CN1626507A

CN1626507A - 新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1626507A
Application number: CN 200310105292
Authority: CN
Inventors: 秦松; 李富超; 阿甄达·皮·马斯克; 哈特马特·拉赤
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2003-12-08
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2005-06-15
Anticipated expiration: 2023-12-08
Also published as: CN1296347C

Abstract

本发明属医药技术领域，具体公开一种新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物及其制备方法和应用。它是将海洋链霉菌Streptomyces sp.，经发酵积累粗提物，利用硅胶层析等多种层析方法分离得到，命名为chinikomycin A和B。体外抗肿瘤活性实验证明：本发明化合物对包括肺癌细胞系LXFA 629L和LXFL 529L，乳腺癌细胞系MAXF 401NL，黑色素瘤细胞系MEXF 462NL，肾肿瘤细胞系RXF 944L和子宫癌细胞系UXF 1138L等人体肿瘤细胞有抑制作用。本发明能对开发利用我国丰富的海洋微生物资源提供可借鉴的模式。

Description

新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体地说是一种新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物及其制备方法和应用。

背景技术

自二十世纪三十年代青霉素被发现以来，微生物成为活性先导化合物的重要来源。但是近年来，从土壤微生物中分离到新结构活性化合物的概率大幅度下降，例如目前通常从两万多株土壤微生物中才能筛选到一株能产生新结构活性化合物的菌株。再如，在所有已知的微生物次级代谢产物中，绝大部分来自土壤中的放线菌Actinomycetes，特别是其中的链霉菌属Streptomyces；然而目前的研究现状是：在90％的有生物活性的链霉菌中，人们很难找到新的化合物，尤其是新骨架化合物，而且这个可能性还在直线下降(文献1：Fencial，W.，Chemical Studies of Marine Bacteria：Developinga New Resource，Chem.Rev.，1993，93：1673-1683)。

在耐药菌广泛出现后，尤其是近年来由于环境恶化和人口流动造成抗药性产生周期日趋缩短的问题，加之耐受药物的种类日益增多，使得人们对新型抗生素的需求比以往任何时候都更加迫切。随着恶性肿瘤发病率的不断提高，对新型抗肿瘤抗生素的需求也日益迫切。二十世纪人们将目光转向蕴藏着丰富微生物资源的海洋，海洋生态环境的特殊性和多样性，决定了海洋微生物种类及其次级代谢产物的多样性，从海洋微生物发现具有抗肿瘤和抑菌作用的先导化合物，成为发现新生物活性物质的一条解决途径。分别来自意大利撒丁岛和日本相模湾的两株海洋微生物所贡献的头孢霉素C和小诺(相模)霉素，充分说明了海洋微生物在产生活性先导化合物方面的潜力。特别是近年来欧美、日本等发达国家加大了对海洋微生物活性物质研究的投入力度，取得了显著进展(文献2：Marwick，J.D.，et al.，Bioprocess Intensification for Production of Novel Marine Bacterial AntibioticsThrough Bioreactor Operation and Design，Marine Biotechnology，1999，1(5)：495-507；文献3：Jensen，P.R.，et al.，Strategies for the Discovery of SecondaryMetabolites from Marine Bacteria：Ecological Perspectives，Annu.Rev.Microbiol，1994，48：559-584)。

同陆地放线菌产生抗生素相似，海洋微生物中的海洋放线菌也是新型抗生素的重要来源。从海洋链霉菌Streptomyces sioyaensisSA-1758中分离到的结构新颖、含硫和氮的生物碱altemicidin，具有单萜骨架，显示强体外抗L1210淋巴瘤和IMC癌细胞活性，IC₅₀分别为0.84和0.82μg/ml，但它对小鼠也有毒性(LD₅₀＝0.3μg/ml)。(文献4：Takahashi，A.，et al.，Altemicidin，a new acaricidal and antitumor substance I，Taxonomy，fermentation，isolationand physico-chemical and biological properties，J.Antibiot.，1989，42(11)：1556-1561；文献5：Takahashi，A.，et al.，Altemicidin，a new acaricidal andantitumor substance II，Structure determination，J.Antibiot.，1989，42(11)：1562-1566)。分离自珊瑚Pacifigotgio sp.体表的链霉菌PG-19，从中得到两个八元环内酯octalactins A和B，octalactins A在体外对B16-F10黑色素瘤细胞及人结肠癌HCT-116细胞有显著细胞毒性(IC₅₀分别为7.2×10^-3μg/ml，0.5μg/ml)，而octalactins B无细胞毒性，这说明环氧结构是必需的活性基团。(文献6：Fenical，W.，and Jensen，P.R.，In Marine Biotechnology，Volume1：Pharmaceutical and Bioactive Natural Products；Attaway，D.H.，Zaborsky，O.R.，Eds.；Plenum Press：New York，1993；pp 419-457)。

Zeeck等(文献7：Zeeck，A.，et al.，The Structure of Manumycin，I.Characterization，Structure Elucidation and Biological Activity，J.Antibiot.1987，11：1530-1540)从一株链霉菌Streptomyces.parvulus中分离得到抗生素manumycin(C₃₁H₃₈N₂O₇)，它对革兰氏阳性细菌以及真菌有很强的抑制作用。本发明所涉及的化合物chinikomycin的新颖碳骨架结构迄今为止，尚未发现有专利或文献报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物，有如下化学结构：

或

式中，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶为氢、羟基、烃基、芳基、芳烃基、卤代烃基、酰基、烷氧基、醛基、卤素、氨基、烃氨基、酰胺基、硫、巯基、磺酸基或羧酸基；其中化学结构可以为：

命名为chinikomycin A；或

命名为chinikomycin B。

其制备方法如下：

(1)固体培养：将海洋链霉菌Streptomyces sp.接种于M²⁺固体培养基，25～40℃培养3～4天，直至长出白色的孢子；

(2)摇床培养：接种所述白色孢子丝到鱼粉液体培养基，25～40℃温度下进行摇床培养，转速为90～130rpm，培养3～4天后，收获发酵液；

(3)萃取：发酵液用有机溶剂浸提3～4次，浓缩蒸干，得到膏状粗提物；

(4)纯化：粗提物用环己烷浸提，溶解部分为提取物I，不溶解部分为提取物II；然后分别进行如下操作：

1)提取物I经硅胶层析柱，用环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱，得到含有化合物chinikomycin A的组分，再用环己烷洗2～3次，获得黄色活性化合物chinikomycin A；

2)提取物II经硅胶柱层析，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，得到含有活性化合物的组分，再用环己烷和二氯甲烷洗涤2～3次，得到黄色粉末状不溶物质，经过制备型薄层层析(Preparative Thin Layer Chromatography，PTLC)，于R_f＝0.58处得到红色化合物chinikomycin B，并回收R_f＝0.34处黄色化合物chinikomycin A；

其中：本发明采用纯化步骤(4)中所得产物chinikomycin A可被氧化为产物chinikomycin B，即将产物chinikomycin A用二氯甲烷溶解，缓缓加入氧化银，搅拌，反应直至溶液颜色由黄色完全变为红色，蒸干溶剂后，再用二氯甲烷溶解，弃去沉淀不溶物，溶解部分经过制备型薄层层析(PTLC)，回收R_f＝0.58处的红色化合物，即为chinikomycin B；

另外，采用纯化步骤(4)中所得产物chinikomycin B可还原为chinikomycin A，即：将产物chinikomycin B用二氯甲烷溶解，再缓缓加入连二亚硫酸钠溶液，振荡至溶液颜色由红色变为黄色，利用薄层层析(ThinLayer Chromatography，TLC)分析，R_f＝0.34处反应产物，即为黄色化合物chinikomycin A；

本发明所述浸提发酵液用有机溶剂可以为乙酸乙酯或甲醇；按体积百分比计，二氯甲烷/环己烷洗涤用量比例为15/85～40/60；用二氯甲烷/甲醇，环己烷/乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱方式按体积百分比计为100/0～0/100；二氯甲烷和甲醇在100/0～90/10梯度下的洗脱为佳，环己烷和乙酸乙酯在50/50～0/100梯度下的洗脱为佳；所述制备型薄层层析(PTLC)所用展开剂为二氯甲烷/甲醇，体积用量比例为95/5～90/10。

本发明新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物可应用于制备抗肿瘤、抗菌、抗病毒药物。

本发明具有如下优点：

1.本发明所涉及的化合物chinikomycin的碳骨架为新颖结构，迄今为止，尚未发现有专利或文献报道。

2.本发明充分利用我国尚未深入研究开发的丰富的海洋微生物资源，寻找到一种化学结构新颖的化合物，它具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒活性，对包括肺癌细胞系LXFA 629L和LXFL 529L，乳腺癌细胞系MAXF 401NL，黑色素瘤细胞系MEXF 462NL，肾肿瘤细胞系RXF 944L和子宫癌细胞系UXF 1138L等人体肿瘤细胞有抑制作用；为临床提供了新型药物或先导化合物。

附图说明

图1为本发明新碳骨架抗肿瘤抗生素chinikomycin A，B的烃酰胺侧链(Ia)的HMBC(→)和NOESY()效应。

图2为本发明新碳骨架抗肿瘤抗生素chinikomycin A(Ib)，B(Ic)碳骨架结构的HMBC(→)和H，H COSY()效应。

图3为本发明新碳骨架抗肿瘤抗生素chinikomycin A，B的制备流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例详述本发明。

实施例1

制备新碳骨架抗肿瘤抗生素chinikomycin A和B(制备流程图参见图3)：

(1)样品采集：从青岛近海采集海泥样品，在实验室中利用高氏一号培养基(可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，重铬酸钾0.1g，琼脂粉18g，天然海水500ml，自来水500ml，调整pH为7.2)进行梯度稀释划线培养，纯化得到一株海洋链霉菌Streptomyces sp.；

(2)固体培养：将所述海洋链霉菌Streptomyces sp.接种于M²⁺固体培养基(大麦提取物10g，酵母粉4g，葡萄糖4g，天然海水500ml，自来水500ml，琼脂粉14g，调整pH为7.4)，28℃培养3天，直至长出白色的孢子；

(3)摇床培养：从所述M²⁺固体培养基上挑取白色孢子丝接种到60个1000ml的Erlenmeyer三角瓶中，每个三角瓶中含有已灭菌的250ml鱼粉液体培养基(鱼粉5g，小麦粉10g，酵母粉1g，葡萄糖21g，硫酸镁0.5g，氯化钠1g，氯化钙0.5g，微量元素溶液10ml，天然海水500ml，自来水500ml，调整pH为6.4)，35℃下回旋式摇床培养，转速为120rpm，4天后，收获发酵液；

其中：微量元素溶液成分：硫酸亚铁10.2g，氯化钴0.04g，氯化钙0.04g，氯化锰0.04g，硫酸锌0.08g，硼酸钠0.08g，钼酸钠0.74g，溶解于500ml蒸馏水；

(4)有机溶剂萃取：发酵液通过板式过滤器分开菌液与菌泥，分别用乙酸乙酯浸提4次，合并有机溶剂相，旋转蒸发仪旋转浓缩蒸干，得到膏状粗提物14g；

(5)分离纯化：用250ml环己烷浸提粗提物，溶解部分为提取物I，不溶解部分为提取物II；然后分别作如下操作：

1)提取物I经硅胶柱层析，用环己烷和乙酸乙酯梯度(100/0～0/100)洗脱，在环己烷与乙酸乙酯(50/50～0/100)梯度下，得到含有化合物chinikomycinA的组分，用50ml环己烷洗涤两次，获得产物chinikomycin A(100mg)；

2)提取物II经硅胶柱层析，二氯甲烷与甲醇梯度(100/0～0/100)洗脱，100％二氯甲烷洗脱得到组分a(80mg)，二氯甲烷与甲醇(99.5/0.5～98/2)梯度下得到组分b(325mg)，二氯甲烷与甲醇(95/5～90/10)梯度下得到组分c(414mg)，取所述组分b用含有25％二氯甲烷的环己烷25ml洗涤两次，得到黄色粉末状不溶物质，经过制备型薄层层析(PTLC，层析板为20×20cm，展开剂为95％二氯甲烷与5％甲醇)，于R_f＝0.34处得到产物chinikomycin A(50mg)，于R_f＝0.58处得到红色化合物chinikomycin B(3.5mg)；

chinikomycin A化学结构如下：

chinikomycin B的化学结构如下：

所述chinikomycin A和B的物理常数、核磁共振氢谱数据、核磁共振碳谱数据分别参见表1～3。

表1所述chinikomycin A和chinikomycin B的物理常数

	chinikomycin A	chinikomycin B
	chinikomycin A	chinikomycin B	PropertiesR_f(CH₂Cl₂/5％MeOH)Molecular formulaEI HRMS(+)-ES-MS(-)-ES-MSIR(KBr)νcm^-1UV/VIS(MeOH)：λ_max(lgε)	黄褐色粉末固体0.34C₃₁H₃₇ClN₂O₆568.2326(calc.568.197629)615([M+2Na-H]⁺¹，5)，613([M+2Na-H]⁺¹，25)，615([M+Na]⁺¹，32)，613([M+Na]⁺¹，100)569([M-H]^-1，52)，567([M-H]^-1，100)3425，2965，2924，2851，1657，1620，1538，1501，1383，1319，1228，1173，1084，1008，873，662，546260(4.46)，335(s，4.46)，395(4.62)	红色固体0.58C₃₁H₃₅ClN₂O₆566.2290(calc.566.181979)611([M+2Na-H]⁺¹)568([M-H]^-1，29)，566([M-H]^-1，100)3425，2963，2923，2857，1655，1620，1502，1457，1382，1318，1297，1233，1173，1121，1083，1035，1008，874，851，653，546261(4.68)，344(4.72)，500(3.98)

表2所述chinikomycin A和chinikomycin B的核磁共振氢谱数据

(δvalues，J＝[Hz])

H No. A^a B^b

3-H 7.47(s) 7.60(s)

7-H 6.97(d，15.5) 6.83(d，15.6)

8-H 7.45(dd，15.5，11.1) 7.80(dd，15.6，10.0)

9-H 6.86(dd，15.1，11.1) 6.73(dd，14.8，10.1)

10-H 6.49(dd，14.6，11.2) 6.68(dd，14.8，10.3)

11-H 7.26(dd，15.1，11.2) 7.37(dd，14.8，10.3)

12-H 6.51(d，14.6) 6.28(d，14.8)

CONH 9.86(s) 8.13(s)

Ar-NH 9.12(s) 8.60(s)

1-OH 9.06(s) -

4-OH 10.04(s) -

4′-H₂ 2.53(m) 2.56(s，br)

5′-H₂ 2.53(m) 2.62(s，br)

3′-OH 13.90(s，br) 13.64(s，br)

3″-H 6.82(s) 6.86(s)

5″-H 5.36(d，9.5) 5.40(d，9.7)

6″-H 2.51(m) 2.45(m)

7″-H₂ 1.4～1.2(m) 1.4～1.2(m)

8″-H₂ 1.4～1.2(m) 1.4～1.2(m)

9″-H₂ 1.4～1.2(m) 1.4～1.2(m)

10″-H₃ 0.88(t，6.8) 0.86(t，7.0)

2″-Me 2.03(s) 2.08(s)

4″-Me 1.82(s) 1.83(s)

6″-Me 0.96(d，6.8) 0.97(d，6.5)

^aDMSO-d₆，^bCDCl₃

表3所述chinikomycin A和chinikomycin B的核磁共振碳谱数据

(δvalues)

C No. A^a B^b C No. A^a B^b

1 136.8 176.3 4′ no 32.1

2 128.6 137.7 5′ no 25.6

3 107.6 114.7 1″ 168.3 168.3

4 150.3 185.2 2″ 128.5 127.6

5 117.0 138.4 3″ 138.7 141.8

6 122.2 135.0 4″ 130.0 129.9

7 130.4 127.3 5″ 141.6 144.2

8 132.8 144.3 6″ 32.1 32.9

9 143.0 141.5 7″ 36.4 37.0

10 129.8 136.3 8″ 29.2 29.7

11 142.6 142.8 9″ 22.2 22.8

12 121.0 123.7 10″ 13.9 14.0

13 166.1 165.2 2″-Me 14.1 14.1

1′ no 197.5 5″-Me 16.3 16.4

2′ 114.9 115.1 6″-Me 20.6 20.6

3′ no 174.6

no＝not observed，^aDMSO-d₆，^bCDCl₃

实施例2

由chinikomycin A氧化为chinikomycin B：

取20mg的产物chinikomycin A，加入到反应瓶中，用50ml二氯甲烷溶解(本实施例为刚好溶解)，缓缓加入约1g氧化银(它相对于溶液中的chinikomycin A是过量的)，搅拌，反应约3小时，溶液颜色由黄色完全变为红色，旋转蒸干，用6ml二氯甲烷溶解(本实施例为充分溶解)，弃去沉淀不溶物，溶解部分进行制备型薄层层析(PTLC)，以95％二氯甲烷/5％甲醇为展开剂，回收R_f＝0.58处的红色化合物7mg，通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱、红外光谱和紫外光谱分析，确定了该化合物的化学结构，为chinikomycin B。

实施例3

由chinikomycin B还原为chinikomycin A：

在试管中，加入0.5mg的chinikomycin B，用2ml二氯甲烷溶解，再缓缓加入1ml0.1N连二亚硫酸钠溶液，振荡直至溶液颜色由红色变为黄色，利用薄层层析(TLC)分析，R_f＝0.34处黄色化合物即是chinikomycinA。

对化合物chinikomycin A和chinikomycin B做二维核磁共振波谱分析，进一步验证了化合物chinikomycin A和chinikomycin B的结构，其烃酰胺侧链的HMBC(→)和NOESY()效应参见图1，碳骨架的HMBC(→)和H，H COSY()效应参见图2。

实施例4

chinikomycinA和chinikomycin B的抗肿瘤活性实验：

抗肿瘤活性实验由德国BIOLEADS生物公司进行测定，选用人体肿瘤细胞系(Human Cancer Cell Lines)，包括肺癌细胞系LXFA 629L和LXFL529L(lung carcinoma cell)，乳腺癌细胞系MAXF 401NL(breast cancer cell)，黑色素瘤细胞系MEXF 462NL(melanoma cell)，肾肿瘤细胞系RXF 944L(renal carcinoma cell)和子宫癌细胞系UXF 1138L(uterus cancer cell)。实验结果表明：chinikomycin A和B的有效浓度IC₇₀分别为5.6μg/ml和5.9μg/ml，表现出抗肿瘤活性。

Claims

1.一种新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物，其特征在于：具有如下化学结构：

或

式中，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶为氢，羟基，烃基，芳基，芳烃基，卤代烃基，酰基，烷氧基，醛基，卤素，氨基，烃氨基，酰胺基，硫，巯基，磺酸基或羧酸基。

2.权利要求1所述新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物，其特征在于，具有如下化学结构：

命名为chinikomycin A，或

命名为chinikomycin B。

3.一种新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物的制备方法，其特征在于按如下步骤操作：

2)提取物II经硅胶柱层析，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱，得到含有活性化合物的组分，再用环己烷和二氯甲烷洗涤2～3次，得到黄色粉末状不溶物质，经过制备型薄层层析，于R_f＝0.58处得到红色化合物chinikomycin B，并回收R_f＝0.34处黄色化合物chinikomycin A。

4.按权利要求3所述新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物的制备方法，其特征在于：纯化步骤(4)中所得产物chinikomycin A可被氧化为产物chinikomycin B，即将产物chinikomycin A用二氯甲烷溶解，缓缓加入氧化银，搅拌，反应直至溶液颜色由黄色完全变为红色，蒸干溶剂后，再用二氯甲烷溶解，弃去沉淀不溶物，溶解部分经过制备型薄层层析，回收R_f＝0.58处的红色化合物，即为chinikomycin B。

5.按权利要求3所述新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物的制备方法，其特征在于：其中纯化步骤(4)中所得产物chinikomycin B可还原为chinikomycinA，即：将产物chinikomycin B用二氯甲烷溶解，再缓缓加入连二亚硫酸钠溶液，振荡至溶液颜色由红色变为黄色，利用薄层层析分析，R_f＝0.34处反应产物，即为化合物chinikomycin A。

6.按权利要求3所述新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物的制备方法，其特征在于：所述浸提发酵液用有机溶剂可以为乙酸乙酯或甲醇；按体积百分比计，二氯甲烷/环己烷洗涤用量比例为15/85～40/60。

7.按权利要求3所述新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物的制备方法，其特征在于：用二氯甲烷/甲醇，环己烷/乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱方式按体积百分比计为100/0～0/100。

8.按权利要求3所述新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物的制备方法，其特征在于：二氯甲烷和甲醇在100/0～90/10梯度下的洗脱为佳，环己烷和乙酸乙酯在50/50～0/100梯度下的洗脱为佳。

9.按权利要求3所述新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物的制备方法，其特征在于：所述制备型薄层层析所用展开剂为二氯甲烷/甲醇，体积用量比例为95/5～90/10。

10.一种新碳骨架抗肿瘤抗生素化合物的应用，其特征在于：作为制备抗肿瘤、抗菌、抗病毒药物。