CN1650882A - 腺苷类及鸟苷类化合物的医药保健用途及一种降压和改善心脑血管功能的药物或保健品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了腺苷类以及鸟苷类化合物的一种医药和保健用途，具体为用腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和环一磷酸腺苷、鸟苷、一磷酸鸟苷、二磷酸鸟苷、三磷酸鸟苷和环一磷酸鸟苷中的一种或几种及其可药用盐制备具有降压和改善心脑血管功能的药物或保健品。实验表明它有明显而持久的降压功能、毒性小、安全等特点，而且对机体具有调整作用，它不同于迄今体内已知的降压物质，它是一种新的血压调节剂，以此作为活性成分可以得到有效的降压新药，或者得到降压并调节心脑血管功能的保健品，为高血压的防治开辟一条新途径。

Description

腺苷类及鸟苷类化合物的医药保健用途 及一种降压和改善心脑血管功能的药物或保健品

技术领域

本发明涉及医药和保健领域，具体涉及腺苷类和鸟苷类物质的医药和保健用途。及一种含有腺苷类和鸟苷类物质的降压功能和对心脑血管系统具有保护和调节功能的药物或保健品。

背景技术

高血压是一个严重危害人类健康的常见病和多发病。在我国其患病率已从1959的5.11％升至2004年的18.00％。即，当今我国每百人中就有18个人患有不同程度的高血压。目前，每年还以300万的病例递增。估算现全国患病人数为1.6亿，比1991年增加7000多万，数目惊人！

高血压的发病机制尚未阐明。至今没有一个很理想的防治措施。药物治疗仍是其主要手段，因此，高血压的用药市场极大。目前，降压药物品种繁多，常用的降压药物就有几十种。其中，许多药物常伴有严重的不良反应。1990年世界卫生组织(WHO)规定以下五类药物为高血压的一线用药：钙通道阻断剂(calcium channel blocker，CCB)血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)，利尿剂，α-肾上腺素能受体阻断剂和β-肾上腺素能受体阻断剂。近年来还有另一类新药，即血管紧张素II受体阻滞剂。其中应用最广泛的是CCB和ACEI。作为一个理想的降压药，除能降低血压外，还应该安全，副作用小，保证重要脏器的良好灌注，预防或逆转心血管结构改变，不增加或减少心血管疾病的危险因素。伴有冠心病或糖尿病等并发症时也可应用，以及费用低、效益高等。由于高血压的发病机制极其复杂，上述药物虽然都有不同程度疗效，目前仍不失为有效的降压药，但它们均有不同程度的副作用和缺点。其中，有的伴有严重的不良反应。例如，利尿剂能引起低镁和低血钾症，CCB长期应用的安全性受到一定质疑，α-肾上腺能受体阻断剂首剂时有时会引起严重的体位性低血压，眩晕，心悸等，β-肾上腺能受体阻断剂主要对糖代谢有影响，并呈剂量相关性。ACEI可引起5％-10％的患者干咳。大剂量使用ACEI还可能引起中性粒细胞减少。还有0.1％患者出现神经性水肿等。

近年来，血管生物学取得了飞速进展。血管不再被认为仅是血液的通道，而被证明是一种具有复杂功能的器官。它不仅能合成及分泌许多生物活性物质，调节自身的功能；而且还能接受周围环境的各种信息，并将它们传递到其本身或周围组织细胞，通过其整合而产生功能或结构反应。血管平滑肌(VSM)还存在自身的信号转导系统，在血管功能调节中具有十分重要的作用。这套调节机制异常，是导致许多心脑血管疾病发生和发展的一个重要原因。冠心病的根本病因在于冠状动脉的病变；脑卒中本身就是脑血管的病变；高血压病的直接发病学环节是血管平滑肌细胞(VSMC)，尤其是阻力VSMC异常增殖，并向内膜下迁移，导致血管腔变窄，外周血液循环阻力升高，血压升高。不难看出，就上述三种发病率最高，危害最大的心脑血管疾病而言，根本上都是血管疾病。因此，开发一个新一代高效和毒副作用低，并能改善心脑血管功能的降压新药具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一类已知结构，但具有新作用机制的全新的医药保健用途的物质，其可用于制备一种高效和毒、副作用很低的降压和改善并调节心脑血管功能的药物或保健品。

本发明提供腺苷类以及鸟苷类化合物的一种医药和保健用途，为腺苷类以及鸟苷类化合物及其可药用盐用于制备具有降压和改善心脑血管功能的药物或保健品。

所述腺苷类化合物具体为腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和环一磷酸腺苷中的一种或几种。

所述鸟苷类化合物具体为鸟苷、一磷酸鸟苷、二磷酸鸟苷、三磷酸鸟苷和环一磷酸鸟苷中的一种或几种。

本发明的另一目的是提供一种降压及改善心脑血管功能的新药，其中以上述化合物及其可作为药用盐作为药性成分。

本发明还有一目的是提供一种降压和改善并调节心脑血管功能的保健品，其中以上述化合物及其可作为药用盐作为活性成分。

本发明提供的上述药物或保健品，可以以其中一种化合物及其可药用盐作为药效成分或活性成分，也可以将两种或多种化合物或其可药用盐联用作为药效成分或活性成分。

上述药物或保健品，还含有适应不同使用剂型的可药用辅料或载体。药品使用剂型为片剂、胶囊剂、口服液、滴丸剂或注射剂，保健品为片剂、胶囊剂、或口服液。

本发明首次提出腺苷类和鸟苷类物质在降压和改善并调节心脑血管功能的用途，并依此得到了以该类物质作为活性成分的药品和保健品。实验表明它有明显而持久的降压功能、毒性小、安全等特点，而且对机体具有调整作用，它不同于迄今体内已知的降压物质，它是一种新的血压调节剂，以此作为活性成分可以得到有效的降压新药，或者得到降压并调节心脑血管功能的保健品，为高血压的防治开辟一条新途径。

