CN1658906A - 支原体多肽 - Google Patents
支原体多肽 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1658906A CN1658906A CN038131285A CN03813128A CN1658906A CN 1658906 A CN1658906 A CN 1658906A CN 038131285 A CN038131285 A CN 038131285A CN 03813128 A CN03813128 A CN 03813128A CN 1658906 A CN1658906 A CN 1658906A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- antibody
- cell
- mycoplasma
- cilium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 231
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 223
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 219
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 title claims abstract description 65
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 204
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 63
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 50
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 193
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 claims description 98
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 claims description 64
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 64
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 55
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 45
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 26
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 230000002725 anti-mycoplasma Effects 0.000 claims description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 15
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 15
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 15
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- HOLQXBRPSSZJMZ-FGRXCANLSA-N (2s)-n-[(2s)-1-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxop Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O HOLQXBRPSSZJMZ-FGRXCANLSA-N 0.000 description 11
- 210000000254 ciliated cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 241000202899 Mycoplasma flocculare Species 0.000 description 10
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 10
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 5
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 5
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 210000000215 ciliated epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N pyocyanin Chemical compound CN1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CC=CC2=O YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- -1 Ethylglycocoll Chemical compound 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 208000001572 Mycoplasma Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N thapsigargin Chemical compound CCCC(=O)O[C@H]1C[C@](C)(OC(C)=O)[C@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C(\C)=C/C)C(C)=C2[C@@H]2OC(=O)[C@@](C)(O)[C@]21O IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N 0.000 description 3
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 description 2
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 2
- 201000008235 Mycoplasma pneumoniae pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 108010026566 Mycoplasma pneumoniae receptor Proteins 0.000 description 2
- KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N N-methylisoleucine Chemical compound CCC(C)C(NC)C(O)=O KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 229940124034 Phospholipase C inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000001424 Ryanodine receptors Human genes 0.000 description 2
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000035559 beat frequency Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 2
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- DZNKOAWEHDKBEP-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[6-[bis(2-methoxy-2-oxoethyl)amino]-5-[2-[2-[bis(2-methoxy-2-oxoethyl)amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]-1-benzofuran-2-yl]-1,3-oxazole-5-carboxylate Chemical compound COC(=O)CN(CC(=O)OC)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC(C(=C1)N(CC(=O)OC)CC(=O)OC)=CC2=C1OC(C=1OC(=CN=1)C(=O)OC)=C2 DZNKOAWEHDKBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 208000008977 mycoplasmal pneumonia of swine Diseases 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 2
- 239000003371 phospholipase C inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- VQMSRUREDGBWKT-UHFFFAOYSA-N quinoline-4-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=CC=NC2=C1 VQMSRUREDGBWKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 108091052345 ryanodine receptor (TC 1.A.3.1) family Proteins 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- IADUEWIQBXOCDZ-VKHMYHEASA-N (S)-azetidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCN1 IADUEWIQBXOCDZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- JHTPBGFVWWSHDL-UHFFFAOYSA-N 1,4-dichloro-2-isothiocyanatobenzene Chemical compound ClC1=CC=C(Cl)C(N=C=S)=C1 JHTPBGFVWWSHDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZOMQRBLCMDCEG-CHHVJCJISA-N 