CN1604911A - Hiv转录阻遏物及其方法 - Google Patents
Hiv转录阻遏物及其方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1604911A CN1604911A CN02808525.6A CN02808525A CN1604911A CN 1604911 A CN1604911 A CN 1604911A CN 02808525 A CN02808525 A CN 02808525A CN 1604911 A CN1604911 A CN 1604911A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ala
- gly
- lys
- pro
- ser
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及抑制获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)病毒基因组(RNA)产生的阻遏物以及抑制其转录的方法。更具体的,本发明涉及抑制艾滋病病毒基因组(RNA)的、由选自包括强有力抑制蛋白例如Spl、NF-kB的活性的蛋白、通过强有力浓缩染色质抑制转录活动的蛋白、以及能够在艾滋病病毒启动子附近结合的蛋白的组的蛋白与识别短RNA链(TAR)的蛋白(例如Tat或Tat衍生物)构成的融合蛋白,以及利用他们抑制转录的方法。所说的融合蛋白利用识别短RNA链的蛋白作为载体,通过释放阻遏蛋白如Spl、NF-kB到HIV-1LTR表现出显著的抑制HIV-1基因组(RNA)产生的效果。本发明通过靶向转录-抑制融合蛋白到HIV LTR而表现出对HIV的转录抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及抑制获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)病毒基因组(RNA)自前病毒或长末端重复序列(LTR)启动子产生的阻遏物。更具体的,本发明涉及抑制艾滋病病毒基因组(RNA)转录的融合蛋白,包含选自下列组的多肽序列:强有力抑制蛋白活性的蛋白例如Sp1或NF-kB;通过强有力浓缩染色质抑制转录的蛋白;能够结合艾滋病病毒启动子的蛋白例如锌指蛋白;以及识别短RNA链(HIV短转录本)的多肽序列(如Tat蛋白或Tat衍生物)。
当强有力抑制蛋白活性的蛋白例如Sp1或NF-kB以及通过强有力浓缩染色质抑制转录的蛋白作为发射物通过短RNA链识别蛋白(如Tat蛋白和其突变体)被靶向到HIV-1 LTR启动子表达调控区附近的时候,该融合蛋白对抑制人免疫缺陷病毒(HIV)-1 RNA的产生具有显著的效果。
技术背景
一般而言,HIV入侵公知需要病毒包膜蛋白(GP120)和细胞膜表面受体的结合。在结合之后,病毒与细胞融合并将其病毒物质注入细胞。融合后,病毒基因组(RNA)通过反转录酶转变为DNA。另外,通过整合酶,DNA类型的病毒基因组随之整合到宿主细胞的DNA中,在那里它作为“前病毒”存在于细胞的一生中。前病毒HIV基因组利用宿主细胞的表达系统产生基因组RNA(转录步骤),并利用病毒基因组大量产生在胞质中增殖(翻译以及蛋白剪切、蛋白酶功能)所必需的成分(蛋白、衣壳)。在装配步骤后,HIV基因组随之从宿主细胞释放并增殖。如果超过临界点,平均每天有100亿新的HIV增殖。因此,感染后爱滋病是无法治愈的。
已研发了许多抑制上述步骤的抗体(疫苗)或化合物抗爱滋病药物。广泛应用的抗爱滋病药物是反转录步骤和蛋白酶的抑制剂。尽管研发了抑制识别宿主细胞步骤的疫苗,但由于病毒包膜蛋白的迅速变异,他们很难抑制HIV。另外,HIV反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂通常也有作用。HIV抑制物、以及多种反转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂已被研发并在许多制药公司销售。他们具有抑制早期HIV生长的效果,但是其存在一些问题例如毒性和快速的抗性。
此外,关于HIV注入宿主细胞或治疗制剂对该步骤的作用机制的研究还不完善。归因于对基因治疗爱滋病的兴趣,反义基因治疗和核酶基因治疗自1997年建立起来。从1997年起就进行了第一阶段的临床实验,但是这种治疗就获得病毒抗性而言具有根深蒂固的问题。
关于病毒RNA生长的表达调控机制的许多研究证明在特定宿主细胞中的转录调控蛋白对于RNA的表达很重要。最近,研究表明与TAK(Tat相关激酶或PTEF)作用的Tat对RNA合成酶的活性具有重大影响。因此,最近的研究焦点集中于抑制Tat或TAK作用的RNA生产抑制剂(例如Tat类似物蛋白片段,TAR类似物RNA片段,TAK抑制剂)。
上文提及的治疗制剂通过减缓疾病的进程能在一定程度上延长生命,但是由于迅速抗性的病毒的产生而失效。那些治疗制剂具有的基本问题是表达的可能性,存在于宿主细胞中的病毒DNA基因组(前病毒)有可能表达成为病毒RNA,因为不管是否有上述的制剂、疫苗和基因治疗,前病毒基因组都能够存在。
因此,克服现存制剂的问题的最好的方式是抑制前病毒LTR表达为基因组RNA的转录步骤。本发明提供了融合蛋白用于抑制HIV转录、调控爱滋病病毒RNA的表达。换言之,本发明的融合蛋白阻止宿主细胞中的病毒DNA基因组表达为病毒RNA基因组,并随之阻断病毒增殖所必需的成分的产生(RNA基因组、蛋白、衣壳),从而基本上抑制病毒的增殖和抗性病毒的产生。因此,本发明克服了常规制剂的问题并提供了一种创新的爱滋病治疗制剂。
发明内容
根据本发明,本发明的一个目的是提供一种新的生物治疗制剂,基本上抑制爱滋病增生所必需的病毒基因组(RNA)并克服病毒抗性,以及一种抑制HIV转录以治疗爱滋病的方法。
为了实现上文提及的目的,本发明提供了一种抑制HIV转录的融合蛋白,包括:一种选自由a)强有力的抑制转录因子例如Sp1或NF-KB的活性;b)通过浓缩染色质抑制转录活动;和c)能结合启动子区(例如,锌指蛋白)组成的组的多肽或化合物;以及一种识别表达调控区附近的RNA链或者病毒启动子顺式作用区的多肽或化合物。
在本发明的融合蛋白中,化合物是通过酶学或化学方法连接于蛋白的识别特定核酸序列的化合物。化合物可以是小分子、核酸类似物或寡聚多糖。
在本发明的融合蛋白中,强有力抑制转录因子例如Sp1或NF-KB的活性、或者通过浓缩染色质抑制转录活动、或者能够结合转录调控启动子的多肽或化合物优选是选自由a)POZ-结构域蛋白;b)HDAC或其激活转录抑制的区域;c)MeCP2或类似物MBP-型蛋白;d)选自由polycom家族蛋白、mSin3A、SMRT和N-CoR组成的组的辅阻遏蛋白;e)Sp1,Sp2,Sp3,Sp4或NF-KB的DNA结合区域多肽;以及f)能在HIV启动子附近结合的蛋白(例如,锌指蛋白)组成的组的多肽或化合物。
识别表达调控区附近的短转录本或者病毒启动子顺式作用区的多肽或化合物优选是SEQ ID NO:1或2中所示的Tat蛋白、它衍生的多肽片段或其突变体。
更优选本发明的融合蛋白是选自由SEQ ID NO:3~10中所示的蛋白组成的组的一个或多个融合蛋白。
本发明还提供了分别编码SEQ ID NO:3~10中所示的多肽的碱基序列SEQ ID NO:11-18。
本发明的一种融合蛋白,SEQ ID NO:1-2中所示的多肽分别是包括73和72个氨基酸的Tat蛋白突变体,SEQ ID NO:3是MeCP2-TatdMT(73aa)融合蛋白的氨基酸序列,SEQ ID NO:4是HDAC 1-TatdMt(73aa)融合蛋白的氨基酸序列,SEQ ID NO:5是POZ-TatdMt(73aa)融合蛋白的氨基酸序列,SEQ ID NO:6是FBI-1-TatdMt(73aa)融合蛋白的氨基酸序列,SEQ ID NO:7是TatdMt(72aa)-MeCP2融合蛋白的氨基酸序列,SEQ ID NO:8是TatdMt(72aa)-HDAC1融合蛋白的氨基酸序列,SEQ ID NO:9是TatdMt(72aa)-POZ融合蛋白的氨基酸序列,而SEQ ID NO:10是TatdMt(72aa)-FBI-1融合蛋白的氨基酸序列。
本发明还提供了SEQ ID NO:11中所示的编码融合蛋白MeCP2-TatdMt(73aa)的碱基序列,SEQ ID NO:12是编码HDAC1-TatdMt(73aa)的碱基序列,SEQ ID NO:13是编码POZ TatdMt(73aa)的碱基序列,SEQ ID NO:14是编码FBI-1-TatdMt(73aa)的碱基序列,SEQ ID NO:15是编码TatdMt(72aa)-MeCP2的碱基序列,SEQ ID NO:16是编码TatdMt(72aa)-HDAc1的碱基序列,SEQ ID NO:17是编码TatdMt(72aa)-POZ的碱基序列,而SEQ IDNO:18是编码TatdMt(72aa)-FBI-1的碱基序列。
本发明提供了抑制HIV增殖的、包括部分或全部这些融合蛋白的组合物。
本发明提供了选自由pcDNA3.0-TatWt、pcDNA3.0-TatMt、pcDNA3.0-FBI-1、pcDNA3.0-MeCP2-TatWt、pcDNA3.0HDAC1-TatWt、pcDNA3.0FBI-1-TatWt、pcDNA3.0-POZ-TatWt、pcDNA3.0TarWt-MeCP2、pcDNA3.0TatWt-HDAC1、pcDNA3.0TatWt-FBI-1、pcDNA3.0TatWt-POZ、pcDNA3.0-MeCP2-TatdMt、pcDNA3.0HDAC1-TatdMt、pcDNA3.0FBI-1-TatdMt、pcDNA3.0-POZ-TatdMt、pcDNA3.0TatdMt-Mecp2、pcDNA3.0TatdMt-HDAC1、pcDNA3.0TatdMt-FBI-1和pcDNA3.0TatdMt-POZ组成的组的一个或多个包含编码上文提及的融合蛋白的基因的重组载体的部分或全部碱基序列。
