CN1648656A - 高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法 - Google Patents
高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1648656A CN1648656A CN200410065986.7A CN200410065986A CN1648656A CN 1648656 A CN1648656 A CN 1648656A CN 200410065986 A CN200410065986 A CN 200410065986A CN 1648656 A CN1648656 A CN 1648656A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hypocrellin
- content
- chromatographic
- determining
- high efficiency
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- VANSZAOQCMTTPB-SETSBSEESA-N hypocrellin Chemical compound C1[C@@](C)(O)[C@@H](C(C)=O)C2=C(OC)C(O)=C3C(=O)C=C(OC)C4=C3C2=C2C3=C4C(OC)=CC(=O)C3=C(O)C(OC)=C21 VANSZAOQCMTTPB-SETSBSEESA-N 0.000 title claims abstract description 49
- BQJKVFXDDMQLBE-UHFFFAOYSA-N shiraiachrome A Natural products COC1=C2C3=C(OC)C=C(O)C4=C3C3=C5C(CC(C)(O)C(C(C)=O)C3=C(OC)C4=O)=C(OC)C(=O)C(C(O)=C1)=C25 BQJKVFXDDMQLBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 49
- YDLBDQPPRTYAIG-UHFFFAOYSA-N hypocrellin A Natural products COC1C2CC(C)(O)C(C(=O)C)C3=C(OC)C(=O)c4c(O)cc(OC)c5c6c(OC)cc(O)c(C1=O)c6c2c3c45 YDLBDQPPRTYAIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title abstract 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title abstract 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 abstract 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- KGHNSNSWRMJVND-UHFFFAOYSA-N Hypocrellin Natural products COC1=CC(=O)C2=C3C4C(C(C(=O)C)C(C)(O)Cc5c(OC)c(O)c6C(=O)C=C(OC)C(=C13)c6c45)C(=C2O)OC KGHNSNSWRMJVND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 241000143667 Hypocrella Species 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000001126 phototherapy Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 2
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 241001330002 Bambuseae Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010019133 Hangover Diseases 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024380 Leukoderma Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004308 accommodation Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical group [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBFREVPLPJASRX-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1,4-dione perylene Chemical class C1=CC=C2C=CC=C3C4=CC=CC5=CC=CC(C1=C23)=C45.C4(C=CC(C5=CC=CC=C45)=O)=O RBFREVPLPJASRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007578 phototoxic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法,包括以下步骤:a.色谱柱选用:Zorbax Extend-C18 column;b.以甲醇和水的体积比为83∶17作为色谱流动相;c.所用条件为:柱温30℃,流速:1ml/min;荧光检测器激发波长:410nm;发射检测波长:610nm;进样体积为10μl。优化方案中,作为色谱流动相的甲醇/水的体积比为83/17。本发明以大量实验和理论分析,找到了适合竹红菌甲素的色谱分析方法,填补了竹红菌甲素色谱方面的研究空白。
Description
技术领域
本发明涉及一种色谱检测方法,具体涉及一种高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法。
背景技术
竹红菌素(Hypocrellin)是我国首次发现并应用于临床的新型光疗药物。临床证明它对某些皮肤顽症有明显的光敏治疗作用,其中包括用于治疗肥厚性瘢痕、皮肤淀粉样苔藓、牛皮藓,白癜疯等皮肤病。经过十多年来对竹红菌素的结构、光化学、光物理、光生物、药理学等各方面的广泛系统的研究,研究工作者发现与其它类型的光敏剂相比,竹红菌素作为一种新型的光敏剂,具有易纯化、化学修饰性好、三重态量子产率高、单重态氧量子产率高、光毒性高、从正常组织排出速度快等优点,因此被公认为是一种极有应用前景的光疗药物。竹红菌素又具有抗癌活性,对实体肉瘤和体外癌细胞具有明显的抑制作用。竹红菌素中最主要的光敏成分为竹红菌甲素(HA)。它属于羟基苝醌类衍生物(图1)。有关它的定量分析研究目前还很少。目前竹红菌甲素含量的测定主要运用分光光度计测量其紫外吸收值,容易受杂质干扰,误差较大。
竹红菌药物正越来越得到广泛运用,竹红菌甲素的科学研究也越来越广泛深入。这一切都对竹红菌甲素定量检测方法的准确性和简便性提出了更高的要求,目前所用的分光光度计定量方法已经不能满足科学发展的需要。特别是,竹红菌甲素一般都由天然产物中提取,而天然提取产物中一般都含有大量的杂质存在。如果选用一般的紫外或示差折光检测器,则这些杂质常常存在于竹红菌甲素色谱峰周围,甚至与竹红菌甲素的色谱峰相叠加,影响了竹红菌甲素定量的准确性。在大量的实验比较后,发明人发现,利用竹红菌甲素的荧光发射性质,如果选用荧光检测器,则可以解决这一难题。竹红菌甲素在激发光为410nm时,于610nm处发射较强的荧光,而大部分杂质都不具备这一发光的特性。因此,选用荧光检测器,并将检测波长定在此处,则大部分杂质都被滤过而不出现在色谱峰中,对竹红菌甲素的色谱测定不造成影响,而保证了竹红菌甲素定量的准确性。
目前之所以没有竹红菌甲素色谱方面的研究成果,是因为要找到适合竹红菌甲素的色谱分析方法相当困难。所做的大量实验表明,竹红菌甲素在一般的C18,C8,以及离子交换色谱柱上,均呈现拖尾达数分钟的扁平色谱峰,改变流动相的洗脱强度,pH值,缓冲盐浓度等均无法使之优化;竹红菌甲素色谱峰不仅峰形差,而且理论塔板数很低,在对竹红菌提取液的分析中,达不到可行的分离效果和回收率。发明人推断这种现象可能是竹红菌甲素分子中的羟基、羰基、以及甲氧基等基团与色谱柱中的硅羟基的作用引起。
发明内容
竹红菌甲素作为新型的光疗药物正广泛用于临床及科学研究。为了提高竹红菌甲素定量的准确性和简便性,避免杂质干扰,适应临床药物及科学研究的需要,本实验首次将反相高效液相色谱法用于竹红菌提取物中竹红菌甲素含量进行测定。针对分光光度计方法的缺点,设计一种快速简便,选择性强,灵敏度高,准确并且容易操作的测定竹红菌甲素浓度的方法。
结合目前色谱柱技术对硅羟基活性的研究成果,发明人选用不同的已知硅羟基活性的色谱柱进行实验,结果发现,硅羟基活性越高,色谱峰越扁平,拖尾越严重,证实了发明人的推断。因而,发明人选用运用双封端保证很低硅羟基活性的Zorbax Extend C18柱,获得良好的峰形,竹红菌甲素色谱峰的理论塔板数达到4000以上。
经过大量比较实验,最后选用能去掉大量杂质影响的荧光检测法。荧光检测器除了选择性好的优点外,又具有灵敏度高的特点,因而本发明的检测最小量达到纳克级,对竹红菌甲素产业化后的质量控制具有实际意义。
所以,本发明目的可以通过以下技术方案实现:一种高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法,包括以下步骤:
a.色谱柱选用:Zorbax Extend-C18 column(4.6mm ID×150mm,5μm);
b.以甲醇和水作为色谱流动相;
c.所用条件为:柱温30℃,流速:1ml/min;
荧光检测器激发波长:410nm;发射检测波长:610nm。
在选择适合的流动相方面,发明人也做了大量的实验摸索。为了研究流动相pH值对保留时间的影响,在甲醇与水的流动相体系中将水的pH值用乙酸和三乙胺分别调到:pH=3.5、4.2、5.0、7.5、8.2。与未加酸碱调节的流动相比较发现,随着pH值逐渐降低,保留时间略有增加,但伴随着峰形展宽;而碱性pH值使保留时间略有减小但样品组分间分离度降低。总地来说,pH值改变对样品分离的影响不大。从分子结构角度来看,竹红菌甲素分子中含有羟基、羰基等基团,但羟基中的H已和旁边羰基的O原子形成氢键,而这样的稳定结构使流动相的酸碱度对其影响不大。因而发明人选用甲醇与水作为流动相系统。而在甲醇与水作为流动相的系统中,随着甲醇比例的增大,竹红菌甲素保留时间迅速减小。考虑到分析时间、分离度及峰形等综合因素,最后选择:甲醇/水=83/17(体积比),柱温30℃。
本发明技术进步在于:测定准确,方法简单,灵敏度高,方法专一。
1.线性试验及检测限试验表明,在一定浓度下,竹红菌甲素的回归方程的相关系数γ=0.9999,线性范围内线性关系很好,易于定量准确。检出限(S/N=3)为1.2ng,最小可测的量达到纳克级,灵敏度高。
2.精密度试验测出相对标准偏差为0.3%左右,表明方法的重复性很好。
3.整个实验过程约半小时,也就是说,在半小时内,运用本方法即能成功将竹红菌甲素与其他杂质分开,并准确测量出其含量。
附图说明
图1、图2分别为竹红菌甲素标准品、竹红菌提取液样品的液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
取采自云南浦江县的竹红菌样品,干燥粉碎,准确称取约1g,加入甲醇250ml,称重,于避光条件下70℃水浴中回流50min。冷却后加甲醇补足减失质量,摇匀后过滤。续滤液过0.45μm微孔滤膜后进样,对其中的竹红菌甲素含量进行分析,得到其中的竹红菌甲素含量分别为28.0mg/g。
实施例2
取采自云南宁蒗县的竹红菌样品,干燥粉碎,准确称取约1g,加入甲醇250ml,称重,于避光条件下70℃水浴中回流50min。冷却后加甲醇补足减失质量,摇匀后过滤。续滤液过0.45μm微孔滤膜后进样,对其中的竹红菌甲素含量进行分析,得到其中的竹红菌甲素含量分别为27.2mg/g。
工作原理和工作过程
流动相甲醇和水载着竹红菌甲素等被测物质进入色谱柱,ZorbaxExtend-C18色谱柱将竹红菌甲素与其他杂质分开,使它们依次到达荧光检测器被检测识别,检测器给出不同成分的响应值,分别对应其进样量的多少。
Claims (2)
1、一种高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法,包括以下步骤:
a.色谱柱选用:Zorbax Extend-C18 column;
b.以甲醇和水的体积比为83∶17作为色谱流动相;
c.所用条件为:柱温30℃,流速:1ml/min;
荧光检测器激发波长:410nm;
发射检测波长:610nm;
进样体积为10μl。
2、按照权利要求1所述的高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法,其特征在于:
作为色谱流动相的甲醇/水的体积比为83/17。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2004100659867A CN100387987C (zh) | 2004-12-29 | 2004-12-29 | 高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2004100659867A CN100387987C (zh) | 2004-12-29 | 2004-12-29 | 高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1648656A true CN1648656A (zh) | 2005-08-03 |
CN100387987C CN100387987C (zh) | 2008-05-14 |
Family
ID=34868922
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2004100659867A Expired - Fee Related CN100387987C (zh) | 2004-12-29 | 2004-12-29 | 高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN100387987C (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101710070B (zh) * | 2009-12-07 | 2011-09-21 | 昆明振华制药厂有限公司 | 测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱方法 |
CN115372510A (zh) * | 2022-08-16 | 2022-11-22 | 云南植物药业有限公司 | 一种竹红菌指纹图谱及其建立方法与应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1452956A (zh) * | 2002-04-22 | 2003-11-05 | 中国人民解放军总医院 | 竹红菌素类光敏剂在制药中的应用 |
-
2004
- 2004-12-29 CN CNB2004100659867A patent/CN100387987C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101710070B (zh) * | 2009-12-07 | 2011-09-21 | 昆明振华制药厂有限公司 | 测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱方法 |
CN115372510A (zh) * | 2022-08-16 | 2022-11-22 | 云南植物药业有限公司 | 一种竹红菌指纹图谱及其建立方法与应用 |
CN115372510B (zh) * | 2022-08-16 | 2024-03-15 | 云南植物药业有限公司 | 一种竹红菌指纹图谱及其建立方法与应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN100387987C (zh) | 2008-05-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105424850B (zh) | 一种石斛药材的检测方法 | |
Escandar et al. | Spectrofluorimetric method for the determination of piroxicam and pyridoxine | |
CN105372337A (zh) | 一种检测维生素d滴剂中维生素d含量的方法 | |
CN115097023A (zh) | 佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法 | |
CN105510488B (zh) | 一种止痛贴剂的指纹图谱及其质量检测方法 | |
CN100351628C (zh) | 一种利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法 | |
CN103063769A (zh) | 一种甲钴胺胶囊的质量检测方法 | |
CN113866337A (zh) | 一种分离与测定磷酸奥司他韦同分异构体的质量分析方法 | |
CN1973855B (zh) | 一种益母草注射剂 | |
Rele Rajan et al. | Simple Spectrophotometric methods for determination of Ambroxol Hydrochloride from pharmaceutical formulation | |
CN100387987C (zh) | 高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法 | |
CN104655748B (zh) | 一种灯盏花颗粒指纹图谱及其建立方法与应用 | |
CN109709222B (zh) | 一种感冒灵和复方感冒灵的成分检测方法 | |
Mane et al. | RP-HPLC method for determination of darunavir in bulk and pharmaceutical preparations | |
CN113702514A (zh) | 一种阿托伐他汀钙有关杂质ⅰ的测定方法 | |
CN108828121B (zh) | 一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法 | |
CN103512975A (zh) | Hplc法分析蛹虫草子实体和残基中有效物含量的方法 | |
CN113866309B (zh) | 蟾酥中11种蟾毒配基类成分的hplc指纹图谱建立方法及应用 | |
CN114894940A (zh) | 一种高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利中杂质的方法 | |
Lotfy et al. | Spectrophotometric and chromatographic methods for the determination of a binary mixture of sodium cromoglicate and xylometazoline hydrochloride | |
CN110274980B (zh) | 一种林下山参与园参新的区分鉴别方法 | |
Radenović et al. | Lamp-based native fluorescence detection of proteins in capillary electrophoresis | |
Porrà et al. | Development of an HPLC method for the identification and dosage of non-allowed substances in cosmetic products. Part I: local anaesthetics and antihistaminics | |
CN103869026B (zh) | 桑叶复方制剂的预处理方法及1-脱氧野尻霉素的检测方法 | |
CN103364517A (zh) | 一种苯噻菌胺·烯酰吗啉复配制剂中有效成分含量的分析方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |