CN1634966A - 以病毒裂解液及沉淀法对临床样品同时进行rna和dna提取的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时提取RNA和DNA的方法，该方法包括：用病毒裂解液裂解待测样品，通过沉淀浓缩上述样品中的核酸(RNA和DNA)，将沉淀烘干存放在－20℃保存或溶解后直接进行核酸扩增。该方法具有收率稳定，样品纯度足够符合下一步核酸扩增的要求，又可对整个制备过程进行质量指标的控制，本发明可广泛地在血站，医院，CDC等临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸提取技术，具体地说，涉及使用病毒裂解液合并沉淀法同时制备临床样本中的DNA和RNA的方法。
背景技术
在最近十多年里，分子生物学发展的速度可以以一日千里而来形容，而基因工程学是其中最重要的一门，现已广泛应用于临床医学、药学、农业、法医学等等方面，有着重要的发展意义。
对于样品核酸的提取，比较经典的是采用有机溶剂离心沉淀的方法。用酚抽提后用乙醇或异丙醇离心沉淀，再洗涤烘干。这样的方法有几个问题：第一，这种抽提的方法仅适用于DNA，对RNA不适合；第二，由于核酸肉眼无法看到，极容易在洗涤等步骤将其不慎弃去。针对这种情况，我们采用了异硫氰酸胍裂解，糖元等合并异丙醇沉淀法，可迅速完全地灭活RNase，同时把核酸完整地释放出来。浓缩沉淀的样品核酸呈现明显的蓝色，避免在以下的步骤中不慎把核酸弃去。
发明内容
本发明涉及对待检测样本同时提取DNA和RNA的方法，本发明的方法使用裂解法和沉淀方法，浓缩得到的样品呈蓝色，可作为判断的指标，可直接进行核酸扩增检测，也可-20℃存放备用。
本发明通过以下过程实现：
(1)裂解样本
待测样品(血清、血浆、血球或其它液化后的生物样品)200μl加入到已盛有400μl(或成倍增加)病毒裂解液的试管中，震荡混匀，65℃保温15分钟；其中病毒裂解液组成：6mol/L异硫氰酸胍(GuSCN)，20mmol/LtrisClpH6.5，1％-3％β-巯基乙醇，10ug/mL-50ug/mL糖元，1％TritonX-100，1％NP40，NF Co-Precipitant 15ug/ml。
(2)沉淀浓缩样本的核酸(RNA和DNA)
在上述反应管内加入600μl(或成倍增加)异丙醇，震荡混匀后收集蓝色沉淀(可使用离心法或抽滤法)；
(3)蓝色沉淀经75％乙醇洗涤后，置该沉淀物于65度下10分钟烘干，得蓝色干燥物；
(4)样品的贮存和使用。
上述蓝色沉淀可溶解后直接进行核酸扩增或存放在-20℃下保存待用，由上述方法制备的浓缩DNA、RNA至少可稳定地储存半年。
当进行RNA测定时，使用10mmol/L TrisCl Ph6.5缓冲液溶解沉淀，在此浅蓝色样品中再加入反转录酶及RNA酶抑制剂进行逆转录反应。
当进行DNA测定时，可将沉淀直接溶解在PCR反应液(或其它扩增法的反应液)中进行扩增反应。
当进行RNA/DNA同时测定时仍使用10mmol/L TrisCl pH6.5缓冲液来溶解，该浅蓝色样品液将分成二部分，一部分进行逆转录反应，而另一部分则直接用于DNAPCR反应。
发明效果
本发明所述方法可以用于临床样品中RNA和DNA的同时提取，它具有浓缩样品，收率稳定并可储存的功能，又是能以蓝色监视制备过程的质量，样品纯度已足够符合下一步核酸扩增的要求。更重要的是整个过程可以发展成自动化操作，达到既能处理大量样品，又能保证操作质量的目的。
附图说明
图1、2、3是本发明实施例中扩增产物经毛细管电泳分离后获得的扫描图。
具体实施方式
实施例一
含HBV、HCV病毒样本的同时制备及检测
1.血清和血浆样本的采集
将全血样品收集到不含任何抗凝剂的采血管中，室温静置30分钟，台式离心机4000rpm离心5分钟，收集上层血清样品，混匀，室温静置30分钟，收集上层血浆样品。
2.样品制备
将200μl血清或血浆样品加入400μl病毒裂解液中，在振动器上震荡混匀，放入65℃水浴中加热15分钟。取出，将样品平衡到室温，加入600μl异丙醇，室温下13000rpm离心15分钟，弃去上清，收集带有蓝色的沉淀，用75％乙醇洗涤后，将得到的蓝色沉淀在65℃干燥10分钟，加入50μl缓冲液(10mmole/L Tris.HCl pH6.5)溶解沉淀，取10μl分别作为HBV、HCVPCR反应模板。
3.PCR扩增用引物
PCR扩增用引物：根据HBV Database、HCV Database，在其各自的高度保守区设计特意引物，由上海博亚公司合成。dNTP、Taq酶、MMLV酶、RNA酶抑制剂、PCR Buffer均购于上海生工生物工程服务有限公司。
HBV引物序列
上游5’-CCTGCTCGTGTTACAGGCGG-3’
下游5’-GGACAAACGGGCAACATACCTT-3’
HCV引物序列
上游5’-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA-3’
下游5’-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3’
4.HBV DNA的扩增
HBV PCR扩增混合物：50μl反应混合物内含5μl 1×PCR Buffer，200μMdNTP，0.5μM上游引物和0.5μM下游引物，2U Taq DNA聚合酶，及10μl制备好的模板。
扩增条件：
95℃5分钟
(94℃30秒，55℃秒；72℃30秒)×35循环
72℃10分钟
检测结果：扩增产物经毛细管电泳分离后，获得扫描图1。
5.HCV RNA的扩增
HCV PCR反转录混合物：10μl反转录混合物内含2μl 1×PCR Buffer，200μM dNTP，0.5μM HCV下游引物，MMLV50U，RNA酶抑制剂25U，及10μl制备好的模板
HCV PCR扩增混合物：50μl反应混合物内含5μl 1×PCR Buffer，200μMdNTP，0.5μM上游引物和0.5μM下游引物，2U Taq DNA聚合酶，及10μl反转录好的模板。
扩增条件：
37℃60分钟
95℃5分钟
(94℃30秒；55℃30秒；72℃30秒；)×35循环
72℃10分钟
检测结果：扩增产物经毛细管电泳分离后，获得如下扫描图2。
6.HBV DNA、HCV RNA的同时检测
反转录混合物：10μl反转录混合物内含2μl 1×PCB Buffer，200μMdNTP，0.5μM HCV下游引物，MMLV50U，RNA酶抑制剂25U，及10μl制备好的模板
PCR扩增混合物：50μl反应混合物内含5μl 1×PCR Buffer，200μMdNTP，0.5μMHCV上游引物和0.5μM HCV下游引物，0.5μMHBV上游引物和0.5μMHBV下游引物，2U Taq DNA聚合酶，及10μl反转录好的模板。
扩增条件：
37℃60分钟
95℃5分钟
(94℃36秒；55℃30秒；72℃30秒)×35循环
72℃10分钟
检测结果：扩增产物经毛细管电泳分离后，获得扫描图3。
附：产物图谱扫描流程
使用美国Caliper公司的Caliper1000微流芯片检测系统，其仪器和试剂均由Caliper公司提供。
在扩增同时，取出DNA500胶和DNA500染料，室温放置片刻，混合匀。，吸取25μl DNA500染料，加入DNA500胶中，充分混匀直至颜色均一。将染色的胶全部加到离心过滤柱上，6000rpm离心20-30分钟。直至绝大部分的染色的胶流至收集管中，而离心过滤柱上只有薄薄一层。弃去离心过滤柱，收集管中即为制备好的染色胶，40℃避光保存可以使用三周。
扩增完成后，取出芯片操作台，将气泵上的拉杆拉至刻度1ml处。将一块DNA500芯片，平放在芯片操作台上。取出制备好的染色胶，在室温下放置片刻，混匀，在标有G的孔内加入6μl染色胶(芯片加样时请将Tip头垂直触底，切忌产生气泡)。将芯片操作台盖子盖上，扣下开关。缓缓压下气泵拉杆至刻度0(应该有明显抗力感)，扣紧，保持一分钟。松开扣子，缓缓拉气泵拉杆至刻度1ml处(气泵拉杆应会自动上升)，打开开关，取出芯片检查其微通道是否有气泡。
在芯片上两个标有G的孔分别加入6μl染色胶，在右下角的那个孔中加入4μl染色胶。
取出DNA500定量标记，混匀。在芯片左侧3排12个样品孔中加入5μl DNA500定量标记。
取出DNA500定位标记，混匀。在芯片右下角的那个孔中加入2μlDNA500定位标记。
把加样完成的芯片放到专用的振荡器上，2200-2300g振荡一分钟(振速以不让孔中液体溅出为准)。5分钟内将芯片放在Caliper1000微流芯片分析仪上进行结果分析。
在电脑上打开Caliper 1000微流芯片仪专用分析软件，等系统连接完成，界面左上方出现芯片图形后，在上方菜单选择“Assay”中选择“DNA500”，再点击“Start”即开始分析。
分析完成后，立刻将分析完成的芯片取出。取清洁芯片，在其孔中加350μl蒸镏水，放入Caliper 1000微流芯片分析仪，盖上盖子，等待20秒。然后打开盖子，将清洁芯片取出，保持开盖状态1分钟，让其残留水份挥发彻底。完成后可以进行下一块芯片的分析。
扫描图谱的结果经荧光杂交检测确证分别为HBV、HCV特异性检测结果，证实此样本确实含有HBV、HCV病毒核酸。
本发明中如无特殊说明，所用百分数均为体积百分数。
Claims (6)
1、一种对临床样品同时进行RNA和DNA提取的方法，该方法包括：
(1)裂解样品
将待测样品加入到已盛有病毒裂解液的试管中，振荡混匀，65℃保温15分钟；
(2)沉淀浓缩样本中的核酸
在上述反应管内加入异丙醇，振荡混匀后收集蓝色沉淀；
(3)蓝色沉淀经75％乙醇洗涤后，置该沉淀物于65℃下10分钟烘干，得蓝色干燥物；
(4)样品的储存和使用
上述蓝色沉淀可溶解后直接进行核酸扩增或存放在-20℃下保存待用。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述的病毒裂解液组成为：
6mol/L异硫氰酸胍(GuSCN)，20mmol/L TrisCl pH6.5，
1％-3％β-巯基乙醇，10ug/mL-50ug/mL糖元，
1％Tritln X-100，1％NP40，NF Co-Precipitant 15ug/mL。
3、根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中所述的收集方法为离心洗或抽滤法。
4、根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中病毒裂解液的量为生物样品量的一倍或成倍增加。
5、根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中异丙醇的量为样品量的一倍或成倍增加。
6、根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所述的待测样品是血清，血浆，血球或其它液化后的生物样品。
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|---|---|---|---|---|
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| CN105385680A (zh) * | 2015-12-24 | 2016-03-09 | 天津脉络生物科技有限公司 | 用于dna和rna同时提取的试剂，提取方法和用途 |
| CN109652517A (zh) * | 2019-02-22 | 2019-04-19 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 一种用于检测血流感染致病菌的试剂盒 |
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2004
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