具体实施方式

本发明所提供的结构式为腺苷类和鸟苷类化合物。它们是发明人首次从红细胞中提取的一种内源性降压物质，其被命名为红细胞源性降压因子(erythrocyte-deriveddepressing factor，EDDF)。经过质谱、液相色谱-质谱(LC-MS)、二级质谱联用技术(MS/MS)，核磁共振，紫外等分析，现已确定EDDF为结构明确的一类化合物，具体为腺苷(AR)、一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、环一磷酸腺苷(cAMP)、鸟苷(GU)、一磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)和环一磷酸鸟苷(cGMP)。其结构式分别为：

腺苷(AR)                                            一磷酸腺苷(AMP)

二磷酸腺苷(ADP)                                      环一磷酸腺苷(cAMP)

鸟苷(GU)                                                        一磷酸鸟苷(GMP)

二磷酸鸟苷(GDP)                                                  三磷酸鸟苷(GTP)

环一磷酸鸟苷(cGMP)

如无特殊说明，本发明中提到的EDDF是指含有上述一种或多种化合物中的降压物质。发明人对它们的药理作用，具体为降压作用、改善心脑血管作用(包括对心脑血管的调节作用及抗衰老作用)、毒性、给药途径、理化特性、降压机制及存在与分布等方面进行了系列研究，首次得到红细胞中存在降压及对心脑血管系统具有调节及保护功能的物质。

EDDF的提取及纯化：该部分内容已在发明人另一专利申请02106068.1中详细描述，现简述其过程：

1).取正常健康人血液，经离心得到红细胞，然后溶血；

2).溶血产物进行热处理，冷却后进行超滤；

3).对超滤样品冷冻干燥；

4).将冷冻干燥样品进行柱层析，所收集的样品分别进行活性鉴定，将有降压活性的样品收集并行冷冻干燥；

5).将步骤4)的样品用高压液相色谱(HPLC)进行进一步纯化，并进行降压活性鉴定，将有活性的部分进行高效毛细管电泳(CE)，鉴定其纯度；

6).将步骤5)的样品行冷冻干燥，并分别进行质谱，核磁共振，紫外等分析，确证其结构和分子量。

经鉴定，上述制备得到的分别为腺苷(AR，MW＝267.25)、一磷酸腺苷(AMP，MW＝347.2)、二磷酸腺苷(ADP，MW＝427.2)、环一磷酸腺苷(cAMP，MW＝329.2)、鸟苷(GU，MW＝283.2)、一磷酸鸟苷(GMP，MW＝363.2)、二磷酸鸟苷(GDP，MW＝443.2)、三磷酸鸟苷(GTP，MW＝523.2)和环一磷酸鸟苷(cGMP，MW＝345.2)。

以上介绍的EDDF提取及纯化方法，只是公开了从红细胞中提取该类化合物的一种方法。事实上，作为一类已知结构的化学物质，还可以从其它途径得到，如通过化学合成或商业渠道购买等。

一、EDDF的药效学实验

本发明的EDDF的药效学实验主要是验证它的降压作用和对心脑血管系统的保护和调节及其抗衰老作用等。

(一)EDDF对血压的影响

用于鉴定EDDF生物活性。包括急性和慢性降压作用。

1.急性降压测定：

实验材料：正常大鼠(n＝100)和/或高血压大鼠，包括自发性高血压大鼠(n＝30)，肾性高血压大鼠(n＝30)及伴有高血压的糖尿病大鼠(n＝10)。均购自中国医学科学院实验动物中心。

实验方法：麻醉状态下分离实验大鼠一侧颈总动脉和颈外静脉。动脉插管通过YP100型压力传感器(北京新航业科贸有限公司)，连接到四导生理记录仪(NIHONKOHDEN，型号：RM6200，成都仪器厂及日本光电工业株式会社)上描记血压，静脉作为注射EDDF或其它对照药物用。

实验结果：

1.急性降压实验

观察了EDDF的生物提取物及几种腺苷及鸟苷类物质对大鼠的急性降压作用及慢性降压作用。急性降压结果见表1。

表1：EDDF对大鼠的急性降压作用

注射药物	浓度(mol/L)	降压效果(mmHg)
			腺苷(AR)、	10-4-10-2	25-70
一磷酸腺苷(AMP)	10-7-10-5	20-50
			二磷酸腺苷(ADP)	10-8-10-6	10-70
环一磷酸腺苷(cAMP)	10-4-10-2	20-40
			鸟苷(GU)	10-4-10-3	25-50
一磷酸鸟苷(GMP)	10-4-10-3	20-50
			二磷酸鸟苷(GDP)	10-4-10-3	15-40
三磷酸鸟苷(GTP)	10-4-10-3	25-40
			环一磷酸鸟苷(cGMP)	10-3-10-1	10-30
GU+cGMP(1∶1)	10-4-10-1	30-60
			AR+cGMP(1∶1)	10-7-10-5	30-60
ADP+cAMP+GTP(1∶1∶1)	10-8-10-6	10-80
			对照：nitrendipine	10-7-10-4	10-40

注：nitrendipine(尼群地平)为目前临床上常用的降压药。

从表1可以看出，表中所列的物质在给予的剂量范围内均具有不同程度的降压作用，但以ADP的降压作用最强，在很低浓度(10^-8mol/L)就有降压效果。

2.慢性降压实验，包括腹腔及口服两种给予药途径

1)腹腔注射：血压测定参考Preffer JM等的方法(J Lab Clin Med 1971，78：957)。给大鼠口饲EDDF，在清醒状态下用尾动脉脉压法测量血压。腹腔一次注射EDDF 30分钟后，自发性高血压大鼠(SHR)的血压(kPa)由原水平的24.00±1.54降至19.30±1.68(P＜0.05)，24小时后血压进一步降至8.66(P＜0.01)。此后血压一直维持在低水平，至第五天才逐步恢复。EDDF对正常大鼠也有降压作用，但维持时间很短。

2)口服EDDF及阳性对照药物对高血压大鼠血压的影响

作为临床的高血压一线用药，口服为最佳用药途径。本发明的研究结果表明，口服EDDF的降压效果也很好。该实验中，人EDDF组为人血液中提取的一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和环一磷酸鸟苷的混合物，猪EDDF组为从猪血液中提取的一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、鸟苷和环一磷酸鸟苷的混合物。实验观察了EDDF对正常及高血压大鼠，包括：自发性高血压大鼠(SHR)、两肾一环肾性高血压大鼠(2K-1Clip)及伴有高血压的糖尿病大鼠血压的影响。实验以不给药组作为阴性对照组，nitrendipine为阳性对照组。结果表明EDDF对它们均有明显降压作用，对正常大鼠也有降压作用，但维持时间短。结果见表2、3、4和5。用电血压计测量大鼠尾动脉血压(RBP-1型，北京中日友好医院临床研究所生产)。

表2清晨5:30口服EDDF对正常Wistar大鼠的降压作用(mmHg，100mg/kg提取物)

分组	血    压(mmHg)
					测压时间06:00                    07:00                     11:00                      19:00
	阴性对照组	136.4±7.1	120.6±9.4	119.2±7.8					123.0±4.0
人EDDF组					121.6±3.4*	120.4±4.7	123.3±2.5	118.3±7.8
	nitrendipine	119.3±2.3	121.0±3.2	116.3±1.6					115.5±6.1

^*P＜0.01 vs control(n＝6)

表3清晨5:30口服EDDF对两肾一夹肾性高血压大鼠的降压作用(mmHg，100.mg/kg提取物)

分组	血    压(mmHg)
					测压时间06:00                    07:00                     11:00                      19:00
	阴性对照组	147.3±3.1	146.8±3.2	135.8±4.3					134.5±6.1
人-EDDF					131.2±5.7**	130.4±2.9**	116.5±4.0*	129.2±6.0
	猪-EDDF	129.4±3.8**	129.0±4.3**	127.6±2.4*					126.8±3.4
nitrendipine					138.3±4.5*	134.5±2.1*	131.8±4.3	130.7±4.6

^**P＜0.01 and^*P＜0.05 vs control(n＝7)

表4：清晨5:30口服人和猪源性EDDF对自发性高血压大鼠的降压作用(100mg/kg EDDF提取物)

分组	血    压(mmHg)
					测压时间06:00                    07:00                      11:00                      19:00
	阴性对照组	184.6±4.9	187.6±5.6	164.2±2.2					175.0±4.1
人-EDDF					164.3±3.6**	171.3±4.1*	154.8±4.0*	171.6±5.5
	猪-EDDF	165.0±3.7**	172.0±5.0*	161.0±4.3					177.0±7.0
nitrendipine					163.0±4.3**	163.3±7.2*	162.3±1.9	175.6±7.0

^**P＜0.01and^*P＜0.05 vs control(n＝7)

表5：口服人EDDF对伴有高血压的糖尿病大鼠的降压作用(100mg/kgEDDF提取物)

分组	给药前血压(mmHg)	给药后血压(mmHg)
			正常大鼠组	118.8±1.3	116.5±2.4
伴有高血压的糖尿大鼠组	135.7±2.5	119.7±1.4**

^**P＜0.01 vs control(n＝9)

表2至表5 EDDF的药效学实验结果表明：EDDF的降压作用明显而持久，降压作用确切、肯定。

对自发性高血压大鼠(SHR)，卒中易感型SHR(SHRsp)、肾性高血压大鼠(RHR)及伴有高血压的糖尿病大鼠等动物的急性实验表明0.01-0.1(g/Kg)半纯品便可引起明显的降压反应；同样在上述高血压大鼠模型中的慢性实验表明，其降压维持的时间较长。腹腔一次注射EDDF同样可以明显降低SHR或RHR的血压且维持的时间较长。对SHR的降压作用在给药后30min达到最大，平均可降低60mmHg。以后逐渐恢复，第四天仍然维持在较低水平，至第五天才恢复至原水平；口服一次，降压作用可以维持数小时。

