时，HGB对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图12描述有/无亚甲兰时，HCT对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图13描述有/无亚甲兰时，MCV对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图14描述有/无亚甲兰时，MCH对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图15描述有/无亚甲兰时，PLT对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图16描述有/无亚甲兰时，MCHC对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图17描述有/无亚甲兰时，RDW对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图18描述有/无亚甲兰时，MPV对应于兆拉德(Mrad)的图表。

附图19是滴定板的照片，表示在按照本发明进行辐射后4周仍保留生物学活性的抗体。

附图20是滴定板的照片，表示在按照本发明进行γ射线辐射并在室温保存四周后的红细胞的Wright染色。

附图21是滴定板的一部分的照片，表示在按照本发明进行辐射后4周仍保留生物学活性的抗体。

优选实施方案的详细描述

本发明涉及用于灭菌和保存生物材料、生物化学实体和生物活性分子(生物制品)来减少其中的一种或多种潜在的生物污染物或病原体的水平的方法，例如病毒、细菌(包括细胞间和细胞内的细菌，例如支原体、脲原体(ureaplasmas)、微型细菌(nanobacteria)、衣原体、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、单细胞或多细胞寄生虫，和/或朊病毒或者单独地或联合地引起可传播的海绵状脑病(TSE)的类似因子。存储这种生物制品的现有方法通常包括在灭菌之前冻干生物制品和/或在灭菌后和在人体内灌注或使用前冷藏该产品。先前公开的某些方法采用电离辐射，但是这种方法使用额外的添加剂和溶液与辐射结合。例如，有些试验目的在于去除白细胞，一般采用不能有效地灭活细胞和血浆中的病毒的低剂量辐射。在现有技术的文献中没有提及可以在辐射后将红细胞存储在室温。本发明的方法不需要那些额外的溶液。大量试验表明，红细胞不会被灭活已知致病性病毒所需的剂量所破坏。因此，本发明是一种在输入前保存和灭菌血液的简单方法和使该血液对受体来说更加安全的途经。

本发明提供一种更加简便的保存和存储红细胞同时提高该材料在辐射后的安全性的方法。现有技术没有提出可以在辐射后将红细胞存储在环境(如室内)温度。现有技术在辐射方法中还结合了其他的溶液。加入溶液可能是有益的，例如含有或不含钾结合试剂的缓冲液，其弥补了钾从红细胞中渗出。血袋中的溶液可能还包括额外的葡萄糖，给红细胞提供额外的能量来源。在它们基础的存储袋中，在合适的溶液环境中简单辐射红细胞适合于消除许多已知的病原体，使红细胞可以在室温存储。

I 污染物

如在此所用，术语“生物学污染物或病原体”是用于指一种直接或间接地与生物材料接触的污染物或病原体(单独地或联合)，可能对生物材料或其受体产生有害作用。这种生物污染物或病原体包括各种病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体、脲原体、微型细菌、衣原体、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、单细胞或多细胞寄生虫，朊病毒，引起TSE的因子，以及本领域技术人员已知的存在于或感染生物材料、生物化学实体和生物活性分子的其他因子。生物污染物或病原体的其他例子包括，但是不限于如下：病毒(例如人免疫缺陷病毒和其它逆转录病毒)、疱疹病毒、线状病毒、环状病毒(circoviruses)、副粘病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒(包括甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒以及它们的变体)、痘病毒、披膜病毒(togaviruses)、EB病毒和微小病毒(parvoviruses)；细菌(包括支原体、脲原体、微型细菌、衣原体、立克次氏体)，例如埃希氏菌属、杆菌属、弯曲菌属、链球菌属、和葡萄球菌属；寄生虫，例如锥虫属和疟疾寄生虫，包括疟原虫属各个种类；酵母；霉菌；和朊病毒，或者单独或联合地引起TSE，例如瘙痒症(scripe)、苦鲁病(kuru)、BSE(牛海绵状脑病)、CJD(Creutzfeldt-Jakob病)、Gerstmann-Straeussler-Scheinkler综合症和致命的家族性失眠症的类似因子。如在此所用，术语“活性生物污染物或病原体”用来指能够单独地或联合其他因子在生物材料中和/或生物材料的受体中产生有害作用的生物污染物或病原体，其他因子如第二种生物污染物或病原体或天然蛋白质(野生型或突变体)或抗体。

II 生物制品

A.生物材料

如在此所用，术语“生物材料”用来指任何来自或得自活的生物体的物质。生物材料的示例性例子包括，但是不限于，细胞、组织、血液、血液成分、蛋白质(包括重组蛋白、转基因蛋白和蛋白质材料)、氨基酸、肽(包括所有的天然和合成的肽)、糖、脂肪、酶，包括消化酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-葡萄糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)，免疫球蛋白(包括单一的免疫球蛋白(monoglobulin)和多聚免疫球蛋白(polyimmunoglobulin)、植物性药材和食物。生物材料的优选例子包括，但是不限于，韧带、肌腱、神经、骨骼(包括脱矿物质的骨基质、移植物、关节、股骨和股骨头)、骨髓(包括完整的或加工过的骨髓细胞悬浮液)、牙齿、皮肤移植物、心脏瓣膜、软骨、角膜、血管、器官(包括用于移植的器官，例如心脏、肝脏、肺、肾脏、肠、胰腺)、四肢、指趾、脂肪、糖、胶原(包括天然的、无纤维的、聚合不全的(atelomeric)、可溶的和不溶的，重组的和转基因的，天然和修饰的序列)、酶、壳质及其衍生物(包括NO-羧基壳聚糖″NOCC″)、干细胞、胰岛细胞和其他用于移植的细胞(包括遗传改变的细胞)、红细胞、白细胞(包括单核细胞)和血小板。

1.血液

迄今难以获得的所需的是一种快速和安全的灭菌用于输入的血液、血液成分和血液产品，同时保存输入的组成成分和蛋白质的重要功能的方法。辐射不仅提供一种用于制备安全性提高的输入成分的方法，而且可以在室温存储以前被冷冻和冷藏的血液成分和全血。这种产品以及制备它们的方法可以通过在室温进行存储，使血液和血液成分的供应变得更加安全和更容易获得，将是非常有益的。还可以预期，被辐射的血液和血液产品的保存限期将远远超过冷藏血液的期限。目前，大约20％的输血单位在输血前已经过期。延长保存期限将可以利用目前被浪费的那些过期的血液单位。因此，延长保存期限将会对增加血液供应产生影响，以及引入这种新技术产生的其他有益影响。

本发明在于处理组织来去除生物污染物，以及更加特别地在于灭菌和存储血液和血液成分。此外，本发明在于在辐射后将红细胞存储于室温。本发明还允许在室温运送和存储库存血液。如在此所用，术语“血液成分”用来指从全血中分离的一种或多种成分，包括但是不限于，细胞血液成分(例如红细胞、白细胞和血小板)，血液蛋白(例如血液凝血因子、酶、白蛋白、血纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白原和免疫球蛋白)和液体血液成分(例如血浆、血浆蛋白部分″PPF″、冷凝蛋白、血浆部分、以及含有血浆的组合物)。如在此所用，术语“液体血液成分”用来指全血的一种或多种液体的非细胞成分，例如血浆(凝结前存在于人或动物的全血中的液体的非细胞部分)和血清(凝结后存在于人或动物的全血中的液体的非细胞部分)。

如在此所用，术语“细胞血液成分”用来指全血的一种或多种成分，包括细胞，例如红细胞、白细胞、干细胞和血小板。存活的红细胞可以通过如下一个或多个特征来表征：能够合成ATP；细胞形态；P₅₀值；氧基血红素、高铁血红蛋白和半染色体数；MCV，MCH，和MCHC值；细胞酶活性；和体内存活。因此，如果细胞被冷冻干燥然后再生和被灭活病毒，该细胞将会被破坏，使得细胞不能够新陈代谢或合成ATP，或者危及细胞循环，进而危及其在输血治疗中的效用。相反，被辐射的红细胞在不需要核酸合成活性的情况下仍然可以从事生物化学功能。不同于大部分的其他哺乳动物细胞，红细胞独特地不具有细胞核，因此，红细胞具有更多的抗性靶点，因为那些蛋白质成分比该细胞的DNA小得多，从而更不可能被灭菌光束的辐射灭活，使得它们在辐射之后仍具有功能。

如在此所用，术语“血液蛋白”用来指一种或多种通常存在于全血中的蛋白质。动物的血液蛋白的示例性例子包括，但是不限于，维生素K依赖的(例如因子VII和因子IX)和非维生素K依赖(例如因子VIII和血管性血友病因子(vonWillebrands factor)的凝血蛋白、白蛋白、脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、补体蛋白、球蛋白(例如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE)。优选的一组血液蛋白包括因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、因子III(组织因子)、因子V(促凝血球蛋白原)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(血清凝血酶原、血清前转变素)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(St-P因子)、因子XI(血浆促凝血酶原激酶前体)、因子VII(哈格曼因子)、因子VIII(转谷氨酰胺酶原(protransglutamidase))、血管性血友病因子(vWF)、因子Ia、因子IIa、因子IIIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。其他优选的血液蛋白群体包括存在于红细胞内的蛋白质(例如血红蛋白)、各种生长因子和这些蛋白质的衍生物。

血浆和血清(已经形成凝块后的液相)是血液的组成。存在大量蛋白质和其他因子并且在广泛的医学应用中是有价值的。抗体存在于血浆和血清中。这些抗体可以被用于许多的应用中来治疗患者(当为γ球蛋白、汇集的抗体的情况下)以及用于研究。本文详细描述的保存红细胞的方法还可以被应用来制备抗体和其他蛋白质，其中这种分离物被辐射来灭菌以便可以在室温存储。这可以广泛在医学条件下和实验室研究中应用。这种技术可以被应用于抗体，该抗体从人的血液或从其他动物血液或从来自制备抗体的细胞培养物的组织培养液制备。这种技术还可以被用于制备在室温存储的灭菌病毒疫苗，从而极大地简化疫苗的分发和施用。此外，红细胞可以在室温被处理和存储，以用于红细胞凝集血液分型检测。

2. 血液袋

用于制备装灭菌和稳定的生物材料、生物化学实体和生物活性分子的袋子或其他容器的合适材料包括，但是不限于硅树脂、塑料和箔。例如，可压瘪的、可透氧的硅树脂袋子适合用于存储被辐射的生物制品，例如灭菌的和稳定的血液产品。使用这种袋子对于在输血前将在辐射过程中形成的高铁血红蛋白转化为氧基血红素是重要的。富含氧气的环境还有助于在低辐射总量下的辐射变得更有效。由多聚(乙烯乙酸乙烯酯)(E.V.A.)塑料制备的柔韧的、可压瘪的袋子可以从伊利诺斯州的Deerfield的Baxter Travenol Laboratories有限公司的Fenwal分公司购买到。

通常洗涤红细胞来减少血液中的白细胞数量。白细胞会引起受体对该血液的免疫反应。鉴于血液的细菌污染物的危险，这些洗涤操作将红细胞的保存期限减少到24h。重新将存储血液的袋子封口并进行辐射将会极大地延长保存期限。目前，辐射后的保存期限的标准为从辐射时开始的28天或该单位的原始有效期，以先到期的为准。这将极大地延长被洗涤的红细胞的保存期限。

B.生物化学实体

本发明在于通过辐射来保存功能性生物化学实体和生物活性分子，例如但是不限于，血红蛋白(包含在或独立于红细胞)，抗体，肽(天然的和合成的)，疫苗和其他抗原。更加特别地，本发明涉及灭活包含从全血(如病毒感染的人的血液)、体液(包括但是不限于，尿液、脊髓、羊水和滑液)、用于制备抗病毒疫苗的离体介质和细胞培养介质(例如胎牛血清和牛血清)中收集的抗体、外周血液细胞(例如红细胞和血小板)、血浆蛋白部分(例如白蛋白和凝血因子)的组合物或者衍生自这种组合物的产品中的潜在生物污染物(例如，病毒、细菌、酵母、霉菌、支原体和寄生虫)。本发明还包括用于制备在室温存储的全血产品的方法。本发明还在于血液蛋白和生物来源的蛋白质，包括但是不限于，肉毒杆菌毒素和植物来源的蛋白质。

