CN1651455A - 假马齿苋皂苷化合物、总皂苷及其在医药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，具体为从草药假马齿苋中提取得到的用于治疗肿瘤、抑郁和老年痴呆的3种达玛烷型三萜皂苷以及包含有这3种达玛烷型三萜皂苷的混合物。3种达玛烷型三萜皂苷分别为Bacopaside l、Bacopasaponin C和Bacopasaponin D。包含有这3种达玛烷型三萜皂苷且重量含量≥50％的混合物被定名为假马齿苋总皂苷。实验研究证明，这三种达玛烷型三萜皂苷以及假马齿苋总皂苷，对人体肿瘤细胞K－562，SHG－44，HCT－8，A－549，PC－3M等细胞株均有抑制作用；对S180荷瘤小鼠的肿瘤组织也有抑制作用；对抑郁病人及东莨菪碱诱导的小鼠大脑记忆损伤均有明显的改善作用。它们是有效的治疗肿瘤、抑郁症和老年痴呆症的药物。

Description

假马齿苋皂苷化合物、总皂苷及其在医药中的应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种从草药假马齿苋中提取分离得到的皂苷类化合物以及包含有皂苷类化合物的混合物(假马齿苋总皂苷)及其在预防和治疗肿瘤、精神抑郁和老年痴呆等疾病的药物中的应用。

背景技术

假马齿苋系玄参科植物假马齿苋(Bacopa Monnieri(L.)Wettst)的全草，中医理论中假马齿苋具有清热凉血，解毒消肿的功效，用于治疗痢疾、目赤肿痛、丹毒、痔疮肿痛、象皮肿等症状。

印度阿育吠陀医药理论(Ayurvedic system of medicine)认为假马齿苋具有改善记忆的功效。

发明内容

本发明的目的是，根据印度阿育吠陀医药理论和治疗经验，结合现代化学和药理手段，从假马齿苋中提取分离高效低毒，可用作治疗肿瘤、精神抑郁和老年痴呆等疾病药物的皂苷类化合物以及含有该皂苷类化合物的混合物(假马齿苋总皂苷)。

本发明从假马齿苋中提取分离具有治疗肿瘤、精神抑郁和老年痴呆等疾病的皂苷类化合物，得到3种达玛烷型三萜皂苷，分别为：Bacopaside I、Bacopasaponin C和Bacopasaponin D，以及包含这1-3种达玛烷型三萜皂苷的混合物——假马齿苋总皂苷。该总皂苷中，一般地皂苷化合物重量含量≥50％。

实验说明，上述这些达玛烷型三萜皂苷，以及包含有这些达玛烷型三萜皂苷的混合物假马齿苋总皂苷，对人体肿瘤细胞K-562，SHG-44，HCT-8，A-549，PC-3M等细胞株均有抑制作用；对S180荷瘤小鼠的肉瘤组织也有抑制作用；对抑郁病人、老年痴呆及东莨菪碱诱导的小鼠大脑记忆损伤均有明显的改善作用。它们是有效的治疗肿瘤、抑郁和老年痴呆的药物。

本发明中的3种达玛烷型三萜皂苷化学结构如下所示：

Bacopaside I中，苷元为pseudojujubogenin(伪酸枣仁苷元)，糖链为3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→2)-[6-O-磺酸基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]}-α-L-比喃阿拉伯糖基。

Bacopasaponin C中，苷元为pseudojujubogenin(伪酸枣仁苷元)，糖链为3-O-[β-D-比喃葡萄糖基(1→3){α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→2)}]-α-L-吡喃阿拉伯糖基。

Bacopasaponin D中，苷元为jujubogenin(酸枣仁苷元)，糖链为3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3){α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→2)}]-α-L-比喃阿拉伯糖基。

本发明提供的达玛烷型三萜皂苷以及包含有达玛烷型三萜皂苷的混合物假马齿苋总皂苷的制备方法如下：对假马齿苋用乙醇等作为提取溶剂进行提取，将提取液浓缩得到浸膏，再经大孔树脂柱层析分离，收集乙醇洗脱液，浓缩，即得到假马齿苋总皂苷。对总皂苷经硅胶柱层析，用薄层层析检测层析流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，再经RP-18低压柱或HPLC(高效液相色谱)分离和纯化，分得Bacopaside I、BacopasaponinC和Bacopasaponin D。

通过酸水解以及紫外光谱仪、红外光谱仪、高分辨快速原子轰击质谱仪、核磁共振氢谱仪、核磁共振碳谱仪、异核多量子相关谱仪、异核多键相关谱仪等光谱分析技术，得到上述3种达玛烷型三萜皂苷化学结构，依次为：3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→2)-[6-O-磺酸基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖基伪酸枣仁苷：3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3){α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→2)}α-L-吡喃阿拉伯糖基]伪酸枣仁苷；3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3){α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→2)}α-L-吡喃阿拉伯糖基]酸枣仁苷。

本发明对假马齿苋总皂苷和3个化合物进行了抗肿瘤、抑郁和老年痴呆的评价实验。

(一)假马齿苋皂苷对体外人肿瘤细胞的抑制作用。

1.实验目的：

评价假马齿苋皂苷对体外人肿瘤细胞K-562，SHG-44，HCT-8，A-549，PC-3M等细胞株生长的影响。

2.方法：

细胞毒活性实验：MTT法筛选样品。三个皂苷和总皂苷样品的浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1.0μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml。

数据处理：数据以抑制率(％)表示。根据所得每组抑制指数，按肿瘤细胞抑制率的计算公式：抑制率＝[细胞死亡均数-(细胞存活数1+细胞存活数2)/2]/细胞死亡均数对照组指数]×100％。

3.结果：在100μg/ml时假马齿苋皂苷对K-562，SHG-44，HCT-8，A-549，PC-3M等细胞株的生长有较强的抑制作用(表1)。

                 表1.假马齿苋皂苷对人体肿瘤细胞的抑制作用

Samples	Cell lines	Cytotoxic ratio(％)
			100μg/ml 10μg/ml  1.0μg/ml  0.1μg/ml   0.01μg/ml
		总皂苷		A-549HCT-8K-562PC-3MSHG-44	94.36       -         -         -            -90.92       -         -         -            -96.91       5.70      -         -            -56.75       -         -         -            -94.43       -         -         -            -
Bacopaside I	A-549HCT-8		100.0       4.36      -         -            2.9989.75       -         -         -            -

Samples	Cell lines	Cytotoxic ratio(％)
			100μg/ml   10μg/ml   1.0μg/ml  0.1μg/ml    0.01μg/ml
		K-562PC-3MSHG-44		100.0       18.06      36.20       9.93          -47.22       1.54       11.20       3.85          14.63100.0       7.39       -           11.94         9.96
	BacopasaponinC		A-549HCT-8K-562PC-3MSHG-44		100.0       -          -           -             -100.0       -          -           -             -100.0       64.02      34.50       -             61.69100.0       -          -           -             -100.0       11.67      25.42       19.86         28.82
BacopasaponinD		A-549HCT-8K-562PC-3MSHG-44		55.28       -          32.66       2.47          -34.80       -          2.96        -             -87.51       -          -           20.63         13.219.11        4.37       1.22        0.16          9.8542.50       11.67      9.31        -             10.07

4.结论：3个达玛烷型三萜皂苷和假马齿苋总皂苷有较强的抗肿瘤活性。

(二)假马齿苋皂苷对S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用。

1.实验目的：评价假马齿苋皂苷对S180荷瘤小鼠肉瘤组织生长情况的影响。

2.方法

S180荷瘤小鼠，体重20g±5g，雌雄各半。动物随机分为4个实验组，1个环磷酰胺对照组和1个空白对照组。实验组分别口服给药3个皂苷(50mg/kg)，假马齿苋总皂苷(100mg/kg)，体积0.5mL/kg(下同)，法莫替丁组ig法莫替丁(30mg/kg)，以上药物用前均以5g/L羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)溶液配成所需浓度。空白对照组ig相应体积的生理盐水。上述各组按容量每日灌胃1次，从皮下植入肿瘤开始连续给药7d，各组均供给正常饮食。各组末次给药后禁食48h，将肉瘤进行组织剥离，称重，计算抑瘤率。

数据处理：数据以均数±标准差( x±SD)表示。根据所得每组离体肿瘤组织重量，按肿瘤抑制率的计算公式：肿瘤抑制率＝(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％；算出肿瘤抑制率。各组间差异的比较采用t检验。

3.结果

口服给药3个皂苷和假马齿苋总皂苷(50-100mg/kg)能明显抑制S180荷瘤小鼠肉瘤组织的生长形成(表2)。

表2 ig 3个三萜皂苷和假马齿苋总皂苷对S180荷瘤小鼠肉瘤组织的抑制作用

samples       Dose    Animal number Animal weight(g) Tumor weight(g) Inhibition(mg/kg) Start/end     (cut of tumor)   ±SD            ratio(％)

Blank            -      20/20        28.82±2.36      2.00±0.76      -CTX              30     10/10        27.66±1.43      0.18±0.07*    91.12总皂苷           100    10/10        28.96±2.93      0.20±0.04*    90.18Bacopaside I     100    10/9         28.07±3.42      0.26±0.06*    87.03Bacopasaponin C  100    10/10        26.56±4.61      0.20±0.04*    90.18Bacopasaponin D  100    10/10        28.96±2.93      1.22±0.44△       39.18

与空白对照组比较：^△P＞0.05；^*P＜0.01

4.结论：3个达玛烷型三萜皂苷和假马齿苋总皂苷有较强的抗肿瘤活性。

(三)假马齿苋皂苷对小鼠游泳不动时间的影响。

1.实验目的：评价假马齿苋皂苷对小鼠强迫游泳不动时间的影响。

2.方法

造模与分组：取ICR小鼠，雄性，体重20±5g。动物随机分为4个实验组，1个氟西汀对照组和1个空白对照组。常规饲养，并用3种三萜皂苷和假马齿苋总皂苷水溶液按50mg/kg溉胃，1次/d，连续7天。末次给药后一小时进行强迫游泳实验。

数据处理：记录每个实验组和阳性对照组小鼠在6min内的平均不动时间。各实验组和阳性组用t检验与空白组比较差异。

3.结果

假马齿苋皂苷能显著缩短小鼠强迫游泳的不动时间(表3)。

表3 ig3个三萜皂苷和假马齿苋总皂苷对小鼠游泳不动时间的影响

剂量组             不动时间      百分比    P
	阴性               124.4±27.0阳性组             24.9±30.8     80.0    ＜0.01总皂苷             10.2±12.2     91.8    ＜0.01Bacopaside I       27.3±16.4     77.2    ＜0.01Bacopasaponin C    39.5±44.6     68.2    ＜0.01

Bacopasaponin D    25.9±30.6    79.2    ＜0.01

4.结论

ig 3个三萜皂苷和假马齿苋总皂苷(10-50mg/kg)具有显著的抗抑郁作用。

(四)假马齿苋皂苷对小鼠悬尾不动时间的影响。

1.实验目的：评价假马齿苋皂苷对小鼠悬尾不动时间的影响作用。

2方法

造模与分组：取ICR小鼠，雄性，体重20±5g。动物随机分为4个实验组，1个氟西汀对照组和1个空白对照组。常规饲养，并用3种三萜皂苷和假马齿苋总皂苷水溶液按50mg/kg溉胃，1次/d，连续7天。末次给药后一小时进行悬尾实验。

数据处理：记录每个实验组和阳性对照组小鼠在6min内的平均不动时间。各实验组和阳性组用t检验与空白组比较差异。

3.结果

ig 3个三萜皂苷和假马齿苋总皂苷(10-50mg/kg)能显著降低悬尾小鼠的不动时间(表4)。

表4 ig3个三萜皂苷和假马齿苋总皂苷对小鼠悬尾不动时间的影响

组别	不动时间	百分比	P
				阴性组	102.3±29.4
阳性组	28.3±23.6	72.3	＜0.01
				总皂苷	54.6±37.5	46.6	＜0.01
Bacopaside I	40.2±40.8	60.7	＜0.01
				Bacopasaponin C	54.2±46.7	47.0	＜0.01
Bacopasaponin D	56.2±34.2	45.1	＜0.01

4.结论：

ig 3个假马齿苋三萜皂苷和假马齿苋总皂苷(10-50mg/kg)具有显著的抗抑郁作用。

(五)假马齿苋三萜皂苷和假马齿苋总皂苷的促智作用。

1.实验目的：

评价假马齿苋三萜皂苷和假马齿苋总皂苷对老年痴呆的治疗作用。

2.方法：

取ICR小鼠，雄性，体重20±5g。动物随机分为6个组，阴性对照和阳性对照组每次均灌以等体积的生理盐水，其余四个实验组先分别给药7天，末次给药后，除阴性对照组外，其余各组均用东莨菪碱灌胃10mg/kg，给药后一小时进行跳台实验。

3.结果：3个三萜皂苷和假马齿苋总皂苷(10-50mg/kg)能显著延长小鼠跳台潜伏期并使错误次数明显减少(表5)

表5假马齿苋皂苷对痴呆模型小鼠抗痴呆和促智作用的影响

组别            训练5min内错     24h后潜伏期       3min内错误次  P误次数(n)         (Tl)/s             数(n)
	阴性组           5.77±3.83       73.23±49.84      0.47±0.23阳性组           16.5±9.7        22.93±12.63      2.90±1.66   ＜0.05总皂苷           9.38±5.75       41.46±14.45      1.00±1.00   ＜0.01Bacopaside I     9.31±8.47       68.62±29.69      0.85±0.90   ＜0.001Bacopasaponin C  5.17±4.32       54.75±18.88      0.67±0.25   ＜0.001Bacopasaponin D  7.50±3.28       65.79±28.68      0.93±0.05   ＜0.01

4.结论：

假马齿苋皂苷具有显著的治疗老年痴呆症作用和促智活性。

具体实施方式

实施例1：

制备假马齿苋总皂苷

假马齿苋全草10kg粉碎后，以90％乙醇回流3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔树脂吸附，分别以水和40％乙醇洗脱后，收集70％乙醇洗脱液，溶剂回收至干得剩余固体即为假马齿苋总皂苷。

假马齿苋总皂苷，淡棕色粉末，Lieberman-Burchard和Keller-Killiani反应均呈阳性。

实施例2：

制备Bacopaside I

假马齿苋全草10kg粉碎后，以90％乙醇回流3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔树脂吸附，分别以水和40％乙醇洗脱后，收集70％乙醇洗脱液，溶剂回收至干得剩余固体即为假马齿苋总皂苷。将假马齿苋总皂苷进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇醇进行梯度洗脱，用薄层层析检查层析流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，分得流分1、2、3、4、5、6，将其中流分5经HPLC(MeOH:H₂O)分离、纯化，得到Bacopaside I。

Bacopaside I，白色无定形粉末，mp260-261℃，[α]_D ²⁸：-35.63°(c＝0.20，MeOH)，分子式：C₄₆H₇₂O₂₀S。

实施例3：

制备Bacopasaponin C

假马齿苋全草10kg粉碎后，以90％乙醇回流3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔树脂吸附，分别以水和40％乙醇洗脱后，收集70％乙醇洗脱液，溶剂回收至干得剩余固体即为假马齿苋总皂苷。将假马齿苋总皂苷进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，用薄层层析检查层析流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，分得流分1、2、3、4、5、6，将其中流分4经HPLC(MeOH:H₂O)分离、纯化，得到Bacopasaponin C。

Bacopasaponin C，白色无定形粉末，mp222-224℃，[α]_D ²⁸：-47.49°(c＝1.20，MeOH)，分子式：C₄₆H₇₄O₁₇。

实施例4：

制备Bacopasaponin D

假马齿苋全草10kg粉碎后，以90％乙醇回流3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔树脂吸附，分别以水和40％乙醇洗脱后，收集70％乙醇洗脱液，溶剂回收至干得剩余固体即为假马齿苋总皂苷。将假马齿苋总皂苷进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，用薄层层析检查层析流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，分得流分1、2、3、4、5、6，将其中流分4经HPLC(MeOH:H₂O)分离、纯化，得到Bacopasaponin D。

Bacopasaponin D，白色无定形粉末，mp234-241℃，[α]_D ²⁸：-42.35°(c＝0.14，MeOH)，分子式：C₄₆H₇₄O₁₇。

实施例5：

取Bacopaside I 100mg，用适量注射用水溶解，加甘露醇200mg，按照常规冻干工艺冻干，即得注射用冻干粉。用于治疗肿瘤疾病。

实施例6：

将假马齿苋总皂苷用适量注射用水分散，喷雾干燥或真空干燥，得假马齿苋总皂苷干粉，取聚乙二醇400，加入假马齿苋总皂苷干粉，边加边搅拌至匀，采用压制法，制成软胶囊。用于治疗抑郁疾病。

实施例7：

取假马齿苋总皂苷100g，用适量注射用水分散，加入辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，压制成1000片，包糖衣即得假马齿苋总皂苷片。用于治疗老年痴呆。

Claims (8)

1.一种从假马齿苋中提取得到的皂苷类化合物，其特征在于这3种达玛烷型三萜皂苷：Bacopaside I、Bacopasaponin C和Bacopasaponin D，其化学结构如下所示：

2.根据权利要求1所述的皂苷类化合物，其特征在于Bacopaside I中，苷元为伪酸枣仁苷元，糖链为3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→2)-[6-O-磺酸基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖基。

3.根据权利要求1所述的皂苷类化合物，其特征在于Bacopasaponin C中，苷元为伪酸枣仁苷元，糖链为3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3){α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→2)}]α-L-吡喃阿拉伯糖基。

4.根据权利要求1所述的皂苷类化合物，其特征在于Bacopasaponin D中，苷元为酸枣仁苷元，糖链为3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3){α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→2)}]α-L-吡喃阿拉伯糖基。

5.一种从假马齿苋中提取得到总皂苷，其特征在于为包含有假马齿苋皂苷类化合物Bacopaside I、Bacopasaponin C和Bacopasaponin D 3种达玛烷型三萜皂苷中的一种或任意组合的混合物。

6.根据权利要求5所述的总皂苷，其特征在于其中假马齿苋皂苷类化合物的重量含量≥50％。

7.一种如权利要求1所述的总皂苷化合物在制备治疗肿瘤、抑郁症和老年痴呆病的药物中的应用。

8.一种如权利要求5所述的总皂苷化合物在制备治疗肿瘤、抑郁症和老年痴呆病的药物中的应用。