(二)、EDDF对心功能的保护作用

EDDF不仅具有显著的降压效应，对SHR的心脏也有很好的保护作用。实验表明它可以显著降低SHR在体心脏的左室收缩压(LVESP)、左室舒张压(LVEDP)及左室收缩和舒张最大变化速率(LVdp/dtmax)，并可显著降低心率。实验提示EDDF对在体心脏具有负性变时变力作用，EDDF也能明显降低SHR离体心脏的收缩强度及静息张力，而对心率和冠状动脉血流量无明显影响。其对在体心脏心率的影响，可能不是对心脏直接作用的结果。试验中观察到EDDF可以很好调节SHR心肌的收缩功能，并证明这种作用是非内皮依赖的。为了揭示EDDF对心脏的保护作用机制，应用膜片钳的实验表明EDDF可以明显抑制来源于心肌胚胎细胞膜上的Ca²⁺通道，激活Na⁺通道。在SHR，EDDF能明显降低心肌细胞EDDF Ca^2-水平，还观察到在SHR及钙超载大鼠，一种研究人类增龄过程中血管老化机制的很好模型，EDDF可以显著提高心肌肌浆网(SR)Ca²⁺的释放速率和摄取速率及Ca²⁺-ATPase的活性。但EDDF对心肌细胞核的Ca²⁺-ATPase的活性和Ca²⁺的摄取速率均未见明显影响。上述结果提示EDDF对心脏的作用机制可能与它通过多种途径改善心肌的Ca²⁺钙转运，包括抑制Ca²⁺内流，促进胞浆Ca²⁺的摄取，激活肌浆网Ca²⁺-ATPase活性密切相关。

(三)、EDDF的抗衰老作用

实验是在一种老年大鼠模型-钙超载(CaO)大鼠上进行的。

实验方法：选用CaO大鼠和正常Wistar大鼠，每组动物4只。用离体动脉环灌流法观察EDDF对两种大鼠胸主动脉、肠系膜二级阻力血管的舒张作用；用透射电镜观察EDDF对CaO大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)超微结构的影响；分别用黄嘌呤氧化法和DTNB比色法观察EDDF对CaO大鼠血管组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的影响；用无机磷方法测定EDDF对CaO大鼠血管组织中Ca²⁺-ATPase的影响。

实验结果：EDDF可以明显舒张CaO大鼠胸主动脉及肠系膜二级阻力血管(P＜0.05或0.01)，可以明显改善VSMC超微结构的异常，可以增加血管组织中SOD、GSH的活性(P＜O.05)，可以明显改善血管组织中Ca²⁺-ATPase活性的异常(P＜0.05)。

实验结论：EDDF可以通过舒张血管平滑肌，降低血管的异常反应性，调节钙离子代谢，增加血管抗氧化的能力，改善VSMC超微结构异常，而起到抗血管老化的作用。

二、EDDF生物活性鉴定

EDDF的生物活性除了通过上述的血压鉴定外，还可依据其对血管舒张功能的影响。该实验用大鼠离体血管平滑肌，包括尾动脉、肠系膜动脉、脑基底动脉、肾动脉和主动脉肌条，观察EDDF的舒血管效应。

(一)EDDF对有、无内皮的大鼠血管舒张功能(％)的影响

具体方法：将Wistar大鼠断头放血后，迅速取出上述血管条，在充95％O₂和5％CO₂的Krebs液(pH7.4)中剪成两个长约20mm宽约1mm的螺旋条。其中一条保留内皮，另一条用湿滤纸轻轻擦去内皮制备成去内皮血管条.将上述两个血管条分别置于1ml的灌流中，在37℃下，以2ml/min的恒速灌流Krebs液，并向浴槽中通上述混合气，向浴槽施加400-500mg的前负荷后记录肌条张力的变化。

待标本稳定后，以70mmol/L KCL灌流1分钟以检测其稳定性。若两次收缩相差小于10％，即可认为标本已稳定。此时向灌流液中加入苯肾上腺素(PE)，使其终浓度为1μmol/L当标本收缩达最大并稳定后，先用0.1μmol/L的乙酰胆碱(Ach)灌流1min以检查内皮的完整性，再依次灌流不同浓度(mg/L)的EDDF。EDDF的舒血管作用以其引起的舒张幅度占PE收缩幅度的百分比(即舒张百分比)表示，数值愈高，说明舒张程度越大。实验结果参见表6。

表6：EDDF对有、无内皮的大鼠血管舒张功能(％)的影响及左旋硝基精氨酸(L-NNA)的作用

动脉条	有无内皮	EDDF(mg/L)
					0.1	1.0	10.0
		EDDF组	有	8.8±3.0				25.1±8.7	53.2±8.9
无	0				0	0
			L-NNA+EDDF组	有			0	0	0
无	0	0			0

