MXPA04009723A - Polipeptidos de micoplasma. - Google Patents

Polipeptidos de micoplasma.

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Abstract

La invencion proporciona metodos y materiales relacionados a micoplasma. Por ejemplo, la invencion proporciona polipeptidos de micoplasma que tiene la habilidad de aumentar la liberacion de calcio de las celulas (por ejemplo, celulas traqueales de porcino) asi como tambien anticuerpos que se unen a tales polipeptidos de micoplasma. Ademas, la invencion proporciona metodos para identificar inhibidores de liberacion de calcio inducido por micoplasma de las celulas traqueales ciliadas de porcino.

Description

POLIPÉPTIDOS DE MICOPLAS A PLANTEAMIENTO EN CUANTO A LA INVESTIGACIÓN PATROCINADA FEDERALMENTE POR EE.UU El fondo para el trabajo que se describe aquí se suministró por el gobierno federal de EE.UU, el cual puede tener ciertos derechos en la invención ANTECEDENTES 1. Campo Técnico La invención se refiere a preparaciones de polipéptido de micoplasma así como preparaciones de anticuerpo que tiene anticuerpos contra polipéptidos de micoplasma. 2. Información de Antecedentes Los micoplasmas son un grupo grande de diversas especies procarióticas que comprenden la clase Mollicutes. Los micoplasmas carecen de una pared de célula, tienen un genoma notablemente pequeño, están filogenéticamente relacionados a eubacteria positiva-gramo y son los organismos de auto reproducción más pequeños que se conocen (Razin, Microbiol. Rev., 49:419-455 (1985); Razin, FEMS Microbiol. Lett., 79:423-432 (1992); y Razin y Jacobs, J Gen. Microbiol., 138:407-422 (1992)). La superficie de los micoplasmas es evidentemente exigente para la interacción de estos organismos con sus células huésped (Freundt y Edward. 1979.
Classification y taxonomy. p. 1-42. En M. F. Barile y S. Razin (eds.), The Micoplasmas. Academic press, New York, NY; Rogers ef a/., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:1160-1164 (1985); y Woese et al., J. Mol. Evol., 21:305-316 (1984- 985)). Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) es el agente etiológico de neunomía micoplasmal de cerdo, la cual continua causando perdidas económicas significativas para los productores de cerdo. Este organismo es un agente patógeno extracelular, y se coloniza en el epitelio respiratorio del cerdo. El papel de la infección M. hyopneumoniae en relación con otros agentes patógenos respiratorios de cerdo ha ganado importancia que va en incremento (Ross, RF.1999. Mycoplasmal diseases, p. 495-509. En B.E. Straw, S.D'Allaire, W.L. Mengeling, y D.J. Taylor (eds), Diseases of Swine. lowa State University Press, Ames, IA). Por ejemplo, M. hyopneumoniae potencializa la neumonía de inducción de virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino (Thacker et al, J. Clin Microbiol., 37:620-627 (1999)). M. hyopneumoniae provoca neunomía primero, dañando las células epiteliales ciliadas de la traquea, bronquios, y bronquiolos (Debey et al., Am. J. Vet. Res., 53:1705-1710 (1992); Mebus y Underdahl, Am J. Vet. Res. 38:1249-1254 (1997); y Tertyshnikova y Fein, Cell Calcuim, 21:331-344 (1997)). Sin embargo, los mecanismos que ocultan perdida o daños ciliares de inducción M. hyopneumoniae de cilios no son bien comprendidos. Recientemente, se desarrolló un modelo de célula epitelial traqueal, el cual nos permite estudiar la patogenia de 91-3 M. hyopneumoniae (Zhang et al., Infecí. Immun., 62:4367-4373 (1994)). La adherencia de M. hyopneumoniae al epitelio ciliado es necesaria para provocar la colonización de organismos, la cual resulta en la pérdida de cilios (Mebus y Underdahl, Am. J. Vet. Res., 38:1249-1254 (1997); Zhang et al., Infect. Immun., 62:1616-1622 (1994); y Zhang ef al., Infect. Immun., 63:1013-1019 (1995)). Por eso, la adherencia del micoplasma a sus células huésped es una etapa inicial importante en la patogenia de las enfermedades micoplasmales. El proceso de adherencia es principalmente mediado por interacciones receptor-ligando (Zhang et al., Infecí. Immun., 62:4367-4373 (1994); Zhang et al., Infect. Immun., 62:1616-1622 (1994); Zhang et al., Infect. Immun., 63:1013-1019 (1995); y Zielinski y oss, Am. J. Vet. Res., 54:1262-1269 (1993)). De acuerdo con este concepto están las observaciones de que deformaciones virulentas de M. hyopneumoniae se adhieren a cilios de tejido traqueal in vitro, en contraste a deformaciones no virulentas de M. hyopneumoniae (Young et al., Vet. Microbiol., 71:269-279 (1999)).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención comprende métodos y materiales que se refieren a preparaciones de polipéptido de micoplasma que tienen la habilidad de aumentar liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino. Tales preparaciones de polipéptido se pueden usar para generar fragmentos de polipéptido que tienen la habilidad de bloquear la liberación de calcio inducido por micoplasma y se pueden usar para generar anticuerpos que tienen la habilidad de unir polipéptidos de micoplasma. La invención, también proporciona anticuerpos que se unen a polipéptidos de micoplasma. Tales anticuerpos, se pueden usar para inhibir la liberación de calcio inducido por micoplasma y se pueden usar para diferenciar entre micoplasma no patógeno y patógeno. Además, la invención proporciona métodos para identificar inhibidores de liberación de calcio inducido por micoplasma en células traqueales ciliadas de porcino. Tales inhibidores se pueden usar para proteger a los cerdos de desarrollar neumonía micoplasmal y se pueden usar para tratar cerdos que tienen neumonía micoplasmal. En general, un aspecto de la invención describe un polipéptido substancialmente puro, en donde el polipéptido incrementa liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular del polipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa. El polipéptido puede ser un polipéptido de micoplasma. El polipéptido se puede obtener de Micoplasma hyopneumoniae patógena. El polipéptido puede ser alrededor de un 80 por ciento puro ó alrededor de un 90 por ciento puro. El peso molecular del polipéptido puede ser de alrededor de 30, 60, 65, 90, ó 120 kDa. El polipéptido puede ser un fragmento tríptico. El peso molecular del polipéptido después de una asimilación tríptica puede ser de alrededor de 35 kDa ó 50 kDa. En otro aspecto, la invención describe un anticuerpo substancialmente puro capaz de unir un polipéptido, en donde el polipéptido incrementa liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular del poiipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de ratón. El poiipéptido puede ser un fragmento tríptico. El poiipéptido puede ser un poiipéptido de micoplasma. El poiipéptido se puede obtener de Micoplasma hyopneumoniae patógena. El anticuerpo puede ser alrededor de un 80 por ciento puro ó alrededor de un 90 por ciento puro. Otro aspecto de la invención describe un método para provocar una respuesta inmune en un mamífero, en donde la respuesta inmune es contra un poiipéptido de micoplasma. El método incluye administrar un poiipéptido de micoplasma substancialmente puro al mamífero bajo condiciones en donde el mamífero produce anticuerpos contra el poiipéptido, en donde el poiipéptido incrementa la liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular del poiipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa. El mamífero puede ser un ratón, conejo, ó cerdo. Otro aspecto de la invención describe un método para unir un anticuerpo a un poiipéptido, en donde el poiipéptido incrementa liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular del poiipéptido es entre alrededor de 30 kDa y 150 kDa. El método incluye (a) obtener un anticuerpo capaz de unir el poiipéptido, y (b) contactar el anticuerpo con el poiipéptido bajo condiciones en donde el anticuerpo une el polipéptido. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de ratón. El polipéptido puede ser un polipéptido de micoplasma. Otro aspecto de la invención describe un método para identificar un inhibidor de liberación de calcio de inducción micoplasma en células traqueales ciliadas de porcino. El método incluye (a) contactar células (por ejemplo, células traqueales ciliadas de porcino) con un polipéptido de micoplasma y un compuesto de prueba, en donde el polipéptido incrementa liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular del polipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa, y (b) determinar si el compuesto de prueba inhibe a las células de liberar calcio, en donde la inhibición de liberación de calcio en las células por el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es el inhibidor. El compuesto de prueba puede ser una proteasa ó anticuerpo. En otra modalidad, la invención describe un método para identificar un inhibidor de liberación de calcio de células (por ejemplo, células traqueales ciliadas de porcino) inducidas por un polipéptido de micoplasma, en donde el polipéptido incrementa liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular del polipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa. El método incluye (a) contactar células (por ejemplo, células traqueales ciliadas de porcino) con un polipéptido de mi'coplasma pretratado con un compuesto de prueba, y (b) determinar si el compuesto de prueba inhibe a las células de liberar calcio, cuando la inhibición de liberación de calcio en las células por el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es el inhibidor. El compuesto de prueba puede ser una proteasa ó anticuerpo. Al menos que de otra manera se defina, todos los términos científicos y técnicos que se usan aquí, tiene el mismo significado como comúnmente entendido por uno de experiencia ordinaria en la materia, a la cual esta invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos que se describen aquí se pueden usar en la práctica ó comprobación de la presente invención, materiales y métodos convenientes se describen abajo. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias que se mencionan aquí, se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, que incluye definiciones, controlará. Además los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no tiene la intención de ser limitados. Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 contiene tres gráficas que traza la reacción de [Ca2*], en células traqueales de porcino ciliadas. Los datos son gráficos representativos que muestran los efectos de (a) cepa 91-3 M. hyopneumoniae patógena (n = 10, un total de 47 células), (b) M. hyopneumoniae no patógena (n = 6, un total de 18 células), y (c) M. flocculare (n = 8, un total de 24 células). La concentración de proteína para las tres preparaciones de micoplasma fue de 300;g/mL. La flecha indica cuando fue administrado el micoplasma. La Figura 2 es una gráfica de barra que traza el incremento en [Ca2+]¡ sobre niveles básicos para los tratamientos indicados. PMH representa cepa 91-3 M. hyopneumoniae patógena; NPMH representa M. hyopneumoniae no patógena; y MF representa M. flocculare. Los datos representan la media ± SE. 91-3 M. hyopneumoniae intacta se administró en 30 (n = 18 células traqueales en 6 experimentos), 100 (n = 16 células en 7 experimentos), y 300/vg/mL (n = 47 células en 10 experimentos). M. flocculare (n = 24 células en 8 experimentos) y M. hyopneumoniae no patógena (n = 18 células en 6 experimentos) se administraron con 300/vg/mL. Los asteriscos indican diferencias significantes de otros tratamientos (P<0.05). La Figura 3 contiene cuatro gráficas que trazan la reacción de [Ca2+]¡ en células traqueales de porcino ciliadas inoculadas con cepa 91-3 M. hyopneumoniae. Los datos son gráficos representativos que muestran el efecto de (a) medio libre Ca2* (n = 5 células), (b) pretratamiento con tapsigargina (TG; 1 /vM) por 30 minutos (n = 5 células), (c) U-73122 (2 µ?; n = 5 células) por 100 segundos, y (d) U-73343 (2 µ?; n = 5 células) en incremento de inducción M. hyopneumoniae en [Ca2+]¡ La flecha indica cuando se administró el micoplasma intacto (300_g/mL). La Figura 4 contiene cuatro gráficas que trazan la reacción de [Ca2+]¡ en células traqueales de porcino ciliadas inoculadas con mastoparan 7 (Mas 7) ó M. hyopneumoniae después de pretratamiento con toxina pertusis (PTX; 100 ng/mL) por 3 horas. Los datos son gráficos representativos para (a) controles de M. hyopneumoniae (n = 9 células), (b) M. hyopneumoniae tratada con PTX (n = 11 células), (c) controles de Mas 7 (10 µ?) (n = 9 células), y (d) Mas 7 tratado con PTX (n = 9 células). La Figura 5 es un diagrama de un modelo propuesto de interacciones de célula traqueal ciliada de M. hyopneumoniae. Re = receptor; ER = retículo endoplasmico. La Figura 6 contiene cuatro gráficas que trazan la reacción de [Ca2+]¡ en células traqueales de porcino ciliadas inoculadas con membranas Mhyo. Cada gráfica indica los cambios de [Ca2+]¡ en cada célula traqueal. Las flechas indican cuando ocurre la administración. (A) La preparación de membrana (100 jug/mL) incrementó [Ca2+]¡ . (B) La asimilación con proteinasa K bloqueó el incremento de inducción de membrana en [Ca2+]¡. La membrana (100 µ?/0.1 mL PBS) se incubó con proteinasa K (2 µg) a 37°C por 8 horas antes de que se aplicara a células traqueales en regulador 0.9mL bicarbonato Krebs-Ringer (KRB). (C) La asimilación con tripsina potencializó el incremento de inducción de membrana en [Ca2+]¡. La membrana (100 µg/ .^ mL PBS) se incubó con tripsina (6 µg) a 37°C por 30 minutos antes deque se aplicara a células traqueales en 0.9mL KRB. (D) La proteína de membrana soluble mostró mayor actividad que la membrana no asimilada en (A). La proteína soluble se preparó sometiendo la membrana tripsinizada a ultracentrifugacion (100,000 x g, 60 minutos) para obtener el flotante. La Figura 7 es una fotografía de una inmunomancha de polipéptidos de membrana Mhyo de Mhyo patógena (P) y no patógena (N) examinada con suero anti Mhyo de cerdo (1:80). El camino marcador identificado por el aparente peso molecular en kDa (1 Ojug/camino). Las flechas denotan las bandas de polipéptido observadas en Mhyo patógena, pero no en no patógena. La figura 8 es una fotografía de una inmunomancha de polipéptidos de membrana Mhyo de Mhyo patógena (P) y no patógena (N). Las muestras se asimilaron con tripsina y examinadas con suero anti Mhyo de cerdo (1:80). El camino marcador identificado por el aparente peso molecular en kDa (10/jg/camino). Las flechas denotan las bandas de polipéptido observadas en Mhyo patógena, pero no en no patógena. La Figura 9 es una gráfica que traza la purificación de fragmentos trípticos de polipéptido de membrana Mhyo utilizando intercambio de anión HPLC. Una gradiente lineal de 0-0.5 M NaCI en regulador Tris (pH 8.5) se usó para disolver los polipéptidos. Los diluyentes se monitorearon en una absorción de 280 mm. El número 3 indica fracción 3; mientras el número 4 indica fracción 4.
La Figura 10 es una gráfica que traza fracción 4 incremento de [Ca2+]¡ de inducción de (10 g/mL) en células traqueales ciliadas de porcino ( n = 8 células). Esta fracción provoco incremento de [Ca2+]¡. La flecha indica la administración de la fracción de polipéptido. La Figura 11 es una fotografía de un ¡nmunomancha de polipéptidos Mhyo examinada con suero convaleciente Mhyo de cerdo. El camino marcador identifica el aparente peso molecular en kDa. Camino 1: fracción #4 (10 µg/camino); camino 2: fragmento tríptico soluble Mhyo antes de la purificación (10 /vg/camino); camino 3: fracción #4 (de otra categoría de purificación; 5 /i/g/camino); camino 4: antígeno de célula completo Mhyo (10 g/camino); camino 5: en blanco (no antígeno). El anticuerpo primario fue antisuero de cerdo (1:100). El anticuerpo secundario fue suero de anti cerdo de cabra (1:1000). Se observó una banda positiva de alrededor de 65 kDa en caminos 1 y 3. La Figura 12 es una gráfica que traza la purificación de fragmentos trípticos de proteína de membrana Mhyo utilizando intercambio de anión HPLC. Una gradiente lineal de 0-0.5 M NaCI en regulador Tris (pH 8.5) se usó para disolver los polipéptidos. Los díluyentes se monitorearon en una absorción de 280 nm. Fracción 8 de los díluyentes mostraron habilidad de liberación de Ca2+. La Figura 13 es una gráfica que traza fracción 8 incremento de [Ca2+]¡ de inducción de (1 ji/g) en células traqueales ciliadas de porcino ( n=4 células). Esta fracción fue la única fracción disuelta que provoco incremento de [Ca2+]¡. La flecha indica la administración de la fracción de polipéptido. La Figura 14 es una gráfica que traza incremento de [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas de porcino incubadas con preparación de membrana Mhyo triptica pretratada con un inhibidor tripsina de soja (TI). TI no consiguió inhibir incremento de [Ca2+]¡ provocado por preparación de membrana tríptico de Mhyo en epitelios traqueales ciliados. TI se incubó con preparación de membrana triptica a 37°C por 10 minutos antes de la administración. La ordenada muestra [Ca2+]¡ en nM. Cada trazo representa cambios de [Ca2+] en una célula.
DESCRIPCIÓN DETALLADA La invención proporciona métodos y materiales que se refieren a micoplasma. Por ejemplo, la invención proporciona polipéptidos de micoplasma que tienen la habilidad de aumentar liberación de calcio de células traquéales ciliadas de porcino, así como anticuerpos que se unen a tales polipéptidos de micoplasma. Además, la invención proporciona métodos para identificar inhibidores de liberación de calcio inducido por micoplasma de células traqueales ciliadas de porcino. En una modalidad, la invención proporciona polipéptidos substancialmente puros. El término "polipéptido" como se usa aquí, se refiere a cualquier cadena de residuos de aminoácido con ó sin una o más modificaciones de pos traslación (por ejemplo fosforilación ó glicosilación). Los polipéptidos proporcionados aquí pueden ser de cualquier tamaño. Por ejemplo, un polipéptido que tiene la habilidad de aumentar liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino puede ser de 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, ó más aminoácidos en longitud. Además, un polipéptido que tiene la habilidad de aumentar liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino pueden tener un peso molecular que es entre alrededor de 10 kDa y alrededor de 150 kDa. Por ejemplo, un polipéptido que tiene la habilidad de aumentar liberación de calcio de células traquéales ciliadas de porcino puede tener un peso molecular de alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, ó 120 kDa. Además, un polipéptido que tiene la habilidad de aumentar liberación de calcio de células (por ejemplo, células traqueales ciliadas de porcino) puede ser un fragmento tríptico. En tales casos, el peso molecular del polipéptido después de una asimilación tríptica puede ser entre alrededor 10 kDa y alrededor 80 kDa. Por ejemplo, el peso molecular de un polipéptido después de una asimilación tríptica puede ser de alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, ó 80 kDa. En algunas modalidades, el polipéptido (por ejemplo, fragmento tríptico ó polipéptido de tamaño normal) que tienen la habilidad de aumentar liberación de calcio de células (por ejemplo, células traqueales ciliadas de porcino) pueden ser de una cepa Mhyo patógena (por ejemplo, cepa 91-3 M. hyopneumoniae patógena). El término "residuo de aminoácido" como se usa aquí se refiere a residuos de aminoácido naturales, residuos de aminoácido no naturales, y análogos de aminoácido, todos en sus estereisomeros L y D si sus estructuras así lo permiten. Los residuos de aminoácido naturales incluyen, sin limitación, alanina (Ala), ariginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteina (Cys), glutamina (GIn), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (lie), leucina (Leu), lisina Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofan (Trp), tirosina (Tyr), y valina (Val). Los residuos de aminoácido no naturales incluyen, sin limitación, ácido acetidinacarboxilico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, alanina-beta, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-aminoheptanóico, ácido 2- aminoisobutírico, ácido 3-am¡no¡sobutírico, ácido 2-aminopiméltco, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, allo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, allo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina, ácido pipecólico, y N-metilarginina. El término "análogo de aminoácido" como se usa aquí se refiere a un compuesto que es estructuralmente similar a un residuo de aminoácido naturalmente ocurrente como es típicamente encontrado en polipéptidos naturales, pero difiere en composición de tal manera que ya sea el grupo carboxi C-terminal, el grupo amino N-terminal, ó el grupo funcional de cadena latera ha sido químicamente modificado por otro grupo funcional. Análogos de aminoácido incluyen, sin limitación, ácido aspártico (éster beta-metil), un análogo de ácido aspártico; N-etilglicina, un análogo de glicina; y alamina carboxamida, un análogo de alanina. Otros ejemplos de residuos de aminoácido y análogos de aminoácido están enunciados en Gross y Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York (1983). Los análogos de aminoácido pueden ser naturalmente ocurrentes ó pueden ser preparados sintéticamente. Los polipéptidos se pueden modificar para uso in vivo por la adición, en el extremo de amino ó carboxi terminal, de un agente estabilizador para facilitar la supervivencia del polipéptido in vivo. Esto puede ser útil en situaciones en las cuales terminales de péptido tienden a ser rebajadas por protoasa antes de la captación celular. Tales agentes obstructores pueden incluir, sin limitación, secuencias de aminoácido relacionadas o no relacionadas adicionales que se pueden unir a los residuos amino y/ó carboxi terminal de un polipéptido (por ejemplo, un grupo acetil unido al aminoácido terminal N ó un grupo de amida unido a el aminoácido terminal C). Dicho acoplamiento puede ser puede lograr ya sea químicamente, durante la síntesis del polipéptido, ó por tecnología de ADN recombinante utilizando métodos estándares. De forma alternativa, agentes obstructores tales como ácido piroglutamico u otras moléculas se pueden unir a los residuos amino y/ó carboxi terminal. En otras modalidades, el grupo amino en la terminal amino y/ó el grupo carboxi en la terminal carboxi se puede reemplazar con una mitad diferente.
Los polipéptidos, también pueden contener una clasificación de aminoácido). El término "clasificación de aminoácido" como se usa aquí se refiere a una secuencia de aminoácido generalmente corta que proporciona un medio preparado de detección y/ó purificación a través de interacciones con un anticuerpo contra la clasificación ó a través de otros compuestos ó moléculas que reconocen la clasificación. Por ejemplo, clasificaciones de aminoácido tales como c-mic, hemagglutinina, polihistidina, ó Flag® se pueden usar para auxiliar la purificación y detección de un polipéptido. Como un ejemplo, un polipéptido con una clasificación polihistidina se puede purificar basado en la afinidad de residuos de histidina para iones de níquel (por ejemplo en una columna Ni-NTA), y se pueden detectar en manchas occidentales por un anticuerpo contra polihistidina (por ejemplo, el anticuerpo Penta-His; Qiagen, Valencia, CA). Las clasificaciones de aminoácido se pueden insertar en cualquier lugar dentro de una secuencia de polipéptido. Por ejemplo, una clasificación de aminoácido se puede insertar en la terminal amino ó carboxi de un polipéptido. Los polipéptidos que se describen aquí se pueden obtener utilizando cualquier método. Por ejemplo, un polipéptido que tiene la habilidad de aumentar liberación de calcio de células se puede obtener por extracción de una origen natural (por ejemplo, de células Mhyo), por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido, ó por síntesis química (por ejemplo, por síntesis de fase sólida u otros métodos conocidos en la técnica, que incluye síntesis con un sintetizador péptido ABI; Biosistemas Aplicados, Foster City, CA). Además, los polipéptidos se pueden purificar por, por ejemplo cromatografía líquida de alta presión (por ejemplo fase opuesta HPLC) ó se pueden purificar utilizando electroforesis en gel. Por ejemplo, la banda que corresponde a un polipéptido particular se puede cortar de un gel y disolverse para obtener una preparación de polipéptido. Los polipéptidos que se proporcionan aquí pueden ser substancialmente puros. El término "substancialmente puro" como se usa aquí con referencia a un polipéptido significa que el polipéptido es substancialmente libre de otros polipéptidos, lipidos, carbohidratos, y ácido nucleico con los cuales este es naturalmente asociado. Por eso, un polipéptido substancialmente puro es cualquier polipéptido que se remueve de su ambiente natural y es al menos 60 por ciento libre, preferentemente 75 por ciento libre, y más preferentemente 90 por ciento libre de otros componentes con los cuales este es naturalmente asociado. Los polipéptidos que se proporcionan aquí pueden ser 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ó 99 por ciento puros. Típicamente, un polipéptido substancialmente puro proporcionará una banda individual mayor en un gel de proliacrilamida de no reducción. Se entiende que un polipéptido Mhyo se considera substancialmente puro se ha purificado y luego mezclado con, por ejemplo un auxiliar ó un vehículo farmacéutico, como el polipéptido Mhyo se separa de los componentes celulares con los cuales este se asocia de forma natural. Cualquier método se puede usar para purificar un polipéptido que se proporciona aquí. Por ejemplo, la cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, cromatografía de exclusión de tamaño, y cromatografía de intercambio de iones se puede usar para purificar un polipéptido Mhyo. El alcance de purificación se puede medir por cualquier método apropiado, que incluye pero no limitado a: cromatografía de columna, electroforesis en gel poliacrilamida, ó cromatografía de líquido de alto desempeño. Cualquier método se puede usar para determinar si una polipéptido particular incrementa liberación de calcio de células. Por ejemplo, las técnicas que se describen aquí se pueden usar para medir liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino. La invención, también proporciona anticuerpos que se unen los polipéptidos que se proporcionan aquí. El término "anticuerpo" como se usa aquí se refiere a anticuerpos intactos así como a fragmentos de anticuerpo que conservan alguna habilidad para unir selectivamente un epitope. Tales fragmentos incluyen, sin limitación, Fab, F(ab')2, y fragmentos de anticuerpo Fv. El término "epitope" se refiere a un factor antigénico en un antígeno al cual el paratope de un lazos de anticuerpo. Los factores epitópicos usualmente consisten de agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas (por ejemplo, aminoácido ó residuos de azúcar) y usualmente tiene características de estructura tridimensional así como características de carga. En una modalidad, la invención proporciona anticuerpos que tienen afinidad de unión específica para un polipéptido que se proporciona aquí. Tales anticuerpos se pueden usar en inmunopruebas en fase liquida ó saltar a la fase sólida. Por ejemplo, los anticuerpos que se proporcionan aquí se pueden usar en inmunopruebas competitivas y no competitivas en ya sea un formato directo ó indirecto. Ejemplos de tales inmunopruebas incluyen la radioinmunoprueba (RAI) y la prueba (inmunométrica) intercalada. Los anticuerpos que se proporcionan aquí se pueden prepara utilizando cualquier método. Por ejemplo, cualquier polipéptido substancialmente puro que se proporciona aquí, ó fragmento del mismo, se puede usar como un inmunogen para provocar una respuesta inmune en un animal de tal manera que se producen anticuerpos específicos. De manera que, un polipéptido intacto de tamaño normal ó fragmentos que contienen pequeños péptidos se puede usar como un antígeno inmunizador. Además, el inmunogen usado para inmunizar un animal se puede sintetizar químicamente ó derivar de cDNA transferido. Además, el inmunogen se puede conjugar para un polipéptido vehículo, si se desea. Comúnmente vehículos que se usan, que son químicamente asociados a un polipéptido inmunizador incluyen, sin limitación, hemocianina de lapa clave(KLH), tiroglobulina, albúmina de suero bovino (BSA), y toxoide de tétanos. La preparación de los anticuerpos policlonales es bien conocida por aquellos expertos en la materia (por ejemplo., Green et al, Production of Polyclonal Antisera, En: Immnunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992) y Coligan y et al, Production of Polyclonal Antiseraa in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, En: Current Protocols ¡ Immnunology, sección 2.4.1 (1992)). Además, varias técnicas comunes en las técnicas de inmunología se pueden usar para purificar y /ó concentrar anticuerpos policlonales, así como anticuerpos monoclonales (Coligan, et al, Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994). La preparación de anticuerpos monoclonales, también es bien conocida por aquellos expertos en la materia (por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975); Coligan et al, secciones 2.5.1-2.6.7, y Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, página 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1998). Brevemente, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener inyectando ratones con una composición que comprende un antígeno, verificar la presencia de producción de anticuerpo, analizar una muestra de suero, remover el bazo para obtener limfocitas B, fusionar la limfocitas B con células de mieloma para producir hibridomas, clonar los hibridomas, seleccionar clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, y aislar los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar de cultivos de hibridoma por una variedad de técnicas bien estabilizadas. Tales técnicas de aislamiento incluyen, sin limitación, cromatografía de afinidad con Sefarosa Proteína-A, cromatografía exclusión de tamaño, y cromatografía de intercambio de ión (Coligan et al, secciones 2.7.1-2.7.12 y secciones 2.9.1-2.9.3; Barnes et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG), En: Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (Humana Press 1992)). Además, los métodos de multiplicación in vitro e in vivo de loa anticuerpos monoclonales son bien conocidos para aquellos expertos en la materia. La multiplicación in vitro se puede llevar a cabo en medios de cultivo adecuados tales como Dulbecco's Modified Tagle Médium (MEM) ó medio RPMI 1640, opcionalmente reemplazada por un suero mamífero tal como un suero de becerro fetal, ó elementos de indicio y suplementos que apoyan el cultivo tales como células de exudado peritonales de ratón normales, células de baso, y macrófagos de medula de hueso. La producción in vitro proporciona preparaciones de anticuerpo relativamente puras y permite cubrirse de incrustaciones para proporcionar grandes cantidades de anticuerpos deseados. La cultivación de hibridoma a gran escala se puede llevar a cabo por cultivo de suspensión homogéneo en un reactivo de puente aéreo, en un reactivo agitador continuo, ó en cultivo de célula entrampada ó inmovilizada. La multiplicación in vivo se puede llevar a cabo inyectando clones de célula dentro de mamíferos histocompatibles con las células madre (por ejemplo, ratones osingenéicos) para originar crecimiento de tumores de producción de anticuerpo. Opcionalmente, los animales se preparan con un hidrocarbono, especialmente aceites tales como pristana (tetrametilpentadecana) antes de la inyección. Después de una a tres semanas, el anticuerpo monoclonal deseado se recupera del fluido del cuerpo del animal.
Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar por hidrólisis proteolítica de un anticuerpo intacto ó por la expresión de un ácido nucleico que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por asimilación de papaína ó pepsina de anticuerpos intactos por métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir por desdoblamiento enzimático de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento además se puede separar utilizando un agente reductor tiol, y opcionalmente un grupo obstructor para los grupos sulfidrilio que resultan de desdoblamiento de enlaces de disulfuro, para producir fragmentos monovalentes de 3.5S Fab'. De forma alternativa, un desdoblamiento enzimático que usa pepsina, produce dos fragmentos monovalentes Fab' y un fragmento Fe, directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg (Patente de EE.UU. Nos. 4,036,945 y 4,331,647) y otros (Nisonhoff ef al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73:119 (1959); Edelman eí al., Methods in Enzymology, Vol 1, página 422 (Academic Press 1967); y Coligan et al. en secciones 2.8.1-2.8.10 y 2.10.1-2.10.4). Además, la invención proporciona métodos y materiales que se pueden usar para identificar compuestos que inhiben la liberación de calcio inducido por micoplasma (por ejemplo la liberación de calcio inducida por polipéptidos Mhyo) de células (por ejemplo, células traqueales ciliadas de porcino). Un método de identificación de un inhibidor de liberación de calcio inducido por micoplasma de células puede comprender la incubar células (por ejemplo, células traqueales ciliadas de porcino) con una preparación que contiene un polipéptido de micoplasma (por ejemplo, un polipéptido Mhyo de Mhyo patógeno) en la presencia de un compuesto de prueba, y determinar si el compuesto de prueba inhibe las células de liberar calcio. En otra modalidad, un método para identificar un inhibidor de liberación de calcio puede comprender contactar células con una preparación de polipéptido de micoplasma pretratado con un compuesto de prueba, y determinar si el compuesto de prueba inhibe las células de liberar calcio. La liberación de calcio se puede medir utilizando cualquiera de los métodos que se describen aquí. La preparación puede ser una preparación de polipéptido de membrana Mhyo cruda, una preparación de polipéptido Mhyo purificada, ó asimilación tríptica de una preparación de polipéptido de membrana Mhyo. Un compuesto de prueba se puede identificar como un inhibidor de liberación de calcio inducido por micoplasma, si el incremento en la liberación de calcio provocado por la preparación que contiene el polipéptido de micoplasma se reduce en la presencia del compuesto cuando se compara en la ausencia del compuesto. Por "reducido" se entiende que la ocurrencia de liberación de calcio es más baja (por ejemplo, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ó 100% más baja) en la presencia del compuesto de prueba que en la ausencia del compuesto. Se puede usar cualquier compuesto como un compuesto de prueba. Por ejemplo, las moléculas que son polipéptidos (por ejemplo, proteasas, anticuerpos, polipéptidos de aminoácido 10-50), oligonucleotidos, ésteres, lípidos, ésteres, carbohidratos, ó esteroides, se pueden usar como compuestos de prueba. Aquellos de experiencia ordinaria en la materia pueden rápidamente establecer cantidades convenientes para compuestos de prueba y tiempos de incubación convenientes. La invención será además descrita en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el ámbito de la invención que se describe en las reivindicaciones.
EJEMPLOS Ejemplo 1- Micoplasma hyopneumoniae incrementa la liberación de calcio intracelular de células traqueales ciliadas de porcino Los efectos de Micoplasma hyopneumoniae patógena intacta, M. hyopneumoniae, no patógena y M. flocculare se determinaron en concentraciones de ([Ca2+]¡) libre de Ca2+ intracelular en células epiteliales traqueales ciliadas de porcino. Brevemente, las células epiteliales ciliadas tuvieron [Ca2+]¡ básico de 103 ± 3nM (n = 217 células). El [Ca2+]¡ incremento por 250 + 19 nM (n = 47 células) del nivel básico dentro 100 segundos de adición de cepa 91-3 M. hyopneumoniae patógena (300 yg/mL), la cual duró 60 segundos. En contraste, M. hyopneumoniae no patógena y M. flocculare en 300 pg/mL no consiguieron aumentar [Ca2+]¡. En un medio libre de Ca +, M. hyopneumoniae patógena todavía incrementó [Ca2+]¡ en células traqueales. El pretratamiento con tapsigargina (1 µ?, 30 minutos), el cual redujo reserva de Ca2+ en el retículo endoplasmico, abolió el efecto de M. hyopneumoniae. El pretratamiento con toxina pertusis (100 ng/mL, 3 horas) ó U-73122 (2 µ?, 100 segundos), un inhibidor de fosfolipasa C, también abolió el efecto de M. hyopneumoniae. La administración de Mastoparan 7, un activador de proteína sensible a la toxina pertusis (G¡0), incremento [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas. Estos resultados sugieren que M. hyopneumoniae patógena activa los receptores que se asocian a (G¡0), el cual a su vez activa un camino de fosfolipasa C, por ello liberación de Ca2+ del retículo endoplasmico. Por ello, Ca2+ sirve como una señal para la patogenia de M. hyopneumoniae.
Métodos y materiales Todos lo reactivos se obtuvieron de Sigma Chemical (St. Louis, MO), excepto que fura-2 AM se obtuvo de Molecular Probes (Eugene, OR) y U-73122, U-73343, y Mastoparan 7 (Mas 7) se obtuvieron de Biomol (Plymounth Meeting, PA). Los siguientes micoplasmas intactos se usaron aquí: (1) una cepa 91-3 de M. hyopneumoniae patógena, originalmente clonada de cepa 232, la cual muestra alta adherencia a cilios en una muestra de adherencia de microconcentración (Zhang et al., Infect. Immun., 62:1616-1622 (1994); (2) una cepa J de M. hyopneumoniae no patógena (cepa 25934 ATCC), la cual no se adhiere a cilios (Zíelinski y Ross, Am. J. Vet. Res., 54:1262-1269 (1993)); y cepa Ms42 de M. flocculare (cepa 27399 ATCC), la cual es no patógena en cerdo. Los micoplasmas se cultivaron en medio Friis (Friis, Nord. Vet. Med., 27:337- 339 (1975)) a fase logarítmica y recogidas por centrifugación a 15,000 x g por 30 minutos. Después de la centrifugación, bolitas de micoplasma se colectaron y lavaron tres veces con 50 mL de PBS por centrifugación a 15,000 x g por 15 minutos. Las bolitas finales se dispersaron a través de una jeringa de medida 27 en PBS. El número de células completas colectadas de 200 mL de cultivo (3.4 ± 1.7 x 1011 CCU, n=7) se determino como unidades cambiantes de color (CCU) utilizando diluciones consecutivas con tubos que contienen medio Friis. Esta densidad de célula correspondió con la proteína 2.70 ± 0.08 mg medida por el método de ácido bicinconinico (Pierce, Rockford, IL) como se describió previamente (Zhang et al., Infect. Immun., 62:4367-4373 (1994) y Zhang er al., Infect. Immun 63:1013-1019 (1995)). La concentración de micoplasma final se ajusto a 3mg proteína/mL en PBS. Las células traqueales se aislaron como se describió previamente (Young ef al., Vet. Microbio!., 71:269-279 (1999)). Brevemente, las traqueas se quitaron de cerdos libres de patógeno específico de 3 a 6 meses de edad anestesiados con pentobartital de sodio utilizando técnicas asépticas. Las células ciliadas se desasociaron utilizando pronasa al 0.15% y DNase al 0.01% en medio MEM libre de Mg2+ y Ca2+, el cual se incubó a 4°C por 24 horas. Las células epiteliales se colectaron por centrifugación a 125 x g por 5 minutos. Las bolitas de célula se resuspendieron en una mezcla de DMEM (glucosa alta) y medio de Ham F12 (1:1) que contiene FBS al 5%, 0.12U/mL de insulina, y 100 U/mL de estreptomicina penicilina.
Las suspensiones de célula se transfirieron a platos de cultivo de tejido de 90-mm se incubaron en C02 al 5% por 60 - 90 minutos para remover fribroblastos. Las células epiteliales traqueales se almacenaron en nitrógeno líquido hasta usarse. Se usaron las siguientes técnicas para obtener medidas de [Ca2+]¡ en células individuales. Las células traqueales se localizaron con éster acetoxilmetil fura-24 µ? de (fura-2AM) en una solución reguladora de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB) que contiene: 136 mM NaCI, 4.8. mM KCI, 1.5 nM CaCI2, 1.2 mM KH2P04, 1.2 mM MgS04, 10mM HEPES, 5.5 mM glucosa, y BSA al 0.1%, pH 7.4 y se incubaron por 30 minutos a 37°C. Las células cargadas se centrifugaron (700 x g, 2 minutos), luego se resuspendieron con KRB en una concentración de 50 a 1000 células/mL. Las células traqueales cargadas de fura-2AM se revistieron en fundas cubiertas de polilisina en un plato Petri hecho a la medida. El plato que contiene células cargadas de fura-2 se montó en el portaobjeto de un microscopio fluorescente invertido (Cari Zeiss, NY). Únicamente células traqueales ciliadas viables se concentraron para la determinación de [Ca2+]¡ a 24°C. Las células traqueales ciliadas de porcino cargadas de fura-2 se deterioraron rápidamente a 37°C. Se obtuvieron imágenes fluorescentes (longitudes de onda de excitación de 334 y 338 nm; longitud de onda de emisión de 510 ± 20 nm) y se usaron para generar mapas resueltos espacialmente de [Ca2+]¡ substrayendo el fondo que dividen las imágenes en un base píxel por píxel. Las señales emitidas se digitalizaron, grabaron, y procesaron utilizando el sistema de representación de fluorescencia digital Attofluor (Atto Intruments, Rockville, MD). Después de leer la fluorescencia por 150 segundos, los micoplasmas se mezclaron con el sistema de célula. [Ca2+]¡ se calcularon como se describió previamente (Grynkiewicz ef al., J. Biol. Chem., 260:3440-3450 (1985)). La calibración se llevo a cavo in situ de acuerdo a el procedimiento proporcionado por Atto Instruments, utilizando Fura-2 penta K* como un estándar. Para comparar el [Ca2+]¡ de la reacción de las células traqueales a la cepa 91-3 M. hyopneumoniae patógena, una M.hyopneumoniae no virulenta, y M.flocculare, las células se trataron con la misma concentración de 300 jug/mL. De una a cinco células traqueales individuales ciliadas en cada experimento se seleccionarón para investigar los cambios de [Ca2+]¡. Los micoplasmas se conservaron en hielo antes ser aplicados a células traqueales. Para investigar el camino de la señalización de Ca2+, la toxina pertusis ( TX, 100 ng/mL) se preincubó con células traqueales por 3 horas. Las células se pretrataron con tapsigargina (TG, 1 JLM por 30 minutos a 37°C antes de la adición de los micoplasmas para reducir la provisión de Ca2+ ER (Thastrup ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:2466-2470 (1990)). Las células se pretrataron con U-73122 (2 µ?), un inhibidor fosfolipase C (Bleasdale y Fisher, Neuroprotocols, 3:125-133 (1993)) ó su análogo inactivo U-73343 por 100 segundos a 37°C antes de la adición de los micoplasmas. Para confirmar que los micoplasmas aumentaron [Ca +]¡ activando una proteina G¡/0, Mas 7 (10µ?), un activador de esta proteína (Higashijima et al., J. Biol. Chem., 265:14186 (1990)), se usó para determinar si este puede aumentar [Ca2+]¡ en células traqueales. Además se determino si PTX puede bloquear el incremento en [Ca2+]¡ debido a Mas 7. Los datos sobre [Ca2+]¡ se analizaron por ANOVA ó por prueba de Student. El nivel de importancia se estableció en P<0.05. Efectos de micoplasmas sobre [Ca2*]¡ en células epiteliales traqueales ciliadas de porcino La cepa 91-3 M. hyopneumoniae unida a cilios de células traqueales (Debey et al., Am. J. Vet. Res., 53:1705-1710 (1992); Mebus y Underdahl, Am. J. Vet. Res., 38:1249-1254 (1977)); y Tajima y Yagihashi, Infect. Immun., 37:1162-1169 (1982)). Los cambios en [Ca2*]¡ se determinaron después de la inoculación de las células traqueales ciliadas con cepa 91-3. Las células epiteliales ciliadas tuvieron [Ca2+], básico de 103 ± 3nM (n= 217 células). Después estar expuestas a con cepa 91-3 M hyopneumoniae a 300 µg/mL, se observó un incremento de [Ca2+]¡ en un 89 por ciento (47 de 53 células en 10 experimentos) de las células. Como se muestra en las Figuras 1 y 2, la administración de cepa 91-3 M hyopneumoniae patógena (300 µg/mL) incremento [Ca2+]¡ en células ciliadas en 100 segundos. En contraste, M hyopneumoniae no patógena (18 células en 6 experimentos) y M. flocculare (24 células en 8 experimentos) no incrementó [Ca2+]¡ en la misma concentración de micoplasma (300 g/mL) (Figura 1).