1-[(z)-[5-(4-nitrophenyl)furan-2-yl]methylideneamino]imidazolidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1C(O1)=CC=C1\C=N/N1C(=O)NC(=O)C1 OZOMQRBLCMDCEG-CHHVJCJISA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-BKLSDQPFSA-N 3-hydroxy-L-proline Chemical compound OC1CCN[C@@H]1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-BKLSDQPFSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-BKLSDQPFSA-N 4-hydroxy-L-proline Chemical compound OC1C[NH2+][C@H](C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-BKLSDQPFSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229940121819 ATPase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 229940123344 GPR antagonist Drugs 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHNVWZDZSA-N L-allo-Isoleucine Chemical compound CC[C@@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 1
- NTWVQPHTOUKMDI-YFKPBYRVSA-N N-Methyl-arginine Chemical compound CN[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NTWVQPHTOUKMDI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OLNLSTNFRUFTLM-UHFFFAOYSA-N N-ethylasparagine Chemical compound CCNC(C(O)=O)CC(N)=O OLNLSTNFRUFTLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N N-methyl-L-valine Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(O)=O AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010059749 Pasteurella multocida toxin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007074 Phospholipase C beta Human genes 0.000 description 1
- 108010047834 Phospholipase C beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017898 Shiga Toxins Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 101710119641 Trypsin-6 Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 1
- AUALQMFGWLZREY-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;methanol Chemical compound OC.CC#N AUALQMFGWLZREY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000362 adenosine triphosphatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001987 dantrolene Drugs 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- VEVRNHHLCPGNDU-MUGJNUQGSA-O desmosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC[N+]1=CC(CC[C@H](N)C(O)=O)=C(CCC[C@H](N)C(O)=O)C(CC[C@H](N)C(O)=O)=C1 VEVRNHHLCPGNDU-MUGJNUQGSA-O 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 235000015177 dried meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000001501 megacaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003322 phosphorimaging Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-WHFBIAKZSA-N threo-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 210000005092 tracheal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229940048102 triphosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1253—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56933—Mycoplasma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/30—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
Abstract
本发明提供涉及支原体的方法和材料。例如,本发明提供的支原体多肽能增加细胞(如猪纤毛气管细胞)的钙释放以及提供的抗体能结合这种支原体多肽。另外,本发明提供鉴定支原体诱导猪纤毛气管细胞钙释放的抑制剂的方法。
Description
关于美国联邦赞助研究的声明
本文所述研究的资金由美国联邦政府提供,联邦政府可拥有本发明的一定权利。
背景
1.技术领域
本发明涉及支原体多肽制品以及含有抗支原体多肽抗体的抗体制品。
2.背景信息
支原体是一大群包括柔膜体(Mollicutes)纲类在内的多种原核生物。支原体缺乏细胞壁,基因组很小,种系发生上与革兰阳性真细菌类相关,是已知的最小自我复制生物体(Razin,Microbiol.Rev.,49:419-455(1985);Razin,FEMSMicrobiol.Lett.,79:423-432(1992);Razin和Jacobs,J.Gen.Microbiol.,138:407-422(1992))。支原体的表面显然是该微生物与其宿主细胞相互作用的关键部位(Freundt和Edward.1979.“分类和分类法”(Classification and taxonomy).1-42页.M.F.Barile和S.Razin(主编),《支原体》(The Mycoplasmas).Academicpress,New York,NY;Rogers等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1160-1164(1985);Woese等,J.Mol.Evol.,21:305-316(1984-1985))。
肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(Mhyo)是猪支原体肺炎的病原,它不断导致猪生产商的显著经济损失。此生物是一种胞外病原体定居于猪呼吸道上皮。肺炎支原体感染在与其它猪呼吸道病原体相关中的作用重要性增加(Ross,RF,1999.“支原体疾病”(Mycoplasmal diseases),495-509页,B.E.Straw,S.D'Allaire,W.L.Mengeling和D.J.Taylor(主编),《猪疾病》(Diseases ofswine).Iowa State University Press,Ames,IA)。例如,肺炎支原体可加重猪生殖和呼吸道综合症、病毒诱导的肺炎(Thacker等,J.Clin.Microbiol.,37:620-627(1999))。肺炎支原体首先通过破坏气管、支气管和细支气管纤毛上皮细胞来诱导肺炎(Debey等,Am.J.Vet.Res.,53:1705-1710(1992);Mebus和Underdahl,Am.J.Vet.Res.,38:1249-1254(1977);Tertyshnikova和Fein,CellCalcium.,21:331-344(1997))。然而,肺炎支原体诱导的纤毛损伤或纤毛损失的机制还不太了解。近来,发展了一种气管上皮细胞模型,使我们能研究肺炎支原体91-3的致病机理(Zhang等,Infect.Immun.,62:4367-4373(1994))。
肺炎支原体对纤毛上皮的粘附是诱导该生物定居所必须的,这导致纤毛损失(Mebus和Underdahl,Am.J.Vet.Res.,38:1249-1254(1977);Zhang等,Infect.Immun.,62:1616-1622(1994);Zhang等,Infect.Immun.,63:1013-1019(1995))。因此,支原体粘附其宿主细胞是支原体疾病发病中的一个重要起始步骤。粘附过程主要通过受体-配基相互作用所介导(Zhang等,Infect.Immun.,62:4367-4373(1994);Zhang等,Infect.Immun.,62:1616-1622(1994);Zhang等,Infect.Immun.,63:1013-1019(1995);Zielinski和Ross,Am.J.Vet.Res.,54:1262-1269(1993))。与此观念一致的是观察到肺炎支原体的强毒株体外能粘附气管组织纤毛,与肺炎支原体无毒株相反(Young等,Vet.Microbiol.,71:269-279(1999))。
概述
本发明涉及与支原体多肽制品相关的方法和材料,这些制品能增加猪纤毛气管细胞的钙释放。这种多肽制品可用于产生能阻断支原体诱导钙释放的多肽片段,且可用于产生能结合支原体多肽的抗体。本发明也提供能结合支原体多肽的抗体。这种抗体可用于抑制支原体诱导的钙释放并可用于鉴别致病和非致病性支原体。另外,本发明提供鉴定支原体诱导猪纤毛气管细胞钙释放的抑制剂。这种抑制剂可用于保护猪不发生支原体肺炎且可用于治疗患支原体肺炎的猪。
一般,本发明一个方面的特征是一种基本纯的多肽,其中该多肽能提高纤毛气管细胞的钙释放,该多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间。该多肽可以是支原体多肽。该多肽可获自致病性肺炎支原体。该多肽可以约80%纯度或约90%纯度。该多肽的分子量可约30、60、65、90或120kDa。该多肽可以是胰蛋白酶消化的片段。胰蛋白酶消化后的该多肽分子量可约35kDa或50kDa。
另一个方面,本发明的特征是能结合其多肽的基本纯的抗体,其中所述的多肽能提高猪纤毛气管细胞的钙释放,所述多肽的分子量在约30kDa和约150kDa之间。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是小鼠抗体。所述多肽可以是胰蛋白酶消化的片段。所述多肽可以是支原体多肽。所述多肽可获自致病性肺炎支原体。所述抗体可以约80%纯度或约90%纯度。
本发明又一方面的特征是一种诱导哺乳动物免疫应答反应的方法,其中所述免疫应答是针对支原体多肽的。该方法包括在哺乳动物生成抗支原体多肽抗体的条件下,给予哺乳动物基本纯的支原体多肽,其中所述多肽能提高猪纤毛气管细胞的钙释放,所述多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间。哺乳动物可以是小鼠、兔或猪。
本发明另外一方面的特征是使抗体结合多肽的方法,其中所述多肽能提高猪纤毛气管细胞的钙释放,所述多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间。该方法包括(a)获得能结合所述多肽的抗体,(b)在抗体结合所述多肽的条件下使抗体接触该多肽。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是小鼠抗体。所述多肽可以是支原体多肽。
本发明另一方面的特征是鉴定支原体诱导猪纤毛气管细胞钙释放的抑制剂的方法,。该方法包括(a)使细胞(如猪纤毛气管细胞)接触支原体多肽和测试化合物,其中所述多肽能提高猪纤毛气管细胞的钙释放,该多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间,(b)确定测试化合物是否能抑制细胞释放钙,其中测试化合物若能抑制细胞的钙释放,表明该测试化合物是抑制剂。测试化合物可以是蛋白酶或抗体。
在另一个实施方案中,本发明的特征是鉴定支原体多肽诱导细胞(如猪纤毛气管细胞)钙释放抑制剂的方法,其中所述多肽能提高纤毛气管细胞的钙释放,该多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间。该方法包括(a)使细胞(如猪纤毛气管细胞)接触已用测试化合物预处理的支原体多肽,(b)确定该测试化合物是否能抑制细胞释放钙,其中测试化合物若能抑制细胞的钙释放,表明该测试化合物是抑制剂。测试化合物可以是蛋白酶或抗体。
除非另有定义,本文所用的全部技术和科学术语与本发明涉及领域普通技术人员通常理解的含意相同。尽管与本文所述类似和相同的方法和材料可用于实施或测试本发明,但下面描述的是适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献全部纳入本文供参考。万一冲突,本说明书会予以控制,包括定义。另外,材料、方法和实施例仅用于阐述不应认为是限制。
本发明的其它特征和优点可从下列详细描述和权利要求而明白。
附图说明
图1包含描绘纤毛物若能抑制来自细胞猪气管细胞[Ca2+]i反应的3张图。资料是代表性扫描图,显示(a)致病性肺炎支原体菌株9-13(n=10,总共47个细胞)、(b)非致病性肺炎支原体菌株(n=6,总共18个细胞)和(c)絮状支原体(n=8,总共24个细胞)的作用。所有三种支原体制品的蛋白浓度是300μg/mL。箭头表示加入支原体。
图2是直方状图,描绘所示治疗的[Ca2+]i升高超过基础水平。PMH代表致病性肺炎支原体菌株9-13;NPMH代表非致病性肺炎支原体;MF代表絮状支原体。数据表示为平均值±SE。完整肺炎支原体9-13以30(在6次实验中n=18个气管细胞)、100(在7次实验中n=16个细胞)和300μg/mL(在10次实验中n=47个细胞)施用。絮状支原体(在8次实验中n=24个细胞)和非致病性肺炎支原体(在6次实验中n=18个细胞)以300μg/mL施用。箭头表示与其它处理相比有显著性差异(P<0.05)。
图3包含描绘接种肺炎支原体菌株9-13猪纤毛气管细胞的[Ca2+]i反应的4张图。资料是代表性扫描图,显示(a)无Ca2+的培养基(n=5个细胞)、(b)用毒胡萝卜素(TG;1μM)预处理30分钟(n=5个细胞)、(c)用U-73122(2μM;n=5个细胞)处理100秒和(d)U-73343(2μM;n=5个细胞)对肺炎支原体诱导的[Ca2+]i增加的效果。箭头表示加入完整支原体(300μg/mL)。
图4包括描绘猪纤毛气管细胞用百日咳毒素(PTX;100ng/mL)预处理3小时后接种肥大脱粒肽7(Mas7)或肺炎支原体的[Ca2+]i反应的4张图。资料是(a)肺炎支原体对照(n=9个细胞)的、(b)用PTX处理的肺炎支原体(n=11个细胞)、(c)Mas 7(10μM)对照(n=9个细胞)和(d)用PTX处理的Mas 7(n=9个细胞)的代表性扫描图。
图5是提出的肺炎支原体-纤毛气管细胞相互作用模型的示意图。Rc=受体;ER=内质网。
图6包括描绘接种Mhyo膜的猪纤毛气管细胞中[Ca2+]i反应的4张图,。各扫描图表示各气管细胞中的[Ca2+]i变化。箭头表示施用的时候。(A)膜制品(100μg/mL)增加了[Ca2+]i。(B)用蛋白酶K消化阻断了膜诱导的[Ca2+]i增加。将该膜(100μg/0.1mL PBS)37℃与蛋白酶K(2μg)一起孵育8小时,然后加到0.9mLKreb-Ringer重碳酸盐(KRB)缓冲液中的气管细胞上。(C)用胰蛋白酶消化加强了膜诱导的[Ca2+]i增加。将此膜(100μg/0.1mL PBS)37℃与胰蛋白酶(6μg)一起孵育30分钟,然后加到0.9mL KRB中的气管细胞上。(D)该可溶性膜蛋白比(A)中未消化的膜活性更高。超离心(100,000xg,60分钟)通过胰蛋白酶消化的膜获得上清,制备该可溶性蛋白。
图7是致病性(P)和非致病性(N)Mhyo的Mhyo膜多肽用猪抗Mhyo血清(1∶80)探测的免疫印迹照片。标记物泳道通过以kDa计的表观分子量(10μg/泳道)鉴定。箭头表示在致病性Mhyo,而不是非致病性Mhyo中观察到的多肽条带。
图8是致病性(P)和非致病性(N)Mhyo的Mhyo膜多肽的免疫印迹照片。样品用胰蛋白酶消化并用猪抗Mhyo血清(1∶80)探测。标记物泳道通过以kDa计的表观分子量(10μg/泳道)鉴定。箭头表示在致病性Mhyo,但不是非致病性Mhyo中观察到的多肽带。
图9是描绘采用阴离子交换HPLC纯化Mhyo膜多肽的胰蛋白酶消化片段的图。采用Tris缓冲液(pH8.5)而且的0-0.5M NaCl线性梯度液洗脱该多肽。洗脱物以280nm吸光率监测。数字3表示组分3;而数字4表示组分4。
图10是描绘组分4(10μg/mL)诱导猪纤毛气管细胞(n=8个细胞)中[Ca2+]i增加的图。此组分引起了[Ca2+]i增加。箭头表示加入该多肽组分。
图11是Mhyo多肽用抗Mhyo猪恢复期血清探测的免疫印迹照片。标记物泳道通过以kDa计的表观分子量鉴定。泳道1:组分#4(10μg/泳道);泳道2:纯化前Mhyo的可溶性胰蛋白酶消化片段(10μg/泳道);泳道3:组分#4(另一次纯化过程所得;5μg/泳道);泳道4:Mhyo的完整细胞抗原(10μg/泳道);泳道5:空白(无抗原)。第一抗体是猪抗血清(1∶100)。第二抗体是山羊抗猪血清(1∶1000)。阳性条带见于泳道1和3中约65kDa处。
图12是描绘用阴离子交换HPLC纯化Mhyo膜蛋白的胰蛋白酶消化片段的图。采用Tris缓冲液(pH8.5)配的0-0.5M NaCl线性梯度液洗脱该多肽。洗脱物以280nm吸光率监测。洗脱物的组分8表现出Ca2+释放能力。
图13是描绘组分8(1μg)诱导猪纤毛气管细胞(n=4个细胞)中[Ca2+]i增加的图。此组分是引起[Ca2+]i增加的唯一洗脱且分。箭头表示加入该多肽组分。
图14是描绘与用大豆胰蛋白酶抑制剂(TI)预处理的胰蛋白酶消化的Myho膜制品孵育后,猪纤毛气管细胞中[Ca2+]i增加的图。TI不能抑制Mhyo胰蛋白酶消化的膜制品诱导的纤毛气管上皮中[Ca2+]i增加。TI在37℃与胰蛋白酶消化的膜制品孵育10分钟,然后加入。纵座标显示以nM计的[Ca2+]i。各扫描图描述一个细胞中的[Ca2+]i变化。
详细描述
本发明提供涉及支原体的方法和材料。例如,本发明提供的支原体多肽能增加猪纤毛气管细胞的钙释放以及结合这种支原体多肽的抗体。另外,本发明提供方法可鉴定支原体诱导猪纤毛气管细胞钙释放的抑制剂,。
在一个实施方案中,本发明提供基本纯的多肽。如本文所用,术语“多肽”指具有或没有一种或多种翻译后修饰(如磷酸化或糖基化)的任何氨基酸残基链。本发明提供的多肽可是任何大小。例如,能增加猪纤毛气管细胞钙释放的多肽可以长10、25、50、75、100、125、150、175、200个或更多个氨基酸。另外,能增加猪纤毛气管细胞钙释放的多肽分子量可在约10kDa和约150kDa之间。例如,能增加猪纤毛气管细胞钙释放的多肽分子量可以约10、20、30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120kDa。此外,能增加细胞(如猪纤毛气管细胞)钙释放的多肽可以是胰蛋白酶消化的片段。在这种情况中,胰蛋白酶消化后的多肽分子量可在约10kDa和约80kDa之间。例如,胰蛋白酶消化后的多肽分子量可以约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80kDa。在一些实施方案中,能增加细胞(如猪纤毛气管细胞)钙释放的多肽(如全长多肽或胰蛋白酶消化片段)可来自致病性Mhyo菌株(如致病性肺炎支原体菌株9-13)。
如本文所用,术语“氨基酸残基”指天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基和氨基酸类似物,如果它们结构允许都可以是其D和L立体异构体。天然氨基酸残基包括但不限于丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸残基包括但不限于吖丁啶羧酸、2-氨基脂肪酸、3-氨基脂肪酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、六氢吡啶羧酸和N-甲基精氨酸。
如本文所用,术语“氨基酸类似物”所指的化合物,结构类似于天然多肽中通常所见的天然产生氨基酸残基,但组成不同,其C-末端羧基、N-末端氨基或侧链官能团被化学修饰成另一种官能团。氨基酸类似物包括但不限于天冬氨酸类似物天冬氨酸-(β-甲酯);甘氨酸类似物N-乙基甘氨酸和丙氨酸类似物氨甲酰丙氨酸。其它氨基酸残基和氨基酸类似物的例子列表于Gross和Meienhofer,《肽:分析、合成、生物学》(Peptides:Analysis,Synthesisi,Biology),Academic Press,Inc.,New York(1983)。氨基酸类似物可天然产生或合成制备。
可通过在氨基和羧基末端加入稳定剂以促进多肽体内存活,而修饰多肽用于体内使用。这可用于肽末端倾向于在细胞摄入前被蛋白酶降解的情况。这种阻断剂可包括但不限于其它相关或不相关的氨基酸序列,这些序列可结合多肽的氨基和/或羧基末端残基(如能结合N-末端氨基酸的乙酰基或能结合C-末端氨基酸的酰胺基)。这种结合可在多肽合成中通过化学反应,或通过重组DNA技术用标准方法实现。另外,阻断剂如焦谷氨酸或其它分子可结合氨基和/或羧基末端残基。在其它实施方案中,氨基末端的氨基和/或羧基末端的羧基可用不同分子取代。