本发明提供了一种抑制病毒基因组(RNA)的转录的方法,利用对HIV短转录本或启动子调控区(顺式作用元件)具有结合作用的蛋白或物质靶向抑制转录的蛋白或物质。
附图说明
图1为HIV LTR区病毒基因组(RNA)的转录调控示意图。低水平的RNA合成主要由Sp1、NF-κB和TATA框决定。缺陷型的Sp1-结合的GC-框或TATA框阻止转录。如果发生一次转录,则在LTR启动子附近存在HIV短链(短转录本)。如果Tat蛋白结合TAR区域,则PTEF(正转录延伸因子)结合,并且接着CDK9(细胞周期蛋白依赖性激酶9)强有力磷酸化聚合酶II(Po1 II)的CTD(C末端结构域)。结果形成了长链病毒RNA,从而迅速复制HIV。
图2显示了阻遏物-TatWt(包含野生型86个氨基酸的Tat蛋白)融合蛋白的构建(a),而(b)显示了CV-1细胞中瞬时表达的分析结果。与TatWt融合的融合蛋白可能不在转录水平抑制HIV-LTR病毒基因组表达,但该融合蛋白可以被TatWt组分靶向到HIV LTR启动子,从而通过刺激转录延伸而增强表达。
图3显示了(a)阻遏物-TatdMt(含有72或73个氨基酸的突变体,其中Tat蛋白的2个氨基酸序列被突变)的构建,(b)显示了CV-1细胞中瞬时表达的结果,而(c)显示了HeLa细胞中的表达结果,其中HIV-1 LTR启动子象前病毒状态一样被插入到基因组中。与TatdMt融合的融合蛋白在存在300ng TatWt表达质粒时强有力的抑制HIV-LTR病毒基因组的转录,从而可在无Tat时将表达降至低水平。该结果揭示HeLa细胞中象前病毒状态一样的HIV-LTR的转录通过Tat将融合蛋白靶向到TAR区域而被强有力的抑制。
图4显示了TatWt和FBI-1、FBI-1-TatdMt、TatdMt对启动子的功能。FBI-1本身不表现出转录抑制功能。TatdMt仅表现出竞争性抑制功能。当提供等量的FBI-1和TatdMt时,表现出大约50%的抑制功能(b8)。但FBI-1-TatdMt在1ng时表现出抑制功能,并且在3ng时表现出50%的抑制功能。FBI-1-TatdMt在81ng时表现出与不存在TatWt时相同的抑制功能,因此完全抑制TatWt介导的转录。不过,FBI-1-TatdMt在243ng时比不存在TatWt时表现出较低水平的表达抑制。
具体实施方式
本发明将以参照伴随附图详细描述示范性实施方式的方式予以说明,其仅仅是提供用于解释而不是限制本发明的。
HIV RNA合成的调控是复杂的,它需要各种病毒LTR中的顺式作用元件、病毒转录激活子和细胞蛋白之间的相互作用。这种相互作用控制基础水平的RNA转录,并诱导表达高数量的病毒基因。HIV-LTR启动子的转录主要由在不存在病毒蛋白Tat的情况下识别邻近启动子的细胞蛋白Sp1转录因子调控。
诱导激活NF-κB的各种信号通过与位于Sp1-结合的GC-框上游的顺式作用元件相互作用激活转录。其他蛋白(辅因子)通过调控蛋白例如Sp1或NF-κB的活性促进具有潜伏性HIV前病毒的细胞中的转录和复制。
HIV编码的Tat蛋白通过增加转录的起始或延伸激活转录,而且他们对于复制很重要。Tat需要TAR,一种存在于病毒转录本5’端的顺式作用RNA元件。Tat还可高度的促进所有在5’端具有TAR茎环RNA结构的HIV转录本产生病毒RNA。
作为最近研究的结果,Sp1通过锌指DNA结合结构域与HDAC和POZ-结构域的相互作用被抑制,并且还可通过与MeCP2的相互作用被抑制。该研究证明一种称之为FBI-1的POZ-结构域转录因子通过与Sp1和Tat相互作用并结合到HIV-LTR的IST区域(短链诱导区域)抑制HIV转录。这些蛋白与辅阻遏蛋白例如mSin3A、SMRT/N-CoR和HAD相互作用通过浓缩染色质抑制转录。从而,如果这些蛋白被靶向到HIV-1 LTR,可通过阻断Sp1的活性、浓缩HIV启动子附近的染色质以及靶向能够结合启动子区域的多肽来调控Sp1和Tat介导的转录活性。
为了靶向转录抑制蛋白到核心启动子区域,制备了融合转录抑制蛋白与TatWt的表达质粒。本发明的发明人制备了不抑制细胞中HIV LTR(启动子)转录的TatWt融合蛋白,并且TatWt融合蛋白通过该融合蛋白的TatWt组分起着病毒RNA转录激活因子的作用。与TatWt融合的转录抑制蛋白的转录刺激因子功能被认为在转录延伸步骤中的有力作用足以补偿抑制转录起始的抑制剂的作用。不过,尽管融合蛋白包括两种不同的蛋白,其可以通过TatWt组分靶向到TAR。因此,蛋白可用作到核心LTR启动子区域的靶向工具。
因而,本发明利用Tat蛋白突变体(
TatdMt:TatK28A&K50A),它强有力的结合TAR,但是不与TAK(或称之为‘PTEF’),一种转录激活中重要的细胞因子相互作用。
HIV最长的Tat包括101个氨基酸。由于存在许多变化各异的突变体,很难辨别哪种Tat是野生型的。本发明利用Lys-28和Lys-50被替换为丙氨酸的Tat蛋白,并且利用了包含72或73个氨基酸的Tat多肽。不过,除了上文提及的Tat之外,Tat多肽的片段或其他Tat突变体具有与上述相似的功能。
在猿CV-1细胞中,甚至是Tat(300ng表达质粒)过量表达的情况下,TatdMt融合蛋白显著的抑制HIV基因组的转录。该实验结果是关于显性-阴性形式的蛋白的一个划时代性的发现。大多数Tat融合蛋白不管其结合TatdMt的方向如何都具有功能。特别的,HDAC-TatdMt、FBI-1-TatdMt融合蛋白强有力的抑制转录(见图3b)。这种融合蛋白在HIV-1 LTR-氯霉素乙酰基转移酶基因被插入到人基因组的HeLa细胞中强有力的起抑制剂的作用。尽管Tat蛋白本身可46倍的激活转录,MeCP2、HDAC、POZ-或FBI-1-TatdMt融合蛋白强有力的抑制TatWt的转录激活作用,甚至是在300ng TatWt过表达条件下。这些融合蛋白中的HDAC-TatdMt和FBI-1-TatdMt在HeLa细胞中也完全抑制Tat的转录激活作用。这一结果表明融合蛋白可抑制以前病毒状态插入人基因组的HIV的转录,从而有效抑制HIV的增殖。
因为本发明的融合蛋白抑制HIV LTR启动子的转录,而生产病毒复制的所有成分所必需的RNA不能产生,继之而来的必然是抑制病毒蛋白的表达和HIV的复制。
实施例1:TatWt质粒的制备
HIV-1 LTR CAT融合质粒(pUC3R-III CAT)通过克隆大约720bp的HIV-LTR到pCAT-基础质粒中(Promega Co.)予以制备。HIV-1 LTR荧光素酶融合质粒(pUC3R-III-Luc)通过克隆720bp的、用Xho I HidIII限制性内切酶消化的pUC3R-III CAT的片段到pGL3-基础质粒中(Xho I HidIII,Promega Co.)予以制备。
本发明中与Tat(包含86个氨基酸)、TatdMt(包含73个氨基酸)、HDAC1、MeCP2、FBI-1、POZ-结构域以及TatWt或突变体TatdMt(TatK28AK50A)融合的融合蛋白通过PCR法扩增相应的基因、然后将基因克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.0(Inivtorgen)中予以制备。为了制备pcDNA3.0 TatWt(86个氨基酸),该基因通过PCR法扩增,利用模板pET-15b-TATWt(86aa,由韩国Hallym大学的Park Jinseo博士提供,HIVHBX2R型)和
5’引物:GATCGAATTCATGGAGCCAGTACCTAGACTAGAGCCC,
3’引物:GATCTCTAGATCATTCCTTCGGGCCTGTCGGGTCCCCTC。
反应条件如下:模板94℃变性3分钟、30个循环的扩增反应(94℃30秒;60℃1分钟;72℃30秒),随后是72℃3分钟的扩增后反应。在用两个限制性内切酶EcoR I和Xba I对PCR产物和表达载体pcDNA3.0进行消化后,用T4 DNA连接酶连接消化产物,然后通过转化方法引入到E.coliDH5a中,并且用碱裂解法制备pcDNA3.0 TatWt(86个氨基酸)质粒。
下一步,为了制备pcDNA3.0 TatdMt(73aa),利用了与上文提及的方法相似的方法。不过,pcDNA3.0 TatdMt的PCR扩增是利用模板HIV Tat基因(
Kiernan等,EMBO J.18:6106-6118,1999)和
5’引物:GAT CGAATT CAT GGA GCC AGTAAATCC TAG CCTAG,
3’引物:GATCTCTAGATCAGCTTTGATAGAGAAACTTGATG(包含终止密码子)。为了制备X-TatdMT的HDAC、MeCP2、POZ-或FBI-1融合蛋白,非-Tat蛋白用PCR法通过扩增相应的人cDNA、然后将扩增的基因克隆到pcDNA3.0 TatdMt中予以制备。反应条件如下:模板95℃变性3分钟、30个循环的扩增反应(95℃30秒;62℃1分钟;72℃7分钟)以及72℃3分钟的扩增后反应,并且PCR反应利用下列引物进行:
MeCP2
5’引物:GATCGGATCCACCATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAG
3’引物:GATCGAATTCGCTAACTCTCTCGGTCACGGGCGTCCG
HCAC1
5’引物:
GATCAAGCTTACCATGGCGCAGACGCAGGGCACCCGGAGG
3’引物:
GATCGAATTCGGCCAACTTGACCTCCTCCTTGACCCCTTTG
POZ-结构域
5’引物:
GATCAAGCTTACCATGGCCGGCGGCGTGGACGGCCCCATC
3’引物:GATCGAATTCCTGCCGGTCCAGGAGGTCGGCGCACACG
FBI-1
5’引物:
GATCAAGCTTACCATGGCCGGCGGCGTGGACGGCCCCATC
3’引物:GATCAGATTCGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTT.