En un estudio de reacción de dosis, 30 µ9/?p?_ de cepa 91-3 M. hyopneumoniae (18 células en 6 experimentos no cambiaron [Ca2+]¡ significativamente. Sin embargo, 100 jig/mL (16 células en 7 experimentos; 84 por ciento de las células reaccionaron) y 300 /vg/mL (47 células en 10 experimentos; 89 por ciento de las células reaccionaron) aumentaron [Ca2+]¡ a 110 ± 9 nM y 250 ± 19 n , respectivamente (Figura 2). Mientras cepa 91-3 M. hyopneumoniae puede aumentar [Ca2+]¡ en células ciliadas a través de su producto secretor, flotantes se colectaron del micoplasma (300 jug/mL) seguido de la centrifugación a 15,000 x g por 15 minutos para probar su habilidad para aumentar [Ca2+]¡. Estos flotantes no aumentaron [Ca2+]¡ en células ciliadas.
Efectos de cepa 91-3 M. hyopneumoniae en un medio libre de Ca2* Para determinar la implicación de Ca2+ extracelular, los experimentos se llevaron a cabo utilizando un medio libre de Ca2+ suplementado con 10µ? EGTA, un quelador Ca2+. La cepa 91-3 M. hyopneumoniae (300 µg/mL) todavía incrementó [Ca +]¡ (antes: 117 ± 6 nM, después: 324± 31 nM, 10 células en 4 experimentos; 84 por ciento de células reaccionaron) (Figura 3). Estos resultados indican que el incremento es atribuible a liberación de Ca2+ de provisiones intracelulares, en vez de a través de un mecanismo entrada de Ca2+.
Efectos de TG en el incremento de [Ca2+]¡ de inducción de M. hyopneumoniae Para determinar si el retículo endoplasmico (ER) fue el origen de la liberación de Ca2+, células ciliadas se trataron con 1 µ? TG, un inhibidor ATPase de Ca2* microsomal por 30 minutos. En estudios previos, se encontró TG para reducir la provisión de Ca2+ER (Thastrup et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:2466-2470 (1990)), mientras se abolió el incremento de Ca + intracelular de inducción de ionomicina en células traqueales ciliadas de porcino. De forma similar el tratamiento TG abolió la liberación de [Ca2+]¡ de inducción de cepa 91-3 M. hyopneumoniae (300 /vg/mL), que demuestra que este organismo provoca la liberación de Ca24 ER en células epiteliales traqueales de porcino. (Figura 3b).
Efectos de U-73122 y U-73433 en el incremento de [Caz"]t de inducción de M. hyopneumoniae Mientras inositol 1 ,4,5-trisfosfate (IP3) libera Ca + de la producción en ER y IP3 se cataliza por fosfolipase C (PLC), se llevo a cabo el siguiente experimento. El pretratamiento de células traqueales con 2 µ? U-73122, un inhibidor PLC específico (Bleasdaie y Fisher, Neuroprotocols, 3:125-133 (1993)), antes de la inoculación con cepa 91-3 M. hyopneumoniae abolió el incremento de [Ca2t]¡ inducido por micoplasma en las células ciliadas (Figura 3c). En contraste, U-73343, un análogo inactivo de U-73122, no impidió la reacción de [Ca2+]¡ a el micoplasma (básico: 90 ± 12 nM, punto máximo 330 ± 25 nM, 10 células en 4 experimentos; 82 por ciento de células reaccionaron) (Figura 3d). Estos resultados sostienen que el incremento de [Ca2+]¡ por M. hyopneumoniae se medía por la activación de PLC.
Efectos de PTX en el incremento de ¡Ca2*]¡ de inducción de M. hyopneumoniae Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para evaluar si una proteína G sensible a PTX medía el efecto de cepa 91-3 M. hyopneumoniae. En células de control no tratadas, cepa 91-3 M. hyopneumoniae incrementó [Ca2+]¡ (254 ± 57 nM, 9 células en 3 experimentos; 81 por ciento de células reaccionaron; Figura 4 a). En contraste, el pretratamiento de células ciliadas con 100 ng PTX/mL por 3 horas, abolió incrementos de inducción de M. hyopneumoniae en [Ca2+]¡ (Figura 4b). Estos resultados indican que M. hyopneumoniae activa receptores que están asociados a una proteína G sensible a PTX (G¡/0). Para confirmar que las proteínas G¡0 se involucran en el incremento de [Ca2+]¡ en las células traqueales, se estudió el efecto de Mas 7, un activador de G¡/0 (Higashijima et al., J. Biol. Chem., 265:14176-14186 (1990)), en [Ca2+]¡. La administración de 10 µ? Mas 7 a células traqueales ciliadas provocó un incremento en [Ca2+]¡ del nivel básico de 103 ± 4 nM a 351 ± 24 nM (n=9 células en 3 experimentos, 82 por ciento de células reaccionaron) en 100 segundos (Figura 4c). El pretratamiento de estas células con PTX abolió el efecto de Mas7 (Figura 4d). Estos resultados demuestran que la activación de Gi 0 en células traqueales ciliadas incrementa [Ca21, M. hyopneumoniae coloniza las vías respiratorias del cerdo uniendo células epiteliales ciliadas (Mebus y Underdahl, Am. J. Vet. Res., 38:1249-1254 (1977); Tajima y Yagihashi, Infecí. Immun., 37:1162-1169 (1982); y Zhang et al., Infecí. Immun., 62:1616-1622 (1994)). La adherencia se medía a través de una proteína P97 superficial (Hsu y Minion, Infecí. Immun., 66:4762-4766 (1998); Hsu ef al., J. Bacieriol., 179:1317-1323 (1997); y Minion ef al., Infecí. Immun., 68:3056-3060 (2000)). La ciliostasis y la pérdida de cilios se originan rápidamente (Debey y Ross, Infecí. Immun., 62:5312-5318 (1994)). Como se demuestra aquí, el flujo de Ca2+ se vincula a perdida de cilios. La cepa 91-3 M. hyopneumoniae patógena incremento [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas de porcino. En contraste, la cepa J de M. hyopneumoniae no patógena y M. flocculare no consiguieron hacerlo entonces, indica que la unión a cilios fue un prerrequisito para la inducción de flujo de Ca2+. La cepa J M. hyopneumoniae no se une a cilios de cerdo (Zhang eí al., Infecí. Immun., 63:1013-1019 (1995)). La reacción de [Ca2+]¡ fue un evento rápido, y el incremento dependió de la concentración de micoplasma. En otro estudio de incremento de [Ca2+]¡ por M. hyopneumoniae en nuetrofils, 107-1010 CCU de cepa patógena incrementa el incremento de inducción de zimosan en [Ca2+]¡, mientras que la cepa no patógena nó (Debey eí al., Vet Res Commun., 17:249-257 (1993)). La adherencia de cepa 91-3 M. hyopneumoniae patógena (10° CCU) a los cilios de los epitelios respiratorios resulta en enrollamiento, agrupamiento y descomposición longitudinal en 90 minutos de la administración de micoplasma, mientras que la cepa M. hyopneumoniae no muestra daños ciliares (Debey et al., Am. J. Vet. Res., 53:1705-1710 (1992) y Young et al., Vet. Microbio!., 71:269-279 (1999)). Por eso los cambios en [Ca2+], en los epitelios traqueales se implican en la patogenia de M. hyopneumoniae. La magnitud de el incremento de [Ca2+]¡ en células ciliadas aisladas en reacción a diversos M. hyopneumoniae en células a célula, pero en general, se incrementa con la concentración de incremento de micoplasma. Esta heterogeneidad de la reacción de Ca2+ en las células epiteliales de ruta aérea fue similar al efecto de ATP extracelular reportado en células gliales (VandenPol et al., J. Neurosci., 12:2648-2664 (1992)), células del conducto biliar (Nathanson et al., Am. J. Physiol., 271:G86-G96 (1996))., megacariocitas (Tertyshnikova y Fein, Cell Calcium, 21:331-344 (1997)), y condrocitas (D'Andrea y Vittur, J. Bone, Miner. Re., 1 :946-954 (1996)). En las células epiteliales respiratorias de conejos, la heterogeneidad de la reacción de Ca2* se debe a la sensibilidad de células individuales a ATP extracelular (Evens y Sanderson, Am. J. Physiol., 227-L30-L41 (1999) y Korgreen et al., J. Physiol. (Lond.) 508:703-720 (1998)). El [Ca2t]¡ incremento debido a microorganismos ó a que sus toxinas se han reportado en otra bacteria. S. typhimurium intacta incrementa [Ca +]¡ en epitelios intestinales, la cual medía el incremento en la secreción IL-8 de estas células (Gewirtz et al., J.