多肽也可包含一氨基酸标志。如本文所用,术语“氨基酸标志”指一般较短的氨基酸序列,它可提供方便的检测方法和/或通过与该抗标的记抗体相互作用或通过能识别该标记的其它化合物和分子来纯化。例如,氨基酸标志如c-myc、红血球凝聚素、聚组氨酸或Flag有助于纯化和检测多肽。例如,含聚组氨酸标志的多肽可依靠组氨酸残基对镍离子的亲和性(如在Ni-NTA柱上)而纯化,可用抗聚组氨酸抗体(如Penta-His抗体;Qiagen,Valencia,CA)在蛋白质印迹中检测。可将氨基酸标志插入多肽序列中的任何地方。例如,可将氨基酸标志插入多肽的氨基和/或羧基末端。
本文所述多肽可用任何方法获得。例如,能增加细胞钙释放的多肽,可通过从天然来源(如来自Mhyo细胞)提取,通过表达编码该多肽的重组核酸或通过化学合成(如固相合成或其它本领域熟知的方法,包括用ABI肽合成仪合成;AppliedBiosystems,Foster City,CA)获得。另外,该多肽可通过例如高压液相层析(如反相HPLC)纯化,或可用凝胶电泳纯化。例如,可从凝胶切下对应于特定多肽的条带并洗脱以获得多肽制品。
本文提供的多肽可以是基本纯化。如本文所用,关于多肽的术语“基本纯的”指该多肽基本上没有其它多肽、脂类、碳水化合物和与其天然相伴随的核酸。因此,基本纯的多肽是从其天然环境中取得的任何多肽且至少60%优选75%,最优选90%,没有其它天然相伴随成分。本文提供的多肽可以是60%、65、70、75、80、85、90、95或99纯。通常,基本纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上产生单个主要条带。如果纯化Mhyo多肽并随后与例如佐剂或药学运载体混合就认为它是基本纯的,因为Mhyo多肽已与其天然相伴随的细胞成分分离。可用任何方法纯化本文提供的多肽。例如,亲和层析、免疫沉淀、大小排阻层析和离子交换层析可用于纯化Mhyo多肽。纯化程度可通过任何适当方法测定,包括但不限于:柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析。
可用任何方法确定特定多肽是否能增加细胞的钙释放。例如,本文所述技术可用于测定猪纤毛气管细胞的钙释放。
本发明也提供能结合本文所提供多肽的抗体。如本文所用,术语“抗体”指完整抗体以及保持某些选择性结合抗原表位能力的抗体片段。这种片段包括但不限于Fab、F(ab')2和Fv抗体片段。术语“抗原表位”指抗原上的抗原决定簇,它能与抗体的互补部分结合。抗原表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖残基)组成且一般具有三维结构特征以及带电荷特征。
在一个实施方案中,本发明提供的抗体对本文所提供多肽具有特异性结合亲和力。这种抗体能用于液相或结合固相的免疫试验。例如,本文提供的抗体可用于直接或间接方式的竞争性和非竞争性免疫试验。这种免疫试验的例子包括放射性免疫试验(RIA)和夹心(免疫测量)试验。
本文提供的抗体可用任何方法制备。例如,本文提供的任何基本纯的多肽或其片段可用作免疫原来诱导动物免疫应答反应,从而产生特异抗体。因此,完整的全长多肽或含小肽的片段可用作免疫用抗原。另外,用于免疫动物的免疫原可用化学合成或获自翻译的cDNA。此外,如果需要,可将免疫原与运载体多肽偶联。常用的化学偶联免疫多肽的载体,包括但不限于匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员熟知的(例如Green等,“产生多克隆抗血清”(Production of Polyclonal Antisera),《免疫化学方案》(ImmunochemicalProtocols)(Manson主编),1-5页(Humana Press 1992)和Coligan等,“在兔、大鼠、小鼠和仓鼠中产生多克隆抗血清”(Production of Polyclonal Antisera inRabbits,Rats,Mice and Hamsters),《免疫学的现代方案》(Current Protocolsin Immunology),2.4.1章(1992))。另外,可采用免疫学领域的常见多种技术纯化和/或浓缩多克隆抗体以及单克隆抗体(Coligan等,第9单元,《免疫学的现代方案》,Wiley Interscience,1994)。
单克隆抗体的制备也是本领域技术人员熟知的(例如Kohler和Milstein,Nature256:495(1975);Coligan等,2.5.1-2.6.7章;Harlow等,《抗体:实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual),726页(Cold Spring Harbor Pub.1998)。简言之,获得单克隆抗体可通过给小鼠注射含抗原的组合物,通过分析血清样品确认有抗体产生,取出脾脏以获得B淋巴细胞,将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤,克隆杂交瘤,选择能产生抗该抗原抗体的阳性克隆,从杂交瘤培养物中分离此抗体。单克隆抗体可通过多种已很好建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。这种分离技术包括但不限于用蛋白A琼脂糖亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析(Coligan等,2.7.1-2.7.12章和2.9.1-2.9.3章;Barnes等,“纯化免疫球蛋白G(IgG)”(Purificaiton of Immunoglobulin(IgG),《分子生物方法》(Methods in Molecular Biology),第10卷,79-104页(Humana Press1992))。
另外,单克隆抗体的体外和体内增殖方法是本领域技术人员熟知的。体外增殖可在适当的培养基中进行,如Dulbecco改良的Egale培养基(MEM)或RPMI 1640培养基,任选补充哺乳动物血清如胎牛血清或痕量元素和生长维持添加物,如正常小鼠腹膜渗出细胞、脾细胞和骨髓巨噬细胞。体外生产提供了相对纯的抗体制品并可放大,产生大量所需抗体。大规模杂交瘤培养可通过均匀悬浮液培养完成,在气升式反应器、连续搅拌反应器、或者固定的或包裹的细胞培养物中培养。进行体内增殖可通过注射细胞克隆到与亲代细胞组织相容的哺乳动物(如osyngeneic小鼠)中以导致产生抗体的肿瘤生长。动物在注射前任选用碳氢化合物预处理,具体是油如姥鲛烷(四甲基十五烷)。1到3周后,从动物体液中回收所需单克隆抗体。
抗体片段可通过蛋白酶水解完整抗体或表达编码该片段的核酸来制备。抗体片段可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得。例如,可用胃蛋白酶切割抗体产生抗体片段以提供名为F(ab')2的5S片段。此片段可用硫醇还原剂进一步切割,并任选用封闭基团封闭二硫键断裂产生的巯基以生成3.5SFab'单价片段。或者,用胃蛋白酶切割直接产生2个单价Fab’片段和Fc片段。这些方法的描述见例如Goldenberg(美国专利号4,036,945和4,331,647)和其他(Nisonhoff等,Arch.Biochem.Biophys.89:230(1960);Porter,Biochem.J.73:119(1959);Edelman等,《酶学方法》(Methods in Enzymology),第1卷,422页(Academic Press 1967);Coligan等,2.8.1-2.8.10章和2.10.1-2.10.4章)。
另外,本发明提供的方法和材料可用于鉴定能抑制支原体诱导细胞(如猪纤毛气管细胞)。钙释放(如Mhyo多肽诱导的钙释放)的化合物。鉴定支原体诱导的细胞钙释放的抑制剂的方法,可包括将细胞(如猪纤毛气管细胞),在测试化合物存在时与含支原体多肽(如致病性Mhyo的Mhyo多肽)的制品一起培养,确定测试化合物是否能抑制该细胞释放钙。在另一个实施方案中,鉴定钙释放抑制剂的方法可包括使细胞接触已预先用支原体多肽制品处理的测试化合物,确定测试化合物是否能抑制该细胞释放钙。钙释放可用本文所述任何方法测定。制品可以是Mhyo膜多肽粗制品、纯化的Mhyo多肽制品或Mhyo膜多肽制品的胰蛋白酶消化产物。如果含支原体多肽的制品诱导的钙释放在某化合物存在时与该化合物缺乏时相比减少,该测试化合物可鉴定为支原体诱导钙释放的抑制剂。“减少”指测试化合物存在时的钙释放低于(如低5%、10%、25%、50%、75%或100%)该化合物缺乏时。任何化合物均可用作测试化合物。例如,可用作测试化合物的分子是多肽(如蛋白酶、抗体、10-50个氨基酸的多肽)、寡核苷酸、酯、脂类、酯、碳水化合物或类固醇。本领域技术人员不难确定测试化合物的适当用量和适当的培养时间。
本发明在下列实施例中作进一步描述,这不限制权利要求所述的本发明的范围。
实施例
实施例1-肺炎支原体增加猪纤毛气管细胞中的胞内钙释放
测定了整致病性肺炎支原体、非致病性肺炎支原体和絮状支原体对猪纤毛气管上皮细胞中胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的作用。简言之,纤毛上皮细胞具有103±3nM的基础[Ca2+]i(n=217个细胞)。[Ca2+]i在致病性肺炎支原体菌株91-3(300μg/mL)加入100秒内从基础水平增加至250±19nM(n=47个细胞),持续约60秒。相反,300μg/mL的非致病性肺炎支原体和絮状支原体不能增加[Ca2+]i。在无Ca2+的培养基中,致病肺炎支原体仍增加了气管细胞中的[Ca2+]i。用毒胡萝卜素预处理(1μM,30分钟)耗尽内质网中的Ca2+贮存,去除了肺炎支原体的作用。用百日咳毒素(100ng/mL,3小时)或磷脂酶C抑制剂U-73122(2μM,100秒)预处理也去除了肺炎支原体的作用。加入百日咳毒素敏感蛋白(Gi/o)激活剂肥大(细胞)脱粒肽7,增加了纤毛气管细胞中的[Ca2+]i。这些结果提示致病性肺炎支原体活化了偶联于Gi/o的受体,进而活化磷脂酶C途径,导致内质网释放Ca2+。因此,Ca2+可用作肺炎支原体致病的一种信号。
材料和方法
所有试剂购自Sigma Chemical(St.Louis,MO),除了fura-2AM获自MolecularProbes(Eugene,OR),U-73122、U-73343和肥大(细胞)脱粒肽7(Mas 7)获自Biomol(Plymouth Meeting,PA)。
采用下列完整支原体:(1)致病性肺炎支原体菌株91-3,最初克隆自菌株232,它在微量滴定粘附试验中表现出对纤毛的高粘附性(Zhang等,Infect.Immun.,62:1616-1622(1994));(2)非致病性肺炎支原体菌株J(ATCC菌株25934),它不粘附纤毛(Zielinski和Ross,Am.J.Vet.Res.,54:1262-1269(1993));絮状支原体菌株Ms42(ATCC菌株27399),它在猪中不致病。将以上支原体在Friis培养基(Friis,Nord.Vet.Med.,27:337-339(1975))中培养到对数生长期,以15,000xg离心30分钟收集。离心后,收集支原体沉淀并用50mL PBS通过15,000xg离心15分钟洗三次。最终沉淀物通过27-号针头分散于PBS中。从200mL培养物(3.4±1.7×1011CCU,n=7)收集的支原体全细胞数用含Friis培养基的试管作系列稀释测定以颜色变化单位(CCU)表示。如上所述此细胞密度对应于2.70±0.08mg蛋白,用二金鸡宁酸方法(Pierce,Rockford,IL)测量,(Zhang等,Infect.Immmun.,62:4367-4373(1994)和Zhang等,Infect.Immun.,63:1013-1019(1995))。最终支原体浓度用PBS调至3mg蛋白/mL。