在本发明的其他实施方案中，抗体、凝血因子、生长因子和其他生物来源的蛋白质，包括完整的病毒或其部分，可以用上面描述的用于血液和血液成分的辐射技术来保存。高剂量的γ射线辐射将会灭活细菌和病毒，并且使被辐射的材料可以在室温存储。这极大地提高了具有重要意义的生物制备物的可用性，如当前必须被冷藏的脊髓灰质炎疫苗，需要冷藏对于极少拥有能存储需要冷藏的疫苗的电冰箱的地区，如中非，来说是一种障碍。

C.生物活性分子

如在此所用，术语“蛋白质材料”用以指任何衍生自或来自活的生物体的材料，其包括至少一种蛋白质或肽。蛋白质材料可以是天然材料，处于其天然状态或被加工/纯化和/或衍生化，或者人工制备的材料，通过化学合成或重组/转基因技术以及，可选择地，被加工/纯化和/或衍生化来制备。示例性的蛋白质材料的例子包括，但是不限于，从细胞培养物中制备的蛋白质和肽、牛奶和其它乳制品；腹水；激素；生长因子；从动物组织或植物原料中提取或分离的材料(包括药物例如胰岛素)；血浆和血浆蛋白部分(包括鲜新的、冷冻的和冻干的)；纤维蛋白原及其衍生物(例如血纤蛋白、血纤蛋白I、血纤蛋白II、可溶性血纤蛋白、血纤蛋白单体和血纤蛋白密封剂产品)；全血；蛋白C；蛋白S；α-1抗胰蛋白酶(α-1蛋白酶抑制剂)；丁基-胆碱脂酶；抗凝血剂；链激酶；组织血浆酶原激活剂(tPA)；促红细胞生成素(EPO)；尿激酶；NEUPOGEN(filgrastim，一种粒细胞刺激因子)；抗凝血酶-3；α-半乳糖苷酶；艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；(胎)牛血清/马血清；肉(meat)；免疫球蛋白(包括抗血清、单克隆抗体，多克隆抗体和遗传工程的或制备的抗体)；白蛋白；α-球蛋白；β-球蛋白；γ-球蛋白；凝血蛋白；补体蛋白和干扰素。

III 辐射

如在此所用，术语“灭菌”用来指按照本发明降低存在于被处理的生物材料中的至少一种活性或潜在的活性生物污染物或病原体的水平。如在此所用，术语“辐射”用来指以足够能量的辐射来杀死被辐射的生物材料中的至少某些成分。辐射的种类包括但是不限于，微粒的(亚原子颗粒流-例如中子、电子和质子)；电磁的(在变化的电磁场产生-例如无线电波，可见光-单色的和多色的，不可见光，红外线，紫外线，x-射线，γ射线及其它们的混合)；声波和压力波。这种辐射通常被描述为电离辐射(能够在被辐射的材料中产生离子)-例如γ射线)，非离子辐射-如可见光。这种射线的来源是变化的，一般而言，特定辐射源的选择不是严格的，只要在合适的时间内产生足够的辐射并且以适当的比例来实现灭菌。实际上，γ射线通常通过同位素钴或铯来产生，而UV和X-射线分别通过能够发出UV和X-射线的机器来产生。在称作″电子束(e-beam)″辐射的方法中电子常常被用来灭菌材料，通过机器辐射该产品。单色和多色的可见光通过机器产生，实际上，包括了不可见光，例如红外线和UV，它们由相同的或不同的机器产生。

本领域知晓，通过用射线以有效灭菌生物材料的比率，以足以有效灭菌生物材料并防止生物材料被损坏的时间来灭菌对辐射敏感的生物材料。参见美国专利公开2003/0012687A1(Macphee等)，系列号09/973,958，现为美国专利6,xxx,xxx，其内容在此引入作为参考。然而，本发明建立在这些现有技术公开物上，并且描述首次知晓的灭菌和制备生物活性分子例如全血样本的γ射线的用途，所述生物活性分子用作可以存储在环境温度的生物试剂。鉴于传播感染性疾病如HIV、肝炎和其他病毒性疾病的危险，显然需要采用一种安全、有效和低廉的方法。限制这种技术有用性的唯一明显的因素是合适的生物活性分子(例如血液、血液成分、生物蛋白质、疫苗、病毒和其他抗原)和钴-60源或其他适合的射线源的可获得性。本发明的方法的成本低廉，以及生物活性分子不含有病毒的特别是不含有HIV，将使之成为制备这种应用于有各种需求的不同患者的生物活性分子的最具有吸引力的方法。由于按照本发明的该方法通常可以在环境温度进行，不需要在实施该方法之前冷却、冷冻或化学处理含有生物活性分子的产品，从而避免了一些现有技术的方法中具有的额外处理步骤。

通过本发明的一种方法，延长呈递γ射线的时间来充分地降低对含生物活性分子的产品的破坏。典型地，进行不少于10h的辐射，优选约20h-约40h，更加优选为约20h-约30h。辐射速率在约0.5kGy/h-约3.0kGy/h的范围内，取决于被灭菌的产品以及辐射时间的长度。给予辐射的总量通常在约20kGy-约32kGy的范围内，这种水平被证明是有效降低污染物如病毒的辐射量。辐射量呈递为4.0kGy/min达5min以及更长时间可以用于灭菌生物产品并保存功能，接着存储在室温。

通过γ射线辐射来保存生物活性分子(例如全血、血液成分、生物蛋白质和病毒实体)具有许多优点，使得可能在目前不能获得这种生物活性分子的地区可能使用这些生物活性分子，例如小医院、诊所和全世界的发展中国家。被辐射的全血的制备是低廉的并且容易实施，仅需要基本材料和获得钴-60源。被辐射的全血可以在架子上室温存储，而不需要液氮或低温冷冻设备中存储。应用被辐射的全血不需要进行其他全血保存方法中的解冻、洗涤或再水合。

在本发明的一种方法中，含有生物活性分子的产品可以以含有优选少于20％固体的形式被辐射。因此，某些产品可能在辐射前被稀释。以稀释的方式处理产品还可以减少产品在辐射过程中被降解。稀释液的选择取决于被辐射的产品的性质。例如，当辐射血细胞时，可以选择生理上可接受的稀释液，如柠檬酸磷酸葡萄糖。

本发明的方法可以用于处理对辐射敏感的有机产品。这种产品通过常规方法辐射时倾向于发生降解。但是，通过本发明的方法辐射敏感的产品将不会对该产品产生危害。该方法虽然不限于，但是通常被应用于生物产品例如血液和血液成分。在活细胞(例如血液细胞)被辐射的情况下，可以加入清除剂来结合对细胞有毒的游离自由基和其他物质。合适的清除剂包括，但是不限于，抗氧化剂、游离自由基清除剂和稳定分子的配体。

本发明的其他方面可以通过辐射生物活性分子样本足够长的时间来提供灭菌剂量的辐射来实施。因此，这种剂量采用辐射量测定的常规和常用的参数来计算。足以实现灭菌的辐射剂量在本领域是已知的。洗涤对于实施本发明并不是必需的。

包括γ射线辐射剂量和呈递该剂量来辐射红细胞的方案的例子包括：

(i)被呈递朝向容器的中心部分的辐射剂量应当为2500cGy，并且在任何其他位点的最小剂量应当为1500cGy；

(ii)呈递该剂量所需时间应当基于辐射源的辐射强度。辐射源的衰变应当按照生产商的介绍来计算。当前，FDA建议每年校正铯-137源，而半年校正钴-60。在标准的操作程序(SOP)中可以参考在用于辐射的操作者手册中所包括的计算衰变的方法；

(iii)SOP应当指明可以一次辐射的血液或血液成分单位的最大量。这是一个批量，应当按照装置生产商的程序和基于公司确认的数据来确定；和

(iv)对于容器的任何部分的总辐射剂量不应该超过5000cGy。

可选择地，血液可以被暴露于30.0kGy的辐射剂量，以杀灭血液中的细菌、病毒和其他潜在的病原体，接着存储在室温。

IV 实施例

附图1-21总结采用本发明的方法的实施方案对全血进行实施的试验数据。对于附图1，得自血库的血液用30kGy总剂量的γ射线辐射。在USP抗凝血剂柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤溶液(CPDA-1)血液包装单位(BaxterHealthcare Corporation，Deerfield，IL)回收血液。存储期满后，在进行辐射前在4℃保存一周。表中列举了辐射前后的几个血液特征。显然在辐射后，pO₂、HbO₂和O₂的饱和度显著降低。表明血色素中铁原子氧化状态的MetHb(高铁血红蛋白)显著地增加。该发现表明需要探索一种用于减少这些变化的方法，使得被辐射的血液在输血后能够更加容易地携带氧气。

试验结果表明，按照本发明辐射全血的效果可见于附图1。产生这些数据的用于试验的方案如下：在5ml真空试管中，用DETA抗凝的鲜新采集的全血在室温用γ射线以从0-50kGy的10kGy梯度的剂量辐射。半数试管作为配对试管的对照，其中加入0.01ml 1％的亚甲兰溶液(10mg/ml)。在分析前，通过简单地往含有亚甲兰的试管通人氧气来检测是否高浓度地形成氧基血红素。辐射后，在医院的血液实验室中采用常规机器分析血液样本。结果数值在附图2-21中描述。

参照附图2，该试验表明，在γ射线辐射全血后保持了血细胞比容，与本发明的教导一致。每个5ml的样本试管加入0.01ml 1％(10mg/ml)的亚甲兰溶液，与用于处理患者中的高铁血红蛋白血症的1-2mg/kg的药理学剂量相当。如附图3所示，部分氧气的压力曲线表明在含有亚甲兰和暴露于氧气条件下所进行的辐射后，在样本试管中有较高的PO₂。参照附图4，试验数据表明，在亚甲兰处理的被辐射样本中，血色素均具有一致的高(接近100％)氧饱和度。在无亚甲兰的试管中，2和3兆拉德(Mrads)饱和度被认为是由于血液在被制备来用于检测时被激活而发生氧化。这表明暴露于氧气的亚甲兰处理的被辐射血液能够结合氧气。如附图5所示，结合氧气的血红蛋白部分随着辐射剂量升高而下降。

参照附图6，该试验证明，提高辐射剂量与高铁血红蛋白含量的升高相关。相对于其他观察值，包括上述附图1中的那些数据，不含亚甲兰的试管的MetHb含量出乎意料地低。类似地，如附图7所示，在未添加亚甲兰的试管中，溶血后的游离血红蛋白部分更高。此外，血液样本试管中的钠浓度表现为一种相对的低钠血症。对照和含有亚甲兰的样本具有相似的数值(附图8)。同样地，如附图9和10所示，白细胞数量和红细胞数量不受辐射或亚甲兰存在的显著影响。

参照附图11，该试验数据表明，以gm％表示的血红蛋白的含量受辐射的影响。这被认为反应了从辐射诱导的变化产生的人为现象。其他附图已经表明了辐射后的巨红细胞症(macrocytosis)的血细胞比容升高，如在本文的某些样本中所示(附图12)。如附图13所示，平均细胞体积(mean corpuscularvolume)似乎随着辐射升高而变大，如其他附图所显示。附图14和16表示在按照本发明进行的试验中所测定的平均细胞血红蛋白(mean corpuscularhemoglobin)和平均细胞血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobinconcentration)。该数据还表明红细胞分布的宽度(附图17)与某一点的例外不具有显著的差别，该点表示某些种类的系统误差。这些数据还证明血小板数量升高(附图15)，可能是由于血液浓缩所致；然而，平均血小板体积在试验条件下没有发生显著变化(附图18)。

采用适当的血液学染色，在显微镜下检查来自全血的辐射单位的样本，在用30.0kGyγ射线辐射后，可以见到完整的红细胞(附图19)。生物化学分析表明，高铁血红蛋白血症可以用医学实践中使用的标准技术来逆转。显然，添加亚甲兰和暴露于氧气对于将存在于血红蛋白的氧化态Fe+++转化为通常存在于功能性血红蛋白的Fe++是有益的。此外，硅树脂血液袋可以在输血前将氧气扩散到血液中并且添加到Fe++原子上，有助于这种转化。

在本发明的一个实施方案中，来自HIV和肝炎阴性供体的全血可以在其即将过期的时候获得。这种HIV感染的血液可以在冷却到4℃保存，并用30kGyγ射线辐射，然后被运输和存储在室温更长时间。

在附图20中，显示抗A抗体能够凝集A组红细胞。对于该试验，抗A抗血清被分为两个等分试样。一份存储在电冰箱中，另一份用30kGyγ射线辐射并在室温存储1个月。在本试验中，在含有A组细胞的圆底孔的生理盐水中，用连续1∶2稀释的抗体检测两种抗血清凝集A组细胞的能力。被冷藏的抗体的滴度为1∶80，存储在室温的被辐射抗体的滴度为1∶40。

虽然已经阐明和描述本发明的特定形式，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的精神和保护范围时进行的各种改进是显而易见的。更加特别地，显然本发明并不限于保存特别叙述的生物材料、生物化学实体和生物活性分子，而且还应用于保存任何合适的未特别指出的生物制品。同样地，本发明不限于能够实现所公开的本发明的方法和产品的任何特定的医学装置结构。因此，除非由附随的权利要求限定，本发明是不被限定的。

Claims (22)

1.一种用于保存功能性生物材料的方法，包括：

提供功能性生物材料；

辐射生物材料来保存其功能；和

在第一种温度存储该生物材料。

2.权利要求1的方法，其中提供功能性生物材料包括提供选自红细胞、白细胞、单核细胞、血小板、凝血因子、免疫球蛋白、单一的球蛋白和多聚球蛋白的血液成分。

3.权利要求1的方法，其中提供功能性生物材料包括提供选自软骨、骨髓、骨髓细胞悬浮液、韧带、肌腱、神经、骨骼、脱矿物质的骨基质、移植物、关节、股骨、股骨头、牙齿、皮肤移植物、心脏瓣膜、角膜、动脉、静脉、器官、糖类和胶原的动物组织。

4.权利要求1的方法，其中提供功能性生物材料包括提供选自蛋白质、蛋白质材料、酶、抗原、氨基酸、肽、糖、脂肪和骨髓的非细胞材料。

5.权利要求1的方法，其中辐射生物材料包括以足以灭菌该生物材料的量来辐射该生物材料。

6.权利要求1的方法，其中辐射生物材料包括以足以灭菌该生物材料的量来γ射线辐射该生物材料。

7.权利要求1的方法，其中辐射生物材料包括以足以灭活病毒的含量来辐射该生物材料。

8.权利要求1的方法，其中辐射生物材料包括以足以杀死细菌的含量来γ射线辐射该生物材料。

9.权利要求1的方法，其中辐射生物材料包括γ射线辐射该生物材料以达到总的30kGy暴露量。

10.权利要求1的方法，其中辐射生物材料包括以约0.5kGy/h到约4.0kGy/min的比率γ射线辐射该生物材料约5min到约40h。

11.权利要求1的方法，其中存储生物材料包括使用前可以在室温保存生物材料。

12.权利要求1的方法，其中存储生物材料包括使用前可以在环境温度保存生物材料。

13.权利要求1的方法，其中存储生物材料包括维持生物材料在摄氏5℃到100℃之间的第一温度。

14.权利要求1的方法，其中存储生物材料包括维持生物材料在约10℃到约30℃之间的第一温度。

15.权利要求1的方法，还包括在生物材料的辐射过程中控制生物材料的第二温度。

16.权利要求1的方法，还包括在生物材料的辐射过程中维持生物材料的第二温度在约10℃到约30℃之间。

17.一种用于保存功能性生物化学实体的方法，包括：

提供功能性生物化学实体；

辐射生物化学实体来保存其功能；和

在环境温度存储该生物化学实体。

18.权利要求17的方法，其中辐射生物化学实体包括以足以灭菌该生物化学实体的量来辐射该生物化学实体。

19.一种用于保存功能性生物活性分子的方法，包括：

提供功能性生物活性分子；

辐射生物活性分子来保存其功能；和

在室温存储该生物活性分子。

20.权利要求19的方法，其中辐射生物活性分子包括以足以灭菌该生物活性分子的量来辐射该生物活性分子。

21.按照权利要求1-16的任何一项的方法制备的功能性生物材料。

22.一种用于预防或治疗一种病症或疾病的方法，包括：

按照权利要求1-16的任何一项的方法提供生物材料；

在环境温度存储该生物材料；和

将有效量的生物材料施用给患者。

Images