Clin. Invest., 105:79-92 (2000) y Pace ef al., Cell, 72:505-514 (1993)). Como S. typhimurium provoca un incremento en [Ca2+]¡ aún no esta claro. Enterotoxina E. coli eleva [Ca2+] liberando Ca2+ ER de células HEp-2 (Baldwin et al., Infecí. Immun., 59:1599-1604 (1991)). Esta liberación es atribuible a la activación de canales de liberación de Ca2+ con receptor rianodina, mientras el efecto se bloquea por un dantroleno antagonista receptor rianodina (Danko ef al., Biochim. Bophys. Acta., 816:18-24 (1985) y Heine y Wicher, Neuroreport, 9:3309-3314 (1998)). E.coli de producción de verocitotoxina intactos, sin embargo, liberan Ca2+ de células HEp-2 a través de el camino IP3 (Ismaili et al., Infect. Immun., 63:3316-3326 (1995)). Pyocianina, un factor virulento oxidante que se secreta por Pseudomonas aerugionasa, incrementa la formación IP3 y [Ca2+]¡ en células epiteliales de ruta aérea humanas, pero reduce proteína-G asociada al incremento de inducción de agonista rector en IP3 y [Ca2+]¡ (Denning et al., Am. J. Physiol., 274:L893-L900 (1998)). La oxidación de inducción de piocianina puede ser responsable del incremento en la formación IP3 (Denning et al., Am J. Physiol., 274:L893-L900 (1998)). La toxina Pasteurella multocida (PMT) incrementa [Ca2+]¡ en células intactas de animales diferentes activando isozima PLC-ß? con asociación Gq (Wilson et al., J. Biol. Chem., 272:1268-1275 (1997)). Este efecto de PMT es en gran parte atribuible a su activación directa del camino de PLC-Gq, mientras la microinyección de PMT dentro de Xenopues occytes, la cual desvía los receptores de membrana de plasma, hasta que activa PLC-Gq (Wilson et al., J. Biol. Chem 272:1268-1275 (1997)). Algunas estructuras bacteriales extracelulares pueden aumentar [Ca2+]¡ de células huésped. Por ejemplo, pili Tipo IV de Neisseria patógena se adhieren a una línea de célula humana tipo epitelial ME180 derivada de carcinoma cervical, e incrementan [Ca2+], a través de receptores pilus (Kallstrom et al., J. Biol. Chem., 273:21777-217782 (1998)). La elevación de [Ca2+]¡ se necesita como una etapa inicial para establecer un contacto estable entre la bacteria y las células huésped (Kallstrom et al., J. Biol. Chem., 273:21777-217782 (1998)). Sin embargo no es claro como los pili de Neisseria provocan un incremento en [Ca2+]¡. Cepa 91-3 M. hyopneumoniae patógena incremento [Ca2+]¡ en las células ciliadas en un medio libre de Ca2+, que indica que el incremento en [Ca +]¡ es atribuible a la liberación de Ca2+ de provisiones ¡ntracelulares. El pretratamiento de células traqueales con TG para reducir provisión de Ca2+ ER abolió el efecto del micoplasma, que contiene la implicación de estos organelos en la liberación de Ca2+. El pretratamiento de células traqueales con U-73122, un inhibidor PLC específico, también impide el incremento de [Ca2+]¡ inducido por micoplasma, que indica que la liberación de Ca + inducido por micoplasma del ER es a través de un camino PLC. Los resultados que se proporcionan aquí, indican que los receptores de M. hyopneumoniae en el epitelio respiratorio se asocian a Gl/0. Activar PLC es también de acuerdo con observaciones con un fenómeno de mediación de receptor de adenosina A, (Tomura et al., J. Biol. Chem., 272:23130-23137 (1997)). Proteínas Gi/0 son usualmente las responsables para la inhibición de ciclasa adenilil, la regulación de canales K* y Ca2+, y la activación de fosfodiesterasa cGMP. Entre proteínas G¡0, G¡2 y G¡3 puede mediar la modulación de de dos caminos de señalización; la activación de PCL se medía por dímero GPv, mientras que la inhibición de ciclasa adenilil se medía por <x¡ (Tomura et al., J. Biol. Chem., 272:23130-23 37 (1997)). En resumen, los resultados que se proporcionan aquí, indican que los receptores para M. hyopneumoniae patógena se asocian a G¡0. Una vez que la unión de estos receptores ha ocurrido, esta proteína G estimula el camino PLC para aumentar [Ca2+]¡ a través de un incremento en la liberación de Ca2+ de el ER (Figura 5). Además, los experimentos con adhesiones, demostraron que las adhesiones de M. hyopneumoniae que incluyen P97 no consiguieron aumentar [Ca2*]¡. Además, la inoculación de células traqueales ciliadas de porcino con cepa 91-3 M. hyopneumoniae incrementó frecuencia de pulsación ciliar en 3 minutos de inoculación, la cual corresponde con el incremento en [Ca2+]¡, en estas células. Estos resultados fueron consistentes con lo que se ha encontrado con la acción de Ca2+ en la frecuencia de pulsación ciliar en células epiteliales ovinas de ruta área (Salathe y Bookman, J. Physiol. (Lond), 520:851-865 (1999)), y sostienen la implicación de los cambios en [Ca2+]¡ en la patogenia de micoplasma.
Ejemplo 2 - Caracterización y purificación de polipéptido Mhyo que provoca incrementos de f Ca2+1 ¡ en células traqueales ciliadas de porcino Las paredes de células con falta de micoplasma y que tiene únicamente un tipo de membrana, la membrana de plasma (Razin S. (1993) Membranas de micoplasma como modelos en investigación de membrana (Capítulo 2), En: Subcellular Biochemestry. Vol 20: Mycoplasma Cell Membrans, editado por Rottem S, Kahane I. Plenum Press, New York.pp. 1-28). La membrana Mhyo se preparó por lisis osmótica de los organismos y se examinó para determinar si incrementó [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas. La membrana Mhyo incrementó [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas (Figura 6A). El pretratamiento de la membrana con una proteinaza K de encima proteolítica ó papaina por 8 horas, abolió el efecto de la membrana (Figura 6B). Estos resultados demostraron que un polipéptido de membrana es responsable para este efecto. De forma interesante, el pretratamiento con tripsina por 30 minutos, no solamente no consiguió reducir el incremento de [Ca2+]¡ si no que también potencializo el efecto de la membrana (Figura 6C). El pretratamiento con tripsina por 16 horas aún no consiguió reducir el efecto de la membrana en [Ca2+]¡. La tripsinización de la membrana puede proporcionar fragmentos de polipéptido que contienen epitopes para los receptores. Los fragmentos trípticos del micoplasma se sometieron a ultracentrifugación (100,000 x g, 60 minutos). El flotante que resulto, el cual contiene polipéptidos solubles, también incremento [Ca2+]¡ en epitelios ciliados. La actividad de elevación de [Ca2+]¡ de este polipéptido de membrana sol ubil izado fue al menos 1 0 veces más potente q ue la membrana no asimilada (Figura 6D) . U na técn ica western blot se usó para comparar polipéptidos de membrana exterior de (91 -3) Mhyo patóge na y (cepa J) Mhyo no patógena. La muestra de Mhyo patógeno mostró cinco bandas de polipéptido que no se mostraron en la muestra de Mhyo no patógeno (Fig ura 7). Las cinco bandas de polipéptidos correspondieron a pesos moleculares de 30, 60, 65, 90 y 120 kDa , respectivamente . La técn ica western b lot se usó para comparar polipéptidos de membrana exterior de (91 -3) Mhyo patógena y (cepa J) Mhyo no patógena después la asimilación con trips ina . La muestra de Mhyo patógena mostró dos bandas de polipéptido que no se mostra ron en la muestra de Mhyo no patógena (Figura 8). Las dos bandas de polipéptido correspondieron a pesos moleculares de 35 y 50 kDa , respectivamente. Electroforesis en gel (21 cm x 50 cm) se usó para colectar estos cinco polipéptidos en grandes cantidades de aproximadamente 10 L/g. Una vez que se colectaron, la preparación de polipéptido se usa para llevar a cabo pruebas de [Ca2+]¡ para confirmar cual polipéptido incrementa [Ca +]¡ en células traqueales cil iadas. Además eletroforesis d imensional 2 se usa para además purificar cada polipéptido. Espectrometría de masa se usa para confirmar la pureza de cada polipéptido antes de llevar a cabo la secuencia de prote ína terminal N . Una vez que la secuencia de aminoácido terminal N se determina, se buscan bases de datos de secuencia para identificar la secuencia de aminoácido del polipéptido Mhyo de tamaño normal. El polipéptido Mhyo solubilizado se purificó por HPLC, utilizando una columna de intercambio de anión con un gradiente lineal de 0.-0.5 M NaCI en regulador Tris (pH 8.5; Figura 9). Una primera fracción, fracción #4, mostró actividad de elevación de [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas (Figura 10). El análisis western blot reveló que la fracción #4 contenía una banda de 65 kDa que se reconoció por un suero convaleciente anti Mhyo (Figura 11). Esta banda de polipéptido de 65 kDa, también apareció en la preparación de célula completa Mhyo. Mientras que la fracción #4 correspondió a un punto máximo que se diluyó justo antes ó un poco después de la aplicación de la gradiente NaCI, se lleva a cabo otro análisis de últimas fracciones. Este análisis reveló que la fracción #8 también incrementó [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas (Figuras 12 y 13). La fracción #8 tuvo lugar en la gradiente NaCI de 0.4 M. Estos resultados indicaron que la fracción #8 contenía un polipéptido Mhyo de membrana externo que muestra actividad de elevación de [Ca2+]¡ en epitelios traqueales ciliados. Utilizando filtros de centrifugación, se determino el tamaño del fragmento de polipéptido tríptico capaz de aumentar [Ca2+]¡ en epitelios traqueales ciliados. El líquido filtrado después del uso de un filtro con poro de tamaño de 30 kDa no consiguió aumentar [Ca2+]¡ mientras el líquido filtrado después del uso de un filtro con poro de tamaño de 100 kDa incrementó [Ca2+]¡ en epitelios traqueales ciliados. Estos resultados indican que el fragmento de polipéptido tríptico que es el responsable para aumentar [Ca2+]¡ en epitelios traqueales ciliados pueda ser de entre alrededor de 30 y alrededor de 100 kDa en tamaño. De acuerdo con un reciente reporte, tripsina a 0.1 U/mL puede aumentar [Ca2+]¡ en epitelios traqueales de puerco de Guinea (Oshiro et al., Life Sci., 71:547-558 (2002)). Mientras la concentración de tripsina estimada en los experimentos de [Ca2*]¡ que se describen aquí es de alrededor de 1 U/mL, nosotros examinamos si la tripsina juega un papel en el incremento de [Ca2+]¡ de inducción de fragmento tríptico. La tripsina sola a 1 U/mL se encontró para aumentar [Ca2+]¡ en epitelios traqueales porcinos. El tratamiento con el inhibidor tripsina de soja (10 U/mL), sin embargo, inhibió el incremento de [Ca +]¡ de inducción de tripsina (10 U/mL), pero no consiguió bloquear el incremento de [Ca2+]¡ de inducción de fragmento de polipéptido Mhyo tríptico (Figura 14). Estos resultados demuestran que el efecto estimulador de la preparación Mhyo triplica en [Ca2+]¡ se atribuye al polipéptido Mhyo, no a la tripsina.
Ejemplo 3 - Obtener la secuencia de aminoácido de el polipéptido Mhyo que provoca incrementos de [Ca2* en células traqueales ciliadas de porcino La cepa 91-3 Mhyo virulenta crece en un medio Friis sustituido con suero de puerco libre de micoplasma al 20% y recogido por centrifugación como se describió previamente (Zhang ef al., Infecí Immun 62:1616-1622 (1994)). Los organismos se sometieron a lisis osmótica y a centrifugación (35,000 x g, 60 minutos) par obtener una preparación de membrana como se describió previamente (Pollack JD. (1998) Análisis de Encima (Capítulo 10), En: Methods in Molecular Biology. Vol. 104: Micoplasma Protocols, editado por Miles R & Nicholas A., Humana Press, lotowa, NJ. p.p. 79-92). La preparación de membrana se suspende en PBS y se trata con tripsina en proporción 17:1 (w/w) a 37°C por 30 minutos, seguida por ultracentrifugación (100,000 x g, 60 minutos). El flotante que resulta, el cual contiene el fragmento tríptico activo, se purifica por HPLC utilizando una columna de intercambio de anión (Waters, Model DEA 5TW) y una gradiente lineal de 0-0.5 M NaCI en regulador Tris (pH8.5). La disolución se monitorea en una absorción de 280 nm, y las fracciones 4 y 8 se colectan y además se purifican por HPLC fase reservada C18 utilizando una gradiente lineal de acetonitrila al 0-60% en ácido trifluoroacético al 0,08% en agua. De forma alternativa, la filtración en gel, la interacción hidrófoba, ó las técnicas de columna de exclusión de tamaño se usan para además purificar el polipéptido. El polipéptido purificado se concentra utilizando un Sep-pak y disuelto con acetonitrile-metanol como el sistema solvente. El solvente se quita bajo un flujo de nitrógeno. Además SDS-PAGE se usa para confirmar el peso molecular del polipéptido. Para conseguir la purificación, los diluyentes colectados de los puntos máximos notables se examinan por su habilidad de aumentar [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas. La pureza de la preparación de polipéptido que resulta, se determina por espectrometría de masa (Voyager, Model DE PRO). El polipéptido purificado por HPLC Ct8 y confirmado por espectrometría de masa, se somete a una secuencia de aminoácido terminal N, utilizando un secuenciador de proteína de Biosistemas de Aplicación (Model 494), De forma alternativa, información de secuencia activa se obtiene de los fragmentos generados que usan desdoblamiento de bromuro cianógeno ó desdoblamiento enzimáticos tal como endoproteasa Lys-C. El fragmento de desdoblamiento se purifica y somete a una secuencia de aminoácido terminal N. Una vez que se determina la secuencia de aminoácido terminal N, se buscan bases de datos de secuencia para identificar la secuencia de aminoácido del polipéptido Mhyo de tamaño normal. Los siguientes métodos se usan para medir el [Ca2+]¡ que se incremento en células traqueales ciliadas. Las células traqueales se obtienen de cerdos libres de Mhyo como se describe por Yamaya eí al., (Am. J. Physiol., 262.L713-L724 (1992)). Brevemente, las células epiteliales traqueales ciliadas, se aislan por asimilación de enzima, utilizando pronasa al 0.15% y DNasa al 0.01% en Ca2+ y un medio MEM libre de M2+ y se incuban a 4°C por 24 horas. La asimilación de enzima se detiene por la adición de suero bovino fetal. Las células se quitan de las traqueas y se lavan por centrifugación en MEM de Dulbecco y un medio (1:1) F-12 de Ham. Estas células se congelan en nitrógeno líquido. Cuando estás listas para usarse, las células se descongelan rápidamente a 37°C y permiten unirse a fundas en el depósito de 5 mm de platos Petri de 30 mm hecho a la medida bañados con polisina en un regulador de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB). El volumen de incubación en tal, un plato es de 200 µ?_. El procedimiento de determinación de [Ca2+]¡ para células individuales se lleva a cabo utilizando una sistema de imagen como se describió previamente (ZhuGe y Hsu, J. Pharmacol. Exp. Ther., 275:1077-1083 (1995)). Los datos de [Ca2+]¡ de un experimento particular se calculan por el porcentaje de los puntos máximos del incremento en [Ca2+]¡ de al menos 5 células individuales en el mismo grupo de tratamiento y comparados con el grupo de control, el cual recibe un placebo (KRB). La bioprueba de [Ca2+]¡ se repite una vez para confirmar los resultados previos. Los datos se analizan utilizando ANOVA, y las comparaciones medias se llevan a cabo utilizando una prueba de Tukey. El nivel a se coloca a P 0.05.
Ejemplo 4- Expresar y caracterizar al polipéptido Mhyo recombinante que provoca incrementos de rCa2*!, en células traqueales ciliadas de porcino. Un polipéptido Mhyo de membrana de elevación de [Ca2+]¡ recombinante (ó fragmentos del mismo) se obtiene utilizando métodos similares a aquellos descritos en otra parte (Hsu y Minion, Infect. Immun., 66:4762-4766 (1998)). Los micoplasmas usan UGA, el cual es normalmente un codón de detención, como un codón codificador de tryptofan. Por eso, se usan sistemas supresores para la expresión de más frecuencias de gen micoplasma en E.coli. De forma alternativa, mutagénesis de dirección de lugar se usa para modificar los condones UGA. El ácido nucleico que codifica el polipéptido Mhyo (ó fragmento del mismo) se clona dentro de un vector de expresión de fusión de polihistidina tal como pTrcHIs para facilitar la purificación del producto recombinante. E.coli recombinante se induce con IPTG, y la producción del polipéptido Mhyo recombinante se monitorea por inmunomancha utilizando anti-pollhistidina. Los E.coli inducidos se permeabilizan con un reactivo B-PER (pierce), y los detritos de célula se remueven por centrifugación. Las proteínas recombinantes se purifican por cromatografía de metal quelatoutilizando ya sea resinas de ProBond (Gen in vitro) ó Talón (técnica de clon). La actividad biológica del polipéptido se examina para confirmar su habilidad para aumentar [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas. Para series grandes, se usa sistema de Cromatografía Biológico Bio-Rad. El polipéptido Mhyo recombinante se examina por su habilidad para aumentar [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas y para provocar daño ciliar en epitelios traqueales. Preparaciones de membrana aisladas de (cepa J) Mhyo no patógena se usan como controles negativos en estos experimentos. Las células epiteliales traqueales en encartes, se tratan con uno de los siguientes siete tratamientos: (1) controles negativos (por ejemplo preparación de membrana de Mhyo no patógena (cepa J), 100 µg/mL·, (2) controles positivos (por ejemplo preparación de membrana de cepa 91-3 Mhyo, 100 L/g/mL, (3) fragmentos de polipéptido Mhyo trípticos solubles (10 µg/mL), (4) polipéptido Mhyo recombinante (0.1 /jg/mL), (5) polipéptido Mhyo recombinante (1 jL/g/mL), (6) polipéptido Mhyo recombinante (10^g/mL), (7) polipéptido Mhyo recombinante (100vg/mL). Cada condición se lleva a cabo por triplicado con el experimento completo que se repite al menos tres veces. Las determinaciones de [Ca2+]¡ se llevan a cabo como se describe arriba. Las siguientes técnicas se usan para evaluar adherencia, daño de cilios, y pérdida de cilios. Las células epiteliales de asimilación de enzima preparadas que utilizan una técnica estéril se revisten en una concentración de 4-5 x 1 O5 células/cm2 en encartes de Millicell-PCF (tamaño de poro de0.45 µ??, área de 0.6 cm2, Millipore, Bedford, MA) como se describe en otra parte (Young et al., Vet. Microbiol., 71:269-279 (2000)). Los encartes se bañan con un colágeno placental humano y colocados en platos de cultivo de depósito 24. Las células se cultivan en la interface de liquido aéreo y alimentadas desde la parte interior con DMEM/F-12 (1:) libre de suero que contiene un sustituto de suero ultroser G al 2% (medio USG) sustituido con penicilina y estreptomicina. Los cultivos de células epiteliales traqueales ciliadas se usan después de 18 a 22 días de cultivo. El medio de cultivo se desecha y se reemplaza con un medio DMEM/F-12 nuevo que contiene una proteína de membrana Mhyo no tratada ó polipéptido Mhyo recombinante, y se incuba a 37°C, C02 al 7.2% por ya sea 90 minutos (para la determinación de adherencia y daño de cilios) ó por dos días (para la determinación de pérdida de cilios). Después de la incubación, los encartes se lavan con PBS tres veces para quitar los micoplasmas no unidos. Las células de desasocian del encarte utilizando Tripsina-EDTA y se lavan con PBS. Estas células se fijan in situ con glutaraldehida y paraformaldehida y se someten a microscopía de electrón de exploración (Young eí al., Vet. Mirobiol., 71:269-279 (2000)) para determinar la adherencia de Mhyo a células ciliadas y el alcance de daño y pérdida de cilios. Se toman fotografías de 5 campos aleatorios (16 x 23 µ??2) en cada muestra y se someten a análisis de imagen para obtener datos para las áreas ocupadas por los cilios (para la determinación de pérdida de cilios) y la unión de micoplasma a el cilio. De forma alternativa, la adherencia y la pérdida de cilios se evalúa utilizando una prueba de adherencia de plato microconcentración descrita por Zheng et al. (Infecí. Immun., 62:1616-1622 (1994)) y/o un modelo de excultivo traqueal descrito por DeBey y Ross [Infecí. Immun., 62:5312-5318 (1994)). El sitio activo del polipéptido Mhyo se traza utilizando mutagénesis y/ó secuencias de péptido de imbricación. Además, las preparaciones de polipéptido Mhyo se usan para vacunar al cerdo para ayudar a controlar la neumonía micoplasmal de cerdo, y/ó análogos de las secuencias de péptido que corresponden a el sitio activo, se usan para bloquear a los receptores de células para el polipéptido de membrana Mhyo.
Ejemplo 5- Producir anticuerpos contra el polipéptido Mhyo que provoca incrementos de fCa2*1¡ en células traqueales ciliadas de porcino Cinco ratones BALBa/c hembras (8 a 10 semanas de edad) se inmunizan con el polipéptido de membrana Mhyo purificado. El polipéptido Mhyo purificado que tiene la habilidad para aumentar [Ca2+]¡ en células traqueales ciliadas se obtiene a través de HPLC, SDS-PAGE, u otras técnicas de purificación. A cada ratón se le da tres inyecciones intraperitonales dos veces por semana de 50 ug del polipéptido, en un auxiliar de Freud. Un elevador intravenosos final de 5 /jg del polipéptido en una solución salina se da un mes después de la tercera inyección y 3 días antes de la fusión con las células de mieloma SP2/0. Alrededor de 500 clones divididos se cubren durante cada fusión, y los cinco ratones se usan para generar MAbs. La protección de hibridoma se lleva a cabo utilizando un ELISA indirecto que contiene una plato ELISA con un polipéptido de membrana Mhyo junto con un polipéptido de membrana de control de M. flocculare y (cepa J) Mhyo no patógena. Una peroxidasa de rábano picante IgG anti ratón de cabra conjugado se usa para detectarse MAbs.
Ejemplo 6- Identificar anticuerpos que inhiben incrementos de Ca2+]¡ de inducción de polipéptido Mhyo en células traqueales ciliadas de porcino Los anticuerpos en diferentes diluciones se añaden a la preparación de membrana de micoplasma ó al polipéptido Mhyo purificado antes de la inclusión en las determinaciones de [Ca2+]¡. Los anticuerpos también se añaden a muestras libres de antígeno para controlar los efectos de anticuerpo no específico. Los métodos para examinar cambios en [Ca2+]¡ es como se describe abajo. Las siguientes técnicas se usan para evaluar la habilidad de los anticuerpos para inhibir la adherencia Mhyo y daño de cilios de inducción Mhyo y pérdida de cilios. Los anticuerpos monoclonales y policlonales que muestran la habilidad de bloquear el incremento de inducción de polipéptido Mhyo recombinante y Mhyo en [Ca2+]¡ en células ciliadas se usaron. Las células epiteliales traqueales en los encartes se trataron con uno de los siguiente tratamientos: (1) controles, (2) cepa 91-3 Mhyo (109 CCU), (3) cepa 91-3 Mhyo plus (dilución A) preparación de anticuerpo, (5) cepa 91-3 Mhyo plus (dilución B) preparación de anticuerpo, (6) cepa 91-3 Mhyo plus (dilución C) preparación de anticuerpo, (7) cepa 91-3 Mhyo plus (dilución D) preparación de anticuerpo. Los anticuerpos se añadieron a muestras libres de Mhyo para controlar los efectos de anticuerpo no específico. Además, los anticuerpos inactivos de calor se usaron para confirmar que el calentamiento abóle una inhibición específica de adherencia de inducción Mhyo y pérdida de cilios. Cada condición se lleva a cabo por triplicado con el experimento completo que se repite al menos tres veces. Los datos para las áreas ocupadas por cilios y la unión de Mhyo a cilios se analizaron usando ANOVA, y las comparaciones medias se llevan a cabo utilizando una prueba de Tukey. El nivel a se establece a P 0.05.
OTRAS MODALIDADES Se entiende que mientras la invención ha sido descrito en conjunto con la descripción detallada de la misma, la descripción anteriormente mencionada tiene la intención de ilustrar y no limitar el ámbito de la invención, la cual se define por el ámbito de las reivindicaciones adjuntas, Otros aspectos, ventajas, y modificaciones están dentro del ámbito de las siguientes reivindicaciones.

Claims (33)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido substancialmente puro, caracterizado porque dicho polipéptido incrementa la liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular de dicho polipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa.
  2. 2. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido se un polipéptido de micoplasma.
  3. 3. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido se obtiene de Micoplasma hyopneumoniae patógena.
  4. 4. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido es alrededor de un 80 por ciento puro.
  5. 5. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido es alrededor de un 90 por ciento puro.
  6. 6. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular de dicho polipéptido es de alrededor de 30 kDa.
  7. 7. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular de dicho polipéptido es de alrededor de 60 kDa.
  8. 8. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular de dicho polipéptido es de alrededor de 65 kDa.
  9. 9. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular de dicho polipéptido es de alrededor de 90 kDa.
  10. 10. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular de dicho polipéptido es de alrededor de 120 kDa.
  11. 11. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido es un fragmento tríptico.
  12. 12. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular de dicho polipéptido después de una asimilación tríptica es de alrededor de 35 kDa.
  13. 13. El polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular de dicho polipéptido después de una asimilación tríptica es de alrededor de 50 kDa.
  14. 14. Un anticuerpo substancialmente puro capaz de unir un polipéptido, caracterizado porque dicho polipéptido incrementa la liberación de calcio de células ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular de dicho polipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa.
  15. 15. El anticuerpo según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  16. 16. El anticuerpo según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo de ratón.
  17. 17. El anticuerpo según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho polipéptido es un fragmento tríptico.
  18. 18. El anticuerpo según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho polipéptido es un polipéptido de micoplasma.
  19. 19. El anticuerpo según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho polipéptido se obtiene de Micoplasma hyopneumoniae patógena.
  20. 20. El anticuerpo de la reivindicación 14, caracterizado porque dicho anticuerpo es alrededor de un 80 por ciento puro.
  21. 21. El anticuerpo de la reivindicación 14, caracterizado porque dicho anticuerpo es alrededor de un 90 por ciento puro.
  22. 22. Un método para provocar una respuesta inmune en un mamífero, caracterizado porque dicha respuesta inmune es contra un polipéptido de micoplasma, dicho método comprende administrar un polipéptido de micoplasma substancialmente puro a dicho mamífero bajo condiciones en donde dicho mamífero produce anticuerpos contra dicho polipéptido, en donde dicho polipéptido incrementa la liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular de dicho polipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa.
  23. 23. El método según la reivindicación 22, caracterizado porque dicho mamífero es un ratón, conejo, ó cerdo.
  24. 24. Un método para unir un anticuerpo a un polipéptido, caracterizado porque dicho polipéptido incrementa la liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular de dicho polipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa, dicho método comprende: a) obtener un anticuerpo capaz de unir dicho polipéptido, y b) contactar dicho anticuerpo con dicho polipéptido bajo condiciones en donde dicho anticuerpo une dicho polipéptido.
  25. 25. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  26. 26. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo de ratón.
  27. 27. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho polipéptido es un polipéptido de micoplasma.
  28. 28. Un método para identificar un inhibidor de liberación de calcio inducido por micoplasma en células, dicho método comprende: a) contactar células con un polipéptido de micoplasma y un compuesto de prueba, caracterizado porque dicho polipéptido incrementa liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular de dicho polipéptido es entre alrededor de 30kDa y alrededor de 150 kDa, b) determinar si dicho compuesto de prueba inhibe dichas células de liberar calcio, caracterizado porque la inhibición de liberación de calcio de dichas células por dicho compuesto de prueba indica que dicho compuesto de prueba es dicho inhibidor.
  29. 29. El método según la reivindicación 28, caracterizado porque dicho compuesto de prueba es una proteasa.
  30. 30. El método según la reivindicación 28, caracterizado porque dicho compuesto de prueba es un anticuerpo.
  31. 31. Un método par identificar un inhibidor de liberación de calcio de células inducidas por un polipéptido de micoplasma, caracterizado porque dicho polipéptido incrementa liberación de calcio de células traqueales ciliadas de porcino, y en donde el peso molecular de dicho polipéptido es entre alrededor de 30 kDa y alrededor de 150 kDa, dicho método comprende: a) contactar células con un polipéptido de micoplasma pretratado con un compuesto de prueba, y b) determinar si dicho compuesto de prueba inhibe dichas células liberar calcio, en donde la inhibición de liberación de calcio en dichas células por dicho compuesto de prueba indica que dicho compuesto de prueba es dicho inhibidor.
  32. 32. El método según la reivindicación 31, caracterizado porque dicho compuesto de prueba es una proteasa.
  33. 33. El método según la reivindicación 31, caracterizado porque dicho compuesto de prueba es un anticuerpo.
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