如上所述分离气管细胞(Young等,Vet.Microbiol.,71:269-279(1999))。简言之,以无菌技术从3-6月龄无特定病原体的用戊巴比妥钠麻醉的猪取得气管。用含0.15%链霉蛋白酶和0.01%DNA酶的无Ca2+和Mg2+的MEM培养基4℃孵育24小时解离获得纤毛细胞。上皮细胞通过125xg离心5分钟收集。将细胞沉淀重悬浮于DMEM(高葡萄糖)和Ham F-12(1∶1)培养基的混合液中,该混合液含有5%FBS、0.12U/mL胰岛素和100U/mL青霉素-链霉素。细胞悬浮液转至90mm组织培养皿在5%CO2中培养60-90分钟以去除成纤维细胞。气管上皮细胞保存于液氮直到使用。
下列技术用于获得单个细胞中的[Ca2+]i测定。气管细胞用Kreb-Ringer重碳酸盐(KRB)缓冲溶液配的4μM呋喃-2乙酰氧基甲酯(呋喃-2AM)上样,该溶液含136mM NaCl、4.8mM KCl、1.5mM CaCl2、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、10mM HEPES、5.5mM葡萄糖和0.1%BSA,pH7.4,37℃孵育30分钟。离心(700xg,2分钟)上样细胞,随后以500-1000个细胞/mL浓度重悬浮于KRB。用fura-2AM上样的气管细胞置于特制培养皿中的聚赖氨酸-包被盖玻片上。将含呋喃-2上样细胞的平皿放在倒置荧光显微镜(Carl Zeiss,NY)镜台上。在24℃时仅聚焦于活的纤毛气管细胞测定[Ca2+]i。fura-2上样的猪纤毛气管细胞在37℃时迅速退化。获得荧光图像(激发波长为334和380nm;发射波长为510±20nm),通过减去背景产生[Ca2+]i的空间分辨图,图像在像素-像素基础上划分。将发射的信号数字化、记录和用Attofluor数字荧光成像系统(Atto Instruments,Rockville,MD)加工。读取荧光150秒后,将支原体与该细胞系统混合。如上所述计算出[Ca2+]i(Grynkiewicz等,J.Biol.Chem.,260:3440-3450(1985))。根据Atto Instruments提供的程序原位进行校准,使用Fura-2 penta K+作为标准。
为比较气管细胞对致病性肺炎支原体菌株91-3、无毒肺炎支原体和絮状支原体的[Ca2+]i反应,细胞用300μg/mL的相同浓度处理。各实验中选出1-5个纤毛气管细胞用于研究[Ca2+]i的变化。这些支原体在加到气管细胞前保持于冰上。
为研究Ca2+信号传递途径,将百日咳毒素(PTX,100ng/mL)与气管细胞预先孵育3小时。用毒胡萝卜素(TG,1μM)37℃预处理细胞30分钟,然后加入支原体以耗尽ER Ca2+贮存(Thastrup等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2466-2479(1990))。细胞用磷脂酶C抑制剂U-73122(2μM)(Bleasdale和Fisher,Neuroprotocols,3:125-133(1993))或其无活性类似物U-73343 37℃预处理100秒,然后加入支原体。为证实支原体可通过活化Gi/o蛋白来增加[Ca2+]i,用此蛋白的活化剂Mas7(10μM)(Higashijima等,J.Biol.Chem.,265:14176-14186(1990))来测定它是否能增加气管细胞中的[Ca2+]i。另外,测定了PTX是否能阻断Mas 7所致的[Ca2+]i增加。
用ANOVA或Student t-检验分析关于[Ca2+]的数据。显著水平设置为P<0.05。支原体对猪纤毛气管上皮细胞中[Ca2+]i的作用
肺炎支原体菌株91-3能结合猪气管细胞的纤毛(Debey等,Am.J.Vet.Res.,53:1705-1710(1992);Mebus和Underdahl,Am.J.Vet.Res.,38:1249-1254(1977);Tajima和Yagihashi,Infect.Immun.,37:1162-1169(1982))。测定了纤毛气管细胞接种菌株91-3后的[Ca2+]i变化。纤毛上皮细胞具有103±3nM的基础[Ca2+]I(n=217个细胞)。接触300μg/mL的肺炎支原体菌株91-3后,观察到89%的细胞(10次实验53个细胞中的47个)中[Ca2+]i增加。如图1和2所示,加入致病性肺炎支原体菌株91-3(300μg/mL)在100秒内增加了纤毛细胞中的[Ca2+]i。相反,非致病性肺炎支原体(6次实验中的18个细胞)和絮状支原体(9次实验中的24个细胞)在相同浓度(300μg/mL)不增加[Ca2+]i(图1)。
在剂量-反应研究中,30μg/mL的肺炎支原体菌株91-3(6次实验中的18个细胞)不显著改变[Ca2+]i(图2)。然而,100μg/mL(7次实验中的16个细胞;84%的细胞有反应)和300μg/mL(10次实验中的47个细胞;89%的细胞响应)分别使[Ca2+]i增加至110±9nM和250±19nM(图2)。
由于肺炎支原体菌株91-3可能通过其分泌产物增加纤毛细胞中的[Ca2+]i,15,000xg离心15分钟后收集支原体(300μg/mL)上清液测试其增加[Ca2+]i的能力。这些上清液不增加纤毛细胞中的[Ca2+]i,。
肺炎支原体菌株91-3在无Ca2+培养液中的作用
为确定胞外Ca2+的参与,实验用无Ca2+培养液进行,培养液中添加了10μMCa2+螯合剂EGTA。肺炎支原体菌株91-3(300μg/mL)仍能增加[Ca2+]i(之前:117±6nM,之后:324±31nM,4次实验中的10个细胞;84%的细胞有反应)(图3a)。这些结果表明增加归于胞内贮存的Ca2+释放,而不是通过Ca2+流入机制。
TG对肺炎支原体诱导[Ca2+]i增加的作用
为确定内质网(ER)是否是Ca2+释放的来源,纤毛细胞用1μM微粒体Ca2+-ATP酶抑制剂TG处理30分钟。在以前的研究中,发现TG能耗尽ER Ca2+贮存(Thastrup等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2466-2479(1990)),因为它能去除离子霉素诱导的猪纤毛气管细胞胞内Ca2+的释放。类似的,TG处理可去除肺炎支原体菌株91-3(300μg/mL)诱导的[Ca2+]i增加,证明此生物体可引起猪气管上皮细胞的ER Ca2+释放。
U-73122和U-73343对肺炎支原体诱导[Ca2+]i增加的作用
由于肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)可从ER释放Ca2+,而IP3的生成受磷脂酶C(PLC)的催化,进行了下列实验。气管细胞用2μM特异性PLC抑制剂(Bleasdale和Fisher,Neuroprotocols,3:125-133(1993))作预处理,然后接种肺炎支原体菌株91-3,去除了纤毛细胞中支原体诱导的[Ca2+]i增加(图3c)。相反,U-73122的无活性类似物U-73343不能防止对支原体的[Ca2+]i反应(基础:90±12nM,峰值:330±25nM,4次实验中的10个细胞;82%的细胞有反应)(图3d)。这些发现支持肺炎支原体诱导的[Ca2+]i增加是通过活化PLC而介导。
PTX对肺炎支原体和Mas 7诱导[Ca2+]i增加的作用
进行了下列实验以评估PTX敏感G蛋白是否能介导肺炎支原体菌株91-3的作用。在不处理对照细胞中,肺炎支原体菌株91-3增加了[Ca2+]i(254±57nM,3次实验中的9个细胞;81%的细胞有反应;图4a)。相反,纤毛细胞用100ng PTX/mL预处理3小时去除了肺炎支原体诱导的[Ca2+]i增加(图4b)。这些结果表明肺炎支原体活化了偶联PTX敏感性G蛋白(Gi/o)的受体。为证实Gi/o蛋白参与了气管细胞中的[Ca2+]i增加,研究了Gi/o活化剂Mas 7(Higashijima等,J.Biol.Chem.,265:14176-14186(1990))对[Ca2+]i的作用。将10μM Mas 7加入纤毛气管细胞在100秒内引起[Ca2+]i从103±4nM的基础水平增加到351±4nM(3次实验中n=9个细胞,82%细胞有反应)(图4c)。用PTX预处理这些细胞去除了Mas 7的作用(图4d)。这些结果证明活化纤毛细胞中的Gi/o能增加[Ca2+]i。
肺炎支原体通过结合纤毛上皮细胞而定居于猪呼吸道(Mebus和Underdahl,Am.J.Vet.Res.,38:1249-1254(1977);Tajima和Yagihashi,Infect.Immun.,37:1162-1169(1982);Zhang等,Infect.Immun.,62:1616-1622(1994))。粘附通过表面蛋白P97介导(Hsu和Minion,Infect.Immun.,66:4762-4766(1998);Hsu等,J.Bacteriol.,179:1317-1323(1997);Minion等,Infect.Immun.,68:3056-3060(2000))。随即迅速发生纤毛运动停滞和纤毛损失(Debey和Ross,Infect.Immun.,62:5312-5318(1994))。如本文所证明,Ca2+流出与纤毛损失相连系。致病性肺炎支原体菌株91-3增加猪纤毛气管细胞中的[Ca2+]i。相反,肺炎支原体非致病菌株J和絮状支原体不能做到这点,表明结合纤毛是Ca2+流出诱导的先决条件。肺炎支原体菌株J不能结合猪纤毛(Zhang等,Infect.Immun.,63:1013-1019(1995))。[Ca2+]i反应是一种快速反应,其增加取决于支原体浓度。在另一项关于肺炎支原体诱导嗜中性粒细胞中[Ca2+]i增加的研究中,107-1010CCU的致病菌株提高了酵母聚糖诱导的[Ca2+]i增加,而非致病菌株不能(Debey等,Vet.Res.Commun.,17:249-257(1993))。加入支原体后90分钟内,致病性肺炎支原体菌株91-3(109CCU)粘附于呼吸上皮细胞的纤毛导致纤毛混乱、聚集和纵裂,而非致病性肺炎支原体菌株不显示纤毛破坏(Debey等,Am.J.Vet.Res.,53:1705-1710(1992);Young等,Vet.Microbiol.,71:269-279(1999))。因此,气管上皮细胞中的[Ca2+]i变化涉及肺炎支原体的致病作用。
对肺炎支原体反应时分离纤毛细胞中的[Ca2+]i增加量级,随细胞而不同,但通常随支原体浓度提高而增加。呼吸道上皮细胞中Ca2+反应的不均一性类似于报道的神经胶质细胞(VandenPol等,J.Neurosci.,12:2648-2664(1992))、胆管细胞(Nathanson等,Am.J.Physiol.,271:G86-G96(1996))、巨核细胞(Tertyshnikova和Fein,Cell Calcium.,21:331-344(1997))和软骨细胞(D’Andrea和Vittur,J.Bone Miner.Res.,11:946-954(1996))中的胞外ATP作用。在兔呼吸上皮细胞中,Ca2+反应的不均一性是由于各个细胞对胞外ATP的敏感性不同(Evens和Sanderson,Am.J.Physiol.,277:L30-L41(1999)和Korngreen等,J.Physiol.(Lond.)508:703-720(1998))。