实验结果表明EDDF的舒血管作用是依赖内皮的，并通过NOS(一氧化氮合酶)介导的。

(二)EDDF对血管平滑肌(VSM)Ca²⁺转运的影响

包括Ca²⁺内流，胞内钙库的释放，胞浆及核Ca²⁺转运，Ca²⁺外流。

1.采用⁴⁵Ca周位素示踪法观察EDDF对Ca²⁺内流的影响：

大鼠在麻醉状态下处死，迅速取出主动脉及肠系膜动脉，置于pH7.6的PSS缓冲液中。将血管周围等结缔组织分离干净，沿纵轴剪开主动脉，将其剪成重量大致相同的若干平行肌条；肠系膜动脉及其2，3级分支也剪成若干段，然后将主动脉条(A)及肠系膜条(MA)置于含5ml PSS的试管中，每管放5-8条。

随后用⁴⁵Ca²⁺示踪法测定Ca²⁺内流。将上述有肌条的培养管置于37℃恒温水浴溶中，并恒速通入95％O2和5％CO₂的混合气，30mim后加入不同浓度的EDDF，保温40mim后加入100μL浓度为0.02mCi/ml的⁴⁵CaCL2溶液，作用30min后立即置入冷的无钙PSS缓冲液中终止反应，然后拭干肌条水迹并称重，将其放入含0.5ml 1NNaOH的液闪测量杯中，在70℃箱中消化3～4h。另取上述保温液0.5ml置于闪烁杯中作为⁴⁵Ca活性管。上述闪烁杯中加入5ml闪烁液，在Backman液闪仪上测其CPM，结果以mmol/l/g湿重表示。

实验结果表明：EDDF可以明显抑制血管平滑肌细胞Ca²⁺内流，降低胞内Ca²⁺水平。

2.激光扫描共聚焦微镜法观察EDDF对胞浆及核Ca²⁺转运的影响：

用消化法培养大鼠主动脉或肠系膜血管平滑肌细胞(VSMC)，制成单细胞悬液(细胞浓度为105个/ml)接种于35mm培养皿，在培养箱继续培养24h，弃去培养基，以D-Hanks液洗2次，然后以含fluo-3/AM(2.5μmol/L，Molccular Probes公司)的DMEM营养液1ml负载细胞，37℃，避光，30min后吸去负载液，用D-Hanks液洗两次，负载后的细胞在ACAS Meridian TM Ultima 212型激扫描共聚焦显微镜下进行扫描。扫描时，培养皿中的液体，即VSMC细胞外液，包括含生理浓度的Ca²(Ca-N液，即Hanks液)和不含Ca²(Ca-N液，即不加Ca²的Hanks液)两种条件，后者旨在观察胞内钙池的释放。

测定时，加药之前先扫描3次，记录细胞静息态胞浆及核内游离Ca²荧光强度值。而后加入一种激动剂，观察胞浆及核内Ca²荧光强度的变化，待细胞回至静息状态后，换液，再将激动剂与EDDF同时加入，观察EDDF对激动剂作用的影响。以ACASMeridian TM Ultima软件进行数据处理。

实验结果表明：EDDF通过多途径降低血管平滑肌胞内Ca²水平，最终使血压下降。

三、EDDF毒性实验

1.口服急性毒性实验

试验材料：Wistar大鼠20只，ICR小鼠10只，雌雄各半，均购自中国医学科学院实验动物中心。

实验方法：大鼠口饲1500mg/kg，小鼠口饲1000mg/kg，连续观察2周，观察死亡情况；2周后对实验动物进行21项血清学指标检查，及重要脏器(肝、肾及心脏等)的病理切片检查。

实验结果：至观察期满，服用EDDF药物的动物无一只死亡，对大鼠21项血清学指标检查表明无明显改变，病理切片显示此剂量对大鼠肝脏，心肌及肾脏无毒性；小鼠口饲1000mg/kg，连续观察3周，对动物无任何毒性作用(都是自身对照)。

2.大、小鼠静脉注射急性毒性实验

试验材料：ICR雄性小鼠7只，体重20±1.2克，Wistar大鼠6只，体重252±5.6克，均购自中国医学科学院实验动物中心。

实验方法：小、小鼠尾静脉注射EDDF 200mg/kg，连续观察14天，观察死亡情况和活动进食情况等；

	小鼠	大鼠
			动物数目	7	6
体重(g)	20.0±1.2	252±5.6
			给药剂量mg/kg	200	200
呼吸频率加快	7	6
			自主活动减少	7	6
恢复正常时间(min)	10	12
			动物死亡数目	0	0

实验结果：在此剂量下，初期大、小鼠均出现呼吸频率加快，自主活动减少症状。但仅持续约5-10分钟，10-12分钟左右恢复正常活动，15-20分钟出现进食。观察期间无一例实验动物发生死亡。分析实验动物在此静脉注射剂量下出现的症状是由低血压造成的。

3.Ames致突实验表明EDDF无致突变作用。

以上实验均表明EDDF安全，毒性极低。

据有关报道，现有的钙通道阻断剂diperdipine的急性毒性资料表明，大鼠口服15mg/kg即开始出现毒性作用，靶器官为肝脏，导致肝细胞粟粒性坏死，口服250mg/kg时动物开始出现死亡。而目前临床常用的nifedipine，在大鼠口服500mg/kg时开始出现死亡。这些现有药物的毒性均明显高EDDF。

四、EDDF对机体的调整作用

本发明实验中发现，在正常动物或/和正常人的红细胞，EDDF的含量明显高于高血压动物或/和高血压病人红细胞同样提取物的量。提示EDDF的减少可能是高血压发病的一个重要原因。

五.EDDF的存在和分布

本发明人不仅从自发性高血压大鼠和正常大鼠，而且首次从原发性高血压病人及正常人及其它动物，如兔、猫、牛、狗等动物的红细胞中提取了EDDF，提示EDDF的存在无种属特异性。由于人红细胞来源有限，为了拓宽EDDF的来源，实验从猪的红细胞中用同样方法提取了EDDF的半纯品，并从器官、细胞和分子水平对人及猪源性EDDF(分别简称为p-EDDF及h-EDDF)进行了比较。结果发现p-EDDF及h-EDDF的降压作用及舒血管特性、抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和DNA合成等方面的作用非常类似。这不仅为解决EDDF的来源提供了理论依据，也进一步证明了EDDF的分布无种属特异性。

六、EDDF降压及对血管保护作用的机制分析

为了揭示EDDF的降压及对心脑血管的保护机制，本发明在上述实验的基础上从整体、器官、细胞和分子水平进行了系列研究。已有的结果表明，EDDF的心脑血管保护作用机制可能包括以下几个方面：

(一)、呈内皮依赖性的舒张血管平滑肌(VSM)，其作用机制可能通过NO-cGMP通路EDDF对正常Wistar大鼠的主动脉具有内皮依赖性的舒张作用，后者可被左旋硝基精氨酸(L-N^G-nitro-arginine，L-NNA)和甲基美蓝(methy Blue，MB)阻断，被铜锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)保护，EDDF还可明显激活Wistar大鼠血管平滑肌产生cGMP。提示EDDF可能是通过NO/cGMP途径舒张血管和降压的。我们应用生物法及双光子激发荧光扫描显微镜(two-photo laser scanning fluorescencemicroscope，TPM)法测定血管反应性，(TPM法的原理是应用红外波段的超快激光作为光源，用光学非线性效应实现对样品的三维层析成像。由于红外光对生物组织的杀伤力小，因此，可利用此技术对生物样品进行活体动态观察，它还具有穿透深的特点，很适宜生物组织样品的成象。结果也表明，EDDF可以明显抑制由苯肾上腺素等激动剂引起的正常大鼠，SHR、2K-1C肾性高血压大鼠(2K-1C RHR)、钙超载大鼠及高血压糖尿病大鼠的胸主动脉、肠系膜阻力血管、脑基底动脉及肾小动脉的收缩，使血管收缩曲线明显右移。在无内皮的血管收缩曲线无明显变化。

为了进一步确证EDDF的舒血管机制是通过NO/EDRF-cGMP通路，本发明又应用组织化学、免疫组化、放免测定及L-³H精氨酸掺入等方法，在L-NNA高血压大鼠模型及对照大鼠上观察了主动脉NOS活性、L-精氨酸(L-arginine，L-arg.)掺入率、cGMP水平的变化及EDDF的影响。L-NNA大鼠模型的优点是制备简单，病因清楚，影响因素单一，提供了一个较理想的研究体内NO体系障碍的模型。因此，很适宜用于探讨EDDF的舒血管机制。给大鼠腹腔注射L-NNA，抑制其体内NOS，用药后第一天大鼠血压就开始升高，这与L-NNA对eNOS的选择性及不可逆抑制作用是一致的。连续用药导致大鼠血压持续升高，至第四周稳定，提示，此时内源性NOS的活性基本被全部抑制。

NOS的底物L-arg.经NOS催化生成L-胍氨酸，同时生成NO。L-arg.的转化率直接反映了组织NOS的活性。我们以³H-L-arg为底物测定了主动脉NOS的转化率，结果表明L-NNA组L-arg.的转化率明显低于正常组。在L-NNA组，cGMP水平也明显低于正常组。提示L-NNA明显抑制了NOS活性。正常大鼠主动脉与EDDF孵育后能明显提高L-arg的转化率，提示EDDF能明显激活正常动物主动脉的NOS，由于在L-NNA组，内源性的NOS已被完全抑制，因此EDDF对L-arg.的转换率及对cGMP的激活作用不能被显示出来。在L-NNA组的主动脉，NOS酶组化染色及免疫组化染色明显的比对照组变浅，表明L-NNA明显抑制了主动脉NOS活性。而正常大鼠的主动脉与EDDF保温后，NOS组化染色明显比未给药组着色深，而在L-NNA组，EDDF处理前后对主动脉的组化染色及免疫组化染色无明显影响。提示EDDF能明显激活正常大鼠主动脉的NOS活性。

L-NNA组大鼠主动脉L-arg转化率明显低于正常对照组，证实了L-NNA对eNOS的选择性不可逆抑制。EDDF短时间孵育不能提高L-NNA抑制的NOS底物转化率，这进一步证明EDDF是通过NO/cGMP通路导致舒血管作用的。

NO发挥生物学效应的基本方式激活靶细胞中的鸟苷酸环化酶，使胞内cGMP水平升高，在血管平滑肌细胞，cGMP作为一种重要的第二信使可通过多种途径影响胞内Ca²⁺水平，最终导致血管平滑肌舒张。因此，测定组织cGMP水平对了解EDDF的舒血管机制具有重要意义。我们发现L-NNA组大鼠主动脉及血浆的cGMP水平显著低于对照组，这有力地论证了NOS活性被抑制，也进一步说明了L-NNA导致动物血压升高的机理。EDDF能明显提高正常大鼠主动脉cGMP水平，这也是EDDF能明显激活NOS活性的直接结果。这可能是EDDF通过NO-cGMP途径舒张正常大鼠血管平滑肌的一个重要机制。

总之，本发明通过生物鉴定，放免测定，³H同位素掺入及组织化学和免疫组化等方法，都证实EDDF的舒血管机制是通过NO-cGMP通路发挥作用的。

本发明实验还表明EDDF还可明显抑制SHR脑基底动脉对苯肾上腺素(PE)及KCl引起的收缩，并可明显降低合并高血压的糖尿病大鼠(DM)肾脏小血管及脑基底动脉等阻力血管对PE及KCl的反应性。EDDF也能明显改善钙超载大鼠主动脉及肠系膜阻力血管的收缩功能。这些结果表明EDDF不仅可以保护高血压大鼠的血管，而且对钙超载大鼠及合并高血压的糖尿病大鼠的血管均有很好的保护作用；不仅对外周血管，对中枢血管也有很好保护作用。从肾脏微血管VSMCs的超微结构可见，DM大鼠的肾小血管VSMCs存在明显异常，说明糖尿病已造成肾血管病变。EDDF能明显减轻该血管VSMCs的异常，从而起到保护肾脏的作用。以上结果非常有意义，因为高血压及糖尿病时均容易引起脑血管意外，而糖尿病晚期还易引起视网膜小血管及肾小血管意外。EDDF可以明显舒张脑部阻力血管及肾小血管，这对脑卒中和糖尿病晚期脑、肾等血管意外的防治具有重要的意义。

不难看出，EDDF不仅能作为降压药，而且可作为心脑血管保护剂，不仅适用于高血压，脑卒中，对老年病及糖尿病，尤其是合并高血压的糖尿病可能均具有明显的应有价值。EDDF对L-NNA诱导的高血压大鼠血管无明显改善作用。进一步证实了EDDF是通过NO/EDRF-cGMP通路舒张血管和降低血压的。

(二)、EDDF对VSMCs钙转运的影响

EDDF明显抑制自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌Ca²⁺内流，降低激动剂所引起的血管平滑肌细胞(VSMC)胞浆及核内Ca²⁺水平的升高。

高血压时VSMCs钙的转运和代谢发生了一系列障碍，因此，纠正高血压时细胞，尤其VSMCs钙代谢紊乱是治疗高血压的有效措施。EDDF可明显改善高血压时细胞钙的转运和代谢障碍，主要表现为明显降低胞外Ca²⁺内流、抑制胞内钙池释放、促进胞内钙池重储来抑制胞浆Ca²⁺水平([Ca²⁺]_i)升高。

1、EDDF具有强大的抑制VSMCs胞外钙内流的作用

VSMCs胞外Ca²⁺跨膜内流主要通过质膜上的Ca²⁺通道。目前，在VSMCs已发现的Ca²⁺通道主要有四种：电压依赖性通道(VDC)、受体依赖性通道(RDC)、机械操纵型通道和漏流离子通道。EDDF可能对L-VDC和R-VDC的开放均有不同程度的抑制作用。

2、EDDF能抑制胞内钙池释放，促进胞内钙池重储

目前认为VSMCs胞内钙池定位于肌浆网(SR)。SR上存在两种释放Ca²⁺的通道：对三磷酸肌醇(IP₃)，敏感的及对ryanodine敏感的Ca²⁺通道。研究发现EDDF对IP₃激发的SR释放的效应有显著抑制作用，对ryanodine敏感钙池的释放无明显抑制作用。

SR膜上存在着高浓度的Ca²⁺-ATPase系统，其作用是将胞浆中大量Ca²⁺泵入SR，CPA(cyclopiazonic acid)是这类酶的一种特异的可逆性抑制剂，它可显著抑制SRCa²⁺-ATPase活性，导致[Ca²⁺]_i及[Ca²⁺]_n升高。EDDF能明显拮抗CPA的作用，促进胞内钙池重储。

综上所述，EDDF对VSMCs胞内Ca²⁺转运影响是多方面的。一方面，它对胞外Ca²⁺经由VDC尤其是L-VDC的内流具有强大的阻断作用；另一方面，它对胞内钙池的释放也有明显的影响。EDDF对IP₃敏感钙池的释放有显著抑制作用，而对ryanodine敏感钙池的释放无抑制作用，甚至还有一过性的激动作用，表现出双向性的特征。我们认为，一方面，EDDF对VSMCs Ca²⁺转运多重作用的最终结果降低了[Ca²⁺]_i，另一方面，VSMCs中并非所有区域的Ca²⁺升高都与兴奋收缩耦联。目前认为，胞外Ca²⁺经质膜Ca²⁺通道的内流和IP₃敏感钙池释放导致的[Ca²⁺]_i升高均与VSMCs收缩相耦联，而ryanodine敏感钙池的释放导致的[Ca²⁺]_i升高并不与VSMCs收缩耦联。我们认为，抑制胞外Ca²⁺经VCD的内流可能是EDDF最主要的降压机制，抑制IP₃敏感钙池的释放可能也在其中起重要作用。

