CN1635136A - 植物分离蛋白的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物分离蛋白的制造方法，采用了与经典的植物分离蛋白生产原理完全不同的新方法。本发明是通过首先激活原料中的蛋白酶(种籽发芽的动力之一)，溶出原料中的蛋白质，分离除渣后，继续酶解反应，利用水解过程产生的酸性使蛋白质在等电点沉出。本发明属于生物化学方法，不使用大量的酸碱，也不产生盐污染，生产流程简单，且产品溶解性等功能大大改善，也为从乳清中提取异黄酮、低聚糖等副产品提供了方便。本发明尤其提供了大豆分离蛋白和花生分离蛋白的连续生产工艺。

Description

植物分离蛋白的制造方法

技术领域

本发明涉及植物蛋白的深加工领域，尤其涉及利用植物自身所含蛋白酶作为蛋白溶出剂与沉淀剂，采用生物化学法提取制造大豆和花生等植物分离蛋白的方法。

背景技术

植物蛋白，尤其是大豆分离蛋白的提取研究在美国始于上世纪四十年代，到八十年代已很完善，形成了以若干家大公司的工艺为代表的生产技术，并且被认为是一套完整成熟的经典技术，已经写进了工科大学的专业教科书，以至于从八十年代开始大多数科学家纷纷转入对大豆蛋白及低聚糖、异黄酮等生理功能的研究并取得了大批科研成果，让人们对大豆营养及生理功能产生新的认识，研究重心也离开了大豆加工领域。

大豆分离蛋白，是以低温脱脂豆粕为原料，经去除可溶性非蛋白成分和不溶性高分子成分而分离提纯，含蛋白质不低于90％的大豆蛋白粉。在本发明以前，提取大豆分离蛋白的代表性工艺路线都是碱提酸沉法，即利用大豆蛋白在碱性条件下溶出率提高和在其等电点(酸性条件下)沉淀出的方法，生产大豆分离蛋白，其理论基础是化学方法。传统工艺一般为将原料(例如低温豆粕)加水磨成浆，加NaOH液调pH值9.0-11.0(加碱液用于提高蛋白质的溶解性)，于15-80℃搅拌数十分钟，使蛋白成分溶出，然后加酸(通常加盐酸)沉淀蛋白。该传统工艺的碱提取法中需要耗用大量的NaOH，酸沉时又耗用大量的酸并造成副产品中产生大量食盐，为从乳清液中提取异黄酮、低聚糖增加生产上的困难，增加脱盐设备投入，大大提高成本且造成环境污染。

随着人们对大豆分离蛋白及低聚糖、异黄酮等深加工产品的生理功能研究的深入，这些产品的应用领域也被不断开发，尤其是作为药品或保健品的功用已经越来越被人们接受，大豆分离蛋白作为功能性食品的重要原料，需求量也骤增，开发高效率、低成本生产分离蛋白、异黄酮和低聚糖的方法在提高经济效益和社会效益方面也就具有非常实际的意义。

发明内容

本发明人经多年探索发现了油料作物种籽，尤其是大豆、花生等作物中供生理发育的蛋白酶在工业生产中的可利用性，找到了在生产条件下，数小时之内激活其活性的方法，并提出了发明专利申请(申请号为02157397.2)。在此基础上又经一年的探索和努力，发现利用这些蛋白酶的活化可自动完成溶出与沉淀两个重要工序的方法，即，不外加碱和酸，在植物自身蛋白酶的作用下，实现蛋白的提取和分离，完全可以取代传统的工艺实现大豆、花生分离蛋白产品的生产。

所以，本发明提供了一种生产植物分离蛋白的新方法，在原理上完全不同于传统化学方法，不再需要使用大量的酸和碱，生产工艺及设备都得到简化。

本发明尤其提供了大豆分离蛋白、花生分离蛋白的生产方法，得到的分离蛋白在性质上达到甚至超过了传统方法生产的分离蛋白。

根据本发明的方法，首先激活原料自身所含蛋白水解酶，使原料在该蛋白水解酶的作用下发生水解反应得到蛋白乳液，当该乳液的pH值达到6.5-6.0时，分离除渣，使蛋白乳液继续水解，当pH值达到蛋白等电点附近，分离收取沉淀蛋白和乳清液，调整沉淀蛋白成为中性蛋白液，然后干燥成为分离蛋白粉。

按照本发明的方法，经分离的蛋白乳液在酶的作用下继续水解反应，此时不加碱控制pH值，当蛋白乳液pH值降至蛋白等电点附近，蛋白质在自身水解产生的酸性环境中沉淀，经离心分离可得到分离蛋白。经调中性、灭菌、喷雾干燥等过程，可得到分离蛋白粉。经适当条件控制，其溶解性将比传统碱提酸沉的化学方法大大提高，可达到乳蛋白水平。

上述方法可以适用于各种植物蛋白的提取，例如：大豆、花生、菜籽、向日葵籽等油料作物榨油或浸出后剩余的饼粕都可作为利用此方法生产分离蛋白粉的原料。根据原料的蛋白组成和含量，比较适于工业化生产的是大豆蛋白和花生蛋白。可以理解，实际生产中，根据原料和蛋白种类的不同，蛋白乳液继续水解过程中的等电点是不同的，对于所述大豆蛋白或花生蛋白的提取中，一般可控制pH5.0-3.0，最好控制在5.0-4.0时分离，而开始分离时的pH值范围的选定也取决于欲获得的蛋白成分的性质和纯度。

分离沉淀蛋白后的乳清液中仍然含有较多的蛋白质，可加热再次使其中的部分蛋白凝固沉淀，收取二次沉淀蛋白，调整成为中性蛋白液(一般情况下用碱液)，干燥成为蛋白粉，或者将该二次沉淀蛋白与前次的沉淀蛋白合并处理。

关于激活大豆等原料自身所含蛋白水解酶的方法，发明人的在先申请02157397.2中已经有详细描述，可以采用外源蛋白酶激活法、自身激活法或交叉激活法。发明人将该申请案的说明书和权利要求书全文引入本发明作为参考。所以，基于本发明的方法，激活大豆等原料自身所含蛋白水解酶的过程包括采用以下方法之一制备激活剂，然后利用该激活剂启动原料的水解反应后作为次批原料的激活剂。

1)利用任何蛋白酶制剂在适宜条件下使原料浆料发生水解；

2)将原料浆液在30-65℃，pH值6.5-8.5条件下搅拌2-6小时，期间的pH值通过加入碱性剂维持，使原料自身所含蛋白酶被激活后作为次批原料的激活剂；

3)前一批原料水解后得到的蛋白乳液，或者其继续水解分离沉淀蛋白后的乳清液直接作为下批原料的激活剂。

其中，制备激活剂的原料可以是大豆、花生、芝麻、杏仁、核桃仁、向日葵籽、油菜籽或棉花籽。如发明人在上述在先申请中所描述的，一旦实现原料中的蛋白酶的活化，每批次水解后的乳清液或其中一部分就可以留做下一生产周期的激活剂，所以，只需在首批原料的水解前制备激活剂。使用这些激活剂作为启动源，采用类似发酵接种的方法“接种”到下一批次的原料中用于激活新的蛋白酶，启动新的生产周期。

从以上描述可以看出，虽然本发明的方法与传统的经典方法类似之处在于仍然包括溶出(蛋白提取)与沉淀两个工序，但其实现的原理是完全不同的。经典方法是化学法，利用碱为促溶剂完成溶出过程，再用酸中和并进一步降低pH值到等电点，两工序都使用化工产品原材料。本发明方法是借鉴了植物生理学的原理，利用植物自己的活性物质加工自己：即把植物种籽发芽生长过程中的蛋白酶应用于工业生产，使原来在发芽过程中数天完成的蛋白酶活化过程缩短为数小时，并利用这些蛋白酶完成植物蛋白质溶出和沉淀两个过程。

所以，本发明的关键在于采用酶法分离提取与酶法沉淀。提取工艺是利用大豆等蛋白酶活化前期的促溶解作用代替化学法中的碱提工艺，而酶法沉淀工艺则是利用蛋白酶的进一步水解使蛋白在自身形成的酸性环境中沉淀，代替化学法中的酸沉工艺。根据本发明具体的实施方法，将豆粕先粉碎成100-120目的细粉或加水直接用胶体磨磨成细浆。前一种方法较少产生泡沫；后一种方法加水研磨时会产生泡沫，不利于操作。本发明对水的硬度无特殊要求，无需使用软化水，只要符合食品工业用水标准即可。此豆糊置于酶活化罐兼提取罐中，pH值可为豆糊自然值，即，不需加碱调节pH值，也可以稍调pH值不超过8，例如6.5-6.8。加入激活剂，·或者首先按照自身激活的方法使蛋白酶活化，为有利于水解过程，一般控制物料在30-65℃，最好在35-50℃温度下搅拌1.5-3.0小时，待pH值开始下降或降低0.2-0.3时(即6.5-6.0)，此时蛋白乳液粘度明显降低，可很容易分离除渣收集蛋白提取液。经测定，利用酶提取的蛋白提取率与传统的碱提取方法基本相同，可达到87-92％，但这种蛋白提取液的外观如普通豆浆样乳白色，所以称蛋白乳液，而碱提取液的外观为半透明棕黄色。除渣后的提取液(蛋白乳液)进入酸沉淀罐，继续搅拌(100-120rpm)，实际上是继续水解过程，温度可以与酶活化提取罐中的温度相同，也可以不同(以确保蛋白酶不失活为限)，一般在0-65℃，此时浆液pH值继续下降，经0.5-2.5小时后pH值可降至5.0-3.0之间，优选控制5.0-4.0之间，例如大豆蛋白可以控制在4.5左右，花生蛋白可以控制在4.5-5.0，确定完成沉淀反应。

在工业生产中，上述过程可以是间歇式，第一批物料的提取需要先活化蛋白酶启动酶解，以后每批新物料中加入前一批已活化物料即可(加入量1/10-1/5)，这样需至少2组罐交替使用，设备体积较大，而且酶活力在每罐物料都经历了初始到完全活化的过程，所需时间较长。所以本发明优选的实施方案中酶解和沉淀过程采用连续方法，当水解提取罐和沉淀反应罐中的物料达到要求的pH范围后，在排出完成反应物料的同时等速加入新料液。

酶活化提取达到要求后，从罐的底或顶部排出豆糊进入离心分离机，并以等速从顶部或底部补充新磨制的豆糊，进入正常顺流生产过程。此后活化提取罐中物料的交替周期可以控制在50-80分钟，一般需要1小时左右(即全罐物料完全排出被交换需要1小时左右)，并维持活化pH值不变，此过程可通过pH值反馈自动控制器控制，也可固定交替周期，通过流量稳定得以控制。

提取液进入酸沉淀罐继续在酶作用下水解，确定完成沉淀反应后，开始以等速度边从罐中排出完成沉淀反应的浆液进入第二次离心分离，边送入新的经酶解提取法得到的蛋白乳液，从而进入正常生产过程，排出的浆液经离心分离得到沉淀蛋白与乳清液。料液在酸沉淀罐中正常生产时交替周期可以在45-120分钟，一般约为1小时，即全罐物料每小时交换一次。

在实际生产中，如采用连续法，可以根据反应速度计算出罐的容积以达到所希望的交换周期(单位时间产量、反应罐容积和反应周期三者之间为函数关系)。

可以看到，提取和沉淀都采用连续法的工艺，与间歇法相比，罐内物料中的酶一直处于高活力状态，缩短了生产周期，减少了设备体积。

以上方法(间歇法或者连续法)中如采用自激活蛋白酶的方法，启动周期较长，溶出与沉淀共约4-4.5小时，如果按照上述利用任何一种蛋白酶制剂加速激活或用上周期生产存留的乳清液作为激活剂，可使启动周期大大缩短。

发明人在研究过程中发现，采用蛋白酶法沉淀的蛋白泥与酸沉淀法得到的蛋白泥主要差异体现在含水率不同：本发明方法的蛋白泥含水率低，在80-60％，而酸法沉淀的蛋白泥含水率通常为80％以上。此蛋白泥的进一步处理与传统方法相似，经洗涤、调中性分散溶解(pH值7.0-7.5)、灭菌、喷雾干燥得到分离蛋白粉，但是溶解性实验显示，本发明方法生产分离蛋白的溶解性比酸沉淀法高，可溶成喷雾干燥前的半透明胶状液。

沉淀反应完成并分离出沉淀蛋白泥后，乳清液中还含有较多的蛋白质，主要是水解过程产生的低分子量蛋白质(约占被提取总蛋白的10-15％)。加热乳清液可使这部分蛋白析出，经离心分离可得到二次蛋白泥，再把它中和至pH值为7.0-7.5溶解成蛋白溶液，可单独喷雾干燥得到溶解性很好的蛋白粉，亦可混入一次分离蛋白共同干燥得到同一产品。所述乳清液也可作为其他蛋白产物的深加工原料。

以上描述中以最普遍生产的大豆分离蛋白为示例，基于蛋白含量的考虑，油料作物中另一种可优先考虑的原料就是花生，同样可以得到花生分离蛋白。所以，利用本发明方法生产分离蛋白的原料优选可以是大豆、转基因大豆或花生等的低温粕、高温粕或其混合物料。采用高温粕做原料时，由于其自身的酶活力较低，优选使用已经被活化的乳清液作为激活剂的方法，为提高蛋白产品得率及缩短反应时间，优选在原料中包括一定比例的低温粕；或者，在提取与沉淀罐的首批启动原料使用低温粕，进入连续反应后可使用高温粕或高温、低温粕混合使用。此时高温粕在混合物料中的比例可以是0-90％。

从以上叙述可以看出，本发明改变了传统的工艺方法，采用生物化学方法利用大豆等自身的蛋白酶溶解提取蛋白，虽然生产步骤还是在于蛋白质提取与沉淀分离，但是与传统的方法有本质不同。

传统的方法是碱性提取，一般是将原料(豆粕)与水研磨，并加NaOH液调到pH值为9-11，在提取罐中加热保温(一般15-80℃)搅拌20-120分钟，提取率可达85-90％。本发明方法在基本中性和适当温度下利用被激活后的植物自身蛋白酶作为促溶剂，提取率可达到碱法同样效率。传统碱提法中虽也保温搅拌，但酶不被活化(根据传统理论，不仅不建议使自身的酶活化，通常的做法是先加热灭酶，以脱除所谓的腥、苦味)。当前世界通行的蛋白沉淀法采用HCl、H₂SO₄调整碱提取乳液的pH值至等电点4.5，使蛋白沉淀并经离心分离得到膏状蛋白；本发明方法则利用经酶法分离的蛋白浆液任其继续酶解反应，直至pH值自己降至等电点附近时再离心沉淀得到膏状蛋白，该过程中的酸性来自蛋白质水解产生的氨基酸端电离释放的H⁺，乳清液中未引入外来阴离子，因此也不必用大量碱二次中和乳清液。在经典的碱提酸沉工艺中，每生产一吨的大豆分离蛋白约耗60Kg烧碱和110Kg浓盐酸，并在乳清中残留大量食盐和盐酸，排放会造成污染，如果分离则成本很高。

因此，本发明方法避免了在生产中大量使用酸、碱，减少了相应工序与设备，降低了材料与设备成本，减少了乳清液中的盐和酸，避免了二次污染，并为进一步提取低聚糖与异黄酮降低了难度。

本发明的方法与传统酸碱法相比，如采用自身酶激活方法，提取罐和酶沉罐的启动反应都需一定时间，所以生产开始时约耗时3-4小时才能进入连续生产。但如果在首罐提取物料中使用蛋白酶制剂或上批生产存留的乳清液，可使提取、沉淀的启动反应各缩短至1小时，甚至更短。

本发明的意义在于把植物生理功能性成份用于工业生产，由于其中的大量机理问题及反应过程尚需深入研究，因此本发明也开拓了植物蛋白科学及工艺研究和生物酶直接工业利用研究的新领域。本发明方法与经典的碱提酸沉法相比，有如下优点：

1、酸碱法生产大豆分离蛋白要使用大量酸碱，增加了生产成本与设备，乳清液处理也繁杂。本发明方法不使用酸碱而减少了辅料成本及相应设备，消除了乳清液中的盐，减少排放污染，因为乳清中没有了外来盐，进而加工提取低聚糖、异黄酮时免除了脱盐工序，大大降低设备及加工成本。

2、本发明方法在简化了整个工艺过程及设备的同时，蛋白提取率和沉淀蛋白的产率均达到传统的碱提酸沉法水平，通过工艺条件的控制还可以得到更优于传统工艺的结果。

3、按照本发明方法生产的大豆分离蛋白还具有良好的溶解性，可达到或接近乳蛋白溶解性，溶水后可达到喷雾干燥前的溶胶状态。

4、通过工艺条件的控制，可同时生产部分低分子量植物蛋白和植物多肽。

5、本发明方法的实施除使用大豆榨油后的低温粕外，目前被认为不能作为植物蛋白生产原料的高温粕中的蛋白酶也能被激活而利用，所以，扩大了蛋白的原料来源。

6、本发明对生产设备没有特殊要求，现使用传统工艺的生产企业对于现有分离蛋白生产线进行简化改造，即可满足本发明的工艺要求。

7、本发明方法生产的大豆分离蛋白的豆腥味大大低于传统方法的产品。

植物种籽中的酶系统是非常复杂的，而每一种酶的存在都是有生命意义的。对应于植物种籽中所存在的任一种成分(蛋白质、脂肪、淀粉、纤维素等等)，必然存在分解或合成它们的酶，否则种籽成熟及发芽生长过程就无法进行。本发明及发明人的在先申请所记载内容的公开将会提示人们：植物中的酶是可能被工业化直接利用的，至少其中的蛋白酶是可以直接利用的，其利用结果对植物蛋白质的加工会产生深刻影响。在食品工业生产中，绝大多数加工工艺都以生物酶为有害对象，因其会产生不良风味、色泽不稳定、出现沉淀等不利现象，所以食品加工都有灭酶工艺。本发明的思路是以生物酶为利用对象，先利用后灭之。可以说，本发明(包括所述在先申请)提出了一种与传统理论反其道而行的思路，在技术上的效果前面已经总结，在获得这些结果的同时，发明人也发自内心地感慨，这些结果是发明人受到植物生理学、医学的启示而激发出的想象力，经多年的努力并走过无数弯路而形成的。它再次证明了在学科交叉过程中如果适当地改变思维方向，就有可能会找到“柳暗花明又一村”，同时在再次阅读许多前人文献时，发现有研究者也曾走到这一发现的大门前而未能想到推开它。可见这样仅一步之遥的改变是建立在发明人突发灵感和不懈地探索与创造性劳动的付出之中，努力之后，成功就在偶然的“蓦然回首”之时。

附图说明

图1是本发明优选实施方案的工艺流程图。

根据该图1所示的工艺，当原料为低温豆粕时，得到的产品为大豆分离蛋白粉，副产物中含有18-35％的蛋白质，可作为饲料。

具体实施方式

以下结合具体方案进一步描述本发明，其中的实施例仅是本发明的优选方案，旨在帮助阅读者更好地理解和领会本发明的实质和创新性所在，不能对本发明的可实施范围构成任何限定，熟知本领域技术的人士在本说明书的教导和启发下所作出的对本发明实施方案的任何修饰和改动，均应落入本发明权利要求书的保护范围。

试验例1、酶法提取与碱法提取比较

取蛋白质含量为48.2％的低温豆粕粉(120目)6份，每份200克，各加入2200毫升普通自来水调成豆糊。其中三份分别为：自然pH值(6.4左右)、分别用NaOH溶液调到pH值9.0和11.0，编号为1#、2#、3#，于室温下(25℃)搅拌20分钟，各取400毫升用小型离心分离机相同转速分离出豆渣，测定浆液中蛋白质含量(凯氏定氮法)，剩余物料搅拌至120分钟时离心分离并测定蛋白浓度。另外三份豆糊也分别为自然pH值(4#)、和用NaOH溶液调pH值6.8(5#)、pH值8.0(6#)，快速升温至45℃后，于45℃水浴中保温搅拌(100rpm)并分别于0.5小时、1.0小时、1.5小时、2.0小时取出400毫升物料离心分离，同样方法分别测定浆液中蛋白质含量。结果如表一。

                                                表一

编号条件		1#	2#	3#	4#	5#	6#
								时间	20分钟	3.39％	3.82％	3.99％
30分钟				3.77％	3.82％	3.82％
							60分钟					3.85％	3.86％	3.84％
90分钟				3.90％	3.95％	3.87％
							120分钟		3.65％	3.90％	3.99％	3.90％	3.95％	3.87％
PH值	起始				6.40	6.80									8.00
							终点				6.20	6.60	7.57

从表一可见：常温下加碱直接提取，随pH值提高蛋白质溶出率也提高，且pH值11.0时蛋白质浓度最高，但此条件下耗NaOH量约为豆粕的2.8％，相应调酸时会耗用更多的酸，造成成本提高和辅助设备增加，而且乳清中含大量盐，后期将会增加污染和脱盐设备及操作费用。而4#、5#、6#试样经保温搅拌于1.5小时即达到各自最高值，分别为3.90％、3.95％和3.87％，与pH值11.0的强碱条件下提取率相似，但分离出的浆液接近中性，利于继续反应和后处理，并且，5#和6#料液pH值在反应中会缓慢下降，120分钟后pH值可分别下降0.2-0.6，可直接进入分离工序。

优选的提取条件选择可据此确定为搅拌30-55℃保温1.0-1.5小时。与碱提取法相比，除蛋白浓度相同外，物料粘度明显降低，与pH值11.0时相似，不仅满足蛋白提取率要求，而且利于浆渣分离，分离出的豆渣干爽松散，含水率可由常法的82-85％降至72-78％。浆液收率提高，又进一步提高了蛋白得率。如果在物料中加入已活化的前一批浆液，提取时间还可以缩短。(注：本案所说的“pH自然值”是指不加入任何碱或酸，物料的pH值。)

试验例2、酶沉淀法与酸沉淀法比较

本发明方法中，酶活化后不使用碱中和，而继续反应任其pH值下降，直至pH值降至4.5，这一过程仍需1.5-2小时，而连续法则维持物料交换周期为1小时，这一蛋白沉出过程与传统工艺的区别在于无需加酸，利用酶解过程形成的酸性环境使蛋白沉淀。沉淀蛋白得率与酸沉法比较，用如下试验证实。

利用试验例1中1#、2#、3#方法(20分钟常温提取)制备的豆乳分别用盐酸调pH值至4.5，离心分出沉淀蛋白，乳清液加热至约65℃产生少量絮状凝聚物，经再次离心分离，分别测定第二次乳清液中残留可溶性蛋白。合并两次沉淀蛋白，分别用pH值为4.5的酸性水洗涤2次，再分别测定沉淀蛋白(凯氏法)。

4#、5#、6#试样也是试验例同样方法提取的活化豆乳(蛋白乳液)于50℃继续反应至pH值分别降至4.5时离心分离，加热、分离，测定二次乳清液中蛋白质浓度，沉淀蛋白合并用pH值4.5的水洗涤2次，凯氏法测定沉淀蛋白收率。

以上六个样品均取1000毫升乳液测试。

                                              表二

	1#	2#	3#	4#	5#	6#
							蛋白质浓度(1)	3.39％	3.82％	3.99％	3.90％	3.95％	3.87％
pH值4.5酸沉后二次乳清中蛋白质浓度(2)	0.59％	0.59％	0.59％
							pH值4.5酶沉淀后二次乳清蛋白质浓度差(2)				0.59％	0.59％	0.59％
(1)-(2)	2.80％	3.23％	3.40％	3.31％	3.36％	3.28％
							实际沉淀蛋白量(干重克)	27.1	31.2	32.6	32.0	32.4	31.6

从表2可见，无论是中性、碱性提取法的浆液，再经酸沉法或酶提取、酶沉法，二次乳清液中不可沉淀蛋白量是恒定的，酶沉法与酸沉法效果相同，说明这部分可溶性蛋白不受提取、沉淀方法影响，数量恒定。经计算浓度差可知pH值11.0碱提取法(3#)及pH值6.8(5#)酶提取酶沉淀法二者效果近似相等。

以上经酶提取与酶沉淀方法提取蛋白质，分离蛋白得率与碱提酸沉法相似。其效果可证明酶解方法可完全代替当前世界通行的碱提酸沉法。另外，酸沉与酶沉法所得到的蛋白性质有明显差异，酶沉法得到的沉淀蛋白膏含水率低于酸沉法，可降至60-65％。即同样离心分离条件下，酶沉蛋白脱水率高。

试验例3、连续法提取

用含蛋白48.2％的低温豆粕1.5Kg加11.5倍自来水用胶体磨制成豆糊，以少量NaOH液调pH值至6.6，作为原始物料，保存于室温(18-25℃)。

取1200毫升此豆糊液于烧杯中置入45℃水浴，采用电动搅拌(100rpm)。预先装置一个虹吸管引出浆液并调节流出速度20毫升/分钟，同时用高位下口瓶调至同样速度向烧杯中加入浆液，调节好此装置后，先使首批1200毫升物料反应1.5小时后，再以每分钟进出物料液20毫升速度交换(即每小时交换一批)，反应后的豆糊液，每收集1200毫升为一批，离心分离去渣得到豆乳，分别测定第一、四、七、十批乳液中蛋白质浓度及固形物浓度。结果见表三。

                               表三

采样批次	一	四	七	十
					蛋白质浓度	3.73％	3.87％	3.90％	3.88％
固形物浓度	6.37％	6.51％	6.48％	6.50％

结果说明：连续法提取效果是稳定的，能始终保持很好的提取率。此连续提取法工业上可行。提取罐体积比间歇法更小，而且提取反应时间可缩短为1.0小时。

试验例4、连续沉淀法效果

将试验例3收集并分离去渣得到的全部蛋白乳液及时冷却，合并保存于室温，作为试验例4的原料，并且用凯氏法测定其中蛋白浓度为3.87％，用与实验例3同样装置作沉淀实验，第一批1200毫升乳液于50℃搅拌反应，至pH值降到4.5时开始以每分钟20毫升速度交换新乳液，此时反应器中的浆液pH值维持在4.5左右，每收集1200毫升为一批，离心分离出沉淀蛋白与乳清液(称为一次乳清液)，再将一次乳清液加热至65℃左右，产生白色絮状蛋白，再经离心，得到二次沉淀蛋白和二次乳清。分别用凯氏定氮法测定第二、四、六、八批共四批次样品的一次乳清液和二次乳清液中蛋白浓度。沉淀蛋白则用pH值4.5的酸性水洗涤2次，同法测蛋白得率。结果见表四。

                                        表四

采样批次	二	四	六	八
					豆乳原料	3.87％	3.87％	3.87％	3.87％
一次乳清蛋白浓度	0.68％	0.85％	0.85％	0.85％
					二次乳清蛋白浓度	0.59％	0.59％	0.59％	0.59％
一次沉淀蛋白重(克)	37.6	35.2	35.4	34.9
					二次沉淀蛋白重(克)	1.00	3.01	3.00	3.10
二次乳清中残留可溶蛋白0.59％×1200ml(克)	7.08	7.08	7.08	7.08

从表四测定结果可见：进入连续反应后，除首批物料外，四、六、八批物料分离出的蛋白，包括一次沉出蛋白、二次沉出蛋白得率都是稳定的，说明沉淀反应是平稳可行的。沉出蛋白量的数值稍有偏差是测定误差所至，而从一次、二次乳清液中残留可溶性蛋白浓度更能说明问题：水解沉淀反应是稳定的，生产上也是可操作的方法。

另外连续法与间歇法相比，出现了一定量的在pH值4.5时未加热可溶而加热则可析出的蛋白。这部分蛋白是酶解反应产出的低分子量的新成分。

连续法生产的这部分pH值4.5的可溶蛋白可以经加热再离心分离，然后调至中性、单独干燥或与沉淀蛋白共同调中性再干燥。

试验例5、分离蛋白溶解度实验

连续法沉淀得到的沉淀蛋白水洗再离心分离后用碱性水溶解并调pH值至7.0-7.5，再经均质并加热灭酶，得到微棕黄色半透明溶液，经3000rpm，10min离心不产生沉淀，再经喷雾干燥形成分离蛋白粉。(离心式喷雾干燥塔：进风温度200℃、出口风温度80-85℃)得到的蛋白粉用80℃纯水或普通自来水均可立即溶解成喷雾干燥前的溶胶状，经3000rpm离心10分钟，不产生沉淀，外观效果与未喷雾干燥前相同，此蛋白粉可作为即溶蛋白饮料配料使用。而用酸沉法按同样条件喷雾干燥的蛋白粉用80℃纯水冲调只能得到悬浊液，放置则产生大量沉淀。

利用国内行业标准测溶氮指数的方法比较，本发明利用酶沉淀法得到的分离蛋白粉氮可溶指数(NSI)为94％，达到国内行业标准≥90％的要求(引用标准为Q/22W004.1-1997)。

以上实验例证明，本发明的利用大豆中存在的天然蛋白酶活化后作为大豆蛋白质的促溶剂和经自发酶反应使pH值下降至4.5作为沉淀剂提取制备大豆分离蛋白的方法完全可以代替当前世界上通行的碱提酸沉法。本方法的特点在于：1、它使用酶代替化学法中的酸碱；2、它使用的不是酶制剂，而是利用植物种籽中自身存在的生物酶，使之成为真正的生物技术；3、根据本发明人在先申请02157397.2中的原理，变性程度大的粕甚至高温粕也可以作为分离蛋白原料使用；4、与当前通用酸碱法相比，减少了化学原料的使用，减少了污染，减少了酸、碱使用的相应设备与原料成本。乳清再加工时可省去脱盐工序及设备，大大降低了副产品生产设备与成本；5、与酸碱法比较，本方法生产设备大大简化，设备及厂房投资可以大大降低；6、传统方法生产的大豆分离蛋白在水中溶解性很差，难以形成真正的溶胶液，而本方法大豆分离蛋白NSI值可达到国内外的行业标准；7、本方法因酶解过程中的脱腥作用，所以生产的分离蛋白没有豆腥味。

实施例1

大豆低温豆粕粉碎成120目细粉，取1000克细豆粕粉与12升约50℃温水混合均匀，保温50℃并用电动搅拌器搅拌2小时，料液pH值由6.48降到6.28。将料液用小型转鼓式离心机离心分离，得到豆乳11.5升(测得其中蛋白质浓度为3.67％)，湿豆渣1.2 5千克(含水率为82.0％，烘干后豆渣中蛋白含量为26.7％)。

被离心分离出的豆乳液于双层保温桶中(夹层中通入约45℃水保温)，乳液用电动搅拌器搅拌，并不断监测乳液pH值变化，经1小时45分钟pH值降至4.5，即停止搅拌，乳液用离心机分离出乳清液10.0升和蛋白膏1.42千克(固形物含率为29.7％，蛋白质为25.6％)。

先用pH值4.5的酸性水洗涤蛋白膏一次，再将蛋白膏用搅拌机边打碎边加入4％NaOH溶液边加水，调至pH值7.0成为半透明液状，并用均质机均质，因均质时可把未分散溶解的蛋白微粒充分分散，pH值会下降，再次用碱液重新调至pH值7.0，此时乳液中的蛋白质浓度为19.2％，于95℃水浴中保温20分钟灭菌灭酶，再喷雾干燥(小型喷雾干燥机：进风210℃、出口风80-85℃)，得到分离大豆蛋白粉约300克(因喷雾干燥机损失无法计算得率)。

此蛋白粉蛋白质含量88.3％，水分含量5.4％，灰份3.3％，氮可溶性指数91.5％，用60℃热水溶解可完全溶解成溶胶态，显微镜观测看不到未溶解微粒，只有少量颗粒碎片。

改变例

以上为自动激活法，如采用其他两种激活法，该实施例则改变：按照所述在先申请02157397.2中实施例1或实施例2的方法先制备“激活剂”，然后加入上述豆糊中，搅拌进行提取反应，观察pH值改变到符合要求(该提取时间将会从2小时缩短到约1小时以内)，以后的操作同上。沉淀反应也可缩短到1小时以内。

实施例2

3千克低温豆粕加33升室温自来水用胶体磨磨成豆糊并加入消泡剂，再用4％NaOH溶液调pH值于6.8，于室温(18-25℃)保存备用。

用实容积8升的可连续进出料液的不锈钢桶于55℃水浴中保温并开动电动搅拌器搅拌(120rpm)，当豆糊pH值下降至6.4时，启动进出料装置，并通过调节进出料速度维持桶中料液pH值稳定于6.4。此条件下每65分钟，桶内物料可交换一次，排出的物料经离心分离去除豆渣得到的豆乳液于另一套6升的连续反应装置中于45℃水浴保温并搅拌(120rpm)，当豆乳pH值由6.4降至4.5时开启进出料装置，进出豆乳速度以维持pH值稳定于4.5为度，排出的pH值为4.5的豆乳进行离心分离。此沉淀反应装置中物料交换一次约50分钟。

进入正常交换阶段后提取罐排料速度与沉淀罐进料速度基本一致。在生产状态下，中间应设置缓冲贮罐，以调节两步反应的平衡。

pH值达到4.5的豆乳经离心分离得到蛋白膏泥和乳清液，乳清液经加热(60-65℃)产生白色絮状蛋白沉淀，用滤布得到二次蛋白膏，与一次沉淀蛋白合并，经用pH值4.5的水洗涤一次，再用搅拌机边打碎边加入4％NaOH溶液及水，调到pH值8.0左右，待蛋白膏恢复至液体，经均质机均质后pH值下降，这是因为搅拌打碎时沉淀蛋白颗粒未完全分散，得不到中和，经均质机打碎后物料pH值又下降，再次调pH值到7.0后，加热至95℃，搅拌并保持20分钟灭菌灭酶，喷雾干燥(离心式喷雾干燥塔：进风温度230℃、排风温度80-85℃)，得到分离蛋白粉约1千克(喷雾干燥损失较大，不能计算准确得率)。此分离蛋白蛋白质含量87.4％、水分5.7％、灰份3.6％、溶氮指数90.5％，用70℃热水溶解时可立即溶解成溶胶状态。

该实施例改变一：同实施例1的改变例。

该实施例改变二：从第二批物料开始，改为使用混合豆粕，即：高温粕与低温粕的重量比在80∶20-50∶50，得到的蛋白在性质上没有明显区别，只是蛋白提取率稍有降低。

实施例3、花生分离蛋白的制法

按本发明人先期申请的油料作物种籽中蛋白酶激活方法(申请号02157397.2)中三种激活方法，或可先用花生、花生低温粕、大豆、大豆粕等任一种方法和任一种原料制备激活剂。

采用实施例1或实施例2的方法同样生产花生分离蛋白粉。

激活剂制备：取300克浸泡8-12小时的花生与1.5升水磨成浆后于55℃水浴中保温并电动搅拌(100rpm)，经3-3.5小时后pH值开始下降，再滴加4％NaOH溶液维持pH值稳定继续反应1小时，作为激活剂备用。

3千克花生粕细粉(含蛋白质45.7％)与24升自来水调成糊状，调pH值6.8保存于室温(18-25℃)备用。

用实施例2的同样装置与方法：在提取槽中加入激活剂并加入花生粕粉水分散液，于50℃保温并搅拌。当物料pH值降至6.2时开始不断排出已反应料和不断加入新料，收集到的物料离心除渣，花生乳液进入沉淀槽于45℃保温并电动搅拌(100rpm)，当物料pH值降到4.7时，从沉淀槽中不断排出反应液并补充去渣后的花生乳液，完成连续反应过程。全过程与实施例2相同(加水量为8倍，等电点pH值4.7)。

离心分离的花生蛋白经洗涤、中和、均质、再调pH值、灭菌、喷雾干燥得到花生蛋白粉0.9千克(喷雾干燥损失无法计算收率)。蛋白质含量92％，溶解性优于大豆分离蛋白粉。

Claims (10)

1、植物分离蛋白的制造方法，其特征在于，首先激活原料自身所含蛋白水解酶，使原料在该蛋白水解酶的作用下发生水解反应得到蛋白乳液，当该乳液的pH值达到6.5-6.0时，分离除去料渣，使蛋白乳液继续水解至蛋白等电点附近，分离收取沉淀蛋白和乳清液，沉淀蛋白经调中性，干燥成为分离蛋白粉。

2、权利要求1所述的制造方法，其中，所用原料可以是大豆、转基因大豆、低温豆粕、高温豆粕、花生粕或其混合物料。

3、权利要求1或2所述的制造方法，其中，蛋白乳液继续水解至pH值5.0-3.0。

4、权利要求1所述的制造方法，其中，激活原料自身所含蛋白水解酶的过程包括采用以下方法之一制备激活剂，然后利用该激活剂启动原料的水解反应：

1)利用任何蛋白酶制剂在适宜条件下使原料浆料发生水解后作为激活剂；

2)将原料浆液在30-65℃，pH值6.5-8.5条件下搅拌2-6小时，期间的pH值通过加入碱性剂维持，使原料自身蛋白酶被激活后作为激活剂；

3)前一批原料水解后得到的蛋白乳液，或者其继续水解分离沉淀蛋白后的乳清液直接作为下批原料的激活剂。

5、权利要求4所述的制造方法，其中，制备激活剂的原料可以是大豆、花生、芝麻、杏仁、核桃仁、向日葵籽、油菜籽、棉花籽或它们的低温粕。

6、权利要求1所述的制造方法，其中，原料在自身蛋白水解酶作用下的水解提取反应和蛋白乳液继续水解得到沉淀蛋白的沉淀反应的温度控制均以蛋白酶不失活为上限。

7、权利要求6所述的制造方法，其中，水解提取反应的温度30-65℃，沉淀反应的温度与水解反应相同或不同。

8、权利要求1所述的制造方法，其中，酶提取和/或沉淀过程采用连续方法，当水解提取罐和沉淀反应罐中的物料达到要求的pH范围后，在排出的同时等速加入新料液，进出料速度以维持罐内pH值稳定为准。

9、权利要求3所述的制造方法，其中，蛋白乳液继续水解发生沉淀反应时，控制pH值下降到5.0-4.0时完成。

10、权利要求1所述的制造方法，其中，分离沉淀蛋白后的乳清液加热再次使其中的蛋白沉淀，收取该二次沉淀蛋白，调整至中性，经干燥成为蛋白粉，或者，将该二次沉淀蛋白与前次的沉淀蛋白合并处理。