已报导在其它细菌中[Ca2+]i的增加是由于微生物或其毒素所致。完整的伤寒杆菌肠上皮中的[Ca2+]i,增加介导了这些细胞的IL-8分泌增加(Gewirtz等,J.Clin.Invest.,105:79-92(2000)和Pace等,Cell.,72:505-514(1993))。伤寒杆菌如何诱导[Ca2+]i增加仍不清楚。大肠杆菌肠毒素可通过从HEp-2细胞释放ER Ca2+来提高[Ca2+]i(Baldwin等,Infect.Immun.,59:1599-1604(1991))。此种释放归因于ryanodine受体Ca2+释放通道的活化,因为ryanodine受体拮抗剂硝苯呋海因可阻断此种作用(Danko等,Biochim.Biophys.Acta.,816:18-24(1985)及Heine和Wicher,Neuroreport.,9:3309-3314(1998))。然而,能产生完整verocytotoxin的大肠杆菌可通过IP3途径从HEp-2细胞释放Ca2+(Ismaili等,Infect.Immun.,63:3316-3326(1995))。绿绿假单胞菌分泌的氧化性毒力因子绿脓素可增加人呼吸道上皮细胞中的IP3形成和[Ca2+]i,但能减少G蛋白偶联受体拮抗剂诱导的IP3和[Ca2+]i增加(Denning等,Am.J.Physiol.,274:L893-L900(1998))。绿脓素诱导的氧化可引起IP3形成增加(Denning等,Am.J.Physiol.,274:L893-L900(1998))。巴斯德菌multocida毒素(PMT)通过活化Gq-偶联PLC-β1同工酶能增加动物不同的完整细胞中的[Ca2+]i(Wilson等,J.Biol.Chem.,272:1268-1275(1997))。此PMT作用主要归于它直接活化Gq-PLC途径,因为将PMT绕过浆膜受体显微注射到非洲爪蟾卵母细胞中仍能活化Gq-PLC,(Wilson等,J.Biol.Chem.,272:1268-1275(1997))。
一些细菌胞外结构能增加宿主细胞的[Ca2+]i。例如,致病奈瑟球菌(Neisseria)的IV型菌毛能粘附于宫颈癌衍生的上皮样人细胞系ME180,通过菌毛受体提高[Ca2+]i(Kallstrom等,J.Biol.Chem.,273:21777-217782(1998))。[Ca2+]i的增高是建立细菌和宿主细胞间稳定接触起初步骤所必需的(Kallstrom等,J.Biol.Chem.,273:21777-217782(1998))。然而,不清楚奈瑟球菌的菌毛如何引起[Ca2+]i增加。
致病性肺炎支原体菌株91-3在无Ca2+培养基中能增加[Ca2+]i,表明[Ca2+]i增加归因于胞内贮存的Ca2+释放。气管细胞用TG预处理以耗尽ER Ca2+贮存,从而消除了支原体的作用,证实此细胞器参与Ca2+释放。气管细胞用特异性PLC抑制剂U-73122预处理也防止了支原体诱导的[Ca2+]i增加,表明支原体诱导的ER Ca2+释放通过PLC途径。
本文提供的结果说明呼吸上皮中的肺炎支原体受体偶联于Gi/o。活化PLC也与观察到的A1腺苷受体-介导的现象一致(Tomura等,J.Biol.Chem.,272:23130-23137(1997))。Gi/o蛋白通常负责腺苷酰环化酶的抑制、调节K+和Ca2+通道、活化cGMP磷酸二酯酶。在Gi/o蛋白中,G12和Gi3能调节2种信号传递途径;PLC活化由Gβγ二聚体介导,而腺苷酰环化酶抑制由αi介导(Tomura等,J.Biol.Chem.,272:23130-23137(1997))。
总之,本文提供的结果表明致病性肺炎支原体受体偶联于Gi/o。一旦发生这些受体的结合,此G蛋白激活PLC途径通过提高ER的Ca2+释放来增加[Ca2+]i(图5)。另外,粘附素实验证明肺炎支原体的粘附素包括P97不能提高[Ca2+]i。同样,猪纤毛气管细胞用肺炎支原体菌株91-3接种在接种3分钟内增加了纤毛搏动频率,与这些细胞中的[Ca2+]i增加相一致。这些结果与所见到的绵羊呼吸道上皮细胞中Ca2+对纤毛搏动频率作用相一致(Salathe和Bookman,J.Physiol.(Lond.),520:851-865(1999)),从而支持[Ca2+]i的变化涉及到支原体的致病作用。
实施例2-可诱导猪纤毛气管细胞中[Ca2+]i 增加的Mhyo多肽的特征分析和纯化
支原体缺乏细胞壁且只有一种类型的膜即质膜(Razin S.(1993)“在膜研究中作为模型的支原体膜”(Mycoplasma membrances as models in membrancesresearch)(第2章),《亚细胞生化》(Subcellular Biochemistry).第20卷:支原体细胞膜,Rottem S,Kahane I.主编.Plenum Press,New York.1-28页)。Mhyo膜可通过渗透裂解该生物体来制备并测试以确定纤毛气管细胞中的[Ca2+]i是否增加。Mhyo膜可提高纤毛气管细胞中的[Ca2+]i(图6A)。用蛋白水解酶蛋白酶K或木瓜蛋白酶预处理此膜8小时可消除此膜的作用(图6B)。这些结果证明有一种膜多肽引起此作用。令人感兴趣的是胰蛋白酶预处理30分钟不仅不能减少[Ca2+]i增加,甚至还加强膜的作用(图6C)。胰蛋白酶预处理30分钟仍不能降低此膜对[Ca2+]i的作用。胰蛋白酶消化的膜能产生含更多该受体抗原表位的多肽片段。将支原体的胰蛋白酶消化片段进行超离心(100,000xg,60分钟)。所得含有可溶性多肽的上清液,也能增加纤毛上皮中的[Ca2+]i。此溶解的膜多肽提高[Ca2+]i的活性至少比未消化膜强10倍(图6D)。
采用蛋白质印迹技术比较致病性Mhyo(91-3)和非致病性Mhyo(菌株J)的外膜多肽。致病性Mhyo的样品显示有5条多肽条带,在非致病Mhyo的样品中未显示(图7)。5条多肽条带分别对应于分子量30、60、65、90和120kDa。
采用蛋白质印迹技术比较胰蛋白酶消化后的致病性Mhyo(91-3)和非致病性Mhyo(菌株J)的外膜多肽。致病性Mhyo的样品显示有2条多肽条带在非致病性Mhyo的样品中未显示(图8)。此2条多肽条带分别对应于分子量35和50kDa。
用凝胶电泳(21cm×50cm)可收集量大于约10μg的这5种多肽。一旦收集到,用该多肽制品进行[Ca2+]i试验以确定哪种多肽能增加纤毛气管细胞中的[Ca2+]i。另外,用2维电泳进一步纯化各多肽。用质谱在进行N-末端蛋白测序前确认各多肽纯度。一旦确定了N-末端氨基酸序列,搜索序列数据库以鉴定全长Mhyo多肽的氨基酸序列。
溶解的Mhyo多肽通过HPLC用阴离子交换柱,采用Tris缓冲液(pH8.5;图9)配的0-0.5M NaCl线性梯度液纯化。组分#4是早期组分,在纤毛气管细胞中显示具有[Ca2+]i提高活性(图10)。蛋白质印迹分析显示组分#4含有抗Mhyo恢复期血清识别的65kDa条带(图11)。此65kDa多肽条带也见于Mhyo全细胞制品中。
由于组分#4对应的峰在NaCl梯度应用之前或稍后洗脱,进一步分析了后面的部分。此分析显示组分#8也能增加纤毛气管细胞中的[Ca2+]i(图12和13)。组分#8在0.4M NaCl梯度时洗脱。这些结果表明组分#8含有纯化的外膜Mhyo多肽,在纤毛气管细胞中表现具有[Ca2+]i提高活性。
使用离心过滤器,测定了能增加纤毛气管上皮中[Ca2+]i的胰蛋白酶消人多肽片段的大小。用30kDa孔径的滤器的滤过物不能增加[Ca2+]i,而用100kDa孔经滤器的滤过物能增加纤毛气管上皮中的[Ca2+]i。这些结果表明引起纤毛气管上皮中[Ca2+]i提高的胰蛋白酶消化多肽片段大小可能在约30和约100kDa之间。
根据最近的报导,0.1U/mL的胰蛋白酶能增加豚鼠气管上皮中的[Ca2+]I(Oshiro等,Life Sci.,71:547-558(2002))。由于本文所述[Ca2+]i实验中估计的胰蛋白酶浓度约为1U/mL,我们测试了胰蛋白酶是否在观察到的胰蛋白酶消人片段诱导[Ca2+]i增加中发挥作用。发现单用≥1U/mL的胰蛋白酶能增加猪纤毛上皮中的[Ca2+]i。然而,用大豆胰蛋白酶抑制剂(10U/mL)处理抑制了胰蛋白酶(10U/mL)诱导的[Ca2+]i增加,但不能阻断观察到的胰蛋白酶消化的Mhyo多肽片段诱导[Ca2+]i增加(图14)。这些结果证明胰蛋白酶Mhyo制品对[Ca2+]i的刺激作用归因于Mhyo多肽,而不是胰蛋白酶。
实施例3-获得能诱导猪纤毛气管细胞中[Ca2+]i 增加的Mhyo多肽的氨基酸序列
将有毒Mhyo菌株91-3在添加20%无支原体猪血清的Friis培养基中培养并如上所述离心收集(Zhang等,Infect.Immun.,62:1616-1622(1994))。生物体进行渗透裂解和离心(35,000xg,60分钟)获得上述膜制品(Pollack JD.(1998)“酶分析”(Enzyme analysis)(第10章),《分子生物学方法》.第104卷:支原体操作,Miles R & Nicholas A主编.Humana Press,Iotowa.NJ.79-93页)。将此膜制品悬浮于PBS并用胰蛋白酶以17∶1比例(w/w)37℃处理30分钟,接着超离心(10,000xg,60分钟)。所得上清液含有活性胰蛋白酶消人片段,通过HPLC纯化,采用阴离子交换柱(Waters,DEA 5TW型)和Tris缓冲液(pH8.5)配的0-0.5M NaCl线性梯度液。以280nm吸光率监测洗脱,收集组分4和8并进一步通过C18反相HPLC纯化,采用水中0.08%三氟乙酸水溶液配的0-60%乙腈线性梯度液。或者,用凝胶过滤、疏水相互作用或大小排阻层析柱技术进一步纯化此多肽。用Sep-pak浓缩纯化多肽,用乙腈-甲醇作为溶剂系统来洗脱。在氮气流下去除溶剂。此外,用SDS-PAGE确认该多肽的分子量。纯化后,测定收集自明显峰洗脱物的增加纤毛气管细胞中[Ca2+]i的能力。所得多肽制品的纯度通过质谱(Voyager,DE PRO型)测定。
C18HPLC纯化和质谱确定的该多肽用Applied Biosystems蛋白测序仪(494型)进行N-末端氨基酸测序。或者,内部序列信息可获自用溴化氰切割和酶如内切蛋白酶Lys-c切割产生的片段。纯化切割片段并进行N-末端氨基酸测序。一旦确定N-末端氨基酸序列,搜索序列数据库以鉴定全长Mhyo多肽的氨基酸序列。
用下列方法测定纤毛气管细胞中的[Ca2+]i增加。气管细胞获自无Mhyo的猪,如Yamaya等(如.Am.J.Physiol.,262:L713-L724(1992))所述。简言之,纤毛气管上皮细胞用0.15%链霉蛋白酶和0.01%DNA酶在无Ca2+和Mg2+的MEM培养基中通过酶消化分离并在4℃孵育24小时。加入胎牛血清终止酶消化。细胞取自气管并用Dulbecco MEM和Ham F-12(1∶1)培养液离心洗涤。将这些细胞冷冻于液氮中。当要使用时,37℃迅速解冻细胞使其粘附于特制的30mm培养皿5mm孔中的盖玻片上,该盖玻片已用Kreb-Ringer重碳酸盐(KRB)缓冲液配的聚赖氨酸包被。这类培养皿中的培养体积为200μL。各个细胞的[Ca2+]i测定方法采用上述图像系统进行(ZhuGe和Hsu,J.Pharmacol.Exp.Ther.,275:1077-1083(1995))。