用BamH I-EcoR I(MeCP2)或HindIII-EcoR I(HDAC 1、POZ、FBI-1)消化扩增产物,然后克隆到pcDNA3.0 TatdMt/BamH I-EcoR I或pcDNA3.0TatdMt/HindIII-EcoR I。
为了制备pcDNA3.0 TatdMt-X的HDAC、MeCP2、POZ-、FBI-1融合蛋白,利用了与上文提及的方法相似的方法。不过,pcDNA3.0 TatdMt(73aa)的PCR扩增是利用模板HIV Tat基因(
Kiernan等,EMBO J.18:6106-6118,1999)和
5’引物:GATCGGATCCACCATGGACGGAGTAAATCCTAGCCTAG
3’引物:GATCGAATTCGGGCTTTGATAGAGAAACTTGATG。
pcDNA3.0 TatdMt-x家族的非-Tat部分在与上文提及的相同的条件下通过扩增相应的人cDNA、并用EcoR I-Xba I消化扩增产物、以及将消化产物克隆到pcDNA3.0 TatdMt/EcoR I-Xba I中予以制备。扩增反应中所用的引物组合如下:
MeCP2
5’引物:GATCGAATTCATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCA
3’引物:GATCTCTAGATCAGCTAACTCTCTCGGTCACGGGC
HDAC1
5’引物:GATCGAATTCATGGCGCAGACGCAGGGCACCCGGA
3’引物:GATCTCTAGATCAGGCCAACTTGACCTCCTCCTTG
POZ-结构域
5’引物:GATCGAATTCATGGCCGGCGGCGGCGTGGACGGCC
3’引物:GATCTCTAGATCACTGCCGGTCCAGGAGGTCGGCG
FBI-1
5’引物:GATCGAATTCATGGCCGGCGGCGGCGTGGACGGCC
3’引物:GATCTCTAGATCAGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTT.
实施例2:瞬时表达分析
CV-1细胞培养于具10%FBS的DMEM培养基中。当细胞生长到足以覆盖培养50-60%的容器底部面积时,用lipopectamin plus试剂(Gibco-BRL)将包含的0.6μg pHIV-LTR-荧光素酶质粒、pCMV-β半乳糖苷酶质粒、TatWt、以及一种选自由HDAC1-TatdMt、MeCP2-TatdMt、FBI-1-TatdMt、POZ-结构域-TatdMt、TatdMt-HDAC1、TatdMt-MeCP2、TatdMt-FBI-1和TatdMt-POZ-结构域组成的组的哺乳动物表达的pCDNA3.0质粒的混合物引入到细胞中。
为在HIV-LTR-CAT插入到基因组中的HeLa细胞中进行抑制基因组表达的实验,用lipopectamin plus试剂(Gibco-BRL)将包括300ng Tat表达质粒和300ng本发明的各种融合蛋白表达质粒的混合物引入到培养于具10%FBS的DMEM培养基中的细胞中。细胞培养24小时,并分析报告基因的表达。利用同时引入和表达的β-半乳糖苷酶标准化质粒引入细胞的效率和回收细胞提取物的偏差。本发明的结果显示于图2~4中。
在图2中,与TatWt融合的融合蛋白可能不在转录水平抑制HIV-LTR基因组的表达,但这些融合蛋白可通过TatWt组份被靶向到HIV LTR启动子区域,从而通过促进转录延伸而增强表达。
在图3中,与TatdMt(含有72或73个氨基酸的突变体,其中Tat蛋白的2个氨基酸序列被突变)融合的融合蛋白在存在300ng TatWt表达质粒时强有力的抑制HIV-LTR基因组的转录,从而在不存在Tat时将表达降至低水平。该结果揭示HeLa细胞中如同前病毒状态的HIV-LTR的转录通过Tat将融合蛋白靶向到TAR区域而被强有力的抑制。
在图4中,FBI-1本身不表现出转录抑制功能。TatdMt仅表现出竞争性结合于同一位点(TAR)的竞争性抑制。当提供等量的FBI-1和TatdMt时,表现出大约50%的抑制功能(b8)。但FBI-1-TatdMt在1ng时表现出抑制功能,并且在3ng时表现出50%的抑制功能。FBI-1-TatdMt在81ng时表现出与不存在TatWt时相同的抑制功能,因此完全抑制介由TatWt的转录。不过,FBI-1-TatdMt在243ng时比不存在TatWt时表现出较低水平的表达抑制。
在细胞核中,宿主细胞蛋白例如Sp1、NF-KB作用于HIV的转录调控区。结果产生短RNA链(短转录本)的病毒RNA,并且它停留在该区域附近(代表结合聚合酶II的RNA链)。如果病毒蛋白例如Tat结合TAR区域,则RNA合成被高度促进。结果大量的病毒基因组(RNA)得以产生,并且利用所生成的病毒基因组(RNA),对于病毒复制所必需的蛋白组份也得以产生。因此,抑制病毒复制最有效的方法是调控Sp1、NF-KB、Tat的功能。
本发明提供了一种方法,通过将该蛋白与选自由抑制转录因子如Sp1、NF-κB的蛋白;辅阻遏物或与辅阻遏物相互作用的蛋白;HDAC、或与HDAC相互作用通过强有力的浓缩染色质而抑制转录活动的蛋白;以及具有病毒启动子区结合活性的蛋白例如锌指蛋白组成的组的蛋白融合,当识别HIV短转录本区域(如TAR)的蛋白被靶向到HIV转录调控启动子区域的时候,可在病毒LTR区强有力的抑制病毒RNA的产生(转录步骤)。
本发明是第一个证明通过靶向转录抑制蛋白组到HIV-LTR强有力的抑制HIV LTR转录活动的方法的研究。通过抑制病毒RNA基因组从作为前病毒状态存在于宿主细胞基因组中的DNA类型的病毒LTR(启动子)表达,本发明还基本上抑制了病毒复制所必需的成分(基因组、蛋白)的产生。因而,本发明可以基本上抑制病毒的增殖和抗性病毒的产生。特别的,HDAC-TatdMt和FBI-1-TatdMt融合蛋白完全封阻了产生病毒基因组的步骤。
所以,本发明克服常规药物的问题的艾滋病治疗制剂是治疗艾滋病有效的蛋白或基因治疗制剂。
序列表
<110> 许晚旭
<120> HIV转录阻遏物及其方法
<150> KR2001-21449
<151> 2001-04-20
<150> KR2002-21307
<151> 2002-04-18
<160> 18
<170> Kopatent In 1.71
<210> 1
<211> 73
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 73个氨基酸Tat突变体
<400> 1
Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe
20 25 30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
35 40 45
Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
50 55 60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Leu Ile
65 70
<210> 2
<211> 72
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 72个氨基酸Tat突变体
<400> 2
Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe
20 25 30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
35 40 45
Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
50 55 60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Leu
65 70
<210> 3
<211> 561
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> MeCP2-Tat dMt融合蛋白
<400> 3
Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln
1 5 10 15
Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys
20 25 30
Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro
35 40 45
Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr
50 55 60
Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser
65 70 75 80
Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp
85 90 95
Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys
100 105 110
Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln
115 120 125
Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys
130 135 140
Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr
145 150 155 160
Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro
165 170 175
Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln
195 200 205
Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met
210 215 220
Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr
225 230 235 240
Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys
245 250 255
Ala Glu Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro
260 265 270
Gly Ser Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val
275 280 285
Lys Glu Ser Ser Ile Arg Ser Val Gln Glu Thr Val Leu Pro Ile Lys
290 295 300
Lys Arg Lys Thr Arg Glu Thr Val Ser Ile Glu Val Lys Glu Val Val
305 310 315 320
Lys Pro Leu Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Lys Ser Gly Lys Gly Leu
325 330 335
Lys Thr Cys Lys Ser Pro Gly Arg Lys Ser Lys Glu Ser Ser Pro Lys
340 345 350
Gly Arg Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Glu His His His
355 360 365
His His His His Ser Glu Ser Pro Lys Ala Pro Val Pro Leu Leu Pro
370 375 380
Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Glu Pro Glu Ser Ser Glu Asp Pro Thr
385 390 395 400
Ser Pro Pro Glu Pro Gln Asp Leu Ser Ser Ser Val Cys Lys Glu Glu
405 410 415
Lys Met Pro Arg Gly Gly Ser Leu Glu Ser Asp Gly Cys Pro Lys Glu
420 425 430
Pro Ala Lys Thr Gln Pro Ala Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Glu
435 440 445
Lys Tyr Lys His Arg Gly Glu Gly Glu Arg Lys Asp Ile Val Ser Ser
450 455 460
Ser Met Pro Arg Pro Asn Arg Glu Glu Pro Val Asp Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480
Val Thr Glu Arg Val Ser Glu Phe Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu
485 490 495
Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn
500 505 510
Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr
515 520 525
Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg
530 535 540
Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Ser Lys Leu
545 550 555 560
Ile
<210> 4
<211> 557
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> HDAC1-TAT dMt融合蛋白
<400> 4
Met Ala Gln Thr Gln Gly Thr Arg Arg Lys Val Cys Tyr Tyr Tyr Asp
1 5 10 15
Gly Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro
20 25 30
His Arg Ile Arg Met Thr His Asn Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr
35 40 45
Arg Lys Met Glu Ile Tyr Arg Pro His Lys Ala Asn Ala Glu Glu Met
50 55 60
Thr Lys Tyr His Ser Asp Asp Tyr Ile Lys Phe Leu Arg Ser Ile Arg
65 70 75 80
Pro Asp Asn Met Ser Glu Tyr Ser Lys Gln Met Gln Arg Phe Asn Val
85 90 95
Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Phe Glu Phe Cys Gln Leu
100 105 110
Ser Thr Gly Gly Ser Val Ala Ser Ala Val Lys Leu Asn Lys Gln Gln
115 120 125
Thr Asp Ile Ala Val Asn Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys
130 135 140
Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Ala Ile
145 150 155 160
Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Gln Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile Asp
165 170 175
Ile His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg
180 185 190
Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr Gly Glu Tyr Phe Pro Gly Thr
195 200 205
Gly Asp Leu Arg Asp Ile Gly Ala Gly Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val
210 215 220
Asn Tyr Pro Leu Arg Asp Gly Ile Asp Asp Glu Ser Tyr Glu Ala Ile
225 230 235 240
Phe Lys Pro Val Met Ser Lys Val Met Glu Met Phe Gln Pro Ser Ala
245 250 255
Val Val Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu Gly
260 265 270
Cys Phe Asn Leu Thr Ile Lys Gly His Ala Lys Cys Val Glu Phe Val
275 280 285
Lys Ser Phe Asn Leu Pro Met Leu Met Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr
290 295 300
Ile Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ala Val Ala Leu
305 310 315 320
Asp Thr Glu Ile Pro Asn Glu Leu Pro Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr
325 330 335
Phe Gly Pro Asp Phe Lys Leu His Ile Ser Pro Ser Asn Met Thr Asn
340 345 350
Gln Asn Thr Asn Glu Tyr Leu Glu Lys Ile Lys Gln Arg Leu Phe Glu
355 360 365
Asn Leu Arg Met Leu Pro His Ala Pro Gly Val Gln Met Gln Ala Ile
370 375 380
Pro Glu Asp Ala Ile Pro Glu Glu Ser Gly Asp Glu Asp Glu Asp Asp
385 390 395 400
Pro Asp Lys Arg Ile Ser Ile Cys Ser Ser Asp Lys Arg Ile Ala Cys
405 410 415
Glu Glu Glu Phe Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gly Glu Gly Gly Arg Lys
420 425 430
Asn Ser Ser Asn Phe Lys Lys Ala Lys Arg Val Lys Thr Glu Asp Glu
435 440 445
Lys Glu Lys Asp Pro Glu Glu Lys Lys Glu Val Thr Glu Glu Glu Lys
450 455 460
Thr Lys Glu Glu Lys Pro Glu Ala Lys Gly Val Lys Glu Glu Val Lys
465 470 475 480
Leu Ala Glu Phe Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys
485 490 495
His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala
500 505 510
Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly
515 520 525
Ile Ser Tyr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
530 535 540
Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Ser Lys Leu Ile
545 550 555
<210> 5
<211> 205
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> POZ-TAT dMt融合蛋白
<400> 5
Met Ala Gly Gly Val Asp Gly Pro Ile Gly Ile Pro Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Ser Ser Asp Ile Leu Ser Gly Leu Asn Glu Gln Arg Thr Gln Gly Leu
20 25 30
Leu Cys Asp Val Val Ile Leu Val Glu Gly Arg Glu Phe Pro Thr His
35 40 45
Arg Ser Val Leu Ala Ala Cys Ser Gln Tyr Phe Lys Lys Leu Phe Thr
50 55 60
Ser Gly Ala Val Val Asp Gln Gln Asn Val Tyr Glu Ile Asp Phe Val
65 70 75 80
Ser Ala Glu Ala Leu Thr Ala Leu Met Asp Phe Ala Tyr Thr Ala Thr
85 90 95
Leu Thr Val Ser Thr Ala Asn Val Gly Asp Ile Leu Ser Ala Ala Arg
100 105 110
Leu Leu Glu Ile Pro Ala Val Ser His Val Cys Ala Asp Leu Leu Asp
115 120 125
Arg Gln Glu Phe Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys
130 135 140
His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala
145 150 155 160
Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly
165 170 175
Ile Ser Tyr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
180 185 190
Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Ser Lys Leu Ile
195 200 205
<210> 6
<211> 659
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> FBI-1-TAT dMt融合蛋白
<400> 6
Met Ala Gly Gly Val Asp Gly Pro Ile Gly Ile Pro Phe Pro Asp His
1 5 10 15
Ser Ser Asp Ile Leu Ser Gly Leu Asn Glu Gln Arg Thr Gln Gly Leu
20 25 30
Leu Cys Asp Val Val Ile Leu Val Glu Gly Arg Glu Phe Pro Thr His
35 40 45
Arg Ser Val Leu Ala Ala Cys Ser Gln Tyr Phe Lys Lys Leu Phe Thr
50 55 60
Ser Gly Ala Val Val Asp Gln Gln Asn Val Tyr Glu Ile Asp Phe Val
65 70 75 80
Ser Ala Glu Ala Leu Thr Ala Leu Met Asp Phe Ala Tyr Thr Ala Thr
85 90 95
Leu Thr Val Ser Thr Ala Asn Val Gly Asp Ile Leu Ser Ala Ala Arg
100 105 110
Leu Leu Glu Ile Pro Ala Val Ser His Val Cys Ala Asp Leu Leu Asp
115 120 125
Arg Gln Ile Leu Ala Ala Asp Ala Gly Ala Asp Ala Gly Gln Leu Asp
130 135 140
Leu Val Asp Gln Ile Asp Gln Arg Asn Leu Leu Arg Ala Lys Glu Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Phe Phe Gln Ser Asn Pro Met Asn Ser Leu Pro Pro Ala Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Phe Pro Trp Ser Ala Phe Gly Ala Ser Asp
180 185 190
Asp Asp Leu Asp Ala Thr Lys Glu Ala Val Ala Ala Ala Val Ala Ala
195 200 205
Val Ala Ala Gly Asp Cys Asn Gly Leu Asp Phe Tyr Gly Pro Gly Pro
210 215 220
Pro Ala Glu Arg Pro Pro Thr Gly Asp Gly Asp Glu Gly Asp Ser Asn
225 230 235 240
Pro Gly Leu Trp Pro Glu Arg Asp Glu Asp Ala Pro Thr Gly Gly Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Pro Val Ala Pro Pro Ala Ala Thr Gln Asn Gly His Tyr
260 265 270
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Glu Ala Ala Ser Leu Ser Glu Ala Ala Pro
275 280 285
Glu Pro Gly Asp Ser Pro Gly Phe Leu Ser Gly Ala Ala Glu Gly Glu
290 295 300
Asp Gly Asp Gly Pro Asp Val Asp Gly Leu Ala Ala Ser Thr Leu Leu
305 310 315 320
Gln Gln Met Met Ser Ser Val Gly Arg Ala Gly Ala Ala Ala Gly Asp
325 330 335
Ser Asp Glu Glu Ser Arg Ala Asp Asp Lys Gly Val Met Asp Tyr Tyr
340 345 350
Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Ala His Asp Gly Asp Val Tyr Pro Ala Trp
355 360 365
Ser Gln Lys Val Glu Lys Lys Ile Arg Ala Lys Ala Phe Gln Lys Cys
370 375 380
Pro Ile Cys Glu Lys Val Ile Gln Gly Ala Gly Lys Leu Pro Arg His
385 390 395 400
Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn Ile Cys Lys
405 410 415
Val Arg Phe Thr Arg Gln Asp Lys Leu Lys Val His Met Arg Lys His
420 425 430
Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Gln Gln Cys Gly Ala Ala Phe Ala
435 440 445
His Asn Tyr Asp Leu Lys Asn His Met Arg Val His Thr Gly Leu Arg
450 455 460
Pro Tyr Gln Cys Asp Ser Cys Cys Lys Thr Phe Val Arg Ser Asp His
465 470 475 480
Leu His Arg His Leu Lys Lys Asp Gly Cys Asn Gly Val Pro Ser Arg
485 490 495
Arg Gly Arg Lys Pro Arg Val Arg Gly Gly Ala Pro Asp Pro Ser Pro
500 505 510
Gly Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Pro Ala Gln Pro Ser Ser Pro Asp
515 520 525
Ala Arg Arg Asn Gly Gln Glu Lys His Phe Lys Asp Glu Asp Glu Asp
530 535 540
Glu Asp Val Ala Ser Pro Asp Gly Leu Gly Arg Leu Asn Val Ala Gly
545 550 555 560
Ala Gly Gly Gly Gly Asp Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Asp
565 570 575
Gly Asn Phe Thr Ala Gly Leu Ala Glu Phe Met Glu Pro Val Asn Pro
580 585 590
Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys
595 600 605
Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe
610 615 620
Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Gln
625 630 635 640
Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Ser
645 650 655
Lys Leu Ile
<210> 7
<211> 560
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> TAT dMt-MeCP2融合蛋白
<400> 7
Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe
20 25 30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
35 40 45
Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
50 55 60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Pro Glu Phe Met Val Ala Gly Met Leu
65 70 75 80
Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln Asp Leu Gln Gly Leu Lys
85 90 95
Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys Lys Asp Lys Lys Glu Glu
100 105 110
Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro Ser Ala His His Ser Ala
115 120 125
Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr Ser Glu Gly Ser Gly Ser
130 135 140
Ala Pro Al a Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Lys Gln Arg Arg Ser
145 150 155 160
Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp Asp Pro Thr Leu Pro Glu
165 170 175
Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys Ser Gly Arg Ser Ala Gly
180 185 190
Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln Gly Lys Ala Phe Arg Ser
195 200 205
Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys Val Gly Asp Thr Ser Leu
210 215 220
Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr Gly Arg Gly Ser Pro Ser
225 230 235 240
Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro Lys Ser Pro Lys Ala Pro
245 250 255
Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys Gly Ser Gly Thr Thr Arg
260 265 270
Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln Val Lys Arg Val Leu Glu
275 280 285
Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met Pro Phe Gln Thr Ser Pro
290 295 300
Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr Thr Ser Thr Gln Val Met
305 310 315 320
Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys Ala Glu Ala Asp Pro Gln
325 330 335
Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro Gly Ser Val Val Ala Ala
340 345 350
Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val Lys Glu Ser Ser Ile Arg
355 360 365
Ser Val Gln Glu Thr Val Leu Pro Ile Lys Lys Arg Lys Thr Arg Glu
370 375 380
Thr Val Ser Ile Glu Val Lys Glu Val Val Lys Pro Leu Leu Val Ser
385 390 395 400
Thr Leu Gly Glu Lys Ser Gly Lys Gly Leu Lys Thr Cys Lys Ser Pro
405 410 415
Gly Arg Lys Ser Lys Glu Ser Ser Pro Lys Gly Arg Ser Ser Ser Ala
420 425 430
Ser Ser Pro Pro Lys Lys Glu His His His His His His His Ser Glu
435 440 445
Ser Pro Lys Ala Pro Val Pro Leu Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro
450 455 460
Pro Glu Pro Glu Ser Ser Glu Asp Pro Thr Ser Pro Pro Glu Pro Gln
465 470 475 480
Asp Leu Ser Ser Ser Val Cys Lys Glu Glu Lys Met Pro Arg Gly Gly
485 490 495
Ser Leu Glu Ser Asp Gly Cys Pro Lys Glu Pro Ala Lys Thr Gln Pro
500 505 510
Ala Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Glu Lys Tyr Lys His Arg Gly
515 520 525
Glu Gly Glu Arg Lys Asp Ile Val Ser Ser Ser Met Pro Arg Pro Asn
530 535 540
Arg Glu Glu Pro Val Asp Ser Arg Thr Pro Val Thr Glu Arg Val Ser
545 550 555 560
<210> 8
<211> 556
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> TAT dMt-HDAC1融合蛋白
<400> 8
Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe
20 25 30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
35 40 45
Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
50 55 60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Pro Glu Phe Met Ala Gln Thr Gln Gly
65 70 75 80
Thr Arg Arg Lys Val Cys Tyr Tyr Tyr Asp Gly Asp Val Gly Asn Tyr
85 90 95
Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro His Arg Ile Arg Met Thr
100 105 110
His Asn Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr Arg Lys Met Glu Ile Tyr
115 120 125
Arg Pro His Lys Ala Asn Ala Glu Glu Met Thr Lys Tyr His Ser Asp
130 135 140
Asp Tyr Ile Lys Phe Leu Arg Ser Ile Arg Pro Asp Asn Met Ser Glu
145 150 155 160
Tyr Ser Lys Gln Met Gln Arg Phe Asn Val Gly Glu Asp Cys Pro Val
165 170 175
Phe Asp Gly Leu Phe Glu Phe Cys Gln Leu Ser Thr Gly Gly Ser Val
180 185 190
Ala Ser Ala Val Lys Leu Asn Lys Gln Gln Thr Asp Ile Ala Val Asn
195 200 205
Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe
210 215 220
Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Ala Ile Leu Glu Leu Leu Lys Tyr
225 230 235 240
His Gln Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile Asp Ile His His Gly Asp Gly
245 250 255
Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg Val Met Thr Val Ser Phe
260 265 270
His Lys Tyr Gly Glu Tyr Phe Pro Gly Thr Gly Asp Leu Arg Asp Ile
275 280 285
Gly Ala Gly Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Asn Tyr Pro Leu Arg Asp
290 295 300
Gly Ile Asp Asp Glu Ser Tyr Glu Ala Ile Phe Lys Pro Val Met Ser
305 310 315 320
Lys Val Met Glu Met Phe Gln Pro Ser Ala Val Val Leu Gln Cys Gly
325 330 335
Ser Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu Gly Cys Phe Asn Leu Thr Ile
340 345 350
Lys Gly His Ala Lys Cys Val Glu Phe Val Lys Ser Phe Asn Leu Pro
355 360 365
Met Leu Met Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Ile Arg Asn Val Ala Arg
370 375 380
Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ala Val Ala Leu Asp Thr Glu Ile Pro Asn
385 390 395 400
Glu Leu Pro Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr Phe Gly Pro Asp Phe Lys
405 410 415
Leu His Ile Ser Pro Ser Asn Met Thr Asn Gln Asn Thr Asn Glu Tyr
420 425 430
Leu Glu Lys Ile Lys Gln Arg Leu Phe Glu Asn Leu Arg Met Leu Pro
435 440 445
His Ala Pro Gly Val Gln Met Gln Ala Ile Pro Glu Asp Ala Ile Pro
450 455 460
Glu Glu Ser Gly Asp Glu Asp Glu Asp Asp Pro Asp Lys Arg Ile Ser
465 470 475 480
Ile Cys Ser Ser Asp Lys Arg Ile Ala Cys Glu Glu Glu Phe Ser Asp
485 490 495
Ser Glu Glu Glu Gly Glu Gly Gly Arg Lys Asn Ser Ser Asn Phe Lys
500 505 510
Lys Ala Lys Arg Val Lys Thr Glu Asp Glu Lys Glu Lys Asp Pro Glu
515 520 525
Glu Lys Lys Glu Val Thr Glu Glu Glu Lys Thr Lys Glu Glu Lys Pro
530 535 540
Glu Ala Lys Gly Val Lys Glu Glu Val Lys Leu Ala
545 550 555
<210> 9
<211> 204
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> TAT dMt-POZ融合蛋白
<400> 9
Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe
20 25 30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
35 40 45
Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
50 55 60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Pro Glu Phe Met Ala Gly Gly Val Asp
65 70 75 80
Gly Pro Ile Gly Ile Pro Phe Pro Asp His Ser Ser Asp Ile Leu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Glu Gln Arg Thr Gln Gly Leu Leu Cys Asp Val Val Ile
100 105 110
Leu Val Glu Gly Arg Glu Phe Pro Thr His Arg Ser Val Leu Ala Ala
115 120 125
Cys Ser Gln Tyr Phe Lys Lys Leu Phe Thr Ser Gly Ala Val Val Asp
130 135 140
Gln Gln Asn Val Tyr Glu Ile Asp Phe Val Ser Ala Glu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ala Leu Met Asp Phe Ala Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Thr Ala
165 170 175
Asn Val Gly Asp Ile Leu Ser Ala Ala Arg Leu Leu Glu Ile Pro Ala
180 185 190
Val Ser His Val Cys Ala Asp Leu Leu Asp Arg Gln
195 200
<210> 10
<211> 658
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> TAT dMt-FBI-1融合蛋白
<400> 10
Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe
20 25 30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
35 40 45
Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
50 55 60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Pro Glu Phe Met Ala Gly Gly Val Asp
65 70 75 80
Gly Pro Ile Gly Ile Pro Phe Pro Asp His Ser Ser Asp Ile Leu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Glu Gln Arg Thr Gln Gly Leu Leu Cys Asp Val Val Ile
100 105 110
Leu Val Glu Gly Arg Glu Phe Pro Thr His Arg Ser Val Leu Ala Ala
115 120 125
Cys Ser Gln Tyr Phe Lys Lys Leu Phe Thr Ser Gly Ala Val Val Asp
130 135 140
Gln Gln Asn Val Tyr Glu Ile Asp Phe Val Ser Ala Glu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ala Leu Met Asp Phe Ala Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Val Ser Thr Ala
165 170 175
Asn Val Gly Asp Ile Leu Ser Ala Ala Arg Leu Leu Glu Ile Pro Ala
180 185 190
Val Ser His Val Cys Ala Asp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Leu Ala Ala
195 200 205
Asp Ala Gly Ala Asp Ala Gly Gln Leu Asp Leu Val Asp Gln Ile Asp
210 215 220
Gln Arg Asn Leu Leu Arg Ala Lys Glu Tyr Leu Glu Phe Phe Gln Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Asn Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser
245 250 255
Phe Pro Trp Ser Ala Phe Gly Ala Ser Asp Asp Asp Leu Asp Ala Thr
260 265 270
Lys Glu Ala Val Ala Ala Ala Val Ala Ala Val Ala Ala Gly Asp Cys
275 280 285
Asn Gly Leu Asp Phe Tyr Gly Pro Gly Pro Pro Ala Glu Arg Pro Pro
290 295 300
Thr Gly Asp Gly Asp Glu Gly Asp Ser Asn Pro Gly Leu Trp Pro Glu
305 310 315 320
Arg Asp Glu Asp Ala Pro Thr Gly Gly Leu Phe Pro Pro Pro Val Ala
325 330 335
Pro Pro Ala Ala Thr Gln Asn Gly His Tyr Gly Arg Gly Gly Glu Glu
340 345 350
Glu Ala Ala Ser Leu Ser Glu Ala Ala Pro Glu Pro Gly Asp Ser Pro
355 360 365
Gly Phe Leu Ser Gly Ala Ala Glu Gly Glu Asp Gly Asp Gly Pro Asp
370 375 380
Val Asp Gly Leu Ala Ala Ser Thr Leu Leu Gln Gln Met Met Ser Ser
385 390 395 400
Val Gly Arg Ala Gly Ala Ala Ala Gly Asp Ser Asp Glu Glu Ser Arg
405 410 415
Ala Asp Asp Lys Gly Val Met Asp Tyr Tyr Leu Lys Tyr Phe Ser Gly
420 425 430
Ala His Asp Gly Asp Val Tyr Pro Ala Trp Ser Gln Lys Val Glu Lys
435 440 445
Lys Ile Arg Ala Lys Ala Phe Gln Lys Cys Pro Ile Cys Glu Lys Val
450 455 460
Ile Gln Gly Ala Gly Lys Leu Pro Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly
465 470 475 480
Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn Ile Cys Lys Val Arg Phe Thr Arg Gln
485 490 495
Asp Lys Leu Lys Val His Met Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr
500 505 510
Leu Cys Gln Gln Cys Gly Ala Ala Phe Ala His Asn Tyr Asp Leu Lys
515 520 525
Asn His Met Arg Val His Thr Gly Leu Arg Pro Tyr Gln Cys Asp Ser
530 535 540
Cys Cys Lys Thr Phe Val Arg Ser Asp His Leu His Arg His Leu Lys
545 550 555 560
Lys Asp Gly Cys Asn Gly Val Pro Ser Arg Arg Gly Arg Lys Pro Arg
565 570 575
Val Arg Gly Gly Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Ala Thr Ala Thr Pro
580 585 590
Gly Ala Pro Ala Gln Pro Ser Ser Pro Asp Ala Arg Arg Asn Gly Gln
595 600 605
Glu Lys His Phe Lys Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Val Ala Ser Pro
610 615 620
Asp Gly Leu Gly Arg Leu Asn Val Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp
625 630 635 640
Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Asp Gly Asn Phe Thr Ala Gly
645 650 655
Leu Ala
<210> 11
<211> 1686
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> MeCP2-TAT dMt融合蛋白的碱基序列
<400> 11
atggtagctg ggatgttagg gctcagggaa gaaaagtcag aagaccagga cctccagggc 60
ctcaaggaca aacccctcaa gtttaaaaag gtgaagaaag ataagaaaga agagaaagag 120
ggcaagcatg agcccgtgca gccatcagcc caccactctg ctgagcccgc agaggcaggc 180
aaagcagaga catcagaagg gtcaggctcc gccccggctg tgccggaagc ttctgcctcc 240
cccaaacagc ggcgctccat catccgtgac cggggaccca tgtatgatga ccccaccctg 300
cctgaaggct ggacacggaa gcttaagcaa aggaaatctg gccgctctgc tgggaagtat 360
gatgtgtatt tgatcaatcc ccagggaaaa gcctttcgct ctaaagtgga gttgattgcg 420
tacttcgaaa aggtaggcga cacatccctg gaccctaatg attttgactt cacggtaact 480
gggagaggga gcccctcccg gcgagagcag aaaccaccta agaagcccaa atctcccaaa 540
gctccaggaa ctggcagagg ccggggacgc cccaaaggga gcggcaccac gagacccaag 600
gcggccacgt cagagggtgt gcaggtgaaa agggtcctgg agaaaagtcc tgggaagctc 660
cttgtcaaga tgccttttca aacttcgcca gggggcaagg ctgagggggg tggggccacc 720
acatccaccc aggtcatggt gatcaaacgc cccggcagga agcgaaaagc tgaagctgac 780
cctcaggcca ttcccaagaa acggggccga aagccgggga gtgtggtggc agccgctgcc 840
gccgaggcca aaaagaaagc cgtgaaggag tcttctatcc gatctgtgca ggagaccgta 900
ctccccatca agaagcgcaa gacccgggag acggtcagca tcgaggtcaa ggaagtggtg 960
aagcccctgc tggtgtccac cctcggtgag aagagcggga aaggactgaa gacctgtaag 1020
agccctgggc ggaaaagcaa ggagagcagc cccaaggggc gcagcagcag cgcctcctca 1080
ccccccaaga aggagcacca ccaccatcac caccactcag agtccccaaa ggcccccgtg 1140
ccactgctcc cacccctgcc cccacctcca cctgagcccg agagctccga ggaccccacc 1200
agcccccctg agccccagga cttgagcagc agcgtctgca aagaggagaa gatgcccaga 1260
ggaggctcac tggagagcga cggctgcccc aaggagccag ctaagactca gcccgcggtt 1320
gccaccgccg ccacggccgc agaaaagtac aaacaccgag gggagggaga gcgcaaagac 1380
attgtttcat cctccatgcc aaggccaaac agagaggagc ctgtggacag ccggacgccc 1440
gtgaccgaga gagttagcga attcatggag ccagtaaatc ctagcctaga gccctggaag 1500
catccaggaa gtcagcctaa aactgcttgt accaattgct attgtgcaaa gtgttgcttt 1560
cattgccaag tttgtttcat aacaaaagcc ttaggcatct cctatggcag ggcaaagcgg 1620
agacagcgac gaagacctcc tcaaggcagt cagactcatc aagtttctct atcaaagctg 1680
atctag 1686
<210> 12
<211> 1674
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> HDAC1-TAT dMt融合蛋白的碱基序列
<400> 12
atggcgcaga cgcagggcac ccggaggaaa gtctgttact actacgacgg ggatgttgga 60
aattactatt atggacaagg ccacccaatg aagcctcacc gaatccgcat gactcataat 120
ttgctgctca actatggtct ctaccgaaaa atggaaatct atcgccctca caaagccaat 180
gctgaggaga tgaccaagta ccacagcgat gactacatta aattcttgcg ctccatccgt 240
ccagataaca tgtcggagta cagcaagcag atgcagagat tcaacgttgg tgaggactgt 300
ccagtattcg atggcctgtt tgagttctgt cagttgtcta ctggtggttc tgtggcaagt 360
gctgtgaaac ttaataagca gcagacggac atcgctgtga attgggctgg gggcctgcac 420
catgcaaaga agtccgaggc atctggcttc tgttacgtca atgatatcgt cttggccatc 480
ctggaactgc taaagtatca ccagagggtg ctgtacattg acattgatat tcaccatggt 540
gacggcgtgg aagaggcctt ctacaccacg gaccgggtca tgactgtgtc ctttcataag 600
tatggagagt acttcccagg aactggggac ctacgggata tcggggctgg caaaggcaag 660
tattatgctg ttaactaccc gctccgagac gggattgatg acgagtccta tgaggccatt 720
ttcaagccgg tcatgtccaa agtaatggag atgttccagc ctagtgcggt ggtcttacag 780
tgtggctcag actccctatc tggggatcgg ttaggttgct tcaatctaac tatcaaagga 840
cacgccaagt gtgtggaatt tgtcaagagc tttaacctgc ctatgctgat gctgggaggc 900
ggtggttaca ccattcgtaa cgttgcccgg tgctggacat atgagacagc tgtggccctg 960
gatacggaga tccctaatga gcttccatac aatgactact ttgaatactt tggaccagat 1020
ttcaagctcc acatcagtcc ttccaatatg actaaccaga acacgaatga gtacctggag 1080
aagatcaaac agcgactgtt tgagaacct tagaatgctgc cgcacgcacc tggggtccaa 1140
atgcaggcga ttcctgagga cgccatccct gaggagagtg gcgatgagga cgaagacgac 1200
cctgacaagc gcatctcgat ctgctcctct gacaaacgaa ttgcctgtga ggaagagttc 1260
tccgattctg aagaggaggg agaggggggc cgcaagaact cttccaactt caaaaaagcc 1320
aagagagtca aaacagagga tgaaaaagag aaagacccag aggagaagaa agaagtcacc 1380
gaagaggaga aaaccaagga ggagaagcca gaagccaaag gggtcaagga ggaggtcaag 1440
ttggccgaat tcatggagcc agtaaatcct agcctagagc cctggaagca tccaggaagt 1500
cagcctaaaa ctgcttgtac caattgctat tgtgcaaagt gttgctttca ttgccaagtt 1560
tgtttcataa caaaagcctt aggcatctcc tatggcaggg caaagcggag acagcgacga 1620
agacctcctc aaggcagtca gactcatcaa gtttctctat caaagctgat ctag 1674
<210> 13
<211> 618
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> POZ-TAT dMt融合蛋白的碱基序列
<400> 13
atggccggcg gcgtggacgg ccccatcggg atcccgttcc ccgaccacag cagcgacatc 60
ctgagtgggc tgaacgagca gcggacgcag ggcctgctgt gcgacgtggt gatcctggtg 120
gagggccgcg agttccccac gcaccgctcg gtgctggccg cctgcagcca gtacttcaag 180
aagctgttca cgtcgggcgc cgtggtggac cagcagaacg tgtacgagat cgacttcgtc 240
agcgccgagg cgctcaccgc gctcatggac ttcgcctaca cggccacgct caccgtcagc 300
acagccaacg tgggtgacat cctcagcgcc gcccgcctgc tggagatccc cgccgtgagc 360
cacgtgtgcg ccgacctcct ggaccggcag gaattcatgg agccagtaaa tcctagccta 420
gagccctgga agcatccagg aagtcagcct aaaactgctt gtaccaattg ctattgtgca 480
aagtgttgct ttcattgcca agtttgtttc ataacaaaag ccttaggcat ctcctatggc 540
agggcaaagc ggagacagcg acgaagacct cctcaaggca gtcagactca tcaagtttct 600
ctatcaaagc tgatctag 618
<210> 14
<211> 1980
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> FBI-1-TAT dMt融合蛋白的碱基序列
<400> 14
atggccggcg gcgtggacgg ccccatcggg atcccgttcc ccgaccacag cagcgacatc 60
ctgagtgggc tgaacgagca gcggacgcag ggcctgctgt gcgacgtggt gatcctggtg 120
gagggccgcg agttccccac gcaccgctcg gtgctggccg cctgcagcca gtacttcaag 180
aagctgttca cgtcgggcgc cgtggtggac cagcagaacg tgtacgagat cgacttcgtc 240
agcgccgagg cgctcaccgc gctcatggac ttcgcctaca cggccacgct caccgtcagc 300
acagccaacg tgggtgacat cctcagcgcc gcccgcctgc tggagatccc cgccgtgagc 360
cacgtgtgcg ccgacctcct ggaccggcag atcctggcgg ccgacgcggg cgccgacgcc 420
gggcagctgg accttgtaga tcaaattgat cagcgcaacc tcctccgcgc caaggagtac 480
ctcgagttct tccagagcaa ccccatgaac agcctgcccc ccgcggccgc cgccgccgct 540
gccagcttcc cgtggtccgc ctttggggcg tccgatgatg acctggatgc caccaaggag 600
gccgtggccg ccgctgtggc cgccgtggcc gcgggcgact gcaacggctt agacttctat 660
gggccgggcc ccccggccga gcggcccccg acgggggacg gggacgaggg cgacagcaac 720
ccgggtctgt ggccagagcg ggatgaggac gcccccaccg ggggtctctt tccgccgccg 780
gtggccccgc cggccgccac gcagaacggc cactacggcc gcggcggaga ggaggaggcc 840
gcctcgctgt cggaggcggc ccccgagccg ggcgactctc cgggcttcct gtcgggagcg 900
gccgagggcg aggacgggga cgggcccgac gtggacgggc tggcggccag cacgctgctg 960
cagcagatga tgtcatcggt gggccgggcg ggggccgcgg cgggggacag cgacgaggag 1020
tcgcgggccg acgacaaggg cgtcatggac tactacctga agtacttcag cggcgcccac 1080
gacggcgacg tctacccggc ctggtcgcag aaggtggaga agaagatccg agccaaggcc 1140
ttccagaagt gccccatctg cgagaaggtc atccagggcg ccggcaagct gccgcgacac 1200
atccgcaccc acacgggcga gaagccctac gagtgcaaca tctgcaaggt ccgcttcacc 1260
aggcaggaca agctgaaggt gcacatgcgg aagcacacgg gcgagaagcc gtacctgtgc 1320
cagcagtgcg gcgccgcctt tgcccacaac tacgacctga agaaccacat gcgcgtgcac 1380
acgggcctgc gcccctacca gtgcgacagc tgctgcaaga ccttcgtccg ctccgaccac 1440
ctgcacagac acctcaagaa agacggctgc aacggcgtcc cctcgcgccg cggccgcaag 1500
ccccgcgtcc ggggcggggc gcccgacccc agcccggggg ccaccgcgac ccccggcgcc 1560
cccgcccagc ccagctcccc cgacgcccgg cgcaacggcc aggagaagca ctttaaggac 1620
gaggacgagg acgaggacgt ggccagcccc gacggcttgg gccggttgaa tgtagcgggc 1680
gccggtggag gaggtgacag cggaggtggc cccggggccg ccaccgacgg taacttcaca 1740
gccggactcg ccgaattcat ggagccagta aatcctagcc tagagccctg gaagcatcca 1800
ggaagtcagc ctaaaactgc ttgtaccaat tgctattgtg caaagtgttg ctttcattgc 1860
caagtttgtt tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcagggcaaa gcggagacag 1920
cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa gctgatctag 1980
1980
<210> 15
<211> 1683
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> TAT dMt-MeCP2融合蛋白的碱基序列
<400> 15
atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60
gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120
aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcccgaat tcatggtagc tgggatgtta 240
gggctcaggg aagaaaagtc agaagaccag gacctccagg gcctcaagga caaacccctc 300
aagtttaaaa aggtgaagaa agataagaaa gaagagaaag agggcaagca tgagcccgtg 360
cagccatcag cccaccactc tgctgagccc gcagaggcag gcaaagcaga gacatcagaa 420
gggtcaggct ccgccccggc tgtgccggaa gcttctgcct cccccaaaca gcggcgctcc 480
atcatccgtg accggggacc catgtatgat gaccccaccc tgcctgaagg ctggacacgg 540
aagcttaagc aaaggaaatc tggccgctct gctgggaagt atgatgtgta tttgatcaat 600
ccccagggaa aagcctttcg ctctaaagtg gagttgattg cgtacttcga aaaggtaggc 660
gacacatccc tggaccctaa tgattttgac ttcacggtaa ctgggagagg gagcccctcc 720
cggcgagagc agaaaccacc taagaagccc aaatctccca aagctccagg aactggcaga 780
ggccggggac gccccaaagg gagcggcacc acgagaccca aggcggccac gtcagagggt 840
gtgcaggtga aaagggtcct ggagaaaagt cctgggaagc tccttgtcaa gatgcctttt 900
caaacttcgc cagggggcaa ggctgagggg ggtggggcca ccacatccac ccaggtcatg 960
gtgatcaaac gccccggcag gaagcgaaaa gctgaagctg accctcaggc cattcccaag 1020
aaacggggcc gaaagccggg gagtgtggtg gcagccgctg ccgccgaggc caaaaagaaa 1080
gccgtgaagg agtcttctat ccgatctgtg caggagaccg tactccccat caagaagcgc 1140
aagacccggg agacggtcag catcgaggtc aaggaagtgg tgaagcccct gctggtgtcc 1200
accctcggtg agaagagcgg gaaaggactg aagacctgta agagccctgg gcggaaaagc 1260
aaggagagca gccccaaggg gcgcagcagc agcgcctcct caccccccaa gaaggagcac 1320
caccaccatc accaccactc agagtcccca aaggcccccg tgccactgct cccacccctg 1380
cccccacctc cacctgagcc cgagagctcc gaggacccca ccagcccccc tgagccccag 1440
gacttgagca gcagcgtctg caaagaggag aagatgccca gaggaggctc actggagagc 1500
gacggctgcc ccaaggagcc agctaagact cagcccgcgg ttgccaccgc cgccacggcc 1560
gcagaaaagt acaaacaccg aggggaggga gagcgcaaag acattgtttc atcctccatg 1620
ccaaggccaa acagagagga gcctgtggac agccggacgc ccgtgaccga gagagttagc 1680
tga 1683
<210> 16
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> TAT dMt-HDAC1融合蛋白的碱基序列
<400> 16
atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60
gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120
aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcccgaat tcatggcgca gacgcagggc 240
acccggagga aagtctgtta ctactacgac ggggatgttg gaaattacta ttatggacaa 300
ggccacccaa tgaagcctca ccgaatccgc atgactcata atttgctgct caactatggt 360
ctctaccgaa aaatggaaat ctatcgccct cacaaagcca atgctgagga gatgaccaag 420
taccacagcg atgactacat taaattcttg cgctccatcc gtccagataa catgtcggag 480
tacagcaagc agatgcagag attcaacgtt ggtgaggact gtccagtatt cgatggcctg 540
tttgagttct gtcagttgtc tactggtggt tctgtggcaa gtgctgtgaa acttaataag 600
cagcagacgg acatcgctgt gaattgggct gggggcctgc accatgcaaa gaagtccgag 660
gcatctggct tctgttacgt caatgatatc gtcttggcca tcctggaact gctaaagtat 720
caccagaggg tgctgtacat tgacattgat attcaccatg gtgacggcgt ggaagaggcc 780
ttctacacca cggaccgggt catgactgtg tcctttcata agtatggaga gtacttccca 840
ggaactgggg acctacggga tatcggggct ggcaaaggca agtattatgc tgttaactac 900
ccgctccgag acgggattga tgacgagtcc tatgaggcca ttttcaagcc ggtcatgtcc 960
aaagtaatgg agatgttcca gcctagtgcg gtggtcttac agtgtggctc agactcccta 1020
tctggggatc ggttaggttg cttcaatcta actatcaaag gacacgccaa gtgtgtggaa 1080
tttgtcaaga gctttaacct gcctatgctg atgctgggag gcggtggtta caccattcgt 1140
aacgttgccc ggtgctggac atatgagaca gctgtggccc tggatacgga gatccctaat 1200
gagcttccat acaatgacta ctttgaatac tttggaccag atttcaagct ccacatcagt 1260
ccttccaata tgactaacca gaacacgaat gagtacctgg agaagatcaa acagcgactg 1320
tttgagaacc ttagaatgct gccgcacgca cctggggtcc aaatgcaggc gattcctgag 1380
gacgccatcc ctgaggagag tggcgatgag gacgaagacg accctgacaa gcgcatctcg 1440
atctgctcct ctgacaaacg aattgcctgt gaggaagagt tctccgattc tgaagaggag 1500
ggagaggggg gccgcaagaa ctcttccaac ttcaaaaaag ccaagagagt caaaacagag 1560
gatgaaaaag agaaagaccc agaggagaag aaagaagtca ccgaagagga gaaaaccaag 1620
gaggagaagc cagaagccaa aggggtcaag gaggaggtca agttggcctg a 1671
<210> 17
<211> 612
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> TAT dMt-POZ融合蛋白的碱基序列
<400> 17
atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60
gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120
aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcccgaat tcatggccgg cggcgtggac 240
ggccccatcg ggatcccgtt ccccgaccac agcagcgaca tcctgagtgg gctgaacgag 300
cagcggacgc agggcctgct gtgcgacgtg gtgatcctgg tggagggccg cgagttcccc 360
acgcaccgct cggtgctggc cgcctgcagc cagtacttca agaagctgtt cacgtcgggc 420
gccgtggtgg accagcagaa cgtgtacgag atcgacttcg tcagcgccga ggcgctcacc 480
gcgctcatgg acttcgccta cacggccacg ctcaccgtca gcacagccaa cgtgggtgac 540
atcctcagcg ccgcccgcct gctggagatc cccgccgtga gccacgtgtg cgccgacctc 600
ctggaccggc ag 612
<210> 18
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> TAT dMt-FBI-1融合蛋白的碱基序列
<400> 18
atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60
gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120
aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcccgaat tcatggccgg cggcgtggac 240
ggccccatcg ggatcccgtt ccccgaccac agcagcgaca tcctgagtgg gctgaacgag 300
cagcggacgc agggcctgct gtgcgacgtg gtgatcctgg tggagggccg cgagttcccc 360
acgcaccgct cggtgctggc cgcctgcagc cagtacttca agaagctgtt cacgtcgggc 420
gccgtggtgg accagcagaa cgtgtacgag atcgacttcg tcagcgccga ggcgctcacc 480
gcgctcatgg acttcgccta cacggccacg ctcaccgtca gcacagccaa cgtgggtgac 540
atcctcagcg ccgcccgcct gctggagatc cccgccgtga gccacgtgtg cgccgacctc 600
ctggaccggc agatcctggc ggccgacgcg ggcgccgacg ccgggcagct ggaccttgta 660
gatcaaattg atcagcgcaa cctcctccgc gccaaggagt acctcgagtt cttccagagc 720
aaccccatga acagcctgcc ccccgcggcc gccgccgccg ctgccagctt cccgtggtcc 780
gcctttgggg cgtccgatga tgacctggat gccaccaagg aggccgtggc cgccgctgtg 840
gccgccgtgg ccgcgggcga ctgcaacggc ttagacttct atgggccggg ccccccggcc 900
gagcggcccc cgacggggga cggggacgag ggcgacagca acccgggtct gtggccagag 960
cgggatgagg acgcccccac cgggggtctc tttccgccgc cggtggcccc gccggccgcc 1020
acgcagaacg gccactacgg ccgcggcgga gaggaggagg ccgcctcgct gtcggaggcg 1080
gcccccgagc cgggcgactc tccgggcttc ctgtcgggag cggccgaggg cgaggacggg 1140
gacgggcccg acgtggacgg gctggcggcc agcacgctgc tgcagcagat gatgtcatcg 1200
gtgggccggg cgggggccgc ggcgggggac agcgacgagg agtcgcgggc cgacgacaag 1260
ggcgtcatgg actactacct gaagtacttc agcggcgccc acgacggcga cgtctacccg 1320
gcctggtcgc agaaggtgga gaagaagatc cgagccaagg ccttccagaa gtgccccatc 1380
tgcgagaagg tcatccaggg cgccggcaag ctgccgcgac acatccgcac ccacacgggc 1440
gagaagccct acgagtgcaa catctgcaag gtccgcttca ccaggcagga caagctgaag 1500
gtgcacatgc ggaagcacac gggcgagaag ccgtacctgt gccagcagtg cggcgccgcc 1560
tttgcccaca actacgacct gaagaaccac atgcgcgtgc acacgggcct gcgcccctac 1620
cagtgcgaca gctgctgcaa gaccttcgtc cgctccgacc acctgcacag acacctcaag 1680
aaagacggct gcaacggcgt cccctcgcgc cgcggccgca agccccgcgt ccggggcggg 1740
gcgcccgacc ccagcccggg ggccaccgcg acccccggcg cccccgccca gcccagctcc 1800
cccgacgccc ggcgcaacgg ccaggagaag cactttaagg acgaggacga ggacgaggac 1860
gtggccagcc ccgacggctt gggccggttg aatgtagcgg gcgccggtgg aggaggtgac 1920
agcggaggtg gccccggggc cgccaccgac ggtaacttca cagccggact cgcctaa 1977
Claims (8)
1.一种抑制HIV转录的融合蛋白,包含:
一种选自由强有力地抑制转录因子Sp1或NF-KB活性的多肽,通过浓缩染色质抑制转录活性的多肽,以及具有启动子结合活性的多肽所组成的组的转录抑制多肽或其化合物;
一种识别表达调控区附近的RNA链或病毒LTR启动子顺式作用元件的多肽或其化合物。
2.根据权利要求1的融合蛋白,其中强有力地抑制转录因子Sp1或NF-KB的转录活性的多肽或其化合物,或者通过浓缩染色质抑制转录活动的多肽或其化合物是选自由a)POZ-结构域家族蛋白;b)HDAC或其具有转录抑制活性的区域;c)MeCP2或MBP-家族蛋白;d)选自由polycom家族蛋白、mSin3A、SMRT、B-CoR和N-CoR所组成的组的辅阻遏蛋白;e)Sp1、Sp2、Sp3、Sp4或NF-KB DNA结合区域的DNA的多肽;以及f)具有结合HIV启动子区域的结合活性的蛋白所组成的组的一种多肽。
3.根据权利要求1的融合蛋白,其中识别表达调控区附近的RNA链或病毒LTR启动子顺式作用元件的多肽或其化合物是Tat蛋白SEQ ID NO:1或2或其突变体。
4.根据前述权利要求的任意一项的融合蛋白,其中该融合蛋白是选自由SEQ ID NO:3~10所示蛋白所组成的组。
5.一种包含SEQ ID NO:11~18的碱基序列的核酸,其编码SEQ ID NO:3~10中所示的多肽。
6.一个或多个包含用于编码根据权利要求5的融合蛋白的基因的重组载体,其中该重组载体是选自由pcDNA3.0-TatWt、pcDNA3.0-TatMt、pcDNA3.0-FBI-1、pcDNA3.0-MeCP2-TatWt、pcDNA3.0HDAC1-TatWt、pcDNA3.0FBI-1-TatWt、pcDNA3.0-POZ-TatWt、pcDNA3.0TarWt-MeCP2、pcDNA3.0TatWt-HDAC1、pcDNA3.0TatWt-FBI-1、pcDNA3.0TatWt-POZ、pcDNA3.0-MeCP2-TatdMt、pcDNA3.0HDAC1-TatdMt、pcDNA3.0FBI-1-TatdMt、pcDNA3.0-POZ-TatdMt、pcDNA3.0TatdMt-Mecp2、pcDNA3.0TatdMt-HDAC1、pcDNA3.0TatdMt-FBI-1和pcDNA3.0TatdMt-POZ所组成的组的载体。
7.一种根据权利要求1或4的抑制HIV转录的组合物,包括部分或全部融合蛋白。
8.一种利用融合蛋白通过在病毒LTR区抑制基因组转录和继而发生的病毒复制而抑制HIV增殖的方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR2001/21449 | 2001-04-20 | ||
KR10-2001-0021449A KR100461630B1 (ko) | 2001-04-20 | 2001-04-20 | 에이즈 바이러스 유전체의 전사억제제 및 전사억제 방법 |
KR2002/21307 | 2002-04-18 | ||
KR1020020021307A KR20030082815A (ko) | 2002-04-18 | 2002-04-18 | 에이즈 바이러스 유전체의 전사억제제 및 전사억제 방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1604911A true CN1604911A (zh) | 2005-04-06 |
Family
ID=26639006
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN02808525.6A Pending CN1604911A (zh) | 2001-04-20 | 2002-04-19 | Hiv转录阻遏物及其方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040126877A1 (zh) |
EP (1) | EP1385887A4 (zh) |
CN (1) | CN1604911A (zh) |
WO (1) | WO2002085948A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104995299A (zh) * | 2012-12-11 | 2015-10-21 | 宝生物工程株式会社 | 表达盒 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005068505A1 (en) * | 2004-01-20 | 2005-07-28 | Man-Wook Hur | Fusion protein comprising tatdmt polypeptide |
WO2006017353A2 (en) * | 2004-07-13 | 2006-02-16 | GOVERNMENT OF THE UNITED STATES, as represented byTHE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Treatment of viral infections |
AU2006341726B2 (en) * | 2006-04-07 | 2012-09-20 | Ipt Pharma Ag | Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy |
WO2023196880A2 (en) * | 2022-04-06 | 2023-10-12 | City Of Hope | Human t-cell lymphotropic virus type 1 targeting proteins and methods of use |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9915126D0 (en) * | 1999-06-30 | 1999-09-01 | Imp College Innovations Ltd | Control of gene expression |
-
2002
- 2002-04-19 US US10/475,681 patent/US20040126877A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-19 WO PCT/KR2002/000730 patent/WO2002085948A1/en not_active Application Discontinuation
- 2002-04-19 CN CN02808525.6A patent/CN1604911A/zh active Pending
- 2002-04-19 EP EP02718695A patent/EP1385887A4/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104995299A (zh) * | 2012-12-11 | 2015-10-21 | 宝生物工程株式会社 | 表达盒 |
CN104995299B (zh) * | 2012-12-11 | 2020-02-28 | 宝生物工程株式会社 | 表达盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1385887A1 (en) | 2004-02-04 |
US20040126877A1 (en) | 2004-07-01 |
WO2002085948A1 (en) | 2002-10-31 |
EP1385887A4 (en) | 2006-12-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1188519C (zh) | 包含HIV-1Tat和/或Nef蛋白的融合蛋白 | |
CN1213068C (zh) | 对hiv免疫应答的改进或与其相关的改进 | |
CN1282656C (zh) | 来自gagp17和p24保守区域的HIV肽以及它们在例如疫苗中的应用 | |
CN101035897A (zh) | 用于预防和治疗hiv感染的疫苗 | |
CN1346367A (zh) | Hiv肽,抗原,疫苗组合物,检测hiv所诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法 | |
CN1756763A (zh) | 二聚体化肽 | |
CN1151252C (zh) | 生产微生物转谷氨酰胺酶的方法 | |
CN101037671A (zh) | 杂交瘤细胞株及其产生的抗人红细胞表面h抗原的单克隆抗体 | |
CN101035899A (zh) | 通过改变CpG含量来调节基因表达的方法 | |
CN1929860A (zh) | HIV gp41衍生肽的位点特异性化学修饰 | |
CN1192037C (zh) | 用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu-水蛭素的信号序列 | |
CN1602202A (zh) | 鉴定和开发治疗剂的方法 | |
CN1458936A (zh) | 来自Tat、Rev和Nef保守区的HIV肽以及它们作为例如疫苗组分的应用 | |
CN1170040A (zh) | 包含转运信号之基因的核酸构建体 | |
CN101062954A (zh) | 具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与应用 | |
CN1509336A (zh) | 肽的制备方法 | |
CN1604911A (zh) | Hiv转录阻遏物及其方法 | |
CN1778930A (zh) | 激发机体抗鸡球虫感染的融合基因及其编码蛋白与应用 | |
CN1531548A (zh) | 编码可诱导抗病毒效应的蛋白质的嵌合链 | |
CN1244698C (zh) | 一种重组sars病毒基因在多形汉逊酵母中的表达及用途 | |
CN1720326A (zh) | 通过抑制tap活性增强mhcⅰ类分子对外来表位的展示的方法 | |
CN1653086A (zh) | 新的肽组合物以及它们在制备抗丙肝病毒药物组合物中的用途 | |
CN1954882A (zh) | 长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治肝衰竭药物中的用途 | |
CN1896104A (zh) | 细胞抑制因子与白蛋白的融合蛋白 | |
CN1268392C (zh) | 预防和治疗人丙型肝炎病毒感染的重组蛋白疫苗及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |