CN1633997A - 和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，该和厚朴酚英文名为honokiol，CAS number：35354－74－6，分子量：266.33，化学命名为：3，5’－diallyl－4，2’－dihydroxybiphenyl，分子式为C18H18O2，对人体毒性小，本发明制备的和厚朴酚药物包括制剂允许的药物赋形剂或载体。本发明可制备用于针对肿瘤的多个特异性靶点包括HIF－1，VEGF，iNOS，HSP70，Bcl－xL，Bid来治疗肿瘤的药物。本发明的实验证明和厚朴酚可有效抑制肿瘤，且毒性低，可改善目前所用的临床抗肿瘤药物对人体都有较大的毒性的不足，具有制备临床抗肿瘤靶点药的应用前景。
Description
技术领域
本发明属天然化合物的用途，涉及从植物提取的和厚朴酚的新用途，尤其涉及和厚朴酚在制备抗肿瘤多个特异性靶点药物中的用途。
背景技术
近年来，抗肿瘤药物的研制已从过去的传统的单纯的细胞毒化疗药转向靶向药物。靶向药物的最大优点是比传统化疗药毒性小和疗效好。
肿瘤细胞内产生的低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是近年来被明确的抗肿瘤靶点，原因如下：肿瘤细胞产生的HIF-1α有多种作用，使肿瘤细胞不易发生凋亡、在肿瘤细胞的多条细胞信号通路起重要作用导致肿瘤细胞生长旺盛，促进肿瘤转移，可导致肿瘤内血管增生、等，临床表现为预后差。
肿瘤细胞产生的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是当前公认的治疗肿瘤的靶点。肿瘤细胞产生VEGF是肿瘤血管生成的关键因子，阻断肿瘤细胞的VEGF表达或功能都可有效地治疗肿瘤。最近，美国的Genetech公司的产品Avastin已进入临床III期试验。Avastin为一个抗血管内皮细胞生长因子的单克隆抗体，若通过临床III期，也将成为第一个抗肿瘤VEGF的靶点药。
可诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是另一治疗肿瘤的靶点。细胞内的一氧化氮(NO)主要由iNOS催化产生。NO在肿瘤的发生发展中的功能可概括为：(1)激活多条肿瘤细胞生长相关的细胞通路，使肿瘤细胞恶性生长；(2)使肿瘤细胞抗凋亡；(3)刺激低氧诱导因子-1和血管内皮细胞生长因子的合成；(4)促进肿瘤向恶性程度进化和转移；(5)抑制机体的肿瘤免疫功能。
热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)与肿瘤细胞的生长密切相关，HSP70在肿瘤细胞中的高表达导致临床肿瘤的治疗和预后不佳。因此研发HSP70的靶向药是当前的一个方向。
化疗是治疗肿瘤的一种主要手段，然而肿瘤化疗往往会因肿瘤的抗药性而失败。肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤细胞产生抗细胞凋亡的特性，如在肿瘤细胞内抗凋亡因子如Bcl-xL表达增加，而促凋亡因子如Bid表达减小，使得肿瘤细胞内的凋亡调控失去平衡。因此，当前的抗肿瘤药物的研究方向之一是通过调控肿瘤细胞内的凋亡来治疗肿瘤。
和厚朴酚是从植物厚朴中提取的一种天然化合物。其化学结构如下：
和厚朴酚在对其抗血栓、抗焦虑等体内实验时，证明能被胃肠道吸收，并具有体内滞留时间较长、没有明显毒副作用等特点。
发明内容
本发明的目的是提供和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，该和厚朴酚英文名为honokiol，CAS number：35354-74-6，分子量：266.33，化学命名为：3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式为C18H18O2，对人体毒性小，本发明所述的肿瘤靶点是指低氧诱导因子-1(HIF-1)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，一氧化氮合成酶(iNOS)，热休克蛋白质70(HSP70)，调控细胞凋亡的因子如Bcl-2家族成员和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族成员。
本发明所述的和厚朴酚与制剂允许的药物赋形剂或载体制成的制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸剂或注射剂。
本发明的有益效果有：(1)提出了和厚朴酚的新用途；(2)由于HIF-1，VEGF，iNOS，HSP70，Bcl-xL，Bid，caspase这些因子在肿瘤细胞生长、血管的生成、肿瘤转移等方面起至关重要的作用，因此和厚朴酚具有肿瘤靶点药的应用前景；(3)和厚朴酚可引起肿瘤细胞凋亡，具有制备临床抗肿瘤药的应用前景；(4)和厚朴酚毒性低，而目前所用的临床抗肿瘤药物对人体都有较大的毒性，因此可解决长期困绕抗肿瘤药毒性大的问题；(5)本发明用体内外实验证明和厚朴酚可有效抑制肿瘤。
附图说明
图1A为和厚朴酚对人结肠上皮癌细胞系RKO细胞内低氧诱导因子-1mRNA含量的影响。
图1B为和厚朴酚对RKO细胞内低氧诱导因子-1mRNA含量影响的直方图。
图2A为和厚朴酚对RKO细胞内低氧诱导因子-1蛋白质含量的影响。
图2B为和厚朴酚对RKO细胞内低氧诱导因子-1蛋白质含量影响的直方图。
图3A为和厚朴酚对RKO细胞内血管生长因子mRNA含量影响。
图3B为和厚朴酚对RKO细胞内血管生长因子mRNA含量影响的直方图。
图4为和厚朴酚对RKO细胞内血管生长因子蛋白质含量的影响。
图5A为和厚朴酚对RKO细胞内一氧化氮合成酶的蛋白质含量的影响。
图5B为和厚朴酚对RKO细胞内一氧化氮合成酶的蛋白质含量影响的直方图。
图6A为和厚朴酚对RKO细胞内热休克蛋白70的mRNA含量的影响。
图6B为和厚朴酚对RKO细胞内热休克蛋白70的mRNA含量影响的直方图。
图7A为和厚朴酚对RKO细胞内热休克蛋白70的蛋白质含量的影响。
图7B为和厚朴酚对RKO细胞内热休克蛋白70的蛋白质含量影响的直方图。
图8为和厚朴酚对RKO细胞内Bcl-2和Bax的mRNA水平的影响。
图9为和厚朴酚对RKO细胞内Bcl-xL和Bid的mRNA水平的影响。
图8为和厚朴酚对RKO细胞内Bcl-2和Bax的蛋白质水平的影响。
图9为和厚朴酚对RKO细胞内Bcl-xL和Bid的蛋白质水平的影响。
图12为和厚朴酚对RKO细胞内caspase-3的表达的影响。
图13为和厚朴酚对RKO细胞内caspase-7的表达的影响。
图14为和厚朴酚对RKO细胞内caspase-9的表达的影响。
图15为和厚朴酚作用于RKO细胞后，细胞内DNA呈梯带的电泳图。
图16为和厚朴酚对荷人大肠癌RKO细胞异种移植物的Balb/C裸鼠的治疗作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1：和厚朴酚对肿瘤细胞内低氧诱导因子-1(HIF-1)mRNA的抑制
(1)实验材料：
细胞株：大肠癌细胞株RKO来源于美国American Type CultureCollection(ATCC)公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；逆转录试剂盒(Promage，美国)，逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)试剂盒，热稳定DNA合成酶(Taq酶上海生工)。
仪器：培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，PCR仪，FCM仪。
(2)实验方法：
细胞培养：分组：根据不同和厚朴酚浓度分为5组，分别以1、2、3、4、5表示。1组为对照；2组加氯化钴(CoCl2)(150μM)；3组CoCl2(150μM)+和厚朴酚0.1μg/ml；4组CoCl2(150μM)+和厚朴酚0.5μg/ml；5组CoCl2(150μM)+和厚朴酚1μg/ml。
药物诱导：RKO细胞2×104每孔接种于24孔板，每组3个复孔；用含10％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl2(对照组除外)，使其终浓度为150μM，继续培养3小时。收集细胞，提取RNA或蛋白质，做相应的RT-PCR。
RT-PCR：收集细胞，弃去培养液，冰生理盐水洗3次后用RNA提取试剂Trizol(每孔400ul)提取细胞RNA(按Trizol试剂说明进行)。RNA逆转录成cDNA按逆转录试剂盒方案进行，引物为寡核苷酸脱氧胸腺嘧啶(Oligo dT)。PCR的引物如下：(引物由上海生工生物工程技术有限公司合成)
引物 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’) PCR产物(bp)
HIF-1α CCAGTTACGTTCCTTCGATCAG CTTTTCCTGCTCTGTTTGGTGA 143
PCR的反应体系按照PCR试剂盒方案进行。
PCR条件如下：
HIF-1：94℃5分钟→35循环{94℃30秒→54℃30秒→72℃30秒}→72℃5分钟。
PCR产物电泳：用1×TAE【三羟甲基氨基甲烷(tris)-冰醋酸-二乙胺四乙酸(EDTA)】电泳缓冲液配制1.5％琼脂糖凝胶，加0.1％溴化乙啶(EB)按说明制成水平DNA电泳胶块。加2×上样缓冲液，加样于加样孔，100V恒压电泳约20分钟。紫外成像仪上摄像。
(3)实验结果：
参见图1A和图1B，图1A：用RT-PCR法检测，细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时。可见随着和厚朴酚浓度增加，HIF-1 mRNA含量减小，图中泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl2；泳道3：CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道5：CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚；β-actin为内对照。图1B：各组HIF-1αRT-PCR产物的条带灰度值分别除去相应β-actin条带的影响因子，图中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl2低氧对照、CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚。CoCl2(150μM)诱导3hrs对RKO细胞HIF-1αmRNA表达有微弱的上调。和厚朴酚浓度依赖性下调RKO细胞HIF-1αmRNA表达，0.1、0.5和1μg/ml三个浓度分别比CoCl2对照组下调7.6％、15.9％和46.7％，说明和厚朴酚0.1-1μg/ml之间浓度时抑制HIF-1α基因转录。
实施例2：和厚朴酚对肿瘤细胞内低氧诱导因子-1(HIF-1)蛋白质的抑制
实施例1表明和厚朴酚可抑制HIF-1的基因转录，但并没有证明和厚朴酚可使肿瘤细胞中的HIF-1蛋白质含量也下降。该实施例证明和厚朴酚有此作用。
(1)实验材料
细胞株：大肠癌细胞株RKO来源于美国ATCC公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜(Bio-Rad公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(KPL，美国)，鼠抗人HIF-1α(NeoMarkers，美国)，化学发光检测系统ECL反应液(SantaCruz公司)，蛋白质测定试剂盒(DC Protein Assay Kit，Bio-Rad公司)，免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司)。
仪器：培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，电泳仪，电转膜仪。
(2)实验方法
细胞培养：分组：根据不同和厚朴酚浓度分为5组，分别以1、2、3、4、5表示。1组为对照；2组加CoCl2(150μM)；3组CoCl2(150μM)+和厚朴酚0.1μg/ml；4组CoCl2(150μM)+和厚朴酚0.5μg/ml；5组CoCl2(150μM)+和厚朴酚1μg/ml。
药物诱导：RKO细胞2×104每孔接种于24孔板，每组3个复孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl2(对照组除外)，使其终浓度为150μM，继续培养3小时。收集细胞，提取RNA或蛋白质，做西部印迹法(Western Blot)检测细胞内的HIF-1蛋白质含量。
Western blot：收集培养细胞，用生理盐水洗两次，细胞沉淀加入1×蛋白提取缓冲液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000转速(rpm)离心20分钟，取上清测定蛋白质浓度(按DC Protein Assay Kit说明书进行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿，停止电泳。
转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的转膜缓冲液(Transferbuffer)中，平衡30分钟。同时截取适当大小的PVDF膜和2张3M滤纸，将PVDF膜先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸-同浸于转膜缓冲液中，平衡10～15分钟，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒流110mA，4℃层析柜中转膜过夜。
封闭：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的缓冲液(TBST)中封闭1hr。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1∶400-500稀释的鼠抗人HIF-1(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃过夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5分钟×5次。
压片、洗片：取出膜，配制显色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分钟后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内，压片，洗片。
(3)实验结果
参见图2A和图2B，图2A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时。用Western Blot方法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，HIF-1蛋白质含量A表达减小，泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl2；泳道3：CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道5：CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚。β-actin为内对照。图2B：各组HIF-1α蛋白条带的灰度值分别去除相应β-actin条带的影响因子。图中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl2低氧对照、CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚。RKO细胞基础水平HIF-1α蛋白表达较低，不易检测到。CoCl2150μM诱导3小时显著上调RKO细胞HIF-1α蛋白表达。和厚朴酚浓度依赖性下调CoCl2(150μM)所致的RKO细胞HIF-1α蛋白积聚(参见图2A)。把western blot结果用图像软件(Scion Image)换算成灰度值，并作直方图(参见图2B)，可以看出，CoCl2(150μM)诱导的HIF-1α蛋白积聚比1组(空白对照组)增加约13倍。和厚朴酚0.1μg/ml浓度时，对CoCl2所致的HIF-1α蛋白积聚没有明显影响，而0.5和1μg/ml浓度时，梯度抑制CoCl2所致的HIF-1α蛋白上调，与2组(CoCl2对照组)相比分别下调28％和63.9％。和厚朴酚三个浓度对RKO细胞HIF-1mRNA及蛋白水平的影响趋势基本一致。此结果说明和厚朴酚可使细胞内的HIF-1α蛋白质含量下降。
实施例3：和厚朴酚对RKO细胞血管生长因子(VEGF)mRNA表达的影响
(1)实验材料
细胞：大肠癌细胞株RKO来源于美国ATCC公司。
试剂：逆转录试剂盒和PCR试剂盒为美国Promega公司产品。和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所。
仪器：PCR仪。
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×105接种于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培养基常规培养24小时，使贴壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl2(对照组除外)，使其终浓度为150μM，培养4小时后更换培养液，以除去CoCl2，继续用不同浓度的和厚朴酚作用3小时。收集细胞，提取RNA，逆转录成cDNA，做PCR检测VEGF的丰度。PCR引物如下：(引物由上海生工生物有限工程技术服务有限公司合成)
引物 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’) 产物(bp)
VEGF-A GCAGAATCATCACGAAGTGG GCATGGTGATGTTGGACTCC 212
反应条件如下：
VEGF-A：95℃5分钟→35循环{95℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟}→72℃7分钟。
PCR产物电泳：用1×TAE电泳缓冲液配制1.5％琼脂糖凝胶，加0.1％EB按说明制成水平DNA电泳胶块。加2×上样缓冲液，加样于加样孔，100V恒压电泳约20分钟。紫外成像仪上摄像。
(3)实验结果：
不同浓度和厚朴酚作用于常氧或CoCl2(150μM)模拟低氧组RKO细胞4hrs，取总RNA逆转录为cDNA，作PCR分析。参见图3A和图3B，图3A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时，用RT-PCR方法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，VEGF的mRNA含量减小。泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl2；泳道3：CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道5：CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚，β-actin为内对照。图3B：各组VEGFRT-PCR产物的条带分别除去其相应β-actin条带的影响因子，其中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl2低氧对照、CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚。CoCl2(150μM)显著上调RKO细胞VEGF mRNA表达，PCR产物条带的灰度值是对照组的1.7倍。和厚朴酚0.1-1μg/ml浓度时，剂量依赖性下调模拟低氧引起的VEGF mRNA表达上调。1μg/ml浓度时灰度值比低氧对照组下调44％，具有显著差异，说明和厚朴酚抑制VEGF的表达。
实施例4：和厚朴酚对RKO细胞VEGF蛋白质表达的影响
实施例3证明和厚朴酚处理肿瘤细胞后，细胞内VEGF mRNA水平下降，但不表明细胞内VEGF的蛋白质水平下降。检测细胞内VEGF蛋白质的水平是必需的。
(1)实验材料
细胞：大肠癌细胞株RKO来源于美国ATCC公司。
试剂：鼠抗人VEGF和免疫荧光试剂盒为福州迈新公司产品。和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所。
仪器：德国蔡氏荧光显微镜。
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×105接种于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培养基常规培养24小时，使贴壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl2(对照组除外)，使其终浓度为150μM，培养4小时后更换培养液，以除去CoCl2，继续用不同浓度的和厚朴酚作用3小时。收集细胞，用鼠抗人VEGF与细胞温育，再用荧光素FITC标记兔抗鼠IgG标记细胞，在荧光显微镜下观察细胞的荧光强度。荧光越强表示VEGF含量越高。
(3)实验结果
RKO细胞经150μMCoCl2作用4小时，并用不同浓度和厚朴酚处理8小时，检测细胞内高分子量VEGF(34-50kDa)的表达量。34-50kDa蛋白是细胞内非分泌形式的VEGF，当被剪接成189kDa、165kDa、121kDa等活性分子后，即被分泌出细胞，产生血管内皮生长因子的生理作用。我们用FITC荧光标记的二抗结合经VEGF-抗作用的细胞涂片，在荧光显微镜下观察，发现150μMCoCl2作用后的RKO细胞高分子量VEGF阳性细胞数明显增加，荧光主要分布在细胞质，不同浓度和厚朴酚(0.1-1μg/ml)作用8小时明显减少模拟低氧引起的阳性细胞增加。每组随机取150个细胞进行统计，结果参见图4，细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理8小时，用荧光免疫组织化学法检测RKO细胞内的荧光强度，荧光值反映VEGF的表达量，可见随着和厚朴酚浓度增加，高分子量VEGF的蛋白表达量减少，组别1-5分别代表常氧对照、CoCl2低氧对照、CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚，“**”表示与常氧对照组相比P＜0.01；“#”表示与低氧对照组相比P＜0.05；“##”表示与低氧对照组相比P＜0.01。
CoCl2(150μM)作用4小时明显上调RKO细胞内VEGF蛋白表达，其荧光值比对照组增加5.6倍，T检验两组间差异非常显著(P＜0.01)。和厚朴酚0.1-1μg/ml均表现为下调CoCl2引起的VEGF表达增加，其中H0.1组比单独低氧组减少29.5％(P＜0.01)，H0.5组和H1组分别减少76.4％和80％，与单独低氧组相比均有显著差异(P＜0.05)。该实验证明，和厚朴酚处理肿瘤细胞后，细胞内VEGF蛋白质含量下降。
实施例5：和厚朴酚对诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的影响
(1)实验材料
细胞：细胞：RKO细胞来源于美国ATCC公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；鼠抗人iNOS(NeoMarkers，美国)，HRP标记的羊抗鼠抗体(Santa Cruz，美国)。化学发光检测系统ECL反应液(Santa Cruz，美国)
仪器：电泳仪，电转膜仪
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×104每孔接种于24孔板，每组3个复孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl2(对照组除外)，使其终浓度为150μM，继续培养3小时。收集细胞，提取RNA或蛋白质，做Western Blot检测细胞内的HIF-1蛋白质含量。
Western blot：收集培养细胞，用生理盐水洗两次，细胞沉淀加入1×蛋白提取缓冲液，吹散，沸水中煮15分钟，13000转/分钟(rpm)离心20分钟，取上清测定蛋白质浓度(按DC Protein Assay Kit说明书进行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿，停止电泳。
转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的转膜缓冲液中，平衡30分钟。同时截取适当大小的PVDF膜和2张3M滤纸，将PVDF膜先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一同浸于转膜缓冲液中，平衡10～15分钟，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒流110mA，4℃层析柜中转膜过夜。
封闭：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1∶400-500稀释的鼠抗人iNOS(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃过夜，TBST漂洗5分钟×5次，再浸于1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5分钟×5次。压片、洗片：取出膜，配制显色液(ECLA液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分钟后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内，压片，洗片。
(3)实验结果
参见图5A和图5B，图5A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时，用Western Blot法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，iNOS蛋白含量减小，β-actin为内对照。图5B：各组iNOS蛋白条带分别除去其相应β-actin条带的影响因子，图中组别分别代表常氧(N)和低氧(H)时不同和厚朴酚(0-1μg/ml)作用浓度。每组取50μg蛋白进行Western blot检测，RKO细胞基础水平iNOS蛋白表达丰度较高。CoCl2(150μM)模拟低氧时，轻度上调RKO细胞iNOS蛋白表达，其Western blot条带的灰度值与常氧对照组相比增强了21.4％。常氧组和厚朴酚1μg/ml浓度时显著下调iNOS。比较常氧组与低氧组Western blot条带的灰度值，发现相同剂量和厚朴酚对RKO细胞iNOS蛋白表达的影响与环境氧含量无明显相关，说明和厚朴酚对RKO细胞iNOS蛋白的调节不受氧分压影响。
该实验结果说明：和厚朴酚可抑制iNOS的表达。
实施例6：和厚朴酚对RKO细胞HSP70mRNA的影响。
(1)实验材料
细胞：RKO细胞来源于美国ATCC公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；逆转录试剂盒和PCR试剂盒为美国Promega公司产品。
仪器：PCR仪。
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×105接种于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培养基常规培养24小时，使贴壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl2(对照组除外)，使其终浓度为150μM，培养4小时后更换培养液，以除去CoCl2，继续用不同浓度的和厚朴酚作用3小时。收集细胞，提取RNA，逆转录成cDNA，做PCR检测HSP70的丰度。PCR引物如下：(引物由上海生工生物工程技术有限公司合成)
引物 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’) 产物(bp)
HSP70 CAAGATCAGCGAGGCTGACAAG AACTGTACACAGGGTGGCAGTG 500
反应条件如下：HSP70：95℃5分钟→35个循环{95℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟}→72℃7分钟
PCR产物电泳：用1×TAE电泳缓冲液配制1.5％琼脂糖凝胶，加0.1％EB按说明制成水平DNA电泳胶块。加2×上样缓冲液，加样于加样孔，100V恒压电泳约20分钟。紫外成像仪上摄像。
(3)实验结果
参见图6A和图6B，图6A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时，用RT-PCR法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，HSP70 mRNA含量减小，泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl2；泳道3：CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道5：CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚。β-actin为内对照。图6B：各组HSP70RT-PCR产物条带分别除去其相应β-actin条带的影响因子，图中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl2低氧对照、CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚、CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚。CoCl2(150μM)上调RKO细胞HSP70mRNA表达，其PCR产物条带的灰度值比对照组上调224％。和厚朴酚浓度依赖性下调化学低氧所致的RKO细胞HSP70mRNA上调，PCR产物条带的灰度值与CoCl2单独作用组相比分别减少了73.1％、76.5％和87.8％。这个结果说明和厚朴酚可抑制HSP70的表达。
实施例7：和厚朴酚对RKO细胞HSP70蛋白质的影响。
(1)实验材料
细胞：RKO细胞来源于美国ATCC公司。
试剂：和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所；鼠抗人HSP70(NeoMarkers，美国)，HRP标记的羊抗鼠抗体(Santa Cruz，美国)。化学发光检测系统ECL反应液(Santa Cruz，美国)
仪器：电泳仪，电转膜仪。
(2)实验方法
药物诱导：RKO细胞2×104每孔接种于24孔板，每组3个复孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培养基稀释和厚朴酚储存液(5mg/ml)，充分混匀，配成所需浓度，并以此更换细胞培养液；药物作用1小时后加入CoCl2(对照组除外)，使其终浓度为150μM，继续培养3小时。收集细胞，提取蛋白质，做Western Blot检测细胞内的HSP70蛋白质含量。
Western blot：收集培养细胞，用生理盐水洗两次，细胞沉淀加入1×蛋白质提取缓冲液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000rpm离心20min，取上清测定蛋白质浓度(按DC Protein Assay Kit说明书进行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿，停止电泳。转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的转膜缓冲液中，平衡30min。同时截取适当大小的PVDF膜和2张3M滤纸，将PVDF膜先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一同浸于转膜缓冲液中，平衡10～15min，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒流110mA，4℃层析柜中转膜过夜。封闭：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1hr。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1∶400-500稀释的鼠抗人HSP70(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃过夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。压片、洗片：取出膜，配制显色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内，压片，洗片。
(3)实验结果
每组取10μg蛋白进行western blot检测。结果参见图7A和图7B，图7A：细胞在化学低氧环境下用不同浓度和厚朴酚处理4小时，用Western Blot法检测，可见随着和厚朴酚浓度增加，HSP70蛋白含量减小，泳道1：常氧对照；泳道2：CoCl2；泳道3：CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚；泳道4：CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚；泳道5：CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚。β-actin为内对照。图7B：各组HSP70蛋白条带分别除去其相应β-actin条带的影响因子，图中组别1-5分别代表常氧对照、CoCl2低氧对照、CoCl2+0.1μg/ml和厚朴酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚朴酚、CoCl2+1.0μg/ml和厚朴酚。CoCl2(150μM)模拟低氧上调RKO细胞HSP70蛋白表达，western blot条带的灰度值与对照组相比增强了195.4％，具有显著差异。和厚朴酚0.1-1μg/ml浓度时剂量依赖性抑制CoCl2对RKO细胞HSP70蛋白表达的影响，抑制率分别为22.8％、35.8％和75.2％。这个结果与实施例5共同说明和厚朴酚可抑制细胞内HSP70的表达，使细胞内HSP70的含量降低，后者含量的降低可导致HIF-1α的降解。
实施例8：和厚朴酚下调Bcl-xL，上调Bid。
(1)实验材料：
鼠抗人单抗P53(NeoMarkers，美国)；兔抗人多抗Bcl-2(武汉博士德公司)；兔抗人多抗Bcl-XL(武汉博士德公司)；兔抗人多抗Bid(武汉博士德公司)；兔抗人多抗Bax(武汉博士德公司)；HRP标记的羊抗鼠二抗(KPL公司，美国)；HRP标记的羊抗兔抗体(北京中山生物制品公司)；化学发光检测系统ECL反应液(Santa Cruz公司，美国)；蛋白质定量试剂盒(DC proteinassay)(Bio-Rad公司，美国)；RT-PCR试剂盒(Promega公司，美国)；Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)；Protein MW marker(Fermentas公司，美国)；逆转录酶(Promega，美国)；RNA酶抑制剂(Promega，美国)；Taq酶(上海生工)。
(2)实验方法：
细胞培养与药物处理：取对数生长期人结肠癌RKO细胞，用含10％灭活小牛血清的RPIM1640培养基，于37℃、5％CO2条件下培养。用含10％小牛血清的新鲜RPIM1640培养基稀释和厚朴酚母液(5mg/ml)，使成所需浓度(5-15μg/ml)，作用细胞48hrs。
RT-PCR：
细胞总RNA提取
取经不同浓度和厚朴酚作用48hrs的RKO细胞，弃去培养基，收集细胞，弃去培养液，冰生理盐水洗3次后用RNA提取试剂Trizol(每孔400ul)提取细胞RNA(按Trizol试剂说明进行)。RNA逆转录成cDNA按逆转录试剂盒方案进行，引物为寡核苷酸脱氧胸腺嘧啶(OligodT)。
引物序列如下(引物全由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)：
上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’) PCR产物大小(碱
基对)
Bax ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGT ACAAAGATGGTCACGGTCTGC 332
Bcl-xl GGAGCTGGTGGTTGACTTTCT CCGGAAGAGTTCATTCACTAC 379
Bid GACCCGGTGCCTCAGGA ATGGTCACGGTCTGCCA 586
Bcl-2 TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG TACTGCTTTAGTGAACCTTTT 332
β AGGCCAACCGCGAGAAGATGA GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC 350
-actin CC
PCR条件：
Bax，Bcl-xl，Bid，Bcl-2：
94℃5分钟→32循环{92℃1分钟→55℃30秒→72℃
90秒}→72℃5分钟→4℃保存
β-actin：
95℃5分钟→25-28循环{95℃20秒→55℃20秒→72
℃30秒→72℃7分钟→4℃保持。
西部印迹法(Western blot)：
收集培养细胞，用生理盐水洗两次，细胞沉淀加入1×蛋白提取缓冲液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000转速(rpm)离心20分钟，取上清测定蛋白质浓度(按蛋白质定量试剂盒(DC protein assay)说明书进行)。取蛋白提取物20μg，加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿，停止电泳。
转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的转膜缓冲液(Transferbuffer)中，平衡30分钟。同时截取适当大小的PVDF膜和2张3M滤纸，将PVDF膜先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一同浸于转膜缓冲液中，平衡10～15分钟，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒流110mA，4℃层析柜中转膜过夜。
封闭：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1hr。
杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1∶400-500稀释的一抗(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃过夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀释的二抗(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。
压片、洗片：取出膜，配制显色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内，压片，分别于1min、2min和5min洗片。
实验结果：
p53和Bcl-2家族成员是细胞凋亡调控的关键因子。Bcl-2家族成员Bax和Bcl-xl是抑制凋亡的因子，在肿瘤细胞中常为高表达，Bcl-2和Bid是促进细胞凋亡的因子，在肿瘤细胞中常为低表达3。
参见图8，和厚朴酚处理肿瘤细胞RKO后，Bax和Bcl-2在mRNA水平上与对照组相比无明显差别，图中M为分子量标记；1为对照，即0μg/ml的和厚朴酚处理；2为用5μg/ml和厚朴酚处理；3为用10μg/ml和厚朴酚处理；β-actin为PCR的内标。
参见图9，和厚朴酚处理RKO细胞后，Bcl-XL的mRNA含量显著下降，Bid的mRNA含量则显著增加，图中M为分子量标记；1为对照，即0μg/ml的和厚朴酚处理；2为用5μg/ml和厚朴酚处理；3为用10μg/ml和厚朴酚处理；β-actin为PCR的内标。
参见图10，和厚朴酚处理RKO细胞后，Bax，Bcl-2和p53在蛋白质水平上与对照组相比无明显差别，图中honokiol为和厚朴酚的英文名，蛋白表达量用内标β-actin作为质控。
参见图11，和厚朴酚处理RKO细胞后，Bcl-XL的蛋白质含量显著下降，Bid的蛋白质含量则显著增加，图中honokiol为和厚朴酚的英文名，蛋白表达量用内标β-actin作为质控。
结论：和厚朴酚可下调肿瘤细胞内抑细胞凋亡因子Bcl-xL，上调促细胞凋亡因子Bid。
实施例9 和厚朴酚上调并激活肿瘤细胞内Caspase成员
实验材料：
鼠抗人单抗caspase-3(NeoMarkers，美国)；鼠抗人单抗Caspase-7(NeoMarkers，美国)；鼠抗人单抗Caspase-9(NeoMarkers，美国)；HRP标记的羊抗鼠二抗(KPL公司，美国)。
实验方法：
细胞培养和药物处理：
取对数生长期人结肠癌RKO细胞，用含10％灭活小牛血清的RPIM1640培养基，于37℃、5％CO2条件下培养。用含10％小牛血清的新鲜RPIM1640培养基稀释和厚朴酚母液(5mg/ml)，使成所需浓度(5-15μg/ml)，作用细胞48hrs。
西部印迹法(Western blot)：
收集培养细胞，用生理盐水洗两次，细胞沉淀加入1×蛋白提取缓冲液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000转速(rpm)离心20分钟，取上清测定蛋白质浓度(按蛋白质定量试剂盒(DC protein assay)说明书进行)。取蛋白提取物20μg，加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿，停止电泳。
转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的转膜缓冲液(Transferbuffer)中，平衡30分钟。同时截取适当大小的PVDF膜和2张3M滤纸，将PVDF膜先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一同浸于转膜缓冲液中，平衡10～15分钟，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒流110mA，4℃层析柜中转膜过夜。
封闭：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1hr。
杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1∶400-500稀释的一抗(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃过夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀释的二抗(用含5％脱脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。
压片、洗片：取出膜，配制显色液(ECLA液0.7ml+ECLB液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内，压片，分别于1min、2min和5min洗片。
实验结果：
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族是细胞凋亡的执行者。Caspase在细胞中有两种形式，无活性的酶元(procaspase)和有活性的酶。和厚朴酚处理RKO肿瘤细胞后，细胞内的酶元procaspase-3，-7，和-9含量显著增加(图12，13，14)，而且细胞内被激活的caspase-3的含量也显著增加(图13)。激活的caspase-3是细胞发生凋亡的关键点(Wang KW.Trends inNeurosciences，23：20-26，2000).见图12，图13，图14。图12中1为对照；2为5μg/ml和厚朴酚；3为10μg/ml和厚朴酚，β-actin为那对照。图13中1为对照；2为5μg/ml和厚朴酚；3为10μg/ml和厚朴酚，β-actin为那对照。图14中1为对照；2为5μg/ml和厚朴酚；3为10μg/ml和厚朴酚，β-actin为内对照。
结论：和厚朴酚可作用于肿瘤细胞内的caspase成员。
实施例10：和厚朴酚抑制肿瘤细胞
(1)实验材料：
细胞系：表2中所列细胞均来源于美国ATCC公司；和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所。碘化丙啶试剂盒为美国Becton-Dickenson公司产品。
仪器：流式细胞仪，电泳仪，电转膜仪。
(2)实验方法
以上肿瘤细胞均培养于RPMI-1640完全培养液中。细胞接种到96孔细胞培养板中，加入不同浓度的和厚朴酚，调零孔和对照组加相应体积的培养液，每组设4个平行孔，培养72h后，每孔加5mg/ml MTT 20μl(调零组除外)，再培养4h，去培养液，加DMSO 100μl/孔，待结晶Formazan完全溶解后，用酶联免疫仪再波长570nm处调零组调零后读取吸光度(A)值。取4孔A值的均数按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(IR)＝[1-(实验孔A均值/对照孔A均值)]×100％。计算IR采用Origin 7.0数据处理软件用Sigmodel函数拟合求出半数抑制浓度(IC50)，每实验重复三次。或者，细胞培养于细胞培养瓶中，加入不同浓度的和厚朴酚，培养48小时，收集细胞，用碘化丙啶试剂盒处理后用流式细胞仪分析细胞凋亡。
结果：和厚朴酚对各种肿瘤细胞的IC50在10μg/ml左右，见表1。
表1.和厚朴酚对各种肿瘤细胞的IC50(μg/ml)
| 细胞系 | IC50(μg/ml) | 细胞系 | IC50(μg/ml) |
| 人成骨肉瘤MG-63人胚肾癌293人大细胞肺癌NCI-H460人白血病细胞HL-60人乳癌细胞Bcap-37 | 10.31±1.027.75±1.019.42±0.530.51±0.1214.5±1.3 | 人血管内皮细胞ECV304人横纹肌瘤细胞RD人结肠腺癌LS174T胰腺癌细胞Aspc-1人结肠癌细胞SW480 | 5.4±0.413.5±1.412.7±1.015.4±1.710.5±1.2 |
| 人结肠癌HCT-116人白血病细胞NB4人结肠癌SW620 | 12.0±0.83.0±0.613.2±1.4 | 结肠腺癌HT29人胰腺癌Bxpc-3人肝癌细胞HepG2人结肠癌RKO | 10.7±0.85.2±1.814.2±0.811.6±1.3 |
RKO细胞经和厚朴酚处理后，用碘化丙啶染色细胞，然后用流式细胞仪分析细胞的凋亡比例。结果指出，细胞和厚朴酚对肿瘤细胞的凋亡诱导作用与其浓度成正比，见表2。
表2.和厚朴酚对人结肠癌细胞RKO细胞凋亡的诱导作用
| 和厚朴酚(μg/ml) 细胞周期分布 凋亡细胞％G0/G1 S G2/M |
| 0 44.38 45.1 10.1 05 48.0 42.4 9.6 4.510 54.0 40.3 5.7 14.115 58.9 39.4 1.7 20.3 |
和厚朴酚可诱导RKO肿瘤细胞内DNA呈特异性梯带，参见图15，其中条带1：对照；条带2：5μg/ml和厚朴酚；条带3：10μg/ml和厚朴酚：条带4：15μg/ml和厚朴酚。DNA特异性梯带是确定细胞凋亡的标志。
实施例11：和厚朴酚在体对人结肠癌细胞系RKO细胞所致实体瘤及腹水瘤的抑制作用
(1)实验材料：
细胞系：人结肠癌细胞系RKO来源于美国ATCC公司；和厚朴酚，中国药品与生物制品鉴定所。
动物：Babl/c小鼠(上海动物中心)
无菌饲养室及饲料(浙江省中医学院提供)
(2)实验方法
腹水瘤模型：取对数生长期RKO细胞→0.25％胰酶消化片刻→离心、生理盐水洗3次，彻底去除胰酶→细胞沉淀溶于无血清RPIM1640培养基，使成2×106/ml→每鼠腹腔接种100μl(含2×105细胞)→观察腹部膨隆情况。
实体瘤模型：取腹水瘤鼠一只→引颈处死→碘酊消毒皮肤，75％乙醇浸泡片刻→剪开腹壁皮肤，无菌生理盐水1000μl冲淋腹腔→收集冲洗液→每鼠50μl(约含2×105细胞)接种于腋部皮下→隔天称量体重，卡尺测量瘤体体积。
分组及用药：腹水瘤及实体瘤各分为3组：空白对照组、溶剂组、用药组。和厚朴酚溶于PEG400/蔗糖(体积比7∶3)溶液，使成25mg/ml，放置37℃摇床振荡2小时，分装备用。用药组隔天每鼠灌胃5mg(100μl)和厚朴酚溶液，溶剂组给予等体积PEG400/蔗糖溶液，对照组给予等体积生理盐水，隔天一次，连续用药至对照组死亡。隔天称量体重及测量瘤体大小或腹部膨隆情况。
(3)实验结果
<1>和厚朴酚对RKO细胞成腹水瘤的抑制作用
腹水瘤组在腹腔接种当天开始用药，每天观测腹部膨隆，隔天记录体重。比较各组平均生存时间。结果如表4所示，溶剂组和对照组的平均寿命分别是28.8天和29.7天，两组之间无显著差异。和厚朴酚用药组平均寿命50.9天，比对照组延长22.18天，平均生存时间是对照组的176.7％，两组之间有显著差异(P＜0.05)，说明和厚朴酚能有效抑制RKO细胞形成腹水瘤，并延长荷瘤鼠的生存时间。
表3和厚朴酚对荷人RKO腹水瘤Balb/C裸鼠的平均生存时间和生存延长时间的影响
实验分组 动物数 MST(天) T/C(％)
对照组 7 28.8 100
溶剂组 6 29.7 104.5
和厚朴酚 7 50.9 176.7*
平均生存时间(mean survival time，MST)。生存时间延长率(The survivalrate，T/C％)，T/C(％)＝[试验组的平均生存时间/对照组的平均生存时间]×100％.*：P＜0.01，与溶剂组相比。
<2>和厚朴酚对RKO细胞成实体瘤的抑制作用
取Babl/c小鼠10只，待瘤体增长至约5×5mm时，随机分为对照组(3只)、溶剂组(3只)与用药组(4只)。用药组每次灌胃5mg和厚朴酚，隔天一次，持续21天。溶剂组给予等体积溶剂(PEG400/蔗糖)，对照组给予等体积生理盐水。隔天称重及测量瘤体大小，以每周最后一次的数据作图，结果参见图16，Y轴代表肿瘤体积，X-轴代表药物治疗天数，可见和厚朴酚可显著遏制肿瘤的生长，“*”表示与对照组相比P＜0.05。
结果为：对照组和用药组开始时的平均瘤体体积分别为0.185cm3和0.171cm3，一周后两组的增长率分别是361％和198％，相差1.8倍，但统计表明无组间差异(P＝0.055＞0.05)。第2周时对照组14天平均增长1182％，而用药组只增长710％，前者与后者的比值为1.66，但统计表明有组间差异(P＝0.011＜0.05)。第3周时用药组的增长明显减慢，21天平均增长率是901％，而对照组达到1626％，两组间差异显著(P＜0.05)。第4周时对照组动物陆续死亡，而用药组也停止给药，但瘤体增长未见明显增快，反而其中一只出现瘤体脱落现象。溶剂组与对照组无组间差异。以上结果表明，和厚朴酚对RKO细胞所致实体瘤具有显著的抑瘤效果。
实施例1-9证明和厚朴酚的作用靶点为低氧诱导因子(HIF-1)，血管生长因子(VEGF)、一氧化氮合成酶、HSP70、Bcl-xL、Bid、和caspase；而实施例10和11用体外和体内实验充分证明和厚朴酚通过作用于这些靶点可有效抑制肿瘤。研发抗肿瘤的靶点药是当前的趋势。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献
1.Ross JS，Schenkein DP，Peitrusko R，et al.Am J Clin Pathol.122：598-609，2004.
2.Powis G & Kirkpatrick L.Mol Cancer Ther.3：647-654，2004。ChristopherW Pugh，Peter J Ratcl iffe.Nature Medicine，9：677-84，2003.
3.Mosser DD，Morimoto RI.Oncogene.23：2907-18，2004，及其中的参考文献)
4.Ferrara N.Endocr Rev.25：581-611.2004.
5.M.R.Raspollini，G.Amunni，A.Villanucci，et al：Gynecol Oncol.2：806-12，2004；Muerkoster S，Wegehenkel K，Arlt A，Cancer Res.64：1331-7，2004.
6.Goyal L.Cell，104：805-808，2001.Kulik G，Carson JP，Vomastek T，et al.Cancer Research 61，2713-2719，2001.Minn AJ，Kettlum CS，Liang H.et al，TheEMBO Journal 18：632-643，1999.Schimmer AD.Cancer Res.64：7183-7190，2004.
7.Teng CM，Chen CC，Ko FN，et al.Thromb Res.1988；50：757-765，Watanabe K，Watanabe H，Goto Y，et al.Planta Med.1983；49：103-108.
Claims (13)
1.和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，和厚朴酚，英文名为honokiol，CAS number：35354-74-6，分子量：266.33，化学命名为：3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式为C18H18O2，肿瘤靶点是指低氧诱导因子-1、血管内皮细胞生长因子、氧化氮合成酶、热休克蛋白质-70、细胞凋亡的相关蛋白。
2.根据权利要求1所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备针对肿瘤细胞内低氧诱导因子-1来治疗肿瘤的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备抑制肿瘤细胞内低氧诱导因子-1α的合成及其积聚的抗肿瘤药物中的用途。
4.根据权利要求1所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备针对肿瘤细胞的血管内皮细胞生长因子来治疗肿瘤的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备抑制肿瘤细胞内的血管内皮细胞生长因子的合成的抗肿瘤药物中的用途。
6.根据权利要求1所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备针对肿瘤细胞的一氧化氮合成酶来治疗肿瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备调控肿瘤细胞内的一氧化氮合成酶的合成的药物中的用途。
8.根据权利要求1所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备针对肿瘤细胞的热休克蛋白质-70来治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备调控肿瘤细胞内的热休克蛋白质-70的合成的抗肿瘤药物中的用途。
10.根据权利要求1所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备针对肿瘤细胞的调控细胞凋亡的因子来治疗肿瘤的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述根据权利要求8所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备抑制肿瘤细胞内抗凋亡因子Bcl-XL，增强促凋亡因子Bid的抗肿瘤药物中的用途。
12.根据权利要求10所述的和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：在制备诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤药物中的应用。
13.根据权利要求1-10所述的任一和厚朴酚在制备抗肿瘤靶点药物中的用途，其特征是：制备的药物是由和厚朴酚与制剂允许的药物赋形剂或载体组合，其制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂。
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