计算具体实验的[Ca2+]i数据,平均相同处理组中至少5个细胞中[Ca2+]i增加的峰值,与接受安慰剂(KRB)的对照组比较。重复一次Ca2+生物试验以确认前面的结果。数据用ANOVA分析,平均值比较用Tukey检验进行。α水平设置为P≤0.05。
实施例4-能诱导猪纤毛气管细胞中[Ca2+]i 增加的重组Mhyo多肽的表达和特征分析
能提高[Ca2+]i的膜Mhyo重组多肽(或其片段)用类似别处所述的方法获得(Hsu和Minion,Infect.Immun.,66:4762-4766(1998))。支原体采用作为色氨酸编码密码子的UGA,它通常是终止密码子。因此,采用抑制子系统在大肠杆菌中表达大部分支原体的基因序列。另外,用定点诱变修饰该UGA密码子。
将编码Mhyo多肽(或其片段)的核酸克隆到聚组氨酸融合表达载体如pTrcHis中以促进重组产物的纯化。重组大肠杆菌用IPTG诱导,重组Mhyo多肽的产生通过免疫印迹用抗聚组氨酸抗体监测。用B-PER试剂(Pierce)渗透诱导的大肠杆菌,离心去除细胞碎片。重组蛋白通过金属螯合层析用Talon(Clontech)或ProBond(Invitrogen)树脂纯化。测定该多肽的生物活性以证实它增加纤毛气管细胞中[Ca2+]i的能力。对于大批量生产,采用Bio-Rad的生物层析系统。
测试重组Mhyo多肽增加纤毛气管细胞中[Ca2+]i和诱导气管上皮纤毛损坏的能力。将分离自非致病性Mhyo(菌株J)的膜制品用作这些实验的阴性对照。插入物中的气管上皮细胞用下列7种处理之一处理:(1)阴性对照(自非致病性Mhyo(菌株J)的膜制品,100μg/mL),(2)阳性对照(如Mhyo菌株91-3的膜制品,100μg/mL),(3)可溶性胰蛋白酶消化的Mhyo多肽片段(10μg/mL),(4)重组Mhyo多肽(0.1μg/mL),(5)重组Mhyo多肽(1μg/mL),(6)重组Mhyo多肽(10μg/mL)和(7)重组Mhyo多肽(100μg/mL)。各条件进行3次,整个实验重复至少3遍。如上所述进行[Ca2+]i测定。
用下列技术评估粘附、纤毛破坏和纤毛损失。将用无菌技术制备的酶消化上皮细胞以4-5×105个细胞/cm2的浓度置于Millicell-PCF插入物上(0.45μm孔大小,0.6cm2面积,Millipore,Bedford,MA),如Young等,Vet.Microbiol.,71:269-279(2000)所述那样。该插入物包被有人胎盘胶原并置于24孔培养板中。细胞生长于空气-液体界面并从下面无血清的DMEM/F-12(1∶1)中获得营养,DMEM/F-12含2%ultroser G血清取代物(USG培养基),添加青霉素和链霉素。
采用培养18-22天后的纤毛气管上皮细胞培养物。弃去培养液用含未处理Mhyo膜蛋白或重组Mhyo多肽的新鲜DMEM/F-12培养液替换,37℃、7.2%CO2培养90分钟(用于测定粘附和纤毛损坏)或2天(用于测定纤毛损失)。培养后,插入物用PBS洗3次以去除未附着的支原体。用胰蛋白酶-EDTA处理插入物解离细胞并用PBS洗涤。用戊二醛和多聚甲醛原位固定这些细胞并如上述进行扫描电镜检查(Young等,Vet.Microbiol.,71:269-279(2000))以确定Mhyo与纤毛细胞的粘附以及纤毛破坏和损失程度。照片取自各样品中的5个随机视野(16×23μm2)并进行图像分析获得纤毛占据区域(用于确定纤毛损失)和支原体粘附纤毛的数据。
另外,评估粘附和纤毛损失用Zhang等(Infect.Immun.,62:1616-1622(1994))描述的微量滴定板粘附试验和/或Debey和Ross(Infect.Immun.,62:5312-5318(1994))描述的气管移植模型。
Mhyo多肽的活性位点用缺失突变和/或重叠肽序列作图。此外用Mhyo多肽制品接种猪以帮助控制猪支原体肺炎,和/或用对应于该活性位点的肽序列类似物阻断Mhyo膜多肽的细胞受体。
实施例5-产生抗Mhyo多肽抗体,该多肽能诱导猪纤毛气管细胞中的[Ca2+]i 增加
5只雌性BALB/c小鼠(8-10周大)用纯化Mhyo膜多肽免疫。能使纤毛气管细胞中[Ca2+]i增加的纯化Mhyo多肽经HPLC、SDS-PAGE或其它纯化技术获得。各小鼠给予3次双周一次的腹膜内注射50μg含弗氏佐剂的多肽。最后一次静脉内加强是在第3次注射后1个月和与SP2/0骨髓瘤细胞融合前3天给予5μg多肽盐水溶液。每次融合筛选到约500个单独克隆,所用的5只小鼠都产生了MAbs。杂交瘤筛选用间接ELISA进行,ELISA板包被纯化的Mhyo膜多肽以及对照絮状支原体和非致病性Mhyo(菌株J)膜多肽。用山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶偶联物检测MAbs。
实施例6-能抑制猪纤毛气管细胞中Mhyo多肽诱导[Ca2+]i 增加的抗体鉴定
将不同稀释度的抗体加入支原体膜制品或纯化的Mhyo多肽中,然后进行[Ca2+]i测定。也将该抗体加入无抗原的样品作为非特异性抗体作用的对照。测定[Ca2+]i变化的方法见以上所述。
用下列技术评估抗体抑制Mhyo粘附及Mhyo诱导纤毛破坏和纤毛损失的能力。采用能阻断Mhyo-和重组Mhyo多肽诱导纤毛细胞中[Ca2+]i增加的多克隆和单克隆抗体。插入物中的气管上皮细胞用下列处理之一处理:(1)对照,(2)Mhyo菌株91-3(109CCU),(3)抗体制品(A稀释液)加Mhyo菌株91-3,(5)抗体制品(B稀释液)加Mhyo菌株91-3,(6)抗体制品(C稀释液)加Mhyo菌株91-3,(7)抗体制品(D稀释液)加Mhyo菌株91-3。将该抗体加入无Mhyo的样品作为非特异性抗体作用的对照。另外,用热灭活抗体来验证加热是否能去除对Mhyo诱导粘附和纤毛损失的特异性抑制作用。各条件进行3次,整个实验重复至少3遍。
纤毛占据区域和Mhyo粘附纤毛的数据用ANOVA分析,平均值比较用Tukey检验进行。α水平设置为P≤0.05。
其它实施方案
可理解尽管本发明已结合详细描述进行了阐明,但上面的描述目的是阐明而非限制本发明范围,本发明范围由所附权利要求限定。其它方面、优势和修改在下列权利要求范围内。
Claims (33)
1.一种基本纯的多肽,其特征在于,所述多肽能增加猪纤毛气管细胞的钙释放,其中所述多肽的分子量在约30kDa和约150kDa之间。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽是支原体多肽。
3.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽获自致病性肺炎支原体。
4.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽约80%纯。
5.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽约90%纯。
6.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽的分子量约30kDa。
7.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽的分子量约60kDa。
8.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽的分子量约65kDa。
9.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽的分子量约90kDa。
10.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽的分子量约120kDa。
11.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽是胰蛋白酶消化的片段。
12.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽的分子量在胰蛋白酶消化后约为35kDa。
13.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽的分子量在胰蛋白酶消化后约为50kDa。
14.一种能结合某多肽的基本纯的抗体,其特征在于,所述多肽能增加猪纤毛气管细胞的钙释放,其中所述多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间。
15.如权利要求14所述的抗体,其特征在于,所述抗体是单克隆抗体。
16.如权利要求14所述的抗体,其特征在于,所述抗体是小鼠抗体。
17.如权利要求14所述的抗体,其特征在于,所述多肽是胰蛋白酶消化的片段。
18.如权利要求14所述的抗体,其特征在于,所述多肽是支原体多肽。
19.如权利要求14所述的抗体,其特征在于,所述多肽获自致病性肺炎支原体。
20.如权利要求14所述的抗体,其特征在于,所述抗体约80%纯。
21.如权利要求14所述的抗体,其特征在于,所述抗体约90%纯。
22.一种诱导哺乳动物中免疫应答反应的方法,其特征在于,所述免疫应答反应是抗支原体多肽的反应,所述方法包括在所述哺乳动物能产生抗所述多肽抗体的条件下,给予所述哺乳动物基本纯的支原体多肽,其中所述多肽能增加猪纤毛气管细胞的钙释放,所述多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间。
23.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述哺乳动物是小鼠、兔或猪。
24.一种使抗体结合某多肽的的方法,其特征在于,所述多肽能增加猪纤毛气管细胞的钙释放,其中所述多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间,所述方法包括:
a)获得能结合所述多肽的抗体,
b)在所述抗体结合所述多肽的条件下,使所述抗体接触所述多肽。
25.如权利要求24所述的方法,其特征在于,所述抗体是单克隆抗体。
26.如权利要求24所述的方法,其特征在于,所述抗体是小鼠抗体。
27.如权利要求24所述的方法,其特征在于,所述多肽是支原体多肽。
28.一种鉴定支原体诱导的细胞钙释放的抑制剂的方法,其特征在于,所述方法包括:
a)使细胞接触支原体多肽和测试化合物,其中所述多肽能增加猪纤毛气管细胞的钙释放,所述多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间,
b)确定所述测试化合物是否能抑制所述细胞释放钙,其中所述测试化合物若能抑制所述细胞的钙释放,表明所述测试化合物是所述抑制剂。
29.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述测试化合物是蛋白酶。
30.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述测试化合物是抗体。
31.一种鉴定支原体多肽诱导的细胞钙释放的抑制剂的方法,其特征在于,所述多肽能增加猪纤毛气管细胞的钙释放,其中所述多肽分子量在约30kDa和约150kDa之间,所述方法包括:
a)使细胞接触已用测试化合物预处理的支原体多肽,
b)确定该测试化合物是否能抑制所述细胞释放钙,其中所述测试化合物若能抑制所述细胞的钙释放,表明所述测试化合物是所述抑制剂。