(三)、EDDF对VSMCs超微结构的影响

透射电镜结果亦显示EDDF可以明显减轻高血压大鼠、钙超载(CaO)大鼠及伴有高血压的糖尿病大鼠主动脉、肾小动脉VSMCs核损伤，及改善线粒体肿胀和其它细胞器异常，从而有效减轻大鼠主动脉VSMCs的损伤；EDDF也可明显减轻SHR心肌细胞上述超微结构的损伤。

(四)对SHR的心脏呈负性变时变力影响。

以上实验和分析表明：EDDF具有明显和持久的降压作用，可以显著改善高血压动物的血管功能异常，对其心脏也有一定的保护作用。其低毒的特性及对机体可能具有良好的调节作用，使其相比于现有的降压药可能更具有优势。

EDDF的降压机制是复杂的，可能通过多条细胞转导途径的网络式调节作用于心脑血管系统。其中，改善高血压时VSMCs的异常钙转运，拮抗体内多种升高胞浆及核钙水平的因子的作用、呈内皮依赖性的舒张血管平滑肌及抑制VSMCs的增殖可能是其降压机制的关键。其信号通路可能是通过Ca²⁺-钙调素-NO/cGMP-生长因子(PDGF等)-MAPK途径。EDDF有望开发为一个安全有效的降压及保护心脑血管的新药，这对高血压及其它心脑血管疾病的防治不仅具有很大的理论意义，也有很大的实用价值。在对血管功能的保护方面，EDDF可能优于硝苯吡啶及血管紧张素转换酶抑制剂等常用抗高血压药物。

本发明公开了从人红细胞中提取的一类内源性的化学物质EDDF的降压和改善心脑血管功能的作用、抗衰老作用及其作用机制。这类物质具有药效学好及毒性极低等特点。从已有的结果表明EDDF不同于迄今体内已知的体内血压调节物质，它是一种新的血压调节物质，并对心脑血管功能具有明显的保护作用和抗衰老作用。将EDDF本身或以它作为药效成分与其它可药用的辅料或载体组合可以形成新的有效降压和保护心脑血管功能的药物，具体可以制成片剂、胶囊、口服液、滴丸剂和注射液以及其它剂型等，对此，本领域技术人员能够依照使用需求选择辅料和剂型，本发明不予赘述；另一方面，本发明EDDF作为活性成分与其它可接受的辅料或载体组合可以形成新的维持正常血压和调节心脑血管功能的保健品，具体也可以制成片剂、胶囊、口服液、以及其它剂型等，甚至可以制成保健食品、保健饮料，对此，技术人员能够依照需求进行选择和制作，本发明也不予赘述。

七、本发明的技术特点：

(一)EDDF是首次从人的红细胞中提取的一种的降压物质，现已确定为一类结构确定的物质。已有的实验表明它们有明显而持久的降压功能、毒性小、安全等特点，而且可能对机体具有调整作用。从对其作用机制的多层次分析表明，它们不同于迄今体内已知的降压物质，应该是一种新的血压调节剂。EDDF的产生可能是机体对抗血压升高的一种生理反应，可以成为一种有效降压新药，为高血压的防治开辟一条新途径；同时也可作为调节血压及抗衰老的保健进行开发。

(二)EDDF对血管，尤其是对高血压大鼠及老年大鼠的血管具有良好的保护功能，其可以为一个新的降压药物和/或保护血管的保健品。

(三).EDDF的存在无种属特异性，它不仅存在人的红细胞中，也广泛存在狗、猪、猫、牛、兔和鼠等动物的红细胞中，而且人源性及动物源性的EDDF的降压活性及降压机制无明显差异，为同一类物质。

Claims (9)

1、腺苷类以及鸟苷类化合物的医药和保健用途，为腺苷类以及鸟苷类化合物及其可药用盐用于制备具有降压和改善心脑血管功能的药物或保健品。

2、根据权利要求1所述的医药和保健用途，其特征在于：所述腺苷类化合物具体为腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和环一磷酸腺苷中的一种或几种。

3、根据权利要求1所述的医药和保健用途，其特征在于：所述鸟苷类化合物具体为鸟苷、一磷酸鸟苷、二磷酸鸟苷、三磷酸鸟苷和环一磷酸鸟苷中的一种或几种。

4、一种降压和改善心脑血管功能的药物，其特征在于：含有药用剂量的权利要求1或2或3的化合物及其可药用的盐中的一种或几种。

5、一种降压和改善心脑血管功能的保健品，其特征在于：含有保健剂量的权利要求1或2或3的化合物及其可药用的盐中的一种或几种。

6、根据权利要求4或5所述的降压和改善心脑血管功能的药物或保健品，其特征在于：含有腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和/或环一磷酸腺苷及其可药用盐。

7、根据权利要求4或5所述的降压和改善心脑血管功能的药物或保健品，其特征在于：含有二磷酸腺苷及其可药用盐。

8、根据权利要求5至7任一所述的降压和改善心脑血管功能的药物或保健品，其特征在于：还含有适应不同使用剂型的可药用辅料或载体。

9、根据权利要求8所述的降压和改善心脑血管功能的药物或保健品，其特征在于：药物使用剂型为片剂、胶囊剂、口服液、滴丸剂或注射剂，保健品使用剂型为片剂、胶囊剂、或口服液。