CN1629155A - 具有抗肿瘤活性的新型嘧啶羧酸酰胺类化合物及其盐类 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的嘧啶羧酸酰胺类化合物及其药学上可接受的盐类。本发明针对现有抗肿瘤化合物嘧啶胺类化合物不易结晶、水溶性差而影响其生物利用度的缺陷，在其嘧啶氨基上引入α－氨基酸骨架，制备成嘧啶羧酸酰胺类化合物，使化合物易结晶，水溶性好。经活性实验表明，提高了抗肿瘤活性，因此可用于抗肿瘤药物。

Description

具有抗肿瘤活性的新型嘧啶羧酸酰胺类化合物及其盐类

                         技术领域

本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的新型嘧啶羧酸酰胺类化合物及其盐类。

                         背景技术

癌症是当前危害人类健康和正常生活的主要的疾病之一，抗癌药物的研究开发一直是科学家选择的热点课题。由于癌症发生机制的复杂性和特殊性，寻找高选择性、高效及低毒副作用的抗癌药物并非易事。已有将嘧啶类化合物改造成嘧啶胺类化合物用于肿瘤治疗的报道：诺华制药公司的美国专利US5521184(申请日：1993年4月2日，授权日：1996年5月28日；在中国已于1999年6月2日授予专利权)。该专利的嘧啶胺类化合物格列卫[Gleevec(imatinibmesylate，STI-571)]的结构式为：

化学名为：4[4-甲基-1-哌嗪基]甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基}苯基苯甲酰胺甲烷磺酸盐。这类化合物通过抑制癌细胞赖以生长的酶(受体蛋白酪氨酸激酶)而发挥抗肿瘤作用。美国食品和药品管理局(FDA)2001年5月10日批准其用于肿瘤治疗。然而嘧啶胺类化合物水溶性较差，有吸湿性，不易结晶，从而对在体内的崩解和溶出造成一定的影响。降低了生物利用度。

                         发明内容

本发明提供一类具有抗肿瘤活性、生物利用度高的新型嘧啶羧酸酰胺类化合物及其盐类。

针对嘧啶胺类化合物不易结晶、水溶性差而影响其生物利用度的缺陷，引入氨基酸，使嘧啶胺与氨基酸形成嘧啶羧酸酰胺，改善了化合物的水溶性，使化合物更稳定，从而提高生物利用度。

本发明化合物(III)通式如下：

其中R¹表示H；C₁-C₄直链烷基或支链烷基；其它氨基酸。优选甲基，异丙基，异丁基，仲丁基。特别优选异丙基。

R²表示H；乙酰基；丙酰基；苄氧羰基；叔丁氧羰基，优选苄氧羰基，叔丁氧羰基。特别优选叔丁氧羰基。

本发明化合物由嘧啶胺类化合物RNH₂(I)与N保护氨基酸(II)反应所得。

由上述反应生成的化合物(III)经酸处理，脱去氨基保护基后得化合物(IV)：

酰胺化反应可以使用相应的酸酐，酰氯等酰化试剂与胺进行缩合反应；也可用相应的N保护氨基酸(II)在活化剂DCC-HOBt(N，N′二环己基碳二亚胺-1-羟基苯并三氮唑)的催化下，使羧基活化，从而方便地形成相应的羧酸酰胺。这类化合物具有很好的结晶。

本发明嘧啶羧酸酰胺类化合物，侧链氨基酸的氨基被保护，保护基为乙酰基、丙酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基等。虽然侧链被保护，但显示在体外具有显著抑制内皮生长因子受体酪氨酸激酶的活性，从而显示抗肿瘤活性。

这类N保护嘧啶羧酸酰胺类化合物(III)，可以用酸催化将保护基水解脱除。这里使用的酸为HF(氢氟酸)、HCl(盐酸)、CH₃COOH(冰醋酸)或CF₃COOH(三氟醋酸)。脱去N保护基的化合物(IV)有好的结晶。同样具有显著抑制内皮生长因子受体酪氨酸激酶的活性，从而显示抗肿瘤活性。

本发明原料化合物嘧啶胺(I)按欧洲专利EP0233461的方法制备，各种N保护氨基酸(II)为吉尔生化(上海)有限公司产品，其它为常规试剂。

本发明化合物具体制备方法为：

等摩尔N-保护氨基酸(II)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量氯仿中，在冰水浴冷却至0-5℃，加入等摩尔N，N′二环己基碳二亚胺(DCC)三乙胺，搅拌15分钟后，再滴加含有嘧啶胺RNH₂(I)和三乙胺氯仿溶液，室温搅拌过夜。反应完毕，过滤，滤液分别用5％的碳酸氢钠溶液、蒸馏水洗涤三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得本发明嘧啶羧酸酰胺类化合物(III)。

把化合物(III)和混合液(三氟乙酸∶二氯甲烷＝1∶1)置于圆底烧瓶中搅拌两小时后，减压蒸除溶剂后呈油状物，加入少量水，用饱和碳酸氢钠溶液中和(有白色沉淀和气泡生成)，用CH₂Cl₂提取三次，合并CH₂Cl₂液，用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，得本发明化合物(IV)的白色固体。

本发明合成的一系列化合物，由于在嘧啶氨基上引入了α-氨基酸骨架，解决了化合物水溶性较差、易氧化、有吸湿性和不易结晶等缺点，从而可制成可口服、注射等不同剂型，且由于水溶性好，提高了疗效。

本发明化合物可制备成药学上可接受的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、甲烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。制备方法为将上述嘧啶羧酸酰胺类化合物与相应的酸回流反应，经分步浓缩结晶而得。

经ELISA法测定本发明化合物抑制血小板衍生生长因子受体-3蛋白酪氨酸激酶的活性，表明本发明嘧啶羧酸酰胺类化合物具有显著的抑制血小板衍生生长因子受体蛋白酪氨酸激酶活性的作用，从而显示其具有抗肿瘤活性。

本发明具有下列有益的结果：

1.本发明嘧啶羧酸酰胺类化合物具有很好的结晶，便于在制备过程中分离纯化，便于产品的质量控制。

2.本发明嘧啶羧酸酰胺类化合物，由于引入了天然的氨基酸侧链，增加了产品的水溶性，并提高了在体内的生物利用度，因而提高了疗效，且可制成不同剂型。

                       具体实施方式

现结合实施例对本发明作进一步的阐述，但不对本发明作限制。

在具体的实施例中，嘧啶胺母环(I)：

用RNH₂来表示。

实施例1.制备本发明化合物之一：

嘧啶N-叔丁氧羰基缬氨酸酰胺(RNH-Boc-Val-OH)

N-叔丁氧羰基缬氨酸(Boc-Val-OH)0.48g(0.0022mol)，HOBt0.27g(0.0022mol)，氯仿12ml，在50ml圆底烧瓶中，冰水浴冷却至0-5℃，加入DCC0.42g(0.0022mol)和三乙胺0.22g(0.0022mol)搅拌15分钟后，再滴加含有嘧啶胺RNH₂0.6g，(0.0022mol)和三乙胺0.22g(0.0022mol)的10ml氯仿溶液，室温搅拌过夜。反应完毕，过滤，滤液分别用5％的碳酸氢钠溶液、蒸馏水洗涤三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得嘧啶N-叔丁氧羰基缬氨酸酰胺(RNH-Val-Boc-OH)0.82g，熔点：172-173℃；MS(质谱分子峰)：476；HRMS(高分辨质谱)：476.3465(理论值476.58334)。

实施例2.制备本发明化合物之二：

嘧啶缬氨酸酰胺(RNH-Val-OH)

把产品RNH-BOC-Val-OH0.476g(0.001mol)与混合液(三氟乙酸∶二氯甲烷＝1∶1)10ml置于50ml的圆底烧瓶中搅拌两小时后，减压蒸除溶剂后呈油状物，加入少量水，用饱和碳酸氢钠溶液中和(有白色沉淀和气泡生成)，用CH₂Cl₂提取三次，每次20ml，合并CH₂Cl₂液，用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，得白色固体嘧啶缬氨酸酰胺(RNH-Val-OH)0.22g，熔点：146-148℃，MS：376；HRMS：376.2347(理论值376.46503)。

实施例3.制备本发明化合物之三：

嘧啶N-叔丁氧羰基丙氨酸酰胺(RNH-Boc-Ala-OH)

N-叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-Ala-OH)0.42g(0.0022mol)，HOBt0.27g(0.0022mol)，氯仿10ml，在50ml圆底烧瓶中，冰水浴冷却至0-5℃，加入DCC0.42g(0.0022mol)和三乙胺0.22g(0.0022mol)搅拌15分钟后，再慢慢滴加含有RNH₂0.6g(0.0022mol)和三乙胺0.22g(0.0022mol)的10ml氯仿溶液，室温搅拌过夜。反应完毕，过滤后滤液分别用5％的碳酸氢钠溶液、蒸馏水洗涤三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得嘧啶N-叔丁氧羰基丙氨酸酰胺(RNH-Boc-Ala-OH)0.76g，熔点：195-197℃；MS：448；HRMS：448.2204(理论值448.52916)。

实施例4制备本发明化合物之四：

嘧啶丙氨酸酰胺(RNH-Ala-OH)

把产品RNH-BOC-Ala-OH0.448g(0.001mol)与混合液(三氟乙酸∶CH₂Cl₂＝1∶1)10ml置于50ml的圆底烧瓶中搅拌两小时后，减压蒸除溶剂后呈油状物，加入少量水，用饱和碳酸氢钠溶液中和(有白色沉淀和气泡生成)，用CH₂Cl₂提取三次，每次20ml，合并CH₂Cl₂液，用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，得白色固体嘧啶丙氨酸酰胺(RNH-Ala-OH)0.20g，熔点：142-144℃，MS：348；HRMS：348.1675(理论值348.41085)。

实施例5.本发明化合物之五：

嘧啶N-叔丁氧羰基异亮氨酸酰胺(RNH-Boc-Ile-OH)

N-叔丁氧羰基异亮氨酸(Boc-Ile-OH)0.462g(0.0020mol)，HOBt0.245g(0.0020mol)，氯仿15ml，在50ml圆底烧瓶中，冰水浴冷却至0-5℃，加入DCC0.38g(0.0020mol)和三乙胺0.2g(0.0020mol)搅拌15分钟后，再滴加含有RNH₂0.545g，(0.0022mol)和三乙胺0.2g(0.0020mol)的10ml氯仿溶液，搅拌过夜。反应完毕，过滤后滤液分别用5％的碳酸氢钠溶液、蒸馏水洗涤三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得N-叔丁氧羰基异亮氨酸酰胺(RNH-Ile-Boc-OH)0.78g，熔点：132-133℃；MS：490；HRMS：490.3576(理论值490.61043)。

实施例6.备本发明化合物之六：

嘧啶异亮氨酸酰胺(RNH-Ile-OH)

把实施例5所得的RNH-Ile-Boc-OH 0.49g(0.001mol)与混合液(三氟乙酸∶CH₂Cl₂＝1∶1)14ml置于50ml的圆底烧瓶中搅拌两小时后，减压蒸除溶剂后呈油状物，加入少量水，用饱和碳酸氢钠溶液中和(有白色沉淀和气泡生成)，用CH₂Cl₂提取三次，每次20ml，合并CH₂Cl₂液，用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，得白色固体嘧啶异亮氨酸酰胺(RNH-Ile-OH)0.24g，熔点：138-139℃，MS：390；HRMS：390.3712(理论值390.49212)。

实施例7制备本发明化合物之七：

嘧啶N-叔丁氧羰基亮氨酸酰胺(RNH-Boc-Leu-OH)

N-叔丁氧羰基亮氨酸(RNH-Boc-Leu-OH)0.213g(0.0015mol)，HOBt0.184g(0.0015mol)，氯仿10ml，在50ml圆底烧瓶中，冰水浴冷却至0-5℃，加入DCC0.285g(0.0015mol)和三乙胺0.15g(0.0016mol)搅拌15分钟后，再慢慢滴加含有RNH₂0.41g(0.0015mol)和三乙胺0.15g(0.0015mol)的氯仿10ml，搅拌过夜。反应完毕，过滤后滤液分别用5％的碳酸氢钠溶液、蒸馏水洗涤三次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得嘧啶N-叔丁氧羰基亮氨酸酰胺(RNH-Boc-Leu-OH)0.52g，熔点：181-182℃；MS：490；HRMS：490.4235(理论值490.61043)。

实施例8制备本发明化合物之八：

嘧啶亮氨酸酰胺(RNH-Leu-OH)

把实施例7所得的产品RNH-Boc-Leu-OH 0.49g(0.001mol)与混合液(三氟乙酸∶CH₂Cl₂＝1∶1)14ml置于50ml的圆底烧瓶中搅拌两小时后，减压蒸除溶剂后呈油状物，加入少量水，用饱和碳酸氢钠溶液中和(有白色沉淀和气泡生成)，用CH₂Cl₂提取三次，每次20ml，合并CH₂Cl₂液，用无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，得白色固体产品(RNH-Ile-OH)0.20g，熔点：147-150℃，MS：390；HRMS：390.5123(理论值390.49212)。

实施例9.制备嘧啶丙氨酸酰胺(RNH-Ala-OH)甲烷磺酸盐：

将实施例4制备的化合物嘧啶丙氨酸酰胺(RNH-Ala-OH)3.48克(0.01mol)加到70ml乙醇中。在该淡黄色悬浮液中，加入0.96克(0.01mol)甲烷磺酸，20分钟加完，然后加热回流20分钟，在65℃过滤，将滤液浓缩到原来体积的50％，浓缩液在25℃下过滤，得固体A。将母液浓缩至干，得残留物B。将A和B悬浮在110ml乙醇和1.5ml蒸馏水组成的混合溶剂中，回流溶解，放冷25℃过夜，过滤得晶体并在65℃干燥直至恒重。得到嘧啶丙氨酸酰胺(RNH-Ala-OH)甲烷磺酸盐结晶2.52克。

本发明其它化合物及其盐类的制备方法与上述实施例类同。

本发明化合物酪氨酸激酶活性测定实验

一、试验材料与试剂

酶反应底物Poly(Glu，Tyr)_4∶1(Sigma公司)；钒酸钠(Sigma公司)；ATP-Na₂(Amresco公司)；抗磷酸化酪氨酸单抗PY99(Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(Calbiochem公司)；HRP底物OPD(Amresco公司)；96孔酶标板(Corning公司)；N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)(Amresco公司)。待测化合物为本发明制备的化合物，分别为RNH-Boc-Val-OH、RNH-Val-OH和RNH-Boc-Ile-OH，配制成10^-4M浓度。

反应缓冲液按下表配制：

试剂       母液浓度      终浓度

HEPES

            1.04M         50mM

(pH7.4)

MgCL₂     100mM         20mM

MnCL₂     100mM         0.2mM

Na₃VO₄   50mM          0.2mM

DTT         1M            1mM

H₂O             补足体积

二、实验步骤

1.酶反应底物Poly(Glu，Tyr)_4∶1用PBS(pH7.2-7.4)稀释成20μg/ml，125μl/孔包被96孔酶标板，置37℃反应12-16小时，弃去孔中液体。

2.洗板，用200μl/孔的T-PBS(含0.1％Tween-20的PBS)洗板三次，每次5分钟。

3.于37℃烘箱中干燥96孔酶标板1-2小时。

4.每孔加入浓度为10μM的ATP 80μl，待测化合物10μl(终浓度为10^-5M)，最后加入用反应缓冲液稀释的血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)酪氨酸激酶酶液10μl(0.5μg酶蛋白)，启动反应，置37℃摇床反应1小时。(在实验中，ATP的中浓度为8μM，PDGFR-β为每孔1ul。实验为复孔。实验中设无底物，无酶，无ATP，相应浓度的DMSO对照。T-PBS洗板三次。)

5.加入抗磷酸化酪氨酸抗体PY99 100μl/孔，(用含BSA5mg/ml的T-PBS稀释，稀释度1∶500)，25℃摇床反应1小时或者37℃30分钟。T-PBS洗板三次。

6.加入二抗羊抗小鼠IgG-HRP 100μl/孔(用含BSA5mg/ml的T-PBS稀释，稀释度1∶2000)，25℃摇床反应1小时或者37℃30分钟。T-PBS洗板三次。

7.加显色液(含2mg/ml OPD，0.03％H₂O₂的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH＝5.4)100μl/孔，25℃避光反应，反应时间视颜色而定(约4分钟)。

8. 2M H₂SO₄ 50μl/孔终止反应，OD₄₉₀nm测定。

三、抑制率的计算公式：

其中：

化合物孔OD值：本发明化合物所测的各个OD值减去空白孔所得到的OD值；

阴性对照孔OD值：不加酶实验孔的OD值；

无药物作用的对照孔OD值：含相应浓度DMSO实验孔的OD值。

四、PDGFR-β酪氨酸激酶活性抑制体外筛选试验测定结果

本发明化合物在浓度为10^-5M条件下，作用1小时，对PDGFR-β酪氨酸激酶活性有不同程度的抑制作用，其中RNH-Boc-Val-OH的抑制作用最强，达到51.5％。

         对PDGFR-β酪氨酸激酶活性的抑制率(％)

         样品                    浓度(10^-5M)

         RNH-Boc-Val-OH          51.5

         RNH-Val-OH              41.7

         RNH-Boc-Ile-OH          12.6

上述结果表明，本发明化合物对酪氨酸激酶活性具有明显的抑制作用，因而可用于制备抗肿瘤药物。

Claims (16)

1.一种嘧啶羧酸酰胺类化合物，分子结构通式如下：

其中R¹表示H；C₁-C₄直链烷基或支链烷基；其它天然氨基酸，R²表示H；乙酰基；丙酰基；苄氧羰基；叔丁氧羰基。

2.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所说的R¹选自甲基，异丙基，异丁基，仲丁基；所说的R²选自苄氧羰基，叔丁氧羰基。

3.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所说的R²为氢。

4.按权利要求2所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所说的R¹为异丙基，R²为叔丁氧羰基，该化合物为嘧啶N-叔丁氧羰基缬氨酸酰胺。

5.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所说的R¹为异丙基，R²为氢，该化合物为嘧啶缬氨酸酰胺。

6.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所说的R¹为甲基，R²为叔丁氧羰基，该化合物为嘧啶N-叔丁氧羰基丙氨酸酰胺。

7.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所说的R¹为异丙基，R²为氢，该化合物为嘧啶丙氨酸酰胺。

8.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所说的R¹为仲丁基，R²为叔丁氧羰基，该化合物为嘧啶N-叔丁氧羰基异亮氨酸酰胺。

9.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所选的R¹为仲丁基，R²为氢，该化合物为嘧啶异亮氨酸酰胺。

10.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所选的R¹为异丁基，R²为叔丁氧羰基，该化合物为嘧啶N-叔丁氧羰基亮氨酸酰胺。

11.按权利要求1所述的嘧啶羧酸酰胺类化合物，所选的R¹为异丁基，R²为氢，该化合物为嘧啶亮氨酸酰胺。

12.权利要求1至11所述的任何一种化合物的药学上可接受的盐。

13.权利要求12所述化合物的盐，选自盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、甲烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

14.权利要求1至11所述的任何一种化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

15.权利要求12所述化合物的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

16.权利要求13所述的任何一种化合物的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。