32.如权利要求31所述的方法,其特征在于,所述测试化合物是蛋白酶。
33.如权利要求31所述的方法,其特征在于,所述测试化合物是抗体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US37034402P | 2002-04-05 | 2002-04-05 | |
US60/370,344 | 2002-04-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1658906A true CN1658906A (zh) | 2005-08-24 |
Family
ID=29250516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN038131285A Pending CN1658906A (zh) | 2002-04-05 | 2003-04-04 | 支原体多肽 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050287163A1 (zh) |
EP (1) | EP1496945A4 (zh) |
JP (1) | JP2005535573A (zh) |
CN (1) | CN1658906A (zh) |
AU (1) | AU2003221791A1 (zh) |
BR (1) | BR0309008A (zh) |
CA (1) | CA2481042A1 (zh) |
MX (1) | MXPA04009723A (zh) |
NZ (1) | NZ535914A (zh) |
WO (1) | WO2003086473A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BRPI0820341B1 (pt) * | 2007-11-06 | 2021-11-09 | Zoetis Services Llc | Composição imunogênica para uso na proteção de um animal contra uma doença associada a uma cepa virulenta de mycoplasma hyopneumoniae |
CN102928585B (zh) * | 2012-10-31 | 2014-07-30 | 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 | 一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4036945A (en) * | 1976-05-03 | 1977-07-19 | The Massachusetts General Hospital | Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts |
US4331647A (en) * | 1980-03-03 | 1982-05-25 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers |
US5252328A (en) * | 1987-03-26 | 1993-10-12 | Martin Marietta Energy Systems, Inc. | Mycoplasma hyopneumoniae antigen and uses therefor |
US5240706A (en) * | 1989-04-07 | 1993-08-31 | Ml Technology Ventures, L.P. | Intranasal administration of Mycoplasma hyopneumoniae antigen |
WO1995009870A1 (en) * | 1993-10-07 | 1995-04-13 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Characterization of mycoplasma hyopneumoniae adhesins |
-
2003
- 2003-04-04 CA CA002481042A patent/CA2481042A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-04 EP EP03718191A patent/EP1496945A4/en not_active Withdrawn
- 2003-04-04 US US10/509,926 patent/US20050287163A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-04 CN CN038131285A patent/CN1658906A/zh active Pending
- 2003-04-04 MX MXPA04009723A patent/MXPA04009723A/es not_active Application Discontinuation
- 2003-04-04 WO PCT/US2003/010305 patent/WO2003086473A1/en active Application Filing
- 2003-04-04 AU AU2003221791A patent/AU2003221791A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-04 JP JP2003583487A patent/JP2005535573A/ja not_active Withdrawn
- 2003-04-04 NZ NZ535914A patent/NZ535914A/en unknown
- 2003-04-04 BR BRPI0309008-6A patent/BR0309008A/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20050287163A1 (en) | 2005-12-29 |
JP2005535573A (ja) | 2005-11-24 |
NZ535914A (en) | 2006-05-26 |
CA2481042A1 (en) | 2003-10-23 |
EP1496945A4 (en) | 2006-11-08 |
WO2003086473A1 (en) | 2003-10-23 |
EP1496945A1 (en) | 2005-01-19 |
AU2003221791A1 (en) | 2003-10-27 |
BR0309008A (pt) | 2007-01-30 |
MXPA04009723A (es) | 2005-07-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104736185B (zh) | 治疗Tau病变的方法 | |
CN105939722A (zh) | Tau肽,抗Tau抗体,及其使用方法 | |
CN101830974A (zh) | 淀粉样β(1-42)蛋白寡聚体、其衍生物及抗体、其制备方法和用途 | |
JPH10501797A (ja) | CD44v6に対するモノクローナル抗体 | |
CN116693681B (zh) | 抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白a的单克隆抗体及其应用 | |
Rosenthal et al. | L-canavanine incorporation into vitellogenin and macromolecular conformation | |
CN109983029A (zh) | Erfe特异性抗体组合物和使用方法 | |
CN102482348A (zh) | 胶原新表位抗体 | |
CN1185209A (zh) | 测定体液中的蛋白片段 | |
US5750647A (en) | Synthetic peptide analogs of NTx | |
Fujii et al. | Localization of biologically uncommon D-beta-aspartate-containing alphaA-crystallin in human eye lens | |
CN1060310A (zh) | 用于免疫诊断结核病的新的17KDa蛋白抗原及由其衍生的肽片段的制备方法 | |
JP3245052B2 (ja) | I型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに対する抗体およびそれを用いるアッセイ法 | |
CN1658906A (zh) | 支原体多肽 | |
KR20060129229A (ko) | 표면에 위치한 빈창자캄필로박터 폴리펩티드 | |
Tanaka et al. | Expression of a dystrophin-like protein on the surface membrane of muscle cells in mdx mice | |
SUGIHARA et al. | Experimental anti‐GBM glomerulonephritis induced in rats by immunization with synthetic peptides based on six α chains of human type IV collagen | |
CN107043752A (zh) | 杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗crh抗体n‑d19及其检测方面的应用 | |
CN112262213A (zh) | 新型抗pad2抗体 | |
CA2488127A1 (en) | Antibodies directed against prothrombin fragment f1+2, the preparation and use thereof | |
AU2006327953B2 (en) | A bioassay and peptides for use therein | |
Wittmann-Liebold et al. | On the statistical significance of homologous structures among the Escherichia coli ribosomal proteins | |
CN105330735B (zh) | 一种prrt2蛋白相关的抗原表位肽及其应用 | |
CN113930408B (zh) | 一种竹叶青pla2蛋白特异性短肽、抗竹叶青pla2蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒 | |
WO1993007487A1 (fr) | Procede de detection de staphylococcus aureus resistant au mesitylene, nouveau peptide, et adn le codant |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |