KR20030082815A - 에이즈 바이러스 유전체의 전사억제제 및 전사억제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에이즈 바이러스 유전체(RNA)의 생산을 억제할수 있는 억제제 및 전사억제 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Sp1, NF-κB 등의 활성을 강하게 억제하는 단백질, 크로마틴을 강하게 압축시켜 전사활성을 억제하는 기능을 갖는 단백질들, 그리고 에이즈바이러스 프로모터 주변에 결합하는 단백질들을 짧은 유전체 RNA 가닥(TAR)을 인식할 수 있는 단백질(예, Tat 및 Tat 유사체)들과 융합하여 얻어진 에이즈 바이러스 유전체(RNA) 생산 억제 효과를 갖는 융합단백질 및 전사억제 방법에 관한 것이다. 상기 융합단백질은 짧은 RNA가닥(TAR) 인식 단백질을 유도탄으로 이용하여 Sp1, NF-κB의 활성억제 단백질을 HIV-1 바이러스의 발현조절 부위에 결합하도록 보내주었을 때에 HIV-1 유전체(RNA) 생산과정을 극적으로 제어하는 효과가 있다. 이 발명은 세계 최초로 전사활성 억제단백질을 고유의 방법으로 HIV LTR에 타겟팅 시킴으로서 HIV 전사를 억제할 수 있음을 보여준다.

Description

에이즈 바이러스 유전체의 전사억제제 및 전사억제 방법{Repressors for HIV transcription and methods thereof}

본 발명은 프로바이러스 상태나 핵 안에 존재하는 에이즈 바이러스의 LTR 프로모터로부터 바이러스 유전체(RNA)의 생산을 억제할 수 있는 억제제에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 Sp1, NF-κB 등의 활성을 강하게 억제하는 단백질, 크로마틴을 강하게 압축시켜 전사활성을 억제하는 기능을 갖는 단백질들, 그리고 에이즈바이러스 프로모터 부위에 결합하는 징크핑거등의 단백질들을 짧은 유전체 RNA 가닥(HIV 쇼트 트랜스크립트)을 인식할 수 있는 단백질(예, Tat 단백질 및 Tat 유사체)들과 융합하여 얻어진 에이즈 바이러스 유전체(RNA)의 전사억제 효과를 갖는 융합단백질에 관한 발명이다.

상기 융합 단백질은 짧은 RNA가닥 인식 단백질(예, Tat 단백질 및 그의 돌연변이체 mutant 의미임)을 유도탄으로 이용하여 Sp1, NF-κB의 활성억제 단백질, 크로마틴을 강하게 압축시켜 전사활성을 억제하는 기능을 갖는 단백질들을 HIV-1 바이러스의 LTR 프로모터의 발현조절 부위에 타겟팅 되도록 했을 때 HIV-1 유전체(RNA) 생산과정을 극적으로 제어하는 효과가 있다.

일반적으로, 에이즈 바이러스는 우리 몸의 세포에 침투할 때 바이러스 표면 단백질(GP120)이 세포막 표면 수용체와 결합하여 세포와 융합한 후 바이러스의 물질을 집어넣는다. 융합 후 바이러스 유전체가(RNA) 역전사효소의 작용으로 DNA로 바뀌고, 삽입효소의 작용으로 DNA 형태의 바이러스 유전체가 숙주세포의 핵 안에 자리잡은 숙주 세포의 유전체로 삽입되어 반영구적으로 자리를 잡는다(프로바이러스). 숙주 유전체 안에 자리잡은 HIV 유전체는 숙주세포의 유전자 발현체계를 이용하여 바이러스 유전체(RNA)를 생산하고(전사과정), 이를 이용 세포질에서 증식에 필요한 부품(단백질, 껍질)을 대량생산하고(번역 및 단백질 분해, 프로테아제 작용), 조립과정을 거처 숙주세포에서 방출됨으로서 증식하게 된다. 임계점을 넘게되면 매일 평균 100억개의 새로운(HIV) 바이러스가 증식하게 되어, 감염 후 에이즈로의 진행은 되돌릴 수 없는 상황으로 치닫게 된다.

현재까지 개발되어 사용되는 의약품들은 위에서 설명되는 여러 과정을 억제하는 화합물이나 항체(백신) 개발 방향으로 진행되어 왔다. 에이즈 치료제로서 가장 널리 사용되는 약물은 역전사과정 억제제와 프로테아제 억제제가 주종을 이룬다. 숙주세포 인식과정을 억제하기 위해서 개발되고 있는 백신은 바이러스의 표면 단백질의 빠른 돌연변이 때문에 어려움이 제기되고 있다. 다양한 역전사효소 억제제나 프로테아제 억제제들이 여러 제약회사에서 개발되어 시판되고 있다. 이들은 공히 초기에는 바이러스 증식 억제에 효과가 있으나, 독성 및 바이러스의 빠른 내성 획득 등이 주요 문제점으로 제기되고 있다.

또한 숙주세포 핵 유전체로 삽입에 대하여서는 그 기전연구나 치료제 개발에 있어서 미미한 상태이며, 97년 이후에는 유전자 요법에 의한 에이즈 치료제 개발에 관심이 증가하는 추세로 안티센스 유전자 요법과 라이보자임 유전자 치료법등이 개발되어 97년에 임상 제1상 단계의 실험이 진행중이다. 그러나 이들 치료방법도 고질적인 바이러스 내성문제를 극복할 수 없는 문제점을 안고 있다.

바이러스 유전체(RNA) 생산에 대한 발현조절 기전 측면에서 많은 연구가 진행되면서, 특정 숙주세포 전사조절 단백질이 RNA 발현에 중요하며 바이러스 단백질인 Tat가 HIV 유전체 발현에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 이 밝혀졌다. 최근에는 Tat가 세포 단백질인 TAK(티에이케이 "Tat 결합 인산화효소" 혹은 피티이에프 "PTEF"라 함)와 작용하여 RNA 합성효소의 활성에 큰 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 따라서 새로운 에이즈 치료제의 개발의 촛점은 Tat나 TAK의 작용을 억제함으로서 유전체(RNA) 생산을 억제하는 물질(Tat 유사 단백질 조각, TAR 유사 RNA 조각, TAK 억제제 등)을 개발하고자하는 시도가 있어 왔다.

위에서 언급된 치료제나 기술은 질병의 진행을 늦추어 생명을 다소 연장할 수 있으나 내성 바이러스의 급격한 출현으로 그 효력을 짧은 기간에 잃게 된다. 상기의 기술의 문제점들의 근본적인 문제는 숙주세포에 자리잡고 있는 DNA형태의 바이러스 유전체(프로바이러스)가 위에서 기술한 약물, 백신, 유전자 치료법에 영향을 받지 않고 존재함으로서 바이러스 유전체(RNA)로 발현될 가능성이 항상 존재한다.

따라서 기존 치료제의 한계를 극복할 수 있는 최선의 방법은 핵 내의 프로 바이러스 상태의 LTR로 부터 유전체(RNA)로 발현 즉 전사과정을 봉쇄하는 것이다. 이를 위하여 본 발명은 에이즈 바이러스 유전체(RNA) 발현제어를 통한 HIV 전사억제 융합단백질들을 개발하였고, 이는 숙주세포 유전체에 자리잡고 있는 DNA 형태의 바이러스 유전체로부터 바이러스 RNA 유전체의 발현을 억제함으로써 바이러스 증식에 필요한 부품(RNA 유전체, 단백질, 껍질) 생산을 원천적으로 봉쇄하여, 바이러스의 증식 및 내성 바이러스의 생성을 근본적으로 차단할 수 있다. 본 발명은 에이즈의 치료제로 사용되고 있는 상기 약물들의 문제점들을 근본적으로 극복함으로서 진정한 의미의 에이즈 치료를 가능케 한 새로운 방법으로 사료된다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하고, 상기의 필요에 의해서 안출된 것으로서,본 발명의 목적은 에이즈 바이러스의 증식에 필요한 유전체(RNA)를 근본적으로 억제하고 바이러스의 내성 획득을 극복하여 궁극적으로 에이즈를 치료할 수 있는 새로운 생물학적 치료제 및 에이즈 바이러스 유전체 전사 억제방법을 제공하는 것이다.

도 1은 에이즈바이러스(HIV)의 LTR 부위에서의 바이러스 유전체(RNA) 전사조절을 보여주는 그림. 낮은 수준의 RNA 합성은 주로 Sp1, NF-κB, TATA box에 의하여 결정되며, Sp1 결합 GC-Box 혹은 TATA box 자리가 망가지면 전사가 전혀 일어나지 않는다. 일단 전사가 일어나면 짧은 가닥(쇼트트랜스크립트)의 상태로 LTR 프로모터 근처에 머무른다. 이곳의 TAR 지역에 Tat 단백질이 결합하면 PTEF(포지티브 트랜스크립션 에롱게이션 팩터)가 결합하고 이어서 CDK9(사이클린 디펜던트 카이네이즈 9)이 중합효소II(Pol II)의 CTD(C 말단 도메인)를 강력히 인산화하여 긴 바이러스 유전체(RNA)가 만들게 되어 바이러스가 급격히 복제하게 된다.

도 2의 a는 리프레서-TatWt(Tat 단백질 자연형 86개의 아미노산으로 구성) 융합단백질들의 구조를 보여주며, b는 CV-1 세포에서 트랜지언트 발현 분석 결과를 보여주는 그림. TatWt에 연결된 융합단백질들은 HIV-LTR에서의 유전체 발현을 전사수준에서 억제할 수는 없으나, 융합단백질들이 HIV 바이러스 LTR 프로모터 부위로 TatWt 부분에 의하여 타겟팅이 될 수 있으며 이에 따라, 전사연장을 촉진하여 발현을 높여줌을 보여준다.

도 3의 a는 리프레서-TatdMt(Tat 단백질의 아미노산 서열 중 2개의 아미노산이 변이된 72 혹은 73개의 아미노산으로 구성된 변이형) 융합단백질들의 구조, b는 CV-1 세포에서 트랜지언트 발현분석 결과를 보여주며, c는 프로바이러스 상태와 같이 HIV-1 LTR 프로모터가 유전체내에 삽입된 HeLa 세포에서의 발현분석 결과를 보여주는 그림. TatdMt에 연결된 융합단백질들은 HIV-LTR에서의 유전체 발현을 300 ng의 TatWt 발현 프라스미드 존재 하에서도 대부분의 융합단백질들이 전사를 강력히 억제하여 Tat 부재시의 낮은 수준의 발현 이하로 감소시키었고, HeLa 세포에서 프로바이러스와 유사한 상태의 HIV-LTR에서의 전사도 융합단백질들이 TAR 부위로 Tat에 의하여 타겟팅이 되어 전사를 강력히 억제하는 것을 보여준다.

도 4는 HIV-1 LTR 프로모터에서의 TatWt 과 FBI-1, FBI-1-TatdMt, TatdMt의 작용을 보여주는 그림. FBI-1 단독으로는 전사억제효과를 보이지 못하며, TatdMt 는 상경적 억제효과만을 보여주며, 거의 동량을 공급하였을 때, 약 50% 정도의 억제효과를 보여준다(b8). FBI-1-TatdMt는 1ng에서 이미 억제를 보여주며 3ng에선 50%정도의 억제를 81ng에서는 TatWt 부재시와 같은 억제를 보여 완전히 TatWt에 의한 전사를 억제한다. 243ng에서는 TatWt 부재시 기본 수준보다도 낮은 정도의 발현억제를 보여 주었다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Sp1, NF-κB 전사인자들의 활성을 억제 또는 크로마틴을 압축시켜 전사활성을 억제하는 기능을 갖는 폴리펩타이드, 전사조절 프로모터부위에 결합할 수 있는 단백질 징크핑거 등의 단백질들 혹은 화합물들과 발현조절부위 주변의 RNA 가닥 혹은 프로모터 시스액팅 부위을 인식할 수 있는 폴리펩타이드 또는 화합물이 융합된 에이즈 바이러스 전사억제 융합단백질을 제공한다.

상기에서 화합물들은 단백질에 여러 형태로 효소적이나 화학적인 방법으로 접합될 수 있는 특이 핵산서열 인식 화합물들을 의미하고, 이들은 작은 분자량 물질(small molecule)일 수도 있고, 핵산 유사물질 또는 올리고 사카라이드일 수도 있다.

본 발명에서, 상기의 Sp1, NF-κB 전사인자들의 활성을 억제 또는 크로마틴을 압축시켜 전사활성을 억제하는 기능을 갖는 폴리펩타이드, 전사조절 프로모터부위에 결합할 수 있는 징크핑거 등의 단백질들 혹은 화합물들은 a) POZ-도메인 계열의 단백질 b) HDAC 또는 이들의 전사억제 활성 부위, c) MeCP2 또는 그 유사기능의 MBP 계열 단백질, d) 폴리콤 계열의 단백질, mSin3A, SMRT, 및 N-CoR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 코리프레서 단백질, e) Sp1, Sp2, Sp3, SP4 또는 NF-kB의 DNA 결합부위 폴리펩타이드, f)에이즈바이러스 프로모터에 결합하는 능력을 보유한 징크핑거 등의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드인 것이 바람직하고, 상기의 발현조절부위 주변의 쇼트 트랜스크립트 혹은 바이러스 LTR 프로모터 시스액팅 부위을 인식할 수 있는 폴리펩타이드 또는 화합물은 서열목록 1 또는 서열목록 2의 Tat 단백질, 이로부터 유도된 폴리펩타이드 조각 또는 이들의 그 돌연변이체인 것이 바람직하다.

본 발명의 융합단백질은 서열목록 3∼10에 기재된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 융합단백질인 것이 더욱 바람직하다.

또, 본발명은 상기의 서열목록 3∼10의 폴리펩타이드를 각각 코팅하는 서열목록 11∼18의 유전자 염기서열을 제공한다.

본 발명에서 서열목록 1과 2는 각각 73개와 72개의 아미노산으로 구성된 Tat 단백질 돌연변이체이고, 서열목록 3은 MeCP2-TatdMt(73aa) 융합단백질에 대한 아미노산 서열, 서열목록 4는 HDAC1-TatdMt(73aa) 융합단백질에 대한 아미노산 서열, 서열목록5는 POZ-TatdMt(73aa) 융합단백질에 대한 아미노산 서열, 서열목록 6은 FBI-1-TatdMt(73aa) 융합단백질에 대한 아미노산 서열, 서열목록 7은 TatdMt(72aa)-MeCP2 융합단백질에 대한 아미노산 서열, 서열목록 8은 TatdMt(72aa)-HDAC1 융합단백질에 대한 아미노산 서열, 서열목록 9는 TatdMt(72aa)-POZ 융합단백질에 대한 아미노산 서열, 및 서열목록 10은 TatdMt(72aa)-FBI-1 융합단백질에 대한 아미노산 서열을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 MeCP2-TatdMt(73aa) 융합단백질을 코딩하는 서열목록 11의 유전자 염기 서열, 상기의 HDAC1-TatdMt(73aa) 융합단백질을 코딩하는 서열목록 12의 유전자 염기 서열, 상기의 POZ-TatdMt(73aa) 융합단백질을 코딩하는 서열목록 13의 유전자 염기 서열, 상기의 FBI-1-TatdMt(73aa) 융합단백질을 코딩하는 서열목록 14의 유전자 염기 서열, 상기의 TatdMt(72aa)-MeCP2 융합단백질을 코딩하는 서열목록 15의 유전자 염기서열, 상기의 TatdMt(72aa)-HDAC1 융합단백질을 코딩하는 서열목록 16의 유전자 염기서열, 상기의 TatdMt(72aa)-POZ 융합단백질을 코딩하는 서열목록 17의 유전자 염기서열, 및 상기의 TatdMt(72aa)-FBI-1을 코딩하는 서열목록 18의 유전자 염기서열을 제공한다.

또, 본 발명은 상기의 융합단백질 부분 혹은 전체를 포함하는 에이즈 바이러스 증식 억제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기에서 기술된 융합 단백질들을 코딩하는 유전자를 포함하는 pcDNA3.0-TatWt, pcDNA3.0-TatdMt, pcDNA3.0-FBI-1, cDNA3.0-MeCP2-TatWt, pcDNA3.0HDAC1-TatWt, pcDNA3.0FBI-1-TatWt, pcDNA3.0-POZ-TatWt, pcDNA3.0TatWt-MeCP2, pcDNA3.0TatWt-HDAC1, pcDNA3.0TatWt-FBI-1, pcDNA3.0TatWt-POZ, pcDNA3.0-MeCP2-TatdMt, pcDNA3.0HDAC1-TatdMt, pcDNA3.0FBI-1-TatdMt, pcDNA3.0-POZ-TatdMt, pcDNA3.0TatdMt-MeCP2, pcDNA3.0TatdMt-HDAC1, pcDNA3.0TatdMt-FBI-1, 및 pcDNA3.0TatdMt-POZ로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 재조합벡터의 전부 또는 일부 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 상기에서 기술된 융합단백질들이 작용하는 공통적인 특성인전사억제기능의 단백질 혹은 물질들을 에이즈 바이러스의 쇼트 트랜스크립트 혹은 프로모터 조절부위(시스액팅 엘리먼트)에 결합능력을 보유한 단백질 혹은 물질을 이용하여 타겟팅시킴으로서 바이러스 유전체(RNA)의 전사를 억제하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. HIV 바이러스 유전체(RNA)의 합성 조절은 복잡하고, 여러 바이러스 LTR에 존재하는 시스-액팅 요소, 바이러스 트랜스액티베이터 및 세포 단백질 사이의 상호작용이 관여한다. 이 상호작용은 기본적인 RNA 전사수준을 조절하고, 다량의 바이러스 유전자 발현을 유도한다. HIV-LTR 프로모터에서 전사는 바이러스 단백질 Tat가 존재하지 않을 때에는 근접 프로모터 부위를 인지하는 세포단백질 Sp1 전사인자에 의해 주로 조절된다. NF-κB 활성을 유도하는 여러 신호들은 Sp1 결합 GC-Box의 위쪽에 존재하는 시스-액팅 요소와 상호작용하여 전사를 활성화 할 수 있다. 그 외의 여러 단백질(코팩터)은 Sp1 이나 NF-κB 등의 단백질의 활성을 조절하는 능력을 가지고 있어, 잠재적인 HIV 프로바이러스를 갖는 세포에서 전사 및 복제를 촉진한다.

더욱 중요한 것은 HIV가 코딩하는 Tat 단백질은 전사의 시작이나 전사연장을 증가시켜 전사를 활성화하고, 복제에도 중요하다. Tat는 바이러스 트랜스크립트의 5′말단에 있는 시스-액팅 RNA 요소인 TAR가 필요하다. Tat는 모든 HIV 바이러스 트랜스크립트의 5′말단의 TAR 스템-루프 RNA 구조를 갖는 바이러스 유전체(RNA)의 생산을 크게 증가시킨다.

최근 연구 결과, Sp1이 징크-핑거 DNA 결합 도메인를 통해 HDAC 및 POZ-도메인과 상호작용하여 억제되고, 또한 MeCP2도 Sp1과 상호작용하여 Sp1을 억제하였다. FBI-1라 불리우는 POZ-도메인 전사인자도 Sp1 및 Tat와 상호작용하고, HIV-LTR의 IST(짧은 가닥 유도부위)지역과 결합하여 HIV 전사를 억제하는 중요한 인자라는 것을 발견하였다. 이들 단백질들의 독특한 성질은 크로마틴 압축에 의한 전사억제에 관여하는 코리프레서 단백질인 mSin3A, SMRT/N-CoR 및 HDAC와 상호작용을 하는 능력을 갖는다. 따라서 본 발명의 발명자들은 HIV-1 LTR에 이들 단백질을 타겟팅 할 수 있다면, Sp1의 활성을 차단하거나 HIV 프로모터 주위의 크로마틴 압축,그리고 에이즈바이러스 프로모터 부위에 결합가능한 폴리펩타이드를 타게팅함으로서 Sp1 및 Tat에 의한 전사 활성화를 조절할 수 있다는 생각을 하게 되었다.

핵심 프로모터 지역에 전사억제 기능의 단백질을 타겟팅하기 위해, TatWt와 억제기능 단백질을 융합한 발현 프라즈미드를 만들었다. TatWt 융합 단백질들은 세포 내에서 에이즈 바이러스 LTR (프로모터)에서 전사를 억제하지 못하고, 융합단백질의 TatWt 부분에 의하여 바이러스 유전체(RNA)의 전사 활성인자로 강력하게 작용하였다. TatWt에 융합된 전사억제 단백질들이 전사 활성인자로서 작용한 것은, TatWt가 전사 시작을 저해하는 억제자들의 작용을 상쇄시킬 정도로 강력하게 전사연장 과정에 작용하는 것으로 추정할 수 있다. 그러나 희망적으로는, 융합단백질이 서로 이질적인 두 종류의 단백질이 결합되어 있음에도 불구하고 TatWt에 의하여 TAR에 타겟팅 될 수 있음을 보여주고 있어 Tat 단백질이 핵심 LTR 프로모터 지역에 타겟팅 도구로 사용될 수 있음을 보여주고 있다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 Tat의 전사활성을 억제하고자 TAR에 강하게결합할 수 있지만, Tat에 의한 전사활성화에 중요한 세포인자인 TAK(혹은 PTEF 피티에프라 부름)와는 상호작용 능력이 결핍된 돌연변이 Tat 단백질(TatdMt:TatK28A&K50A)을 이용하였다.

에이즈 바이러스의 가장 긴 Tat의 길이는 101의 아미노산으로 구성되어 있으나, 매우 다양한 변이형 이 존재하여 실제로 어느것이 wild type이라고 얘기하기도 곤란하나, 일반적으로, Tat 단백질 중 28번과 50번의 라이신이 알라닌으로 치환된 형태 등 다양한 형태가 있고, 본 발명에서는 이중 28번과 50번의 라이신이 알라닌으로 치환된 형태를 이용하였으며, 72개의 아미노산이나 73개의 아미노산으로 구성된 Tat 폴리펩타이드를 이용하였다. 그러나 이 폴리펩타이드의 조각이나 다른 돌연변이체도 이와 유사한 작용을 할 수 있다.

원숭이 CV-1 세포에서, TatdMt 융합단백질들은 과량의 Tat이 발현(300ng 발현 프라즈미드)된 조건에서도 에이즈 바이러스 유전체의 전사를 극적으로 억제하였다. 이는 에이즈 연구 연구자들의 오랜안의 바램 즉 도미넌트네가티브 형태의 단백질의 출현을 알리는 획기적인 발견이다. Tat의 대부분의 융합단백질은 TatdMt에 연결된 방향에 무관하게 작용한다. 특히 HDAC-TatdMt, FBI-1-TatdMt 융합단백질이 전사를 가장 크게 억제하였다(도 3b). 융합단백질은 HIV-1 LTR-크로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이즈 유전자가 인간 유전체에 삽입된 HeLa 세포에서 더 강하게 억제제로 작용하였다. Tat만으로 전사를 46배 활성화시켰으나 MeCP2, HDAC, POZ-, FBI-1-TatdMt 단백질은 300ng의 TatWt 과발현 프라즈미드가 존재하는 경우에서 TatWt에 의한 46배에 달하는 전사활성화를 강력히 억제하는 효과가 있었다. 역시 HeLa 세포에서도 HDAC-TatdMT 과 FBI-1-TatdMt 융합단백질이 가장 강력한 억제자로 Tat에 의한 전사 활성화를 완전히 억제하였다. 이 결과는 프로바이러스 상태로 인간 유전체로 삽입된 에이즈 바이러스의 전사를 억제하고 그 결과 바이러스 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 융합단백질이 에이즈 바이러스 LTR 프로모터에서 전사를 억제할 수 있으므로, 바이러스 단백질의 발현억제와 에이즈 바이러스 복제도 억제할 수 있음은 당연한 것으로 여겨진다. 왜냐하면 바이러스 복제에 필요한 모든 부품들의 생산에 필요한 유전체(RNA)가 생산되지 않기 때문이다.

이하, 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: TatWt 플라스미드 제조

HIV-1 LTR CAT 융합 플라스미드(pUC3R-III CAT)는 약 720 bp의 HIV-LTR을 pCAT-Basic 프라스미드(Promega 사)에 클로닝하였다. HIV-1 LTR Luciferase 융합 플라스미드(pUC3R-III-Luc)는 pUC3R-III CAT의 XhoI HidIII 제한효소처리시 얻어진 720bp 조각을 pGL3-Basic 프라스미드(XhoI-HindIII, Promega 사)에 클로닝하여 사용하였다.

본 발명에서 사용된 (86개의 아미노산으로 구성됨), TatdMt(73개의 아미노산으로 구성됨), HDAC1, MeCP2, FBI-1, POZ-도메인과 TatWt 또는 돌연변이 TatdMt(TatK28AK50A)에 연결된 융합단백질들은 해당 유전자를 PCR 방법으로 증폭하였으며 포유류 발현벡터인 pCDNA3.0(Inivtorgen)에 클로닝하였다. pcDNA3.0 TatWt(86aa)를 제조하기 위하여 pET-15b-TATWt(86 aa, 한림대학교 박진서박사 제공, HIVHBX2R 형)을 주형으로 이용하여

5' 프라이머 GATCGAATTCATGGAGCCAGTACCTAGACTAGAGCCC,

3' 프라이머 GATCTCTAGATCATTCCTTCGGGCCTGTCGGGTCCCCTC 를 사용하여 PCR 기법으로 증폭하였다. 증폭 목적으로 94℃에서 3분간의 주형 변성을 위한 전처리 반응을 실시하고, 30회의 증폭반응(94℃ 30 초; 60℃ 1분; 72℃ 30초), 그리고 72℃에서 3분간의 증폭 후 반응을 실시하였다. PCR 산물 및 발현벡터 pcDNA3.0을 제한효소 EcoR1과 Xba1으로 절단한 후 T4 DNA 리가제로 처리하여 접한한 후, 대장균 (E. coliDH5a)에 형질전환 방법으로 도입하고 알카리 용해 방법으로 pcDNA3.0 TatWt(86aa) 플라스미드를 제조하였다. pcDNA3.0 TatdMt(73aa)를 제조하기 위하여서는 위와 동일하나 주형으로는 HIV Tat 유전자(Kiernan등, EMBO J. 18: 6106-6118, 1999)를 다음의 프라이머 조합으로

5' 프라이머 GAT CGA ATT CAT GGA GCC AGT AAA TCC TAG CCT AG

3' 프라이머 GATCTCTAGATCAGCTTTGATAGAGAAACTTGATG(stop 코돈 보유) 을 이용 PCR 증폭하여 위와 유사한 방법으로 pcDNA3.0TatdMt 제조하였다. pcDNA3.0 X-TatdMT 배열의 HDAC, MeCP2, POZ-, FBI-1 융합단백질들을 제조하기 위하여 비 Tat 부분을 각각 해당 사람의 cDNA를 PCR 증폭하여 pcDNA3.0 TatdMt에 클론잉 하였다. 다음의 여러 PCR 프라이머들을 사요하였으며 공히 PCR 증폭 목적으로 95℃에서 3분간의 주형 변성을 위한 전처리 반응을 실시하고, 30회의 증폭반응(95℃ 30 초; 62℃ 1분; 72℃ 7분), 72℃에서 3분간의 증폭 후 반응을 실시하였다. 증폭된 산물을 BamH1-ECoR1 (MeCP2의 경우) 나 HindIII-EcoR1(HDAC1, POZ, FBI-1)으로 처리하여, pcDNA3.0 TatdMt/BamH1-ECoR1 혹은 pcDNA3.0 TatdMt/HindIII-EcoR1에 각각 클로닝하였다.

MeCP2,

5' 프라이머 GATCGGATCCACCATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAG

3' 프라이머 GATCGAATTCGCTAACTCTCTCGGTCACGGGCGTCCG

HDAC1

5' 프라이머 GATCAAGCTTACCATGGCGCAGACGCAGGGCACCCGGAGG

3' 프라이머 GATCGAATTCGGCCAACTTGACCTCCTCCTTGACCCCTTTG

POZ-도메인

5' 프라이머 GATCAAGCTTACCATGGCCGGCGGCGTGGACGGCCCCATC

3' 프라이머 GATCGAATTCCTGCCGGTCCAGGAGGTCGGCGCACACG

FBI-1

5' 프라이머 GATCAAGCTTACCATGGCCGGCGGCGTGGACGGCCCCATC

3' 프라이머 GATCGAATTCGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTT

pcDNA3.0 TatdMT-X 배열의 HDAC, MeCP2, POZ-, FBI-1 융합단백질들을 제조하기 위하여, pcDNA3.0 TatdMt(73 aa)를 제조하기 위하여서는 위와 동일하나 주형으로는 HIV Tat 유전자(Kiernan등, EMBO J. 18: 6106-6118, 1999)를 다음의 프라이머 조합으로

5' 프라이머 GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTAAATCCTAGCCTAG

3' 프라이머 GATCGAATTCGGGCTTTGATAGAGAAACTTGATG 을 사용하여

PCR 증폭하여 위와 유사한 방법으로 pcDNA3.0TatdMt 제조하였다. 우선 pcDNA3.0 TatdMt-x 류의 비 Tat 부분을 각각 해당 사람의 cDNA를 위와 동일한 조건으로 PCR 증폭하여 EcoR1-Xba1으로 절단하여, pcDNA3.0TatdMt/EcoR1-Xba1 에 클로닝 하였다. 증폭에 사용된 프라이머 조합은 아래와 같다.

MeCP2,

5' 프라이머 GATCGAATTCATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCA

3' 프라이머 GATCTCTAGATCAGCTAACTCTCTCGGTCACGGGC

HDAC1

5' 프라이머 GATCGAATTCATGGCGCAGACGCAGGGCACCCGGA

3' 프라이머 GATCTCTAGATCAGGCCAACTTGACCTCCTCCTTG

POZ-도메인

5' 프라이머 GATCGAATTCATGGCCGGCGGCGGCGTGGACGGCC

3' 프라이머 GATCTCTAGATCACTGCCGGTCCAGGAGGTCGGCG

FBI-1

5' 프라이머 GATCGAATTCATGGCCGGCGGCGGCGTGGACGGCC

3' 프라이머 GATCTCTAGATCAGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTT

실시예 2: 트랜지언트 발현 에세이

CV-1 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포들이 배양기의 바닥 면적의 50-60%를 차지할 정도로 성장했을 때, 0.6㎍의 pHIV-LTR-루시퍼레이즈 프라즈미드, pCMV-β갈락토시데이즈 프라즈미드, TatWt와 다음중의 하나의 포유류 발현 pCDNA3.0 플라스미드(HDAC1-TatdMt, MeCP2-TatdMt, FBI-1-TatdMt, POZ-도메인-TatdMt, TatdMt-HDAC1, TatdMt-MeCP2, TatdMt-FBI-1, TatdMt-POZ-도메인)의 혼합물을 리포펙타민 프러스시약(Gibco-BRL)를 사용하여 세포내로 도입하였다. 또한 HIV-LTR-CAT가 유전체내로 삽입된 HeLa 세포에서 유전체 발현 억제실험을 위하여 10% FBS의 DMEM 배지에서 성장시킨 세포를 300ng의 Tat 발현 프라즈미드와 300ng의 여러 융합단백질 발현 프라즈미드를 혼합하여 리포펙타민 프러스 시약(Gibco-BRL)으로 도입시키었다. 세포를 24시간 배양하고 리포터 유전자 발현을 분석하였다. 세포 내로의 플라스미드 도입 효율 및 세포추출물 회수율의 편차는 동시에 도입시키어 발현된 β-갈락토시데이즈 활성으로 표준화하였다. 본 발명의 결과를 도 2∼4에서 보여준다.

도 2에서는 TatWt에 연결된 융합단백질들은 HIV-LTR에서의 유전체 발현을 전사수준에서 억제할 수는 없으나, 융합단백질들이 HIV 바이러스 LTR 프로모터 부위로 TatWt 부분에 의하여 타겟팅이 될 수 있으며 이에 따라, 전사연장을 촉진하여 발현을 높여줌을 보여주고,

도 3에서는 TatdMt(Tat 단백질의 2개의 아미노산이 변이된 73개의 아미노산으로 구성된 변이형)에 연결된 융합단백질들은 HIV-LTR에서의 유전체 발현을 300ng의 TatWt 발현 프라스미드 존재 하에서도 대부분의 융합단백질들이 전사를 강력히 억제하여, Tat 부재시의 낮은 수준의 발현 이하로 감소시키었고, HeLa 세포에서 프로바이러스와 유사한 상태의 HIV-LTR에서의 전사도 융합단백질들이 TAR 부위로 Tat에 의하여 타겟팅이 되어 전사를 강력히 억제하는 것을 보여주며,

도 4에서는 FBI-1 단독으로는 전사억제효과를 보이지 못하며, TatdMt는 상호 경쟁적으로 동일한 자리인 TAR에 결합하려 하는 억제효과만을 보여주며, 거의 동량을 공급하였을 때, 약 50% 정도의 억제효과를 보여준다(b8). 또, FBI-1-TatdMt는 1ng에서 이미 억제를 보여주며 3ng에선 50%정도의 억제를 81ng에서는 TatWt 부재시와 같은 억제를 보여 완전히 TatWt에 의한 전사를 억제한다. 243ng에서는 TatWt 부재시 기본 수준보다도 낮은 정도의 발현억제를 보여 준다.

핵 내부에서 숙주세포 단백질인 Sp1, NF-κB가 에이즈 바이러스 전사 발현조절 부위에 작용하여, 짧은 RNA 가닥(Short transcript) 상태의 바이러스 유전체(RNA)가 생산되고 근처에 머물러 있다(폴리머레이즈 II에 연결된 RNA 가닥을 나타냄). TAR 지역에 바이러스 단백질인 Tat가 결합하게 되면 RNA 합성이 극적으로 촉진되어 다량의 바이러스 유전체(RNA)를 만들고 이를 이용, 바이러스 증식에 필요한 단백질 부품들을 생산하게 된다. 따라서 Sp1, NF-κB, Tat의 작용을 제어하는 것이 바이러스의 증식을 차단할 수 있는 매우 효과적인 방법이다.

에이즈 바이러스의 쇼트트랜스크립트(short transcript)의 부위(예, TAR)를 인식하는 단백질을 전사인자 Sp1, NF-κB을 억제하는 단백질, 코리프레서 혹은 이들과 상호작용 가능한 단백질 및 HDAC 및 HDAC과 상호작용하는 단백질등 크로마틴을 강하게 압축시켜 전사활성을 억제하는 기능을 갖는 단백질들, 그리고 프로모터 부위에 결합능을 보유한 징크핑거 등의 단백질들과 융합시켜 에이즈 바이러스 전사조절 프로모터 부위에 타겟팅 하였을 때 바이러스 LTR에서 바이러스 유전체(RNA)의 생산(전사과정)을 극적으로 억제한다.

본 발명은 전사억제 단백질군을 HIV-LTR에 타겟팅 함으로서 에이즈 바이러스 LTR에서 전사활성을 강하게 억제시킬 수 있음을 보여준 최초의 연구이다. 또한 숙주세포 유전체 내부에 자리잡고 있는 프로바이러스 상태의 DNA 형태의 바이러스 LTR (프로모터)로부터 바이러스 RNA 유전체의 발현을 억제하므로써 바이러스 증식에 필요한 부품(유전체, 단백질) 생산을 원천적으로 봉쇄한다. 이러한 이유로 바이러스의 증식 및 내성 바이러스의 생성을 근본적으로 차단할 수 있다고 여겨진다. 특히 HDAC-TatdMt 와 FBI-1-TatdMt 물질은 바이러스 유전체(RNA)의 생산 과정을 완전히 봉쇄할 수 있음을 보여주고 있다.

우리의 기술은 에이즈의 치료제로 사용되고 있는 기존 약물들의 문제점들을 근본적으로 극복하여 진정한 의미의 효과적인 에이즈 치료용 단백질 치료제 또는 유전자 치료제로 사용이 가능한 새로운 방법으로 사료된다.

Claims (8)

1. Sp1, NF-κB 전사인자들의 활성을 억제하거나 크로마틴을 압축시켜 전사활성을 억제하는 기능을 갖는 폴리펩타이드, 프로모터결합능을 보유한 폴리펩타이드 혹은 화합물들과 발현조절부위 주변의 RNA 가닥 (예, TAR 부위) 혹은 바이러스 LTR 프로모터 시스액팅 부위을 인식할 수 있는 폴리펩타이드 또는 화합물이 융합된 에이즈 바이러스 전사억제 융합단백질
2. 제 1 항에 있어서,

   상기의 Sp1, NF-κB 전사인자들의 활성을 억제 또는 크로마틴을 압축시켜 전사활성을 억제하는 기능을 갖는 폴리펩타이드 혹은 화합물들은 a) POZ-도메인 계열의 단백질 b) HDAC 또는 이들의 전사억제 활성 부위, c) MeCP2 또는 그 유사기능의 MBP 계열 단백질, d) 폴리콤 계열의 단백질, mSin3A, SMRT, 및 N-CoR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 코리프레서 단백질, e) Sp1, Sp2, Sp3, SP4 또는 NF-kB의 DNA 결합부위 폴리펩타이드, f)에이즈바이러스 프로모터 부위에 결합능을 보유한 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기의 발현조절부위 주변의 쇼트 트랜스크립트 혹은 바이러스 LTR 프로모터시스액팅 부위을 인식할 수 있는 폴리펩타이드 또는 화합물은 서열목록 1 또는 서열목록 2의 Tat 단백질 또는 그의 그 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 임의의 한 항에 있어서,

   상기의 융합단백질은 서열목록 3∼10에 기재된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 융합단백질인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기의 서열목록 3∼10의 폴리펩타이드를 각각 코팅하는 서열목록 11∼18의 유전자 염기서열
6. 제 5 항에 있어서,

   상기의 융합 단백질들을 코딩하는 유전자를 포함하는 pcDNA3.0-TatWt, pcDNA3.0-TatdMt, pcDNA3.0-FBI-1, pcDNA3.0-MeCP2-TatWt, pcDNA3.0HDAC1-TatWt, pcDNA3.0FBI-1-TatWt, pcDNA3.0-POZ-TatWt, pcDNA3.0TatWt-MeCP2, pcDNA3.0TatWt-HDAC1, pcDNA3.0TatWt-FBI-1, pcDNA3.0TatWt-POZ, pcDNA3.0-MeCP2-TatdMt, pcDNA3.0HDAC1-TatdMt, pcDNA3.0FBI-1-TatdMt, pcDNA3.0-POZ-TatdMt, pcDNA3.0TatdMt-MeCP2, pcDNA3.0TatdMt-HDAC1, pcDNA3.0TatdMt-FBI-1, 및 pcDNA3.0TatdMt-POZ으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 재조합벡터.
7. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,

   상기의 융합단백질 부분 혹은 전체를 포함하는 에이즈 바이러스 전사 억제 조성물.
8. 상기의 융합단백질들을 이용하여 바이러스 LTR에서의 유전체(RNA)의 전사를 억제하고. 이에 따른 바이러스 복제를 억제함으로서 바이러스 증식을 억